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8/3/2019 Premio Seleccin 2011. Albert Soler
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ESCUELA TCNICASUPERIOR DEINGENIEROS
AGRNOMOS
Anexo 4
Autorizacin del director/a,codirector/a o tutor/a
Datos del trabajo de fin de carrera
Autor: Albert Soler Hernndez DNI: 22584259-F
Ttulo: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMAS BIOLGICASAISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LA COMUNIDAD VALENCIANA
rea o reas de conocimiento a las que corresponde el trabajo: Microbiologa y Medio Ambiente
Titulacin: Ingeniero Agrnomo
A cumplimentar por el director/a, codirector/a o tutor/a del trabajo
Nombre y apellidos: Gonzalo Cuesta Amat
Departamento: Biotecnologa
En calidad de: X director/a codirector/a tutor/a
Autorizo la presentacin del trabajo de fin de carrera cuyos datos figuran en el apartado anterior y certifico
que se adecua plenamente a los requisitos formales, metodolgicos y de contenido exigidos a un trabajo defin de carrera, de acuerdo con la normativa aplicable en la ETSIA.
(Firma)* Gonzalo Cuesta Amat Jose Luis Alonso Molina
Valencia, 21 de Julio de 2008
En el caso de codireccin, han de firmar necesariamente los que sean profesores de esta Escuela; si existe tutor o tutora,tiene que ser ste quien firme esta autorizacin.
DIRECCIN DE LA ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS
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ESCUELA TCNICASUPERIOR DEINGENIEROS
AGRNOMOS
Anexo 5
Ficha resumen del Trabajo Fin deCarrera
Datos personales
Nombre y apellidos: Albert Soler Hernndez
Datos del trabajo de fin de carrera
Ttulo del TFC: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMASBIOLGICAS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LACOMUNIDAD VALENCIANA
Lugar de realizacin: ETSIA, Departamento de Biotecnologa Fecha de lectura: Septiembre 2008
Titulacin: Ingeniero AgrnomoEspecialidad: Recursos Naturales y Medio AmbienteDirector/a: Gonzalo Cuesta AmatCodirector/a: Jose Luis Alonso Molina
ResumenLa formacin de espumas de origen biolgico en la superficie de los reactores y de los clarificadores secundarios
en las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDARs) es uno de los problemas de separacin de slidos msimportantes.
Entre las bacterias responsables de estas espumas se encuentran los actinomicetos nocardioformes que contienencidos miclicos (mycolata) que pertenecen al phylumActinobacteria. Este grupo de microorganismos contiene especies
filamentosas que causan problemas de formacin de espumas biolgicas (foaming) en plantas de tratamiento de aguasresiduales con sistemas de fangos activos. Estas espumas interfieren en el proceso de depuracin de depuracin deaguas residuales, ya que retienen hasta el 40% de los slidos en suspensin. La presencia de especies patgenas en estegrupo de microorganismos implica un riesgo para la salud pblica y, por lo tanto, la necesidad de detectar estas especies.
En el presente trabajo se han investigado varias EDARs de la Comunidad Valenciana para identificar a nivel deespecie las bacterias causantes de estas espumas biolgicas. Para ello se han utilizado cuatro tcnicas: caracterizacinmorfolgica, caracterizacin quimiotaxonmica, caracterizacin genotpica y caracterizacin fenotpica.
En la caracterizacin morfolgica se realiz un estudio micro y macroscpico de los asilados.Para caracterizar quimiotaxonmicamente los asilados se llevaron a cabo tres marcadores quimiotaxonmicos:
extraccin de cidos miclicos, extraccin de los ismeros del cido diaminopimlico y extraccin de los azcarespredominantes de la pared celular.
En la caracterizacin genotpica se llev a cabo la extraccin del DNA de los aislados seleccionados y laamplificacin por PCR del 16S rDNA. Los productos de PCR se purificaron y se enviaron a secuenciar. Las secuencias seanalizaron mediante los programas BLAST, CHROMAS y PHYDIT. Posteriormente se realizaron rboles filogenticos ymatrices de similaridad.
En la caracterizacin fenotpica se realizaron una serie de pruebas para completar los resultados obtenidos. Laspruebas se basaron en tests de tolerancia a diferentes temperaturas, tests de degradacin y tests en donde se hacacrecer a los aislados con diferentes fuentes de carbono y/o nitrgeno.
De los 25 aislados seleccionados el 48% pertenece al gnero Gordonia, el 36% al gnero Tsukamurella, el 8% algnero Dietzia, el 4% al gnero Rhodococcusy el ltimo 4% al gnero Mycobacterium. Todas ellas presentaban cidosmiclicos, forma meso-DAP y arabinosa y galactosa como azcares predominantes.
Con ello demostramos que en las EDARs de la Comunidad Valenciana existe una amplia diversidad de especiesformadoras de espumas biolgicas.
Palabras clave
Fangos activos, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium
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Resum
La formaci de bromeres d'origen biolgic en la superfcie dels reactors i dels clarificadors secundaris en lesestacions Depuradores d'Aiges Residuals (EDARs) s un dels problemes de separaci de slids ms importants.
Entre els bacteris responsables d'estes bromeres es troben els actinomicets nocardioformes que contenen cids
miclics (mycolata) que pertanyen al phylum Actinobacteria. Este grup de microorganismes cont espcies filamentosesque causen problemes de formaci de bromeres biolgiques (foaming) en plantes de tractament d'aiges residuals ambsistemes de fangs actius. Estes bromeres interferixen en el procs de depuraci de depuraci d'aiges residuals, ja queretenen fins al 40% dels slids en suspensi. La presncia d'espcies patgenes en este grup de microorganismes implicaun risc per a la salut pblica i, per tant, la necessitat de detectar estes espcies.
En el present treball s'han investigat diverses EDARs de la Comunitat Valenciana per a identificar a nivell d'espcieels bacteris causants d'estes bromeres biolgiques. Per a aix s'han utilitzat quatre tcniques: caracteritzaci morfolgica,caracteritzaci quimiotaxonmica, caracteritzaci genotpica i caracteritzaci fenotpica.
En la caracteritzaci morfolgica es va realitzar un estudi micro i macroscpic dels allats.Per a caracteritzar quimiotaxonmicament els allats es van dur a terme tres marcadors quimiotaxonmics:
extracci d'cids miclics, extracci dels ismers de l'cid diaminopimlic i extracci dels sucres predominants de la paretcellular.
En la caracteritzaci genotpica es va dur a terme l'extracci del ADN dels allats seleccionats i l'amplificaci perPCR del 16S rDNA. Els productes de PCR es van purificar i es van enviar a seqenciar. Les seqncies es van analitzar per
mitj dels programes BLAST, CHROMAS i PHYDIT. Posteriorment es van realitzar arbres filogentics i matrius desimilaritat.
En la caracteritzaci fenotpica es van realitzar una srie de proves per a completar els resultats obtinguts. Lesproves es van basar en tests de tolerncia a diferents temperatures, tests de degradaci i tests on es feia crixer alsallats amb diferents fonts de carboni i/o nitrogen.
Dels 25 allats seleccionats el 48% pertany al gnere Gordonia, el 36% al gnere Tsukamurella, el 8% al gnereDietzia, el 4% al gnere Rhodococcusi l'ltim 4% al gnere Mycobacterium. Tots ells presentaven cids miclics, formameso-DAP i arabinosa i galactosa com a sucres predominants.
Amb aix demostrem que en les EDARs de la Comunitat Valenciana hi ha una mplia diversitat d'espciesformadores de bromeres biolgiques.
Paraules clau
Fangs actius, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium
AbstractThe formation of thick viscous scums layers in activated sludge tanks and secondary clarifiers of wastewater
treatment plants is one of the most important problems of solid separation.The most significant filamentous bacteria of foaming are nocardioform actinomycetes (mycolata), which belong to
phylum Actinobacteria. That group of microorganisms has filamentous species that causes foaming in wastewatertreatment plants. These foams interfere in that process because retain until 40% of suspension solids. The presence ofpathogen species in that group is a danger to public health.
In this study had been study a lot of wastewater treatment plants of the Comunidad Valenciana to identificate thespecies that causes foaming.
We have been use four procedures: morphologic, chemotaxonomy, genotypic and phenotypic characterization.
In the morphologic characterization we did a micro and macro study of the isolates.In the chemotaxonomy characterization we did micolic acids extraction, DAP extraction and Whole-cell sugar.In the genotypic characterization we did the DNA extraction and PCR amplification of the 16s rDNA. The
sequences were analysed trough BLAST, CHROMAS and PHYDIT programs. Later we did the philogenetic trees and thesimilarity values.
In the phenotypic characterization we did a lot of tests to complete the results (tolerance tests and degradationtests).
48% of isolates belongs to the Gordonagenus, 36% belongs to the Tsukamurellagenus, 8% belongs to theDietziagenus, 4% to the Rhodococcusgenus and the last 4% belongs to the Mycobacterium genus. All of these hadmicolic acids, meso-Dap form and galactose and arabinose.
In conclusion, the results obtained show a great diversity of foaming filamentous bacteria in the EDARs of theComunidad Valenciana with the activated sludge process.
Key words
Activated sludge, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium
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I
NDICE
INTRODUCCIN 1
1.- Depuracin de aguas residuales 1
1.1.- Sistema de fangos activos 1
1.2.- El flculo 2
2.- Problemas en sistemas de fangos activos 2
2.1.-Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking 2
2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming 3
2.2.1.- Microorganismos productores de espumas 42.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas 5
2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de
espumas 6
2.2.4.- Control del foaming 7
3.- Actinomicetos 8
3.1.- Taxonoma 8
3.2.- Clasificacin actual 9
3.3.- Suborden Corynebacterineae 10
3.3.1.- Familia Corynebacterineae 10
3.3.2.- Familia Dietziaceae 10
3.3.3.- Familia Gordoniaceae 10
3.3.3.1.- Gnero Gordonia 11
3.3.3.2.- Gnero Millisia 12
3.3.3.3.- Gnero Skermania 12
3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae 12
3.3.5.- Familia Nocardiaceae 13
3.3.5.1.- Gnero Nocardia 14
3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus 14
3.3.6.- Familia Segniliparaceae 15
3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae 15
3.3.8.- Familia Williamsiaceae 163.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza 16
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II
3.4.1.- Suelo 16
3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces 17
3.4.3.- Aguas residuales 17
4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos 18
4.1.- Aislamiento y recuento 18
4.2.- Identificacin y caracterizacin 19
4.2.1.- Mtodos clsicos 19
4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos 19
4.2.1.2.- Quimiotaxonoma 20
4.2.2.- Mtodos genotpicos 21
4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA 21
4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 22
4.2.3.- Mtodos fenotpicos 23
OBJETIVOS 24
MATERIAL Y MTODOS 25
1.- Cepas bacterianas de referencia 25
2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 26
2.1.- Toma de muestras 26
2.2.- Caracterizacin morfolgica 27
2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica 28
2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos 28
2.3.1.1.- Materiales 28
2.3.1.2.- Metodologa 292.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) 29
2.3.2.1.- Materiales 29
2.3.2.2.- Metodologa 30
2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular 31
2.3.3.1.- Materiales 31
2.3.3.2.- Metodologa 31
2.4.- Caracterizacin genotpica 32
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III
2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB. 32
2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa 33
2.4.3.- Amplificacin por PCR 34
2.4.4.- Purificacin del DNA 34
2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA 35
2.4.6.- rboles filogenticos 35
2.4.7.- Matrices de similaridad 36
2.5.- Caracterizacin fenotpica 36
2.5.1.- Tests fenotpicos 36
2.5.1.1.- Degradacin 37
2.5.1.1.1.- Esculina 37
2.5.1.1.2.- L- Tirosina 37
2.5.1.2.- Fuente de carbono (1%) 37
2.5.1.2.1.- -L-Ramnosa 37
2.5.1.2.2.- D-Galactosa 37
2.5.1.2.3.- D-Ribosa 38
2.5.1.2.4.- meso-Inositol 38
2.5.1.3.- Fuente de carbono (0,1%) 38
2.5.1.3.1.- cido Benzoico (sal de Na) 38
2.5.1.3.2.- cido ctrico 39
2.5.1.4.- Fuente de carbono y nitrgeno (0,1%) 39
2.5.1.4.1.- L-Prolina 39
2.5.1.5.- Test de tolerancia 39
2.5.1.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas 39
RESULTADOS Y DISCUSIN 40
1.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 40
1.1.- Caracterizacin morfolgica 40
1.2.- Caracterizacin quimiotaxonmica 43
1.3.- Caracterizacin genotpica 47
1.3.1.- rboles filogenticos y matrices de similaridad 49
1.3.1.1.- Gnero Dietzia 49
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IV
1.3.1.2.- Gnero Rhodococcus 52
1.3.1.3.- Gnero Tsukamurella 55
1.3.1.4.- Gnero Gordonia 58
1.4.- Caracterizacin fenotpica 62
CONCLUSIONES 68
BIBLIOGRAFA 69
ANEXOS 75
ANEXO 1: Medios de cultivo 75
ANEXO 2: Reactivos para biologa molecular 77
ANEXO 3: Abreviaturas empleadas 78
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NDICE DE TABLAS
Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuenciasde DNA y RNA ribosmico 16S. (Stackebrandt et al., 1997, Kmpferet al., 1999, Stach et al.,2004, Butleret al., 2005, Soddell et al., 2006) 9
Tabla 2: Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios(Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20
Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios con meso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20
Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizados25
Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS 27Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos 34
Tabla 7:Descripcin macroscpica y microscpica de los aislados 40
Tabla 8:Resultados pruebas quimiotaxonmicas de los aislados 44
Tabla 9:Posible identificacin obtenida mediante BLAST de la secuencias del 16S rDNA 48
Tabla 10: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Dietzia 51
Tabla 11: Matriz de similaridad del gen 16S r DNA del gnero Rhodococcus 54
Tabla 12: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Tsukamurella 57
Tabla 13: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Gordonia 60
Tabla 14: Identificacin obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S
rDNA 62
Tabla 15: Resultados test fenotpicos 64
Tabla 15 (continuacin): Resultados test fenotpicos 65
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NDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos 1
Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998)21
Figura 3: Dietzia maris (P26) 41
Figura 4: Gordonia amarae (P152) 41
Figura 5: Gordonia malaquae (P175) 41
Figura 6: Rhodococcus ruber(P135) 42
Figura 7: Tsukamurella pseudospumae (N1) 42
Figura 8: Tsukamurella spumae (P166) 42
Figura 9: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados P46p, P48b, P108, P152, P132.Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardiaasteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomycesalbus (CECT 3077) (5) 45Figura 10: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados N1, N4, N5, N9-1, L2.Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardiaasteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomycesalbus (CECT 3077) (5) 45Figura 11: Cromatoplaca de ismeros del DAP. En los extremos se observan los patrones delas formas L-DAP y meso-DAP 46Figura 12: Cromatoplaca de los azcares predominantes. En los extremos se observan lospatrones de Arabinosa y Galactosa 46Figura 13: Comprobacin extraccin DNA. 1: P26; 2: P72; 3:P108; 4: P132; 5: P166; 6: N1; 7:N4; 8: N9-1 47Figura 14: Gel de PCR con los productos de amplificacin del 16S rDNA.1 y 16: Marcador depeso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: P39; 5: P46p; 6:P48b; 7: P54; 8: P72; 9: P108;10: P135; 11: P141; 12: P145; 13: N5; 14: N16-9; 15: N17-4 47Figura 15: rbol filogentico gnero Dietzia 50
Figura 16:rbol filogentico gnero Rhodococcus 53
Figura 17:rbol filogentico gnero Tsukamurella 56
Figura 18:rbol filogentico gnero Gordonia 59
Figura 19: Test Tirosina 66
Figura 20: Test Esculina 66
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INTRODUCCIN
1
1.- Depuracin de aguas residuales
1.1.- Sistema de fangos activos
El sistema de fangos activos es un proceso que se lleva utilizando durante los ltimos 60
aos para la depuracin de aguas residuales. Este proceso surgi a partir de la observacin de
que cualquier agua residual ya sea domstica o industrial, aireada durante un cierto periodo de
tiempo, reduce su contenido en materia orgnica, al mismo tiempo que se forma un fluido con
flculos de bacterias. Esto flculos se encuentran formados por una poblacin muy heterognea
de microorganismos. (Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999).
Los fangos activos constituyen una mezcla de microorganismos, en su mayora bacterias
hetertrofas, que transforman la materia orgnica biodegradable hasta formas ms simples y
estables. Consiste en un tratamiento aerbico que oxida la materia orgnica hasta CO2, NH3 y
H2O y forma nueva biomasa celular. La biomasa celular obtenida forma flculos que sedimentan
en el tanque de clarificacin o sedimentacin. Este procedimiento se utiliza a escala mundial
como tratamiento biolgico secundario para el tratamiento de aguas residuales domsticas
(Bitton, 1999). Parte de los fangos recogidos en el sedimentador secundario se recirculan alreactor y son los que contienen los microorganismos que llevan a cabo la depuracin biolgica.
(Metcalf y Hed, 2000). (Ver figura 1).
1.2.- El flculo
Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos
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INTRODUCCIN
2
El flculo est formado por la unin de microorganismos, partculas orgnicas e
inorgnicas, teniendo un tamao que oscila entre 1 y 1000 m. Para que el proceso de
depuracin sea llevado con xito es necesaria la formacin de un flculo adecuado de
microorganismos en el tanque de aireacin. Con ello se permite la separacin de los slidos en
suspensin en el tanque de sedimentacin producindose un sobrenadante fluido y claro. A su
vez, parte de estos slidos que contienen los flculos son recirculados al tanque de aireacin
para as aumentar el nivel de actividad microbiana (Soddell y Seviour, 1990).
Las bacterias filamentosas juegan un papel importante ya que gracias a ellas el flculo
adquiere consistencia con lo que se pueden formar flculos de mayor tamao y ms compactos
que resisten mucho mejor las turbulencias del sistema de agitacin. Tambin ayudan a capturar
y mantener atrapadas pequeas partculas durante la sedimentacin (Kerley y Forster, 1995).
Si no existieran bacterias filamentosas o stas estuvieran en una proporcin muy baja se
formaran flculos llamados flculos en punta de alfiler, los cuales son de pequeo tamao y de
consistencia muy dbil con lo que el sistema de aireacin los disgregara, adems la
sedimentacin no se producira correctamente con lo que se originara un sobrenadante turbio
con muchos slidos en suspensin. En cambio, si hubiera un crecimiento excesivo de
microorganismos filamentosos se producira un aumento de volumen de los slidos
sedimentados por compactacin defectuosa denominado bulking (Bitton, 1999). Si por el
contrario se produce un crecimiento excesivo de actinomicetos nocardioformes que contienen
cidos miclicos (mycolata) se produce la formacin de espumas biolgicas, fenmeno conocido
como foaming (Seviour y Blackall, 1998).
2.- Problemas en sistemas de fangos activos
2.1.- Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking
Este fenmeno se produce por el crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos
no mycolata en el lquido de mezcla. Su presencia provoca que los flculos biolgicos del reactor
sean voluminosos y poco consistentes. Estos flculos no sedimentan bien y suelen ser
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INTRODUCCIN
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arrastrados en grandes cantidades en el efluente de los tanques de sedimentacin con el
consiguiente problema que comporta (Chi Nam Seong et al., 1999).
2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming
Se produce cuando hay un crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos que
contienen cidos miclicos y a Microthrix parvicella(Goodfellow et al., 1996). Aunque pueden
existir otros tipos de espumas producidas por tensioactivos de lenta degradacin (Jenkins et al.,
1993) las espumas producidas por mycolata son espesas, viscosas y muy estables. De todos los
microorganismos que pueden producir el foaming los mycolata son los ms problemticos ya que
las espumas que originan son de gran consistencia y su eliminacin es difcil sin que se altere la
calidad del efluente.
La primera vez que se describi la formacin de estas espumas fue en el ao 1969. En
el mismo se realiz un estudio en donde se describe el llamado misterio de Milwaukee, por ser
sta la localidad en donde se observaron por primera vez estas espumas que contenan gran
cantidad de actinomicetos ramificados Gram-positivos. Estas bacterias fueron posteriormente
identificadas como pertenecientes al gnero Nocardia, concretamente N. amarae y N.
rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas espumas se les empez a
conocer como Nocardia foams (Jenkins et al., 1993). Posteriormente esta especie fue
transferida al gnero Gordonia como G. amarae (Klate, 1994). Sin embargo actualmente este
trmino hace referencia al problema de espumas producidas por mycolata, ya que otros
microorganismos tambin pueden causar este problema, entre ellos Rhodococcus, y
Tsukamurella (Nam et al., 2003).
La aparicin de espumas causa una serie de problemas (Seviour y Blackall, 1998):
Las espumas pueden llegar a tener ms de un metro de espesor y, por tanto, desbordarse enlas pasarelas y reas circundantes donde se originan peligrosas zonas resbaladizas.
Se pierden gran cantidad de slidos sedimentables, ya que las espumas pueden retener msdel 40% de los slidos en suspensin.
Son las responsables de la disminucin de oxgeno transferido a la superficie de los tanquesaireados mecnicamente.
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Los sistemas de eliminacin de espumas pueden verse bloqueados y stas pueden entrar enalgunos casos en el tanque de sedimentacin, reduciendo as la calidad del efluente.
La espuma puede congelarse en climas fros o pudrirse en climas clidos.La espuma puede introducirse en los digestores anaerobios y ocasionar tambin problemas defoaming.
Los aerosoles de los organismos formadores de espumas constituyen un peligro potencial parala salud (Goodfellow et al., 1998). Algunos organismos hallados en las espumas son
patgenos oportunistas, tales comoNocardia asteroides y Rhodococcus equi(Prescott, 1991).
2.2.1.- Microorganismos productores de espumas
Antes de los 80s, los nicos microorganismos reconocidos como formadores deespumas eran los actinomicetos nocardioformes aunque actualmente se conocen otros tipos de
microorganismos filamentosos productores de espumas como Microthrix parvicella(Blackall et
al., 1994; Blackall et al., 1996). Los mycolata son la causa ms importante de foaming en
Australia, Sudfrica, Los Pases Bajos o Francia. En EE.UU., Nocardia (Gordonia) es la bacteria
filamentosa cuya presencia es ms comn en fangos activos y la mayora de espumas biolgicas
estn producidas por este gnero, sin embargo, estudios recientes en otros pases indican que la
situacin es ms compleja (Jenkins et al., 2003). En Espaa, este problema esta poco estudiado
ya que no existen estudios detallados que muestren la diversidad de los productores de
espumas.
Los microorganismos dominantes identificados por microscopa en espumas de fangos
activos son:
Gordonia amarae (GALO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, al gneroGordonia. Fue transferida desde el gnero Nocardia a este gnero (Klate, 1994) por sus
propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del 16S rRNA. Desde su primera
descripcin como N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en
gran cantidad de plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los
mycolata ms frecuentes implicados en problemas de espumas biolgicas.
Nocardia sp. (NALO / GALO): perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de sta, algnero Nocardia. Debido a que durante 20 aos el principal productor de espumas biolgicas
era conocido como N. amarae y debido a su similitud morfolgica todava existe la tendencia
de llamar a estas bacterias NALO (Nocardia amarae-Like Organism).Su abundancia provoca
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disgregacin flocular y presentan una cubierta crea que forma una suspensin en medio
lquido, ya que atrapan burbujas de aire, que causa la aparicin de espumas densas en el
sobrenadante clarificado. Su abundancia est asociada a bajas cargas msicas, alta edad del
fango y altas temperaturas.
Skermania piniformis (PTLO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, algnero Skermania. Es la nica especie con morfologa lo suficientemente caracterstica como
para identificarla correctamente. Originariamente se llamaba PTLO (Pine Tree Like
Organism) porque sus ramificaciones se asemejan a las hojas de un pino (Eales et al., 2003 y
Ramrez et al., 2005).
Rhodococcus: perteneciente a la familia Nocardiaceae. Cocos Gram-positivos que producenespumas no filamentosas en diversas plantas de fangos activados australianas.
Microthrix parvicella: es muy frecuente en plantas de Europa, Australia y Sudfrica, peromenos frecuente de EE.UU. Su ubicacin taxonmica no est clara todava aunque su
secuencia de 16S rDNA indica un parentesco con los actinomicetos (Blackall et al., 1994).
Aunque los principales actinomicetos formadores de espumas como Gordonia amarae y
S. piniformis no son conocidos como patgenos otros, como N. asteroides, R. equi y T.
paurometabolum, pueden causar enfermedades, particularmente en pacientes que usan
medicacin inmunodepresiva o infectados por el virus VIH (Castelli et al., 1994). Las
micobacterias, tambin detectadas en fangos activos aunque no causantes de espumas, pueden
representar un serio peligro potencial para la salud (Dailloux et al., 1999). Adems, el personal
de la planta se encuentra expuesto a los aerosoles producidos por los nocardioformes que son
potencialmente patgenos y cuya ruta de infeccin es probablemente la inhalacin (Goodfellow,
1992).
2.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas
La formacin de una espuma biolgica estable y viscosa en los tanques de aireacin en
las plantas de tratamiento de aguas residuales implica el enriquecimiento selectivo de los
organismos en el licor de mezcla mediante un proceso de flotacin (Seviour y Blackall, 1998) y
resulta de la combinacin de elementos relacionados con la flotacin de los microorganismos y
mecanismos para estabilizar la espuma producida.
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Para que se originen estas espumas biolgicas es necesaria la presencia conjunta de
burbujas de aire, partculas hidrofbicas. Estos componentes estn presentes en la mayora de
plantas de fangos activos con problemas de espumas. Las burbujas de aire son producidas por
el sistema de aireacin y retenidas por la matriz de bacterias filamentosas. Las partculas
hidrofbicas ms importantes en espumas biolgicas son los cidos miclicos contenidos en la
pared celular de los mycolata.
2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de
espumas
Requisitos nutricionales: diversos estudios taxonmicos han demostrado que losmycolata son capaces de utilizar un amplio rango de sustratos que va desde los azcares
simples hasta componentes orgnicos complejos, lpidos complejos, esteroides, fenoles (Klatte
et al., 1994). Los gneros Rhodococcus y Gordonia, son extremadamente verstiles en su
capacidad para degradar sustratos complejos derivados de hidrocarburos (Kmpferet al., 1995).
Requisitos de oxgeno: los mycolata son aerobios estrictos y por ello no crecen si eloxgeno no se encuentra presente (Goodfellow, 1992). Esto no significa necesariamente que
algunos mycolata no sean capaces de metabolizar bajo condiciones anaerobias, como ciertas
especies de Rhodococcus que pueden metabolizar anaerbicamente clorofenoles (Uotila et al.,
1992).
Temperatura: en climas clidos es ms probable la aparicin de mycolata formadoresde espumas (Eikelboom, 1994). Los mycolata crecen en un amplio rango de temperaturas.
Algunos, principalmente Rhodococcus, crecen a temperaturas de 5 C, mientras que la
temperatura mnima de crecimiento para G. amarae es de 15 C o superiores. La temperaturaptima de estos microorganismos es de 25 C, mientras que las temperaturas mximas de
crecimiento son, al igual que las mnimas, muy variadas, algunos no pueden crecer con
temperaturas de 30 C o superiores y, sin embargo, otros lo hacen a ms de 40 C.
pH: el pH en el licor de mezcla influye de forma importante en el crecimiento de losfilamentos. Se ha determinado que los niveles de pH recomendados para el desarrollo de los
mycolata se encuentran entre 6 y 8, aunque dejan de crecer a pH superior a 8. Especies de
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Rhodococcus,Gordonia y Tsukamurella crecen a pH alcalinos superiores a 9 (Goodfellow et al.,
1991).
2.2.4.- Control del foaming
La formacin de espumas en los sistemas de fangos activos tiene lugar en muchas
plantas de tratamiento, las cuales difieren unas de otras en sus parmetros operacionales. La
temperatura, los mtodos de aireacin, la edad del fango, el nivel de slidos, etc. pueden
determinar qu microorganismos crecen particularmente en una planta, y resulta pues difcil
determinar los factores especficos que favorezcan el crecimiento de las grandes cantidades de
organismos formadores de espumas. Las medidas comnmente empleadas son:
Manipulacin de la edad del fango: debido a que los actinomicetos son consideradosmicroorganismos de lento crecimiento, una reduccin en la edad del fango eliminara al
organismo del sistema. Sin embargo, sta no resulta ser una medida totalmente efectiva ya que
los organismos nocardioformes difieren en la velocidad de crecimiento. Aunque esta medida
controle el problema en situaciones adversas, la calidad del efluente se ve afectada (Seviour y
Blackall, 1998).
Cloracin: la cloracin es normalmente utilizada como un mtodo de control noespecfico para los problemas de bulking y tambin se emplea en el control de espumas, aunque
hoy en da se cree que perjudica a los flculos que contienen los mycolata. Un uso ms efectivo
de la cloracin en el control de espumas originadas por Gordonia reside en su aplicacin en
spray directamente sobre la espuma en el tanque de aireacin (Jenkins et al., 1993).
Uso de selectores: se basa en la manipulacin del crecimiento del filamento a travs deuna zona de seleccin previa al tanque de aireacin. En esta zona se crea un ambiente
anaerbico donde los aireadores dejan de funcionar durante determinados periodos de tiempo,
favorecindose as el crecimiento de bacterias formadoras de flculos a expensas de los
mycolata (Seviour y Blackall, 1998).
Eliminacin fsica: existen varias tcnicas de eliminacin fsica utilizadas para controlarel foaming que incluyen desde la eliminacin mecnica de la capa superficial del licor de mezcla(Pagilla et al., 1996).
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3.- Actinomicetos
Los actinomicetos forman un grupo de microorganismos morfolgicamente muy
heterogneo, pertenecientes al dominio Bacteria, formado por bacterias generalmente aerobias,Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Muchos de ellos forman filamentos ramificados o
hifas y esporas asexuales. Su diversidad morfolgica es considerable, desde formas bacilares
hasta formas filamentosas ramificadas. Dos de las propiedades ms significativas de los
actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos que no pueden
ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar
numerosos metabolitos bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable
del metabolismo celular de este grupo microbiano (Goodfellow et al., 1997).
El inters por los actinomicetos comenz a raz del descubrimiento de la capacidad de
estos microorganismos para producir antibiticos. Aunque la bsqueda de compuestos
bioactivos sigue en auge, el inters por los actinomicetos se ha diversificado y actualmente
ocupa reas muy variadas. Pueden ser patgenos de plantas, de animales, de humanos,
descomponer productos del caucho, crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones
depuradoras de aguas residuales causan espumas densas que llegan a obstruir las
instalaciones. Por la diversidad de hbitats que pueden colonizar este grupo de microorganismos
tiene un enorme inters ecolgico (June et al., 1999).
3.1.- Taxonoma
La taxonoma de los actinomicetos ha evolucionado considerablemente durante las
ltimas dcadas al mismo tiempo que se ha incrementado el nmero de gneros. Los
actinomicetos nocardioformes aparecen descritos por H. A. Lechevalier en la Seccin 26 de la 1
edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Williams et al., 1989). En esta edicin
se describen once gneros de nocardioformes de los cuales slo Nocardia y Rhodococcus
contienen cidos miclicos. En la 9 edicin del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology
(Holt et al., 1994) los actinomicetos nocardioformes estn incluidos en el Grupo 22, el cul est
dividido en 4 subgrupos. El subgrupo 1 rene los actinomicetos que contienen cidos miclicos
(mycolata).
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3.2.- Clasificacin actual
Desde hace algn tiempo se ha observado que las secciones del Volumen 4 del
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology de 1989 no son homogneas y que no coincidencon los datos de la secuencia del 16S rRNA. Con el fin de corregir este problema se realiz una
propuesta para una nueva clasificacin jerrquica basada en el estudio filogentico de las
secuencias del 16S rRNA. En 1997 se propone la clase Actinobacteria (Stackebrandt et al.,
1997) compuesta por los actinomicetos y sus parientes filogenticos con un alto contenido en
G+C. Contiene cinco subclases de las cuales la ms extensa es Actinobacteridae, compuesta a
su vez por dos rdenes; Actinomycetales y Bifidobacteriales. Los gneros incluidos en estetrabajo estn en el orden de Actinomycetales , que se divide en 10 subrdenes. El suborden
Corynebacterineae engloba a 8 familias, de las que parte estudiaremos en el presente trabajo,
conteniendo todos ellos cidos miclicos (tabla 1).
Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuenciasde DNA y RNA ribosmico 16S.(Stackebrandt et al., 1997, Kmpferet al., 1999, Stach et al.,
2004, Butleret al., 2005, Soddell et al., 2006)
Suborden Familia Gnero
Corynebacteriaceae Corynebacterium
Dietziaceae Dietzia
Gordonia
Gordoniaceae Millisia
Skermania
Corynebacterineae Mycobacteriaceae Mycobacterium
Nocardiaceae Nocardia
Rhodococcus
Segniliparaceae Segniliparus
Tsukamurellaceae Tsukamurella
Williamsiaceae Williamsia
La segunda edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology(Boone et al., 2001)
recoge la clasificacin actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum.
Dentro del phylum se reconoce una nica clase, Actinobacteria, que mantiene la estructura
jerrquica propuesta por Stackebrandt et al., (1997).
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3.3.- Suborden Corynebacterineae
Este suborden se compone de 8 familias: Corynebacteriaceae, Dietziaceae,
Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Segniliparaceae, Tsukamurellaceae yWilliamsiaceae (Euzby, J. P.).
3.3.1.- Familia Corynebacterineae
Es la familia tipo del suborden Corynebacterineae. Contiene un nico gnero,
Corynebacterium (Stackebrandt et al., 1997).Corynebacterium est incluido en el grupo 20 del
Bergeys Manual of Determinative Bacteriology(Holt et al., 1994).
El gnero Corynebacterium contiene bacilos rectos o levemente curvados, aerobios y
anaerobios facultativos, catalasa positivos, a menudo de extremos afilados. Se suelen observar
formas en maza. Las corinobacterias poseen un quimiotipo de pared celular tipo IV (cido meso-
diaminopimlico, arabinosa y galactosa). Contienen cidos miclicos de 22-36 tomos de
carbono (Collins y Cummins, 1986).
3.3.2.- Familia Dietziaceae
Solamente posee un nico gnero, Dietzia. Este gnero apareci como resultado de la
reclasificacin de Rhodococcus maris a Dietzia maris basndose en la secuencia del 16S rRNA
(Rainey et al., 1995). El gnero Dietzia est constituido por cocobacilos, Gram-positivos, catalasa
positivos, aerobios y no formadores de esporas. La pared celular contiene cido meso-
diaminopimlico y los azcares que predominan son la galactosa y la arabinosa (quimiotipo de
pared celular IV). Contiene cidos miclicos de 34-38 tomos de carbono. Su contenido en G+C
expresado en mol% es del 73% (Rainey et al., 1995). Actualmente se conocen seis especies
vlidas descritas de este gnero (Euzby, J. P.).
3.3.3.- Familia Gordoniaceae
En la publicacin de Stackebrandt et al. (1997) esta familia contena un nico gnero,
Gordonia, ubicado en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del
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Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). En la edicin del Bergeys
Taxonomic Outline de 2002 esta familia incluye el gnero Skermania y el gnero Millisia.
3.3.3.1.- Gnero Gordonia
Originariamente, este gnero fue propuesto por Tsukamura en 1971 para algunos
actinomicetos dbilmente cido-alcohol resistente aislados del suelo y de esputos de pacientes
con enfermedades pulmonares. Las tres especies originales G. bronchialis, G. rubropertincta y
G. terrae fueron trasferidas en 1977 por Goodfellow y Alderson al gnero Rhodococcus
desapareciendo como tal el gnero Gordonia. Posteriormente, el descubrimiento de que en el
gnero Rhodococcus existan dos grupos filogenticamente distintos segn el anlisis de la
secuencia del 16S rRNA condujo a Stackebrandt et al. (1988) a recuperar el gnero Gordonia.
Actualmente existen 25 especies de Gordonia vlidamente descritas y al menos dos en
proceso de clasificacin (Euzby, J. P.). Gordonia amarae fue transferida desde el gnero
Nocardia a este gnero en base a sus propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del
16S rRNA (Klate et al., 1994, Goodfelllow et al., 1994). Desde su primera descripcin como N.
amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en gran cantidad de
plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata ms
frecuentemente implicados en problemas de espumas biolgicas(Iwahori et al., 2001).
El gnero incluye pequeos bacilos y formas cocceas, pueden formar hifas con
ramificaciones en ngulo recto, son aerobios, Gram-positivos o Gram-variable, catalasa positivos
y normalmente parcialmente cido-alcohol resistentes. Forman colonias marronceas, rosas,
naranjas o rojas cuyas clulas se encuentran en algunos casos formando agregados. La pared
celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son galactosa yarabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 48-66 tomos de carbono
(Arenskteret al., 2004).
El gnero Gordonia ha sido considerado como patgeno oportunista aislado de esputos
de pacientes con afecciones pulmonares como G. sputiy G. bronchialis (Tsukamura, 1982). La
etimologa del gnero fue corregida por Stackebrandt en 1997 quedando como Gordonia y no
Gordona (Stackebrandt et al., 1997).
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3.3.3.2.- Gnero Millisia
Este gnero fue propuesto por Soddell et al. en 2006 y fue aislado de espumas
procedentes de plantas de fangos activados. Actualmente la nica especie de este gnero es,
Millisia brevis. Est constituido por bacilos con ramificaciones en ngulo recto, aerobios, Gram-
positivos o Gram-variables, cido-alcohol resistentes, catalasa positivos y con grnulos de
polifosfato. Forman colonias rosceo-asalmonadas, irregulares y con escasos filamentos. La
pared celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son
galactosa y arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 44-52 tomos
de carbono. Su contenido en G+C expresado en mol% es del 64,7%
3.3.3.3.- Gnero Skermania
Nocardia pinensis fue propuesta como una de las principales especies de actinomicetos
que ocasionan espumas en las superficies de los tanques de aireacin de las plantas de
tratamiento de aguas residuales de Australia (Blackall et al., 1989). La secuencia completa del
16S rDNA y la estructura de los cidos miclicos representativos de los mycolata ha sido
determinante para clarificar la posicin taxonmica de esta especie, ya que pone de manifiesto el
error al clasificarla en el gnero Nocardia, a pesar de estar relacionada filogenticamente con las
distintas familias que integran la clase Actinobacteria. En base al estudio realizado por Chun et
al. (1997), Nocardia pinensis fue reclasificada como un gnero nuevo dentro de la familia
Nocardiaceae, renombrndose como Skermania piniformis,la nica especie del gnero.
El gnero Skermania lo componen bacterias filamentosas Gram-positivas, no cido-
alcohol resistentes con un metabolismo oxidativo y catalasa, oxidasa y ureasa positivos. Los
componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Elnmero de tomos de carbono de sus cidos miclicos oscila entre 58 y 64, y su DNA tiene un
porcentaje muy alto en G+C (Chun et al., 1997).
3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae
Contiene solamente el gnero Mycobacterium del cual se han contabilizado 95 especies
en la edicin del Bergeys Taxonomic Outline de 2002. Mycobacterium est compuesto porbacilos ligeramente curvos o rectos, que a veces se ramifican o forman filamentos que se
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3.3.5.1.- Gnero Nocardia
La primera Nocardia fue aislada en 1888 por el veterinario y bacterilogo francs
Edmond Nocard y fue caracterizada un ao despus por Trevisan, el cual le dio el nombre de
Nocardia farcinica.Desde la transferencia de N. amarae al gnero Gordonia como G. amarae
(Goodfellow et al., 1994) y de N. pinensis al gnero Skermania como S. piniformis (Chun et al.,
1997)el gnero Nocardia ha quedado como un taxn homogneo. El gnero Nocardia contiene
71 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Se ha demostrado que una de estas
especies, N. farcinica, es una de las responsables de formacin de espumas en plantas de
fangos activos (Stratton et al., 1996).
Son aerobios, catalasa positivos, parcialmente cido-alcohol resistentes, Gram-positivas
o Gram-variables. Forman un micelio areo, aunque nicamente visible al microscopio, que se
eleva por encima del agar, donde ocasionalmente se pueden encontrar conidios. Las hifas del
micelio del sustrato adquieren unas dimensiones de 0.5-1,2 m de dimetro y la principal
caracterstica morfolgica de este gnero es la tendencia a fragmentarse con facilidad en bacilos
y elementos cocoides. Las hifas forman ramificaciones caractersticas en ngulo recto. Las
colonias tienen un aspecto aterciopelado o calcreo y pueden ser marrones, rosas, rojas,
naranjas, prpuras, grises o blancas y, adems, pueden producir pigmentos solubles de color
marrn o amarillo. Los componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP,
arabinosa y galactosa. Contienen cidos miclicos de 44-60 tomos de carbono y su contenido
en G+C expresado en mol% es del 64-72%.
3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus
El gnero Rhodococcus abarca actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasapositivos y parcialmente cido-alcohol resistentes en alguno de sus estados de crecimiento. Son
coco-bacilos que pueden formar micelio de sustrato que da lugar a la aparicin de extensas
hifas, mientras que tan slo en algunas especies es caracterstico un micelio areo visible al
microscopio. Las colonias de Rhodococcus pueden ser aterciopeladas, rugosas o mucosas, de
color rojo, naranja, amarillo o crema. Los componentes mayoritarios del peptidoglicano de la
pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Contiene cidos miclicos de 32-66
tomos de carbono y su contenido en G+C expresado en mol% es del 73%.
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El hbitat de Rhodococcus es muy amplio y frecuentemente es aislado de suelos,
medios acuticos y excrementos de animales herbvoros. Existen 29 especies de Rhodococcus
vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Algunas especies como R. equi son patgenos para
hombres y animales. Otras especies tienen inters medioambiental ya que son capaces de
degradar herbicidas y otros compuestos (Finnerty, 1992, Briglia et al., 1996).
3.3.6.- Familia Segniliparaceae
Esta familia est integrada por un nico gnero, Segniliparus y actualmente contiene
nicamente do especies validadas, Segniliparus rotundus y Segniliparus rugosus.
Estas bacterias estn caracterizadas por tener forma bacilar. Producen colonias no
pigmentadas (de blancas a beiges), lisas o arrugadas. Su contenido en G+C se encuentra
comprendido entre un 68 y un 72 mol%. La pared celular contiene cido meso-DAP y cidos
miclicos (Butleret al., 2005).
3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae
Aparece en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del
Bergeys Manual of Determinative Bacteriology de 1994. Est integrada por un nico gnero,
Tsukamurella, el cul fue introducido en 1988 para acomodar dos organismos previamente
clasificados como Corynebacterium paurometabolum y Rhodococcus auranticus y reducirlos a
una sola especie T. paurometabola mediante el anlisis de la secuencia del 16S rRNA (Collins et
al., 1988). Actualmente el gnero contiene 8 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.).
El gnero incluye actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa positivos, dbilmentecido-alcohol resistentes y de forma bacilar, que pueden observarse solos, en parejas o en
masa. Tambin pueden aparecer elementos cocobacilares. Forman colonias convexas que son
secas pero ligeramente emulsificables y cuyos colores van desde el blanco o crema hasta el
naranja. El componente mayoritario del peptidoglucano es el cido meso-DAP, galactosa y
arabinosa. La envoltura celular posee cidos miclicos de 62-78 tomos de carbono y su
contenido en G+C expresado en mol% es del 68%. Han sido aisladas mayoritariamente del suelo
y de esputos humanos. La especie T. spumae ha sido aislada en espumas de fangos activos(Nam et al., 2003) al igual que la especie T. pseudospumae (Nam et al., 2004).
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3.3.8.- FamiliaWilliamsiaceae
Esta nueva familia se describi en 1999 con un gnero nuevo, Williamsia, aislado de las
paredes de una guardera en Finlandia. Est formada por un nico gnero y dos especies
Williamsia muralis y W. maris (Stach et al., 2004).Los componentes mayoritarios de la pared
celular son el cido meso-DAP, arabinosa, galactosa, manosa y ribosa. El nmero de tomos de
carbono de sus cidos miclicos oscila entre 50 y 56. La secuencia del 16S rDNA indica que
representa un taxn dentro del suborden Corynebacterineae. Aunque las propiedades
morfolgicas y quimiotaxonmicas son parecidas a las del gnero Gordonia, pueden ser
diferenciadas por la secuencia del 16S rRNA y la longitud de las cadenas de cidos miclicos
(Kmpfer et al., 1999). Este taxn es reconocido como familia en la edicin del Bergeys
Taxonomic Outline (2002).
3.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza
Los actinomicetos son microorganismos muy extendidos que se encuentran sobre todos
los sustratos naturales corrientes. Aunque las primeras cepas de actinomicetos fueron aisladas
de fuentes humanas y animales por Cohn en 1875 y Nocard en 1888, respectivamente, el mayor
reservorio de actinomicetos es el suelo, y a partir de aqu estos pueden invadir numerosos
biotopos. Otra ubicacin importante es el medio acutico: medios marinos, aguas dulces y aguas
residuales. (Williams et al., 1989).
3.4.1.- Suelo
Los actinomicetos estn presentes en todo tipo de suelos tanto en las capas ms
superficiales como en horizontes profundos disminuyendo su concentracin con la profundidad.
Suelen ser el segundo grupo de microorganismos ms abundantes en el suelo, despus de las
bacterias no actinomicetos. Los actinomicetos comienzan su actividad cuando las bacterias y los
hongos no pueden descomponer las molculas ms complejas que quedan en el suelo. Utilizan
como fuente de carbono compuestos simples y muy complejos tales como cidos orgnicos,
azcares, polisacridos, lpidos, protenas e hidrocarburos alifticos. Muchos pueden degradar
protenas, lpidos, almidn y quitina.
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Estos microorganismos participan en muchos procesos del suelo, tales como la
descomposicin de los compuestos ms resistentes procedentes de plantas y animales,
formacin de humus, fermentacin del compost, causantes de fitopatologas, infecciones en
animales y humanos y simbiosis con plantas.
3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces
Hay mucha controversia acerca de la poblacin de actinomicetos en medios marinos ya
que mientras unos afirman que las cepas de estos microorganismos slo seran formas terrcolas
adaptadas al medio marino, otros aseveran que son una flora propia de medio acutico. Los
actinomicetos estn bien representados en este medio de donde se pueden aislar fcilmente
cepas de Micromonospora, Actinoplanes y Streptosporangium. Estos estn presentes en
sedimentos fluviales o lacustres donde juegan un papel importante en la descomposicin de los
restos vegetales (Stach et al., 2003).
3.4.3.- Aguas residuales
Los actinomicetos que contienen cidos miclicos son los mximos responsables de la
aparicin del foaming en el proceso de depuracin por fangos activados. Estos microorganismos
generalmente proliferan en los tanques de aireacin pero tambin se pueden encontrar en el
sedimentador.
Como ya hemos visto anteriormente, varios gneros de este grupo han sido observados
en la espuma, tales como Nocardia, Gordonia y Rhodococcus, aunque tambin se han detectado
otros organismos filamentosos como son Microthrix parvicella, Streptomyces spp. y
Micromonospora (de los Reyes et al., 1997). Sin embargo, estudios realizados demuestran que,a pesar de que problema del foaming no est causado por un solo gnero, hay que hacer una
mencin especial al gnero Gordonia ya que se han encontrado gran cantidad de especies en
las espumas de las depuradoras (Goodfellow et al., 1996).
Hay que destacar que las especies ms comnmente encontradas en los fangos activos
son Gordonia amarae y Skermania pinensis, sobretodo en plantas depuradoras de Australia y
Estados Unidos. En Europa, el gnero predominante es el Rhodococcus, sin embargo, Microthrixparvicella es la especie que ms predomina ltimamente en Francia (Bitton, 1999).
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Otras ventajas de este tipo de bacterias sobre otras que puedan crecer en las aguas
residuales son su alta resistencia a la desecacin y a la radiacin ultravioleta adems de su
capacidad para almacenar polifosfatos y poli--hidroxibutrico (Lemmer y Baumann, 1988b). Su
deteccin resulta interesante en cuanto a que ciertos actinomicetos aislados de las espumas de
fangos activados son patgenos oportunistas de humanos y animales, tales como Nocardia
asteroides (nocardiosis humana), Rhodococcus equi(bronconeumona en caballos) y Gordonia
bronchialis (afecciones pulmonares).
El gnero Tsukamurella y, ms concretamente la especie T. paurometabola, es un claro
ejemplo de patgeno oportunista de humanos. Est asociada principalmente a desechos clnicos
y se ha encontrado en fangos activos, de ah su importancia, ya que puede representar un
peligro para la salud pblica debido a la difusin de patgenos mediante aerosoles (Goodfellow
et al., 1998).
La especie Nocardia farcinica tambin es un patgeno oportunista de humanos ya que
puede provocar neumona y infecciones cutneas en personas inmunodepresivas. Adems es
conocida su alta resistencia a la mayora de antibiticos. El problema asociado a esta especie es
que la mayora de las veces su identificacin por tcnicas convencionales es errnea (Stratton
et al., 1996).
4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos
4.1.- Aislamiento y recuento
Para aislar nocardioformes se utiliza la tcnica de dilucin y siembra en medios
selectivos suplementados con antibiticos, como el cido nalidxico que inhibe la flora
acompaante Gram-negativa (Goodfellow et al., 1996). Adems es necesario resaltar que la
morfologa de algunos organismos formadores de espumas puede variar en cultivo puro debido a
las influencias en su ritmo de crecimiento y estado fisiolgico y hay que tener en cuenta tambin
que los nocardioformes no crecen a temperaturas superiores a los 30C. Sin embargo, recientes
avances en biologa molecular estn permitiendo el desarrollo de pruebas ms rpidas y exactas
en la identificacin in situaunque el aislamiento por mtodos clsicos es necesario como primer
peldao en este tipo de investigaciones.
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INTRODUCCIN
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Uno de los inconvenientes de sta tcnica es que la gran cantidad de microbiota
acompaante enmascara el crecimiento de los nocardioformes ms lentos como Skermania
piniformis. Debido a esta limitacin con ste mtodo slo pueden ser aislados los nocardioformes
ms abundantes y de crecimiento ms rpido, siendo inadecuado este mtodo para
nocardioformes de crecimiento lento. Las cepas de Gordonia difcilmente son detectadas por
ste mtodo ya que tardan alrededor de dos semanas en crecer.
4.2.- Identificacin y caracterizacin
4.2.1.- Mtodos clsicos
Para identificar los diversos grupos de actinomicetos se ha utilizan tradicionalmente
criterios fisiolgicos, morfolgicos y quimiotaxonmicos. Los criterios fisiolgicos se limitan al tipo
de metabolismo oxidativo o fermentativo. Los caracteres morfolgicos y quimiotaxonmicos son
los ms importantes. Estos ltimos se han utilizado tanto para distinguir grupos supragenricos
como para distinguir especies (Williams et al., 1989).
4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos
Los caracteres morfolgicos son todava muy utilizados para caracterizar el gnero. Los
principales tratan sobre el modo de septacin de las hifas, la estabilidad o fugacidad, importancia
y disposicin de las hifas del micelio del sustrato o del micelio areo, la presencia de
esporangios o de las diversas formas de los conidios, la presencia de esporas, su nmero, su
movilidad, su disposicin en las hifas y su forma. La observacin microscpica de estos
caracteres debe realizarse alterando lo menos posible las estructuras morfolgicas de las cepas
examinadas. Esto es posible empleando objetivos a gran distancia focal que permiten el estudio
de las colonias desarrolladas sobre medios slidos translcidos. Pero, aunque a veces sea
posible clasificar una cepa en base a criterios morfolgicos completamente evidentes, estos no
son suficientes para establecer una determinacin correcta y es indispensable considerar otros
caracteres (Lechevalieret al., 1980).
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4.2.1.2.- Quimiotaxonoma
El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos ha
mostrado que estos microorganismos se pueden dividir en ocho tipos, de los cuales los ms
importantes son los cuatro primeros. (Tabla 2)
Tabla 2:Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios(Lechevalier y Lechevalier, 1980)
Tipo dePared
Constituyentes mayoritarios Ejemplo de gneros
I L-DAP, glicina Streptomyces
II Meso-DAP, glicina Micromonospora
III Meso-DAP Actinomadura
IV Meso-DAP, arabinosa, galactosa Nocardia, Gordonia, Saccharopolyspora
V Lisina, ornitina Actinomyces
VI Acido asprtico y galactosa Oerskovia
VII DAB, glicina Agromyces
VIII Ornitina Cellulomonas
Los actinomicetos con paredes celulares del tipo I poseen principalmente cido
diaminopimlico de la forma L, mientras que la forma meso de este mismo cido es
caracterstica de los tipos II, III y IV. Por otra parte, la presencia o ausencia de cuatro azcares
arabinosa, galactosa, xilosa y madurosa en los hidrolizados cidos de clulas enteras permite
clasificar los actinomicetos de los tipos II, III o IV que contienen meso-diaminopimlico. Sobre
esta misma base, es posible repartir en dos grupos los actinomicetos con pared celular tipo III
segn la presencia o ausencia de madurosa. (Tabla 3)
Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios conmeso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980)
Tipo de paredConstituyentes
distintivosmayoritarios
Tipoglucdico
celular
Constituyentesglucdicos
caractersticosII Glicina D Xilosa, arabinosa
III NingunoB MadurosaC Ninguno o ramnosa
IV Arabinosa, galactosa A Arabinosa, galactosa
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Los cidos miclicos tienen un inters particular en la definicin de los gneros incluidos
en el suborden Corynebacterineae (Stackebrandt et al. 1997). Estos son nicos y constituyentes
caractersticos de la pared celular de los gneros Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia,
Tsukamurella, Corynebacterium y Mycobacterium, Skermania y Williamsia. Los nicos
actinomicetos que contienen cidos miclicos pertenecen al suborden Corynebacterineae al que
corresponden todos los microorganismos estudiados en el presente trabajo.
El modelo propuesto por Minnikin para la estructura de la cubierta celular los mycolata est
descrito en el trabajo de Sutcliffe (1998). En este modelo, los cidos miclicos pueden llegar al
30% del peso de la pared celular.
4.2.2.- Mtodos genotpicos
4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA
En la actualidad est demostrado que ciertas macromolculas son cronmetros evolutivos,
es decir, medidas del cambio evolutivo. As pues, la distancia evolutiva entre dos organismos
puede determinarse por las diferencias en la secuencia de aminocidos o nucletidos de
macromolculas homlogas aisladas de cada uno de ellos.
Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998)
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Para determinar las verdaderas relaciones evolutivas entre organismos, es esencial elegir
las molculas adecuadas para los estudios de secuenciacin. Esto es importante por varios
motivos. Primero, la molcula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para ser
estudiado. Segundo, deben ser funcionalmente homlogos en cada organismo; las
comparaciones filogenticas deben realizarse con molculas de idntica funcin. Tercero, resulta
crucial poder alinear apropiadamente las dos molculas a fin de identificar regiones tanto con
homologa como con variacin de secuencia. Finalmente, la secuencia de la molcula elegida
debera cambiar con una velocidad proporcional a la distancia filogentica que se va a
determinar. Y, de hecho, cuanto mayor sea la distancia filogentica a determinar, menos ser la
velocidad de cambio de la molcula; demasiado cambio tiende a enturbiar el registro evolutivo.
Se han evaluado muchas molculas como cronmetros evolutivos, y entre ellas, los genes
que codifican los RNAs ribosmicos, componentes clave del sistema de traduccin, son los que
han proporcionado la informacin gentica ms significativa sobre los microorganismos. La
mayor parte de la atencin se ha centrado en las secuencias del rRNA 5S y 16S aislados
respectivamente de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas procariotas. Los rRNA son
prcticamente ideales para los estudios de evolucin y parentesco microbianos, puesto que son
imprescindibles para un orgnulo esencial que se encuentra en todos los microorganismos. Su
papel funcional es el mismo en todos los ribosomas. Adems, su estructura se modifica muy
lentamente en el tiempo, debido probablemente a la funcin esencial y constante que
desempean. Debido a que el rRNA contiene secuencias variables y estables, es posible
comparar tanto microorganismos estrechamente relacionados como de parentesco muy lejano.
Esto constituye una importante ventaja, ya que los microorganismos de parentesco lejano slo
pueden estudiarse utilizando secuencias que sufren pocas modificaciones con el tiempo.
(Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002)
4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR es un proceso de amplificacin enzimtica in vitro del DNA, iniciada por unos
fragmentos cortos de DNA llamados iniciadores o cebadores (primers). Este proceso se lleva a
cabo cclicamente. Cada ciclo est dividido temporalmente en tres fases trmicas:
desnaturalizacin de la doble cadena de DNA, acoplamiento o unin de los iniciadores y
polimerizacin mediante la adicin de dNTPs por la enzima Taq polimerasa. Los productos de laPCR, se detectan por electroforesis en gel de agarosa y se visualizan bajo luz ultravioleta.
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Muchos problemas derivados de la identificacin de microorganismos mediante las
tcnicas tradicionales pueden obviarse mediante la PCR, lo que ha hecho que esta tcnica
suponga una alternativa muy eficaz en microbiologa. Adems, la versatilidad de esta tcnica ha
permitido su aplicacin a otros campos de inters econmico, como la identificacin gentica, la
medicina forense o el control de calidad en las industrias.
Para poder disear los iniciadores es necesario conocer la secuencia del fragmento o
gen de DNA o RNA que se va amplificar. En muchos casos conocer la secuencia completa del
organismo que nos interesa es un proceso caro y difcil, por lo que se recurre a informacin
generada por otros investigadores y almacenada en los numerosos bancos de datos para esta
finalidad (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002).
4.2.3.- Mtodos fenotpicos
Actualmente, para clasificar correctamente un microorganismo se utiliza la taxonoma
polifsica, es decir, utilizar gran cantidad de informacin. Esta informacin se divide en
informacin genotpica e informacin fenotpica. La informacin genotpica comprende todo lo
relacionado con el DNA, el RNA y las protenas. La informacin fenotpica comprende todo lo
que son marcadores quimiotaxonmicos as como la morfologa y fisiologa del microorganismo.
ste tipo de taxonoma intenta asimilar muchos niveles de informacin, desde
moleculares a ecolgicos para as poder clasificar e identificar de una manera ms correcta a los
microorganismos. El estudio del 16S solamente abarca una pequea porcin del genoma de la
bacteria, con lo que estaramos despreciando un alto contenido de informacin. Como datos de
apoyo se utilizan los marcadores quimiotaxonmicos y las pruebas fenotpicas son las que nos
dan una visin ms global del genoma (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2 Ed.,2001).
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OBJETIVOS
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OBJETIVOS
La depuracin de aguas residuales por el sistema de fangos activos es un proceso
biotecnolgico donde intervienen multitud de parmetros operacionales, todos ellos
interrelacionados. Tradicionalmente se han controlado los parmetros fsico-qumicos como si de
un sistema inerte se tratara aunque actualmente se conoce el papel crucial que realizan los
microorganismos.
Segn se ha explicado en la introduccin, el crecimiento indeseado de actinomicetos
productores de cidos miclicos (mycolata) puede interferir seriamente en el funcionamiento
correcto del sistema de fangos activados. En muchas plantas de tratamiento europeas,
australianas y americanas se han estudiado con detalle estos microorganismos; sin embargo en
las plantas de tratamiento espaolas se est empezando a estudiar desde hace escasos aos.
Por ello es importante conocer la diversidad de especies que nos encontramos en las
plantas de tratamiento potencialmente productoras de espumas. Por lo tanto, en el presente
trabajo nos planteamos utilizar la taxonoma polifsica para estudiar la biodiversidad de los
microorganismos productores de espumas. Los objetivos parciales son:
1.- Caracterizacin morfolgica de los aislados obtenidos de muestras de espumas biolgicas
provenientes de plantas depuradoras. Seleccin de los aislados ms representativos.
2.- Caracterizacin quimiotaxonmica de las cepas mediante la extraccin y anlisis de cidos
miclicos, la determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) y la extraccin y
anlisis de los azcares predominantes de la pared celular.
3.- Caracterizacin fenotpica de las cepas mediante la realizacin de una serie de tests
fenotpicos.
4.- Identificacin a nivel de especie mediante anlisis de la secuencia del 16S rRNA por medio
de la realizacin de rboles filogenticos para establecer las relaciones evolutivas entre los
aislados y anlisis de las matrices de similaridad de nucletidos.
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MATERIAL Y MTODOS
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1.- Cepas bacterianas de referencia
En el presente trabajo se han utilizado un total de 22 cepas de referencia suministradas
por la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Esta coleccin de cepas contiene especiespertenecientes a todas las familias del suborden Corynebacterineae. Entre las cepas del gnero
Gordonia se encuentra la especie G. amarae que es la especie aislada con ms frecuencia en
muestras de espumas. De los gneros Nocardia y Rhodococcus se incluyen las especies
patgenas N. asteroides y R. equi. En la tabla 4 se muestra la relacin de cepas de referencia
utilizadas.
Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizadosCepa Nmero de la coleccin
Corynebacterium xerosis CECT 4160
Dietzia maris CECT 4617
Gordonia amarae CECT 5704
Gordonia rubropertincta CECT 5393
Gordonia terrae CECT 5707
Gordonia nitida CECT 7017
Gordonia hirsuta CECT 7018
Gordonia hydrophobica CECT 7021
Mycobacterium phlei CECT 3009
Nocardia asteroides CECT 3051
Nocardia brasiliensis CECT 3052
Nocardia carnea CECT 3374
Nocardia farcinica CECT 3053
Nocardia nova CECT 3056
Nocardia soli CECT 3375
Rhodococcus coprophilus CECT 5751
Rhodococcus equi CECT 555
Rhodococcus erythropolis CECT 3013
Rhodococcus rhodnii CECT 5750
Rhodococcus rhodochrous CECT 5749
Skermania piniformis CECT 3057
Tsukamurella spumae DSM 44113
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Todas las cepas se incubaron en medio YEME en condiciones de aerobiosis de 5 a 10
das dependiendo de la cepa. En el caso de Skermania piniformis se utiliz el medio 180 segn
recomienda la CECT. Esta especie necesita un tiempo de incubacin de 20-25 das para obtener
colonias visibles.
Todas las cepas se mantuvieron en crioviales con caldo nutritivo con un 20% de glicerol
a 20C. Antes de proceder a su congelacin, as como despus de recuperar una cepa, se
comprob la pureza del cultivo mediante tincin Gram, para comprobar que no ha habido ningn
tipo de contaminacin. El estudio previo de estas cepas de referencia, tanto a nivel macroscpico
como a nivel microscpico, facilit la posterior caracterizacin morfolgica de los aislados
estudiados en este trabajo.
2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos
2.1.- Toma de muestras
La toma de muestras se realiz por el propio personal de la planta. Se tomaron muestras
de espumas del reactor biolgico en recipientes estriles y se enviaron al laboratorio donde seguardaron en refrigeracin a 4 C y se procesaron dentro de las 24 horas siguientes. Todas las
plantas estudiadas realizan el proceso basado en el sistema de fangos activos y realizan la
depuracin de aguas residuales urbanas.
En el presente trabajo se ha realizado una seleccin de aislados que fueran lo ms
representativos posibles seleccionando aquellos que presentaron mayor diversidad morfolgica.
En la tabla 5 se presentan las plantas estudiadas en el presente trabajo. En esta tabla se
muestran todas las muestras de fangos activos que fueron recibidas, as como los aislados que
se obtuvieron a partir de ellas en trabajos anteriores. Se resaltan en negrita los aislados
utilizados en el presente estudio.
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MATERIAL Y MTODOS
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Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS
EDAR FECHA AISLADOS
Alcoy 2004 P54
Algemes 2004 P145, P162Algors 2004 P152, P153, P155, P157, P163Bemsa 2004 P102, P103, P105, P107, P108, P110
Benidorm 2004 P60, P61, P63, P72, P73, P74, P80, P81, P84Camp de Turia 2004 P134, P135, P136,P138
Carcaixent 2004 P132Castelln 2005 N16-9, N22-7, N22-11
Denia 2004 P158, P159, P160Formentera 2005 N4
Mancomunada 2004 P175Mora dEbre 2005 N5
Pinedo 2004 P48a, P48b, P51, P52Quart 2004 P26, P28, P38
Rincn de Len 2004 P39Rojales 2005 N1, N2
Torres Torres 2004 P165, P166, P167, P168, P169, P177Torrevieja 2004 P141Vall dUx 2005 N7, N9-1, N9-3, N20-1Vinalop 2004 P42, P46, P46p
Viver 2005 N17-4, N17-8, N17-11Lloc Nou 2005 L2, L10, E9
2.2.- Caracterizacin morfolgica
Para cada aislado se realiz una observacin macroscpica y una observacin
microscpica. Con esto se comprob que los resultados obtenidos coincidieran con el trabajoprevio realizado. La observacin macroscpica se fundamenta en el aspecto de las colonias
aisladas: dimensin, color, contorno regular o irregular, textura, superficie lisa o rugosa,
opacidad, color reverso, consistenciaetctera. Adems, se efectu la prueba de la catalasa
para comprobar que fueran catalasa positivos.
Para la observacin microscpica se realiz una tincin Gram para comprobar que
tuvieran una morfologa tpicamente nocardioforme.
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La microscopa directa est basada en que determinados grupos de mycolata tienen una
morfologa peculiar que se puede utilizar para identificarlos:
* Morfologa GALO (Gordonia amarae- like-organism). Presenta ramificaciones en ngulo
recto producida por especies de Gordonia y de Nocardia.
* Morfologa PTLO (Pine-Tree-Like-Organism). Presenta ramificaciones en ngulo agudo
para el caso de Skermania.
2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica
Para esta caracterizacin se llevaron a cabo tres pruebas fundamentales:
Extraccin y anlisis de cidos miclicos,
Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico
Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular.
Estos tres marcadores quimiotaxonmicos son lo que mejor definen al grupo de los
mycolata.
2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos
2.3.1.1.- Materiales
Para realizar este anlisis se prepar previamente:
TBAH (hidrxido de tetrabutil amonio) al 5% mediante la dilucin, con agua destilada y
estril, de TBAH al 40%.
cido molibdofosfrico al 5% mediante la dilucin de cido molibdofosfrico al 10% con
etanol absoluto. La solucin adquiere un color verdoso. Es necesario mantener a 4 C.
En el ensayo se emple una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05554).
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2.3.1.2.- Metodologa
La deteccin de cidos miclicos se ha realizado siguiendo el mtodo propuesto por
Hamid et al. (1993). En primer lugar se aadi, en criotubos de 2 ml., 1000 L de TBAH y
aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (< 106 ). Posteriormente, a partir de los cultivos
en ISP-2 de los actinomicetos, se agreg un asa de siembra de cada muestra a cada criotubo y,
tras agitar en vrtex durante 30 segundos como mnimo, se incubaron en termoblock a 100 C
durante 4 horas.
Tras las 4 horas de incubacin, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5
minutos. Seguidamente se transfiri el sobrenadante a un nuevo criotubo, al que se le aadi 1
ml de diclorometano y 25 L de yodometano (todo ello se realiz en la cmara de extraccin de
gases) para, posteriormente homogeneizarlo en un tuborotador a 40 rpm durante 30 minutos.
Pasados estos se centrifug a 2000 rpm durante 3 minutos y se transfiri la capa de abajo a un
nuevo tubo eppendorf. Esos tubos eppendorf se depositaron en el termoblock a una temperatura
constante de 55 C hasta que estuvieron completamente secos y, seguidamente, se
redisolvieron con 75 L de ter de petrleo. Una vez preparadas las muestras se procedi a
aplicar 5 L de cada una de ellas en una placa de celulosa.
Esta placa de celulosa se coloc en una cubeta de vidrio que contena ter de petrleo y
acetona (95:5) y se mantuvo all hasta que el frente estuvo aproximadamente a 1 cm del final de
la placa. A continuacin se dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases,
con cido molibdofosfrico al 5%. Finalmente se incub en estufa a 100 C durante 5-10 minutos
y se procedi a su lectura.
2.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP)
2.3.2.1.- Materiales
Para realizar esta prueba se tuvo que preparar anteriormente:
50 ml de sistema disolvente, aadiendo 33,3 ml de metanol, 11 ml de agua destilada y
esterilizada, 1,6 ml de HCl 6 N y 4,1 ml de piridina. La mezcla se conserv a 4 C en cmarafrigorfica hasta su utilizacin.
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dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases, con ninidrina en acetona al
0,2%. A continuacin, se incub en estufa a 100C durante 5-10 minutos y se procedi a su
lectura.
2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular
2.3.3.1.- Materiales
Para realizar esta prueba se prepar anteriormente:
Reactivo de eftalato de anilina: se prepar con 3,25 g de cido eftlico, que se aadieron
a 100 ml de agua saturada en butanol y 2ml de anilina. Se mantuvo a 4 C en cmara frigorfica
hasta su utilizacin.
Agua saturada en butanol: se aadieron agua y n-butanol en una proporcin de 1:1.
Azcar estndar en piridina al 1% (en nuestro caso arabinosa y galactosa).
En el ensayo se utiliz una placa de celulosa TLC de 10x20 cm (Merck 1.05552).
2.3.3.2.- Metodologa
El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos tiene
una importancia taxonmica considerable. Es por ello por lo que consideramos que esta prueba
es fundamental. Para llevarla a cabo se utiliz el protocolo propuesto por Hasegawa et al., 1983.
En primer lugar se aadieron 0,1 ml de HCl 0,25 N a cada criotubo. Posteriormente, y a
partir de los cultivos puros de cada cepa, se aadi media asa de siembra a cada criotubo y seautoclavaron durante 15 minutos a 121 C.
Despus de dejar enfriar a temperatura ambiente se aadieron, a la placa de celulosa
TLC, 1 L de la preparacin estndar de los azcares (arabinosa y galactosa) y 3 L de cada
muestra.
Hecho esto, la placa se introdujo en una cubeta de vidrio conteniendo 10 n-butanol : 6H2O : 6 piridina: 1 tolueno y se dej desarrollar hasta que el frente estuvo a 1 cm del final de la
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placa. Posteriormente se dej secar fuera de la cubeta y se meti de nuevo en la cubeta durante
2 horas aproximadamente.
Una vez transcurridas esas 2 horas se dej secar la placa fuera de la cubeta y se roci, en
la cmara extractora de gases, con el reactivo de eftalato de anilina. A continuacin se incub en
estufa a 100 C durante 4 minutos.
2.4.- Caracterizacin genotpica
Para ello, partiendo de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedi a la
extraccin del DNA siguiendo el protocolo del CTAB (Bromuro de Cetil-trimetil-amonio). Adems
tambin se utiliz un kit de extraccin de DNA (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante,
que asegura un contenido ms puro aunque una menor cantidad. El DNA extrado de las
muestras fue amplificado mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) utilizando los
iniciadores especficos 27f (5AGAGTTTGATCMTGGCTCAG, siendo M = C,A) y 1492r
(5TACGGYTACCTTGTTACGACTT, siendo Y = C,T) (Lane, 1991). Finalmente, los productos
obtenidos de la PCR se purificaron y secuenciaron, para posteriormente analizar la secuencia e
identificar cada cepa a nivel de especie.
2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB.
Los actinomicetos forman agrupaciones de hifas fuertemente unidas que es necesario
disgregar para conseguir rendimientos adecuados en la extraccin de DNA. Adems, muchas
especies crecen adheridas al agar debido al micelio de sustrato que producen.
En primer lugar se aadi 500 L de tampn TE (Tris-ClH 10 mM, EDTA 1mM) a cada
tubo eppendorf, a los que previamente se haban aadido perlas de vidrio (< 106 ).
Posteriormente se lisaron las clulas aadiendo 100 L de lisozima (50 mg/mL) y se incubaron
durante 1 hora a 37 C en un termoblock agitando cada 5-10 minutos en vrtex para deshacer
agregados y facilitar la accin de la lisozima. A continuacin se aadieron 30 L de dodecil
sulfato sdico (SDS) al 10% y 3 L de proteinasa K (20 mg/mL). Los tubos eppendorf se agitaron
y se incubaron nuevamente, esta vez durante 30 minutos a 37 C.
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Pasado este tiempo, se aadieron 100 L de NaCl 5 M y 80 L de una solucin de
CTAB/NaCl (CTAB 10% en NaCl 0,7 M), se agitaron las muestras en vrtex y se incubaron a
65C durante 10 minutos.
La purificacin del DNA se realiz aadiendo un volumen de 700 L de
fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1), agitando y centrifugando a 12000 rpm durante 5
minutos para eliminar los complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfiri a un
nuevo tubo eppendorf y se aadi un volumen de 700 L de cloroformo/alcohol-isoamlico
(24:1). Se agit la mezcla y se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos
de complejos con el CTAB (protenas y polisacridos).
A continuacin, el sobrenadante, que contiene los cidos nuclicos, se transfiri a otro
tubo eppendorf y se adicion el mismo volumen de isopropanol fro para precipitar el DNA. El
DNA precipitado se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar el isopropanol y se
lav el precipitado con 500 L de etanol fro al 70%. Finalmente, se centrifug para eliminar el
etanol, se sec en una secadora de vaco durante 15 minutos y se resuspendi en 50 L de
tampn TE. Para eliminar los restos de RNA extrado se aadi 1 L de RNAsa (25 mg/mL). Las
muestras se conservaron a 4 C durante 24 horas, tras las cuales, se realiz un gel de
comprobacin de la extraccin.
2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa
Para comprobar la adecuada extraccin del DNA se analizaron las muestras (3 L de cada
una de ellas) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en tampn TAE 1X. Para ello se
aadi 1,2 g de agarosa en 100 ml de TAE 1X, preparado a partir de la adicin de 20 ml de TAE
50X (48,9 g de Tris base, 7,44 g de Na2EDTA 2H2O y 1,42 mL de cido actico glacial a 1000
mL de agua MiliQ, ajustando el pH a 8,5) y 980 ml de agua MiliQ.
Una vez solidificado el gel se procedi a cargarlo con los 3 L de cada muestra, a los que
anteriormente se mezclaron un tampn de carga. Adems se debe disponer en los extremos del
gel un marcador que, en nuestro caso, es de 100 pb. Una vez cargado el gel, se le somete a un
voltaje de 90 V durante 45 minutos. Los fragmentos de DNA se visualizaron con un
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transiluminador de UV tras teirlos con bromuro de etidio. Finalmente, las muestras se
conservaron a -20 C hasta su utilizacin.
2.4.3.- Amplificacin por PCR
La amplificacin del 16S rDNA se realiz mediante PCR, utilizando los iniciadores 27f y
1492r (Lane, 1991). La reaccin se realiz en un volumen total de 50 L conteniendo 1,5 M de
MgCl2, 0,2 mM de dNTPs (mezcla equimolar de los cuatro nucletidos), 0,4 M de cada iniciador,
1,25 U del enzima Taq polimerasa (Ecogen) con su correspondiente tampn y 3 L de DNA. En
cada reaccin de amplificacin se incluy un control negativo en el que el DNA se reemplaz por
agua estril.
A continuacin, se realiz la reaccin de amplificacin que comienza con una fase inicial
de desnaturalizacin (95 C durante 5 minutos), seguida de 35 ciclos compuestos por la
desnaturalizacin (95 C durante 1 minuto), la unin de iniciadores (54 C durante 1 minuto) y la
elongacin (72 C durante 1 minuto). Por ltimo, se produce un ciclo final de extensin (72 C
durante 10 minutos) (Tabla 6).
Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos
1 ciclo 95 C 5 min. Desnaturalizacin
95 C 1 min. Desnaturalizacin
35 ciclos 55 C 1 min. Unin de iniciadores
72 C 1 min. Elongacin
1 ciclo 72 C 10 min. Extensin
El DNA amplificado por la PCR (8 L) se visualiz mediante electroforesis en gel de
agarosa del modo descrito anteriormente.
2.4.4.- Purificacin del DNA
El 16S rDNA obtenido tras la PCR se purific utilizando el kit de purificacin GenElute
(Sigma), siguiendo las indicaciones del fabricante. A continuacin, los productos purificados
(3 L) se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa del modo descrito anteriormente
(punto 2.4.2.).
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2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA
La secuenciacin de los productos obtenidos tras la PCR fue realizada en el Laboratorio
de Secuenciacin de Sistemas Genmicos S.L. Para la realizacin de las reacciones de
secuenciacin se utiliz el kit ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction
(versin 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador
automtico Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer.
La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproximada de 600 a 700
nucletidos, se obtuvo en un archivo de texto electrnico desde el electroferograma mediante la
aplicacin cientfica CHROMAS (versin 1.43). Las secuencias del 16S rDNA fueron
ensambladas manualmente, utilizando el programa informtico PHYDIT, a partir de la
combinacin de fragmentos separados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican
el segmento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucletidos
de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron
eliminados antes de ensamblar la secuencia completa. Las secuencias parcialmente alineadas
se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA.
La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se determin mediante la
herramienta informtica BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a
partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Jones, 2006).
2.4.6.- rboles filogenticos
A partir de las secuencias se obtienen los rboles filogenticos de cada gnero, para as
po