prÁctico de fisiologÍa actividad contrÁctil del Útero ... · de la onda, representa la...
TRANSCRIPT
1
Universidad de la República
Facultad de Medicina
Departamento de Fisiología
Seminarios de Fisiología
Módulo 5- Ciclo básico clínico comunitario
PRÁCTICO DE FISIOLOGÍA
ACTIVIDAD CONTRÁCTIL DEL ÚTERO AISLADO Y SU
REGULACIÓN
OBJETIVOS
Objetivos generales
1) Caracterizar la actividad contráctil del útero in vitro y algunos de los
mecanismos que subyacen a ésta.
2) Determinar in vitro el efecto de algunos mediadores hormonales sobre la
actividad contráctil del útero.
Objetivos específicos
1) Caracterizar la actividad contráctil espontánea del útero in vitro.
2) Evidenciar el papel del calcio en la actividad contráctil uterina.
3) Evidenciar el papel del acoplamiento intercelular en actividad contráctil
uterina.
4) Determinar los efectos de diversos reguladores hormonales de la actividad
contráctil uterina: oxitocina, prostaglandina, adrenalina, determinando en
algunos casos los receptores involucrados y la dosis-dependencia del efecto.
4a) Determinar acción de la Oxitocina en la actividad contráctil del útero y si
ésta es dosis dependiente.
4b) Determinar el efecto del agregado de Prostaglandina (F2) en la
actividad contráctil uterina.
4c) Determinar el efecto del agregado de Adrenalina en la actividad contráctil
uterina.
2
4d) Determinar el efecto del agregado de agonistas -adrenérgicos en la
actividad contráctil uterina.
4e) Determinar el efecto del agregado de agonistas -adrenérgicos en la
actividad contráctil uterina.
MATERIALES
Materiales
1 rata tratada con estradiol (10mg/Kg s.c.) 24 hrs previo al práctico.
Campana de CO2
Material de disección
Plancha de corcho
Jeringa con catéter
Hilo
Agujas
Caja de Petri
Tubos para aireación con carbógeno
Tanque de Carbógeno
Baño de Dale
Anza
Resistencia termostatizada y termómetro
Transductor de tensión
Amplificador mecánico
Conversor análogo/digital (A/D)
PC
Sustancias y soluciones
Solución fisiológica Tyrode [NaCl 113.8mM, KCl 5.4mM, CaCl2 2.0mM, MgCl2
1.0mM, NaHCO3 25.0mM, NaH2PO4 1.2mM, Glucosa 10.0mM].
Estradiol
Mezcla gaseosa con 95% de O2 y 5% de CO2: carbógeno.
Soluciones de Nifedipina, Carbenoxolona, Oxitocina, Prostaglandina F2α,
Metilergonovina, y Fenoterol
MÉTODOS
Modelo experimental
Se utilizará un modelo in vitro, el cual consiste en aislar compontes celulares,
tejidos u órganos del organismo entero. Este tipo de estudio reduccionista permite
eliminar la interacción con otros órganos y sistemas, facilitando el control de las
3
variables a estudiar. Este modelo requiere controlar y mantener variables
fisiológicas como composición electrolítica, osmolaridad, pH, Temperatura, aporte
energético y oxigenación de modo de mantener la viabilidad del preparado.
El preparado a utilizar se trata de un segmento de útero de una rata
previamente (24 horas) tratada con estradiol (10mg/Kg s.c.).
Dispositivo experimental
El dispositivo experimental consta de un Baño de Dale, el cual consiste en
dos cámaras de vidrio concéntricas: una cámara interna y otra externa. Se coloca
una resistencia con termostato en la cámara externa con el objetivo de mantener
el agua contenida en ésta a una temperatura de 37º C y mediante equilibrio
térmico mantener constante la temperatura de la cámara interna donde se ubicará
el preparado. En la cámara interna se coloca una solución fisiológica, denominada
Tyrode, la cual proporcionará los sustratos y nutrientes que se requieren para
mantener la viabilidad del tejido. Esta solución es equilibrada con una mezcla de
gases denominada carbógeno el cual está conformado por un 95% de O2 y un 5%
de CO2. El carbógeno es aportado desde un tanque, a través de un sistema de
tubuladuras y un tubo de vidrio denominado anza. El anza, a la vez es el soporte
físico del preparado. El Tyrode cumple a su vez la función de buffer o solución
amortiguadora por medio del aporte de bicarbonato de sodio (NaHCO3) que junto
con un ácido débil, en nuestro caso el ácido carbónico que proviene del CO2 del
carbógeno, forman el sistema de tamponamiento encargado de ajustar
continuamente el pH.
El sistema de registro y adquisición consta de un transductor de tensión
isométrica Grass modelo FT03. El transductor de tensión es el encargado de
transformar la energía mecánica en energía eléctrica (expresada en milivoltios:
mV). Esta señal es amplificada por medio de un amplificador mecánico, y la señal
(del tipo analógica) es adquirida en la computadora a través de un conversor
Análogo/Digital (VER ANEXOS). La adquisición y procesamiento de la señal se
llevará a cabo mediante los software DasyLab y Spike respectivamente.
4
Figura 1. Representación del dispositivo experimental, sistema de registro y adquisición
Calibración
Para poder cuantificar variaciones en la tensión, se debe realizar la
calibración del sistema. Para esto, se utilizan pesas con un valor pre-establecido
de 1, 2, 3 y 4 gramos. Estas pesas se cuelgan del transductor de tensión y se
observan las variaciones de voltaje (mV) correspondientes a la fuerza o tensión en
gramos ejercida en el transductor por cada pesa. Inmediatamente después, las
pesas son retiradas del transductor una a una.
Con el fin de determinar el correcto funcionamiento del sistema de registro y
adquisición, así como para establecer un rango de amplificación apropiado, es
conveniente realizar la calibración al inicio del práctico. En el caso de que sea
necesario modificar la amplificación durante el transcurso del práctico, la misma
debe repetirse al finalizar el mismo.
La relación entre la tensión ejercida en el transductor y el voltaje deber ser
tabulada y graficada. Como se puede observar en el ejemplo de la Figura 2,
ambas variables se modifican de forma directamente proporcional. La relación
entre ambas variables sigue una relación lineal y puede representarse mediante
una ecuación de la función y=ax+b. En esta ecuación “a” representa la pendiente o
el factor de conversión, “b” (la ordenada en el origen o término independiente) es
igual a cero ya que la recta pasa por el origen. El valor de “a”, el factor de
conversión, nos permitirá expresar y convertir todos los datos obtenidos en la
computadora como unidad de voltaje, a una unidad de tensión: gramos.
5
Figura 2. Calibración
Obtención del preparado
Para la obtención del útero, se procede a realizar la eutanasia de la rata
mediante dislocación cervical luego de anestesiarla por inhalación de CO2.
Para la disección se dispone el animal en una plancha de corcho en posición
decúbito dorsal y se realiza una incisión mediana en la piel abdominal. Se reclinan
las vísceras abdominales y se identifican el útero por su anatomía bicorne y los
ovarios (Figura 3).
Figura 3. Útero bicorne de una rata.
A continuación, se procede a cortar un segmento de uno de los cuerno
uterinos (de aproximadamente 1.5 cm) y el mismo es colocado en una caja de
Petri conteniendo una solución fisiológica fría (-4°C) equilibrada con carbógeno.
Una vez extraído el segmento de útero, su interior es lavado con Tyrode mediante
un catéter conectado a una jeringa. Luego se pasa un hilo perforando la pared del
órgano en cada extremo, evitando cerrar la luz del órgano lo cual podría llevar a
una acumulación de sustancias y secreciones. A continuación, el segmento de
6
útero se introduce en la cámara interna del baño de Dale quedando totalmente
sumergido en el Tyrode. Desde su extremo distal se lo ancla al anza, el cual está
sostenido por un soporte. Luego se suspende el preparado desde su extremo
proximal al transductor de tensión.
Maniobras
Luego de la obtención del registro basal de la actividad contráctil espontánea,
se procederá a realizar las diferentes maniobras. En cada maniobra, la
concentración de cada sustancia en la cámara interna será obtenida a partir de
utilizar la ecuación de dilución, la cual establece que la Ci x Vi = Cf x Vf. Para esto
se debe conocer la concentración de la solución inicial o solución madre (Ci), la
concentración a la cual se quiere llegar o concentración final (Cf) y el volumen final
(Vf), en nuestro caso el volumen de la cámara interna. Así podemos calcular qué
volumen (Vi) debemos tomar de una solución madre, para que una vez colocada
en la cámara interna, alcance la concentración deseada.
Recuerde realizar al menos dos lavados del baño con un nuevo Tyrode luego
de la utilización de cada uno de los fármacos y obtener un registro en las nuevas
condiciones para tomar como referencia (registro control).
Administrar las siguientes sustancias para obtener la concentración final en el
baño indicada en cada caso.
1) Nifedipina: 1.0 x 10-9M.
2) Carbenoxolona: 0.2 x 10-3M.
3) Oxitocina: 6.5 x 10-4 UI/ml.
4) Oxitocina: 1.3 x 10-3 UI/ml.
5) Prostaglandina F2: 1.9 x 10-4 M.
6) Adrenalina: 1.3 x 10-6 M.
7) Metilergonovina: 1.7 x 10-5 M.
8) Fenoterol: 0.007g/ml, 1 x10-6 M.
El orden de las sustancias no se corresponde con el orden de
administración.
RESULTADOS
1) Registro de la actividad contráctil del útero aislado
1A) Registro de la actividad contráctil espontánea basal del útero aislado
De acuerdo al primer objetivo, el dispositivo experimental, permite obtener un
registro de tensión del preparado en función del tiempo.
7
Figura 4. Actividad basal del útero aislado
En condiciones basales, este registro presenta ondas monofásicas, positivas,
de forma irregular y con un ritmo determinado. Estas ondas representan ondas de
contracciones fásicas. También podemos observar que entre cada contracción
fásica el registro de tensión no cae a cero, esta línea de base de la tensión
representa el tono muscular.
El tono consiste en el grado mínimo de desarrollo de tensión muscular que
presenta el preparado; podemos observar que se mantiene relativamente estable
entre contracciones consecutivas. El tono va a estar determinado no sólo por la
tensión desarrollada por el órgano, sino también por la tensión ejercida mediante
el estiramiento del preparado, el peso del mismo, así como por la tensión y el peso
del hilo. Sin embargo, a lo largo de la actividad práctica asumiremos que las
diferentes maniobras no modifican estas últimas variables, por lo que los
resultados observados pueden ser atribuidos a variaciones en la tensión
desarrollada por el órgano. Para cuantificar variaciones en el tono muscular
tomamos el valor de la línea envolvente inferior que une los valles de las ondas
fásicas.
El presente registro muestra características medibles de amplitud y duración
de la onda contráctil, así como de la frecuencia con la que se contrae. La amplitud
de la onda, representa la intensidad máxima que alcanza cada contracción y en el
registro queda representada por la diferencia entre el pico de la onda y el valle, es
decir, el tono basal. La duración de una contracción se mide desde que comienza
la fase ascendente de la onda hasta el final de la fase descendente, el punto en el
que alcanza nuevamente el tono basal. Por último, la frecuencia representa el
número de veces que el órgano se contrae en un determinado período. En el
ejemplo del registro de la Figura 4, el preparado se contrae con una frecuencia de
1onda/min, con una amplitud promedio de 4.5g y una duración promedio de
60seg.
8
El desarrollo de tensión por el miometrio nos permite inferir que el órgano
presenta la propiedad mecánica de Contractilidad. Asimismo, el hecho de que
dicha actividad contráctil se presente en un preparado aislado, constituye una
evidencia indirecta de la existencia de un sistema de control intrínseco,
independiente del sistema nervioso central. Este sistema de control está formado
por células marcapasos, las cuales le otorgan al preparado la propiedad eléctrica
de Automatismo. Sin embargo, para confirmar la presencia de estas células
marcapasos deberíamos realizar un registro electrofisiológico de las mismas.
En relación a la actividad contráctil, recuerde el mecanismo general de la
contracción muscular ¿Conoce el principal determinante del acoplamiento excito-
contráctil? Hipotetice sobre el efecto de alterar la disponibilidad de calcio.
1B) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de bloquear los
canales de calcio tipo L
A continuación, se procederá a administrar Nifedipina. La nifedipina es un
antagonista de los canales de calcio de tipo L. Se agregará en la cámara interna
de modo de que alcance una concentración final de 1x10-9M. ¿Qué resultados
espera obtener ante el agregado de Nifedipina y por qué?
a. Describa los resultados obtenidos.
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (frecuencia, duración, amplitud
y regularidad de las contracciones).
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas.
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Conoce el mecanismo de acción de la nifedipina? ¿Qué experimentos
propone para investigar el mecanismo de acción de la nifedipina?
A continuación, lave el preparado con Tyrode nuevo y deje estabilizar el
preparado hasta obtener un nuevo registro.
9
En relación a las propiedades del músculo liso, recuerde el concepto de
sincitio funcional ¿Conoce el principal determinante? Hipotetice sobre el efecto de
alterar el acoplamiento de las células del músculo liso.
1C) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de desacoplar
las uniones GAP
La carbenoxolona es un derivado de la enoxolona que inhibe las uniones en
hendidura o uniones gap desacoplando las células entre sí. Se administrará de
modo de que alcance una concentración de 200 microM (0.2 x 10-3M) en la
cámara interna del baño del Dale. Plantee resultados esperados frente a la
colocación de Carbenoxolona.
a. Describa los resultados obtenidos.
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (frecuencia, duración, amplitud
y regularidad de las ondas).
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas. ¿Qué significan variaciones en estas
últimas?
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Cómo explica los resultados obtenidos? ¿Qué experimentos realizaría para
confirmar su explicación?
2) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de la
colocación de diferentes sustancia que participan en la regulación de la
contractilidad del mismo
El segundo objetivo general del práctico es determinar el efecto del agregado
de diferentes mediadores involucrados en el sistema de regulación de la actividad
contráctil uterina. Con este fin, mostraremos a continuación diversas maniobras
farmacológicas que afectan distintos componentes de estos sistemas de
regulación.
10
Recuerde los principales sistemas de regulación involucrados en el control de
la contractilidad uterina y su rol en las diferentes etapas del ciclo sexual y
reproductor. ¿De qué depende la prevalencia o participación de los diferentes
sistemas de regulación?
2A) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego del agregado de
Oxitocina
La primera maniobra consiste en estimular nuestro preparado con oxitocina.
La oxitocina es una hormona peptídica, sintetizada en los núcleos supraóptico y
paraventricular del hipotálamo y liberada desde la neurohipófisis. El número de
receptores para la oxitocina aumenta progresivamente a lo largo de la gestación y
la activación de estos receptores induce contractilidad uterina fundamental para el
progreso del trabajo de parto y el parto mismo.
Se administrará en la cámara interna de modo que la concentración
alcanzada en dicha cámara sea de 6.5x10-4UI/ml. ¿Qué variaciones en los
parámetros de la actividad contráctil previamente descriptos esperaría obtener
frente a la aplicación de oxitocina?
a. Describa los resultados que se obtuvieron.
b. Cuantifique la frecuencia, la amplitud y la duración de las contracciones en la
situación control y luego de la aplicación de Oxitocina en la cámara interna.
c. Cuantifique las variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y
de descenso de las contracciones fásicas. ¿Qué significan variaciones en estos
parámetros?
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Conoce el mecanismo de acción de la oxitocina? ¿Qué experimentos
propone para investigar el mecanismo de acción de dicha hormona?
11
2B) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego del agregado de una
dosis mayor de Oxitocina
Luego de extraer el Tyrode, lavar el preparado y dejar estabilizar el registro
durante unos minutos, se obtendrá un nuevo registro el cual será utilizado como
control para la siguiente maniobra.
A continuación, se agregará Oxitocina nuevamente, pero en este caso
utilizaremos aproximadamente el doble (1.3x10-3UI/ml) de la dosis anterior. ¿Qué
resultados espera obtener ante el agregado de esta nueva dosis de oxitocina?
a. Describa los resultados obtenidos.
b. Cuantifique nuevamente la frecuencia, la amplitud y la duración de las
contracciones en la situación control y luego de la aplicación de la Oxitocina en la
cámara interna.
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas. ¿Qué significan variaciones en estas
últimas?
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. Compare los resultados obtenidos con ambas concentraciones de oxitocina y
discuta su implicancia en la inducción del parto.
2C) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de la administración
de Prostaglandina F2
Luego de extraer el Tyrode, lavar el preparado y dejar estabilizar el registro
durante unos minutos, se obtendrá un nuevo registro el cual será utilizado como
control para la siguiente maniobra.
Las prostaglandinas juegan un papel fundamental en la reproducción en
mamíferos. Durante el parto las prostaglandinas, y específicamente las de tipo
F2 inducen contracciones uterinas que facilitan la expulsión del feto.
12
Administraremos Prostaglandina F2, la cual alcanzará una concentración
final en el baño de 1.9x10-4M. ¿Qué resultados espera obtener ante el agregado
de Prostaglandina?
a. Describa los resultados obtenidos
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (frecuencia, duración, amplitud
y regularidad de las contracciones).
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas.
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Conoce el mecanismo de acción de la prostaglandina? ¿Qué experimentos
propone para investigar el mecanismo de acción de la prostaglandina
F2?¿Conoce su utilización clínica?
2D) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de la administración
de Adrenalina
En la siguiente maniobra, y luego de haber lavado el preparado,
procederemos a agregar adrenalina a la cámara interna. La adrenalina es una
hormona sintetizada en la médula suprarrenal y que como tal se transporta por vía
sanguínea hacia órganos y células blanco. Asimismo, la Adrenalina actúa como
neurotransmisor. Los efectos de esta hormona varían según el ciclo sexual y el
estado gestacional de la rata. El mecanismo de acción de la adrenalina incluye
dos tipos de receptores: alfa y beta. La Adrenalina alcanzará una concentración
final en el baño de 1.3x10-6M. ¿Qué resultados espera obtener ante el agregado
de Adrenalina y por qué?
13
a. Describa los resultados obtenidos.
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (frecuencia, duración, amplitud
y regularidad de las contracciones).
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas.
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Conoce el mecanismo de acción de la Adrenalina? ¿Cómo explica los
resultados obtenidos?
f. Conoce la implicancia clínica de la utilización de mediadores adrenérgica en
la regulación de la contractilidad uterina? ¿En qué etapas del ciclo reproductor se
utilizan?
2E) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de la administración
de Metilergonovina
Luego de haber lavado el preparado y reemplazado la solución Tyrode
conteniendo adrenalina por una nueva, se estimularán los receptores adrenérgicos
alfa o beta. Se utilizará metilergonovina, un agonista alfa-adrenérgico, la cual
alcanzará una concentración final en el baño de 1.7x10-5M. ¿Qué resultados
espera obtener ante el agregado de Metilergonovina y por qué?
14
a. Describa los resultados obtenidos.
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (frecuencia, duración, amplitud
y regularidad de las contracciones).
c. Cuantifique variaciones en el tono muscular y en las fases de ascenso y de
descenso de las contracciones fásicas.
d. Calcule la latencia al efecto máximo.
e. ¿Conoce el mecanismo de acción de la Metilergonovina? ¿Qué experimentos
propone para investigarlo?
2F) Registro de la actividad contráctil del útero aislado luego de la administración
de Fenoterol
En la siguiente maniobra, y luego de haber lavado el preparado y
reemplazado la solución Tyrode por una nueva, se empleará un agonista beta-
adrenérgico: Salbutamol. El salbutamol alcanzará una concentración final en el
baño de 1.0 x 10-6M. ¿Qué resultados espera obtener ante el agregado de
Salbutamol?
a. Describa los resultados obtenidos
b. Analice y cuantifique los resultados obtenidos (en relación a la frecuencia, la
duración, la amplitud y la regularidad de las contracciones).
c. Calcule la latencia al efecto máximo.
d. ¿Conoce el mecanismo de acción del Salbutamol? ¿Qué experimentos
propone para investigarlo? Compare el resultado con el obtenido con adrenalina.