practicas del laboratorio

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1 Practica Numero 1: Preparación de Medios de Cultivo. -Introducción: Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas optimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en los Laboratorios de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y usos asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la silicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. MEDIOS DEFINIDOS O SINTETICOS: Son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.

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Practica Numero 1: Preparación de Medios de Cultivo.

-Introducción: Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes

que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas optimas,

permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son

esenciales en los Laboratorios de Microbiología por lo que un control

en su fabricación, preparación, conservación y usos asegura la

exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados

obtenidos.

En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de

medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o

sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un

medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar,

la gelatina o la silicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza

de sus constituyentes en:

MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: Constituidos por

sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son

usualmente complementadas por la adición de minerales y

otras sustancias. En ellos no se conocen todos los

componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno

de ellos.

MEDIOS DEFINIDOS O SINTETICOS: Son los medios que tienen

una composición química definida cuali y cuantitativamente.

Generalmente se usan en trabajos de investigación.

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De acuerdo al uso del medio de cultivo, estos se clasifican en:

MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son medios líquidos que

favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismos en

particular. Permiten aumentar el número de microorganismos

de este tipo. Usualmente contienen una o más sustancias

inhibidores del crecimiento de los microorganismos con

excepción de los que se quieren cultivar.

MEDIOS SELECTIVAS: Son parecidos a los de enriquecimiento,

se diferencian por medios sólidos y están diseñados para el

aislamiento de microorganismos específicos.

MEDIOS DIFERENCIALES: Son medios que contienen

indicadores de productos derivados de la actividad microbiana

de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia

con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características

fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir

de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple

rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios d

cultivo deshidratado). Generalmente se prefiere el uso de los medios

de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo,

con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados

reproducibles.

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes

aspectos:

Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de

fabricantes o proveedores que suministren productos de

calidad.

3

Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad

microbiológica y fisicoquímica adecuada.

Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua

destilada o desmineralizada.

Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su

esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones

señaladas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIO DE CULTIVO.

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases

sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente

se almacenan en un lugar fresco (entre 15° y 25°), con poca humedad

y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca

de autoclaves, hornos, ni otras fuentes de calor o vapor.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los

envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para

su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto

como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la

entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH,

formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica

que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios

químicos o estar contaminados.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado,

puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo

de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12-15°C.

Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se

prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0°C porque

se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben

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mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación

y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una

envoltura de papel (Craft).

Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio

de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control

de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas

(apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de

crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad

establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.

-Objetivo: Al finalizar el trabajo práctico nosotros como estudiantes

estaremos en capacidad de:

Preparar medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a

partir de medios de cultivo deshidratados.

Indicando el método de esterilización apropiado.

-Fundamento: La preparación adecuada de un medio de cultivo nos

permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para

favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.

-Materiales:

Cajas de Petri (5). Abatelenguas (1). Mechero (1). Jeringa (1).

Medio de Cultivo Agar

Sangre (1).

Agua Destilada (1). Tapón (1). Campana Extractora (1).

Balanza Granataria (1). Matraz (1). Autoclave (1). Sangre (5 mili l itros).

Pedazo de Papel

Aluminio (1).

Agitador (1). Cinta Mástil (1). Guantes (2).

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-Procedimiento: En el siguiente procedimiento relataremos el

medio de cultivo que nos asignó la doctora para realizarlo, el cual fue

AGAR SANGRE, aunque también se realizaron otros medios como

Agar Macconkey, Agar Nutritivo, Eosina y Azul de Metileno (EMB),

Salmonella Shigella, Agar Sal y Manitol y de todos estos solo

mencionares como son, cuáles son sus ingredientes y para que nos

sirve.

AGAR SANGRE: El agar sangre es una combinación de un agar

base (agar nutritivo) con el agregado de 5% de sangre humano

en nuestro caso de esta práctica ya que también se utiliza

sangre ovina. Aporta muchos factores de enriquecimiento. Se

usa también para ver la capacidad hemolítica de los

microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia).

Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se

determina el tipo de hemolisis que posee:

-Alfa: Halos verdosos (reducción de la hemoglobina de los glóbulos

rojos a metahemoglobina en el medio).

-Bata: Halos incoloros (hemolisis total).

-Gamma: Inexistencia de halos (sin hemolisis).

No permite el crecimiento de Neisseria y Haemophilus.

Hemolisis de Streptococcus: Izquierda: alfa

hemolisis (hemolisis parcial) por S. mitis.

Centro: beta hemolisis (hemolisis total) por

S. pyogenes. Derecha gamma hemolisis (sin

hemolisis) por S. salivarius.

Agar sangre para el diagnóstico de infecciones.

Ala Izquierda positivo para infección por

Staphylococcus, ala Derecha positivo para un

cultivo de Streptococcus.

Beta hemolisis en agar sangre, se observan

tres colonias centrales y sus halos de

hemolisis.

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AGAR MACCONKEY: Es un medio de cultivo específico para

bacterias Gram negativas y cepas que fermentan la lactosa. Los

ingredientes necesarios para este medio son los siguientes:

Sales Biliares (medio inhóspito para el crecimiento de bacterias

Gram positivos, excepto Enterococcus y algunas especies de

Staphylococcus), Colorante Crista Violeta (inhóspito para cierto

tipo de bacterias Gram-Positivo), Colorante Rojo Neutro (el

cual marca microorganismos que fermentan lactosa). Lactosa,

Peptona y Cloruro Sódico.

Sirve como indicador visual de pH, distinguiendo así las bacterias

Gram negativas que pueden fermentar Lactosa (Lac+) y las que no

pueden (Lac-).

-LAC+: Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como

Escherichia Coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual

baja el pH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparición de

colonias de color rosadas o rojas.

-LAC-: Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella,

Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando

amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias

blancas o incoloras.

-SLOW: Algunas bacterias en cambio fermentan la lactosa de manera

lenta, y con consideraciones en una categoría distinta, por ejemplo:

Serratia y Citrobacter.

Agar Macconkey con Bacterias Lac+

(izquierda), Lac- (derecha).

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AGAR NUTRITIVO: El agar nutritivo es un medio de cultivo

usado normalmente como rutina para todo tipo de rutina para

todo tipo de rutina. Es muy útil porque permanece sólido

incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento

bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se

distinguen mejor las colonias pequeñas.

El agar nutritivo contiene normalmente lo siguiente:

- 0,5% de Peptona.

- 0,3% de Extracto de carne/extracto de levadura.

- 1,5% de Agar.

- 0.5% de Cloruro de Sodio.

- Agua Destilada.

- pH casi neutro (6,8) a 25°C.

En esta caja de Petri con Agar Nutritivo se inocularon los micro-organismos y acá se puede

evidenciar el crecimiento de colonias de los mismos. Posteriormente se elaboró una placa

con el contenido de esta caja y se puede evidenciar la presencia de Bacillus Esporulados.

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EOSINA AZUL DE METILENO (EMB): Es un medio de cultivo

selectivo y diferencial: Inhibe el crecimiento de bacterias Gram

positivas y algunas Gram negativas y muestra si las Gram

Negativas que crecen son o no fermentadores de lactosa. Esto

lo realiza gracia ala eosina y el azul de metileno:

-La Eosina es un indicador de pH y, por tanto, de la presencia de

fermentación.

-El Azul de Metileno es un compuesto que inhibe el crecimiento

de bacterias Gram Positivas y ciertos grupos de Gram Negativas.

Cultivo de Escherichia Coli en medio

de EMB. Es un medio selectivo y

diferencial.

Esta especialmente diseñado para

diferenciar entre E. Coli (colonias

metálicas) de Enterobacter (sin este

color).

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AGAR SALMONELLA SHIGELLA: Es una modificación del Agar

Citrato Desoxicolato. Se le considera un medio

moderadamente selectivo según el nivel de inhibición de los

microorganismos Gram positivos y Enterobacteriaceae

diferentes de Salmonella Shigella, que inhibe por contenido de

Sales Biliares, Verde Brillante y Citratos.

En BD Salmonella Shigella, la diferenciación de los organismos

entéricos se logra mediante la incorporación de lactosa en el medio.

Los organismos que fermentan lactosa produce acido que, en

presencia del indicador rojo neutro, propicia la formación de

colonias de color rojo. Los organismos no fermentadores de lactosa

forman colonias incoloras. Este último grupo incluye la mayoría de

los patógenos intestinales, incluidos Salmonella y Shigella.

Agar Salmonella Shigella contiene lo siguiente:

- Extracto de Carne Bovina 5,0g.

- Digerido Pancreático de Caseína 2,5.

- Digerido Péptido de Tejido Animal 2,5.

- Lactosa 10,0.

- Sales Biliares 8,5.

- Citrato Sódico 8,5.

- Tiosulfato Sódico 8,5.

- Citrato Férrico 1.0.

- Rojo Neutro 0,025.

- Agar 13,5.

- Verde Brillante 0,330mg.

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AGAR SAL Y MANITOL: Es un medio de cultivo que se utiliza

normalmente en el laboratorio de microbiología. Permite el

crecimiento de un determinado grupo de bacterias mientras

que inhibe el crecimiento de otras. Este medio es importante

debido que es capaz de distinguir microorganismos patógenos

en corto periodo de tiempo.

Contiene una alta concentración de sal, asiendo selectivo para

Staphylococci.

Es coagulasa positivo Staphylococci produce colonias amarillas con

zonas amarillas, mientras que coagulasa negativa Staphylococci

producen colonias rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno del

medio.

Su composición es la siguiente:

-5,0 g/L enzima digestiva de cafeína.

-5,0 g/L enzima digestiva de tejido animal.

-1.0 g/L extracto de carne de vaca.

-10,0 g/L D-manitol.

-75,0 g/L NaCI.

-0,025 g/L rojo de fenol.

-15,0 g/L agar.

En este medio se logra apreciar lo s iguiente:

1. Su color es rosado eso refiere ser coagulasa

negativo.

2. Su color es amarillo refiere ser coagulasa

pos i tivo.

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Seguidamente de esta explicación detallada de cada medio ahora si

indicaremos cual fue el procedimiento que utilizamos para hacer el

medio de AGAR SANGRE.

1. Como todo medio para hacer las medidas exactas pesamos en

una Balanza Granataria el peso específico del papel aluminio

para poder pesar correctamente el medio, el peso total del

medio fue de 5,00 gramos menos el peso específico del papel

aluminio que fue de 1,00 gramo y 4,00 gramos de medio.

2. Este paso solo fue disolver el medio en un matraz, con una

solución salina, lo mezclamos bien.

3. Cuando lo estábamos mezclando, lo acercamos al mechero

para que hirviera y a si se tornara líquido.

4. Lo tapamos con un tapón hecho de algodón y gasas por la

técnica ya conocida.

5. Posteriormente lo llevamos a la autoclave con una

temperatura de 100 ° C durante una hora.

6. Cuando se completó la hora sacamos los medios de la

autoclave y pues obvias razones estaba caliente, lo dejamos

enfriar para tener un mejor manejo.

7. Cuando ya estaba listo para su manejo, como el medio que nos

toco fue AGAR SANGRE y como sabemos este medio necesita

un porcentaje de sangre humana. Como paso principal fue

extraer 5 mililitros de sangre a uno de mis compañeros e

inmediatamente con la jeringa sin aguja, disolvimos la sangre

por las paredes del matraz y a si mezclarlo hasta que esté bien

mezclado.

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8. Ya que se mezcló bien, proseguimos a disolver el medio en las

cajas de Petri en la Campana de Extracción, a si preparamos 5

cajas de este medio.

9. Y como último paso las dejamos guardadas, selladas y

rotuladas las cajas de Petri con dicho medio.

-Resultado: Como cada equipo hiso un medio especifico los cuales

fueron AGAR SANGRE, AGAR NUTRITIVO, AGAR MACCONKEY, SAL Y

MANITOL Y AGAR SALMONELLA SHIGELLA; se repartió una caja de

medio a cada equipo para proseguir con la siguiente practica de

Sembrado.

AGAR SANGRE AGAR NUTRITIVO AGAR MACCONKEY AGAR SAL Y MANITOL AGAR SALMONELLA

SHIGELLA

AGAR AZUL DE METILENO

(EMB)

-Conclusión: Por medio de esta práctica se logró aprender, que

técnicas se utilizan para poder hacer un medio de cultivo, sea cual

sea el que se utilice.

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Practica Numero 2: Exudado Faríngeo.

-Introducción: Los cultivos de exudado faríngeo son importantes

para determinar el diagnostico el diagnostico de infecciones como:

amigdalitis y faringitis producidas por estafilococos y estreptococos,

para establecer el foco infeccioso de enfermedades como fiebre

reumática, glomerulonefritis así como para determinar el estado de

portador de microorganismos como Staphylococcus Aureus,

Streptococcus Beta Hemolíticos, etc.

La obtención de resultados confiables depende en gran parte de una

buena toma de muestra que se le haga al paciente, a quien se le

deben dar las instrucciones correspondientes para que se presente

a la toma de muestra.

Algunos de las Morfologías Bacterianas característicos del tracto

respiratorio son los siguientes:

Klebsiella Pneumoniae (AGAR MACCONKEY) Staphylococcus Aureus (AGAR SANGRE)

Colonias grandes planoconvexa, mucoides,

brillantes, forma irregular, también se

observan redondas, bordes ondulados,

lactosa positivo (consume el carbohidrato

lo cual acidifica el medio y el indicador rojo

de fenol cambia rojo-rosado, por ello las

colonias se ven de este color).

Colonias medianas, convexas, de color

blanco, forma circular, bordes redondos.

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-Objetivo: Identificar los microorganismos presentes en la muestra

problema (exudado faríngeo).

-Fundamento: El sistema respiratorio se divide en vías altas o

superiores, que comprenden las áreas anteriores a la laringe,

incluyendo la nasofaringe, orofaríngea, laringe, epiglotis, oído

externo y medio, y los senos paranasales, y vías bajas o inferiores

que incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe.

El tracto respiratorio habitual (la faringe) está formado por distintos

microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y

especies: estreptococos, estafilococos, micrococos, neisserias,

Moraxella catarrhalis, corinebacterias, Haemophilus spp,

Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela,

Peptostreptococcus, Actinomyces, etc.

Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el

agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus

pyogenes, pero también, otros microorganismos patógenos que

podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae.

Para poder identificar el agente microbiano de la muestra problema,

se procederá a la siembra del mismo en el medio de cultivo.

-Material:

Hisopos Estériles

(1).

Abatelenguas (1). Guantes (2). Placas de Agar Sal y

Manitol (1).

Asas Bacteriológicas

(1).

Mechero (1). Cinta Mástil (1). Plumón

Permanente (1).

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-Procedimiento:

1. Para la toma de la muestra: Se tomó un hisopo estéril, se froto

y raspo suavemente en la parte posterior de la garganta,

tomando la muestra de las amígdalas.

2. Descargamos el hisopo en la caja de Petri de Sal y Manitol,

siempre cerca del mechero, como medida de precaución.

3. Se descargó el hisopo en una parte de la caja de Petri y así se

fue girando a 90° grados la caja de Petri y con ayuda del aza

bacteriológico se fue arrastrando la descarga en forma de

zigzag.

4. Posteriormente serramos la caja de Petri y la rotulamos, para

así guardarla y esperar si creció o no la bacteria.

-Resultado: Como resultado final, después de dejar crecer la

bacteria nos percatamos que creció Staphylococcus Áureos, donde

sus colonias presentaron un color amarillo que esto nos dice que es

coagulasa positivo. También queriéndose mostrar un color rosado

identificado como coagulasa negativo, pero no se extendió como

debería de ser, así que nos quedamos con el amarillo.

-Conclusión: En esta práctica que podría decirse sencilla pero muy

importante pudimos observar como se muestra una colonia, su

forma color de Staphylococcus.

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Practica Numero 3: Siembra en Medios de Cultivo.

-Introducción: Un cultivo es un método para la multiplicación de

microorganismos, tales como hongos, bacterias y parásitos, en el

que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado.

Un cultivo es deseado como un método fundamental para el estudio

de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades

en medicina humana.

Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o solido

de agar. Los medios de cultivo contiene distintos nutrientes que van,

desde azúcares simples asta sustancias complejas como la sangre o

el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie

bacteriana a partir de una muestra de forma por muchos tipos de

bacterias, se siembra en un medio de cultivo solido donde las células

que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos

reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria

una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de

células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a

su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo

de bacteria.

La principal diferencia entre en un medio de cultivo sólido y uno

liquido es que el medio de cultivo contiene 1,5-2% de agar-agar,

mientras que el líquido no contiene agar-agar.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente

que es imposible diferenciarlas solo con el uso del microscopio. En

este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus

características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo

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especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el

crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la del

tipo que se desea averiguar si está presente. Otra veces, el medio de

cultivo contiene determinados azucares especiales que solo pueden

utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores

de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio

es fermentado y se generan catabolismos ácidos. Si las bacterias son

capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser

detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.

Con otros cultivos se puede identificar si las bacterias producen

determinación de enzimas que digieren los nutrientes. Así, algunas

bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper glóbulos

rojos) producen hidrolisis y cambios apreciables prosaicamente en

las placas de agar-sangre.

Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en un

laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para

identificar las bacterias causadas de las enfermedades infecciosas y

los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos

suelen usarse en medicina para determinar agentes patógenos en

fluidos corporales (como por ejemplo la sangre y orina).

Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los

resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir

con los siguientes requisitos:

-Disponibilidad de nutrientes.

-Consistencia adecuada del medio.

-Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases.

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-Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorífico).

-Luz ambiental.

-pH adecuado.

-Temperatura.

-Esterilidad.

En la siembra en medios de cultivo estos son algunos ejemplos de lo

que se puede observar en cada uno de ellos:

AGAR SANGRE: Enterococcus cultivo en agar sangre

donde creció a las 24 horas colonias de

Enterococcus faecalis. Tienen un tamaño entre 0.5 y

1 mm, a menudos opacos y blancos, que suelen ser

α hemolíticos o no hemolíticas, aunque algunos

casos aparecen β hemolíticas.

AGAR MACCONKEY: Es un medio diferencial porque

contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

Las bacterias capaces de fermentar lactosa

producirán un cambio en el pH del medio por

l iberación de productos ácidos. Como consecuencia

sus colonias aparecerán de color fucsia/violeta,

contrastando con la coloración amarillenta de las

colonias incapaces de fermentar la lactos a.

AGAR AZUL DE METILENO (EMB): Las colonias

fermentadoras son de color rosado. Escherichia Coli

fermenta los azucares y forma colonias verdes con

bril lo metálico. Las colonias no fermentadoras son

incoloras

AGAR SALMONELLA SHIGELLA: Las cepas de Shigella

y la mayoría de Salmonella presentan colonias

incoloras. Colonias trasparentes con centro negro:

Proteus y algunas Salmonellas. Las bacterias

fermentadoras de Lactosa presentan colonias rojas

a rosadas.

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-Objetivo: Practicar el aislamiento de bacterias en el Laboratorio

utilizando la técnica de siembra en cajas de Petri.

-Fundamento: En el manejo de muestras contaminadas o cultivos

mixtos en los que se encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra. Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos. Al depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una "colonia" que no es más que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y presenta diferentes características según el microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo estéril, a estos cultivos los

consideraremos "puros" por poseer un sólo tipo de microorganismo. (El fundamento es válido teniendo en cuenta sólo microorganismos cultivables)

-Material: Cajas de Petri con Agar Sangre (2).

Caja de Petri con Agar Macconkey (1).

Cepas de Streptococcus.

Cepas de Staphylococcus áureos.

Mechero (1). Asa Bacteriológica (1).

Cinta Mástil (1). Marcador (1).

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-Procedimiento:

1. Esterilizamos el asa bacteriológica, enfriamos en el medio en un lado del cultivo, con el asa levantar la bacteria, para llevarla al nuevo cultivo, pero nunca separar el asa del mechero para un mejor funcionamiento.

2. Levantamos la tapa de la placa donde se va a sembrar, depositamos el inoculo en el primer sector (descarga) hacer un zigzag, pero solo tocando 2 o 3 veces la descarga.

3. Y a si nuevamente esterilizamos el asa la dejamos enfriar en una parte de la placa sin tocar el inocuo, giramos e 90 grados e hicimos estrías en zigzag y así lo repetimos dos veces más, cerramos la placa.

4. Las rotulamos y las dejamos incubar durante 24 horas, para así ver si creció alguna bacteria.

-Resultados: En esta tabla se muestra que nos creció en los medios

que nos tocó: AGAR MACCONKEY: En esta podemos

observar que torno un color rosado esto quiere decir que es fermentadora de

lactosa y esto también hace que su pH baje a menos de 6,8 y ase este color

característico. AGAR SANGRE: En este medio podemos

observar un color blanquecino característico de Staphylococcus áureos y

son β hemolíticas, también podemos observar que sus colonias son redondas unas separadas y otras juntas. AGAR SANGRE: En este medio podemos observar que es un Streptococcus β

hemolíticos con un color como amarillento y en colonias redondas separadas y juntas.

-Conclusión: En esta práctica podemos observar cómo se manifiestan las bacterias en los diferentes cultivos bacteriológicos.

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Practica Numero 4: Antibiograma.

-Introducción: Es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones.

Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o semisintéticos (modificación química de un compuesto natural). La

historia moderna de los antibióticos comienza con el descubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos. La utilización de antibióticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que padecían procesos infecciosos, aunque también supuso un aumento en los niveles de resistencia antibiótica.

El antibiograma tiene cuatro utilidades principales:

La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento antibiótico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algún antibiótico para no incluirlo como terapia.

En cuanto al tratamiento el antibiograma no sólo es necesario en la instauración, también resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de tratamientos empíricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El

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antibiograma tiene que confirmar, o en su caso corregir el

tratamiento.

Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas correctoras.

Por otro lado también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de resistencia puede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.

Existen multitud de antimicrobianos en el mercado y el número sigue creciendo porque el desarrollo de más mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se traduce en un esfuerzo mayor por fabricar más y mejores antibióticos. No es necesario contrastar la eficacia de todos los antibióticos para cada aislamiento bacteriano. Los criterios que se siguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan respondes a factores de diversa índole:

Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia descritos previamente en su especie.

Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de absorción, distribución y eliminación.

Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado general de salud. Situación inmunológica e hipersensibilidad.

Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia antibiótica más habituales para cada especie.

Estos son los resultados que deberían de aparecer en un

antibiograma:

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Resultado del Disco anterior:

PLANTAS DE ESTUDIO RESISTENCIA SUSCEPTIBLE

CUACHALALATE X Se observan cambios de coloración. ESTAFIATE X

EUCALIPTO X Se observan cambios de coloración. QUINA AMARILLA X Se observan cambios de coloración.

TOMILLO X

ANTIBIÓTICOS RESISTENCIA SUSCEPTIBLE

AMIKACINA XXX

AMPICILINA XXX CARBENICILINA XXX

CEFOTAXIMA XXX CEFTRIAXONA XXX

CLORANFENICOL XXX GENTAMICINA XXX

NETILMICINA XXX NITROFURANTOINA XXX

TRIMETROPIM SULFAMEROXAZOL XXX

-Objetivo: Observar la sensibilidad de bacterias a la acción de

diversos antibióticos.

-Fundamento: El antibiograma lo que hace es evaluar la

sensibilidad de un microorganismo a ciertos medicamentos.

Los parámetros para elegir los antibióticos a probar son los

siguientes:

Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos

de resistencia descritos previamente en su especie.

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Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de

absorción, distribución y eliminación.

Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado

general de salud. Situación inmunológica e hipersensibilidad.

Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia

antibiótica más habituales para cada especie.

-Material:

Cepas de Streptococcus y

Staphylococcus en placa de

agar nutri tivo.

Ca ja de Petri con agar

Muel ler-Hinton en placa de

agar nutri tivo.

Discos de antibióticos para

gran pos i tivos .

Discos de antibióticos para

gran negativos .

Pinzas metálicas. Tubos con solución salina

estéri l .

Hisopos estéri les . Mecheros .

Asas Bacteriológicas Tuvo 0.5 del Nefelómetro

de McFarland.

Cinta Másti l . Plumón permanente.

-Procedimiento:

1. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada y enfriada,

se tomó una pequeña porción de la colonia bacteriana a

estudiar.

2. En un tubo conteniendo solución salina estéril, hicimos una

suspensión al tubo 0.5 del Nefelómetro

3. Con un hisopo estéril tomamos bacterias de la suspensión,

mojando y presionando el hisopo sobre las paredes del tubo de

ensaye para evitar el exceso de suspensión.

4. Se tomó la placa de Mueller-Hinton, se sostuvo con la mano

izquierda, se levantó la tapa ligeramente y se procedió a

realizar el extendido de la suspensión bacteriana rotando el

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hisopo uniformemente por toda la superficie de la placa,

girando la placa varias veces.

5. Se desechó el hisopo en un recipiente ya flameado en el

mechero.

6. Con ayuda de la pinza, se colocó los discos individuales, sobre

la superficie de la placa de cultivo de Mueller-Hinton, este

procedimiento se hiso teniendo encendido un mechero para

poder evitar cualquier tipo de contaminación.

7. Incubamos las placas en un promedio de 24 horas, para así

poder observar las reacciones.

-Resultado: En este apartado tuvimos la mala suerte de no poder

observar las reacciones correspondientes, esto fue por un mal

manejo y un mal extendimiento de la suspensión.

-Conclusión: En esta práctica debíamos de haber observado un gran

funcionamiento de lo que son las reacciones antibióticas, pero por

un mal funcionamiento, no logramos hacerlo, pero esto nos llevó a

pensar que si llega a haber otra práctica de este tipo ahora si hacerlo

bien.