practica n° 4 bv
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B I OTEGNOLOGIA V E G ETAL
P R A C T I C A 4 : C U L T I V O I N
V I T R O D E H O J A S
CARDENAS HURTADO, ROSMERY
Biotecnología Vegetal
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PRACTICA N° 4
Cultivo in vitro de hojas
1. OBJETIVOS:
o Micropropagacion, mejoramiento genético, conservación del germoplasma y la
sanidad vegetal.
o El objetico de estos cultivos ha sido el conocer hasta donde se llega en el
desarrollo de dicho órgano en condiciones in vitro y que propiedades contribuyen
a su desarrollo.
2. RESUMEN:
En el presente trabajo se estudió el desarrollo de organogénesis indirecta en rosas (Phyllis
Bide) para la obtención de brotes. La metodología utilizada durante este estudio consistió en
tomar explantes de hoja de rosas, los cuales fueron desinfectados con una solución etanol al 70%
durante 30 segundos. Para la siembra se utilizó medio MS enriquecido con 0,5 µM de ANA,
10µM de BAP y 8 µM de GA3. Después de una semana de incubación en luz natural y a
temperatura ambiente se observó la presencia de contaminación fúngica en uno de los frascos
utilizados en este ensayo.
3. MARCO TEORICO:
ORGANOGÉNESIS
Es una técnica de la biotecnología vegetal que permite la formación de tallos
adventicios, yemas, y de raíces a partir de explantes directamente (hojas, tallos y flores,
etc.), cultivo de callos, de meristemos o de células en suspensión. Estos órganos inducidos a partir de una célula o de un grupo de células que según la condiciones de
cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa división (Jarret, 1993, citado por
Roca, 1993).
Se da normalmente en dos fases, la producción y crecimiento de tallos a partir de callo,
hojas, cotiledones, hipocótilos, etc. y como segunda fase su posterior enraizamiento
(Mansouri et al., 2006).
Existen dos tipos de organogénesis in vitro: directa e indirecta. La forma directa son
sistemas mediante los cuales a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes
relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos
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brotes, raíces o flores directamente de una parte de la planta, sin la formación de callo
(Polci y Friedrich, 2004). Según Pati et al., (2005), se ha realizado organogénesis directa en
cultivos de rosa en: Rosa persica_x xanthiana a partir de hojas y raíces en medio MS con
BAP (Lloyd et al., 1988), Rosa hybrida cvs. Madelon, Only Love, Presto, Sonia, Tinekel, a
partir de hojas y peciolos en un medio de inducción formulado con medio MS, TDZ, ANA,
caseína, Nitrato de Plata y sales hidrosolubles; y en un medio de regeneración a base de
MS, BAP, NAA y FeEDDAH (Dubois and de Vries, 1995).
La forma indirecta en cambio es que a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la
proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará
la producción de callos o suspensiones celulares; esta diferenciación de órganos, estará
condicionada a la previa formación de los meristemoides; este sistema es el más utilizado y el
que más investigaciones ha tenido debido a su importancia en la micropropagación clonal (Roca,
1993).
Ventajas de la Organogénesis
La organogénesis como sistema de propagación de plantas presenta una serie de ventajas
frente a otros sistemas (López, 2003) entre las principales tenemos:
Una enorme capacidad de multiplicación aplicable industrialmente, permite obtener en un
solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y
encapsuladas perfectamente con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y
sanidad deseables. Permite desviarse de los procesos sexuales normales y producir
posteriormente una población de plantas con las características de la planta original de la
cual derivaba el explante primario, y proporciona información para una mejora de plantas en
lo relacionado al saneamiento de enfermedades, conservac ión de germoplasma y selección
de especímenes transformados
Fases de la Regeneración u Organogénesis
La regeneración es un proceso que comprende diferentes fases, de acuerdo con de Klerk et
al., (1997) denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisición de la
competencia, fase de inducción y fase de realización (Polci y Friedrich, 2004).
En la primera fase las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa
competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase llamada fase de
inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa
entre el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al
medio de cultivo y el órgano a desarrollar, y por último la fase de realización, la célula sufre
sucesivas divisiones para formar el órgano determinado (Polci y Friedrich, 2004).
Factores que Afectan la Organogénesis
Los factores que afectan la organogénesis son: los tipos de explante, el medio de cultivo,
los reguladores de crecimiento, entre otros factores tanto físicos como químicos.
Explante
Virtualmente todas las partes de la planta se han utilizado como explantes para la iniciación
de callo, no obstante los tejidos juveniles poseen un alto grado de actividad meristemática.
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Los explantes que se han utilizado exitosamente son ramas en floración, pedúnculos florales,
embriones inmaduros, meristemas, epicotilos, yemas florales, partes de rizomas, caquis,
bulbos, hojas de coníferas, tubérculos y raíces ( Jarret, 1993, citado por Roca, 1993).
Puede haber variación en los requerimientos de los reguladores de crecimiento para la
organogenésis según el tipo de tejido usado como explante, así como también el tamaño del
explante, ya que los explantes grandes poseen un potencial regenerador mayor. Además el
estado de la planta madre y la estación durante la cual el explante es extraído también
pueden afectar notablemente el potencial organogénico (Jarret, 1993, citado por Roca,
1993).
Medio de cultivo
Los medios usados más frecuentemente para promover la organogénesis son los de
Murashige et al., (1962), White (1963), Gamborg et al., (1968), Linsmaier et al., (1965),
Schenk et al., (1972) y Heller (1953). Pero Murashige es el más usado para cualquier tipo
de planta (Linz, 1993, citado por Roca, 1993).
La sacarosa es generalmente la fuente carbonada que se usa en los estudios de
organogénesis. Este elemento puede favorecer la formación de yemas y de callos, como
también cambiar la textura de los mismos (Linz, 1993, citado por Roca, 1993).
Otros tipos de compuestos que pueden afectar la organogénesis, son los fenoles sustituidos
y los alcaloides. Lee et al., (1965) informaron que los fenoles monohidróxidos sustituidos en
las posiciones 2 o 4 estimulan la formación de yemas (Linz, 1993, citado por Roca, 1993).
Ventajas de la Organogénesis
La organogénesis como sistema de propagación de plantas presenta una serie de
ventajas frente a otros sistemas (López, 2003) entre las principales tenemos:
Una enorme capacidad de multiplicación aplicable industrialmente, permite obtener en
un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, que pueden ser almacenadas y
encapsuladas perfectamente con las condiciones ambientales requeridas y la calidad y
sanidad deseables. Permite desviarse de los procesos sexuales normales y producir
posteriormente una población de plantas con las características de la planta original de
la cual derivaba el explante primario, y proporciona información para una mejora de
plantas en lo relacionado al saneamiento de enfermedades, conservación de
germoplasma y selección de especímenes transformados
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4. METERIALES:
i. Material vegetal: Hojas de ROSA (Phyllis Bide).
ii.Medios de cultivo: Medio de Murashige y Skoog,
a. suplementado con ANA 0,5 µM BAP, 10µM y GA3, 8 µM.
iii.Material de vidrio:
a. Beakers, 250 mL.
b. Matraz, 100 mL.
c. Tubo de ensayo.
iv. Insumos: Agua destilada estéril.
v.Reactivos:
a. Etanol (70%).
b. Hipoclorito de sodio (2.5%).
vi. Instrumentos:
a. Bisturíes.
b. Mechero Bunsen.
c. Pinzas.
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5. METODOLOGIA:
5.6. DES INFESTACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL:
o Recolectar hojas jóvenes y sanas. Lavar cuidadosamente el haz y el envés de las
hojas con agua corriente
o En un matraz, colocar el material vegetal en inmersión con etanol al 70% durante
30 segundos.
o Eliminar por decantación el etanol al 70%.
o Colocar en inmersión con Hipoclorito de sodio al 2.5% por 3 min.
o Antes de finalizar los 3 min, introducir el matraz con el material vegetal inmerso
en el Hipoclorito de sodio en la cámara de flujo laminar.
4.3. AISLAMIENTO DE LOS EXPLANTES:
o En la cámara de flujo laminar, decantar el Hipoclorito de sodio y proceder a
realizar tres enjuagues con movimientos rotatorios utilizando agua destilada
estéril.
o Las pinzas y bisturíes se mantienen sumergidos en etanol al 70% hasta el
momento de su uso, y se esterilizan conforme se van empleando, por medio de
frecuentes inmersiones en alcohol, seguidas por flameo y enfriamiento.
o Después de la esterilización y utilizando las pinzas colocar el explante sobre
placas de vidrio estéril o papel secante estéril.
o Utilizando un bisturí estéril retirar el peciolo y todo el margen de la hoja, así
como las superficies cortadas que han estado en contacto con lejía.
o Eliminar la nervadura central y cortar la lámina en secciones de aproximadamente
1 cm2.
4.4. INOCULACIÓN DE LOS EXPLANTES:
o Durante la inoculación, el cuello del recipiente que contiene el medio sólido debe
ser flameado rápidamente.
o Las secciones de hojas se colocan ligeramente en el agar de manera que el envés se ponga en contacto con el medio de cultivo.
o Colocar cinco secciones de hoja por frasco de cultivo.
o Tapar el frasco con plastic wrap, sujetándolo con ligas a la boca del frasco.
o Reponer el papel secante sobre el cual se trabajó y dejar los instrumentos
inmersos en etanol al 70%.
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6. PROCEDIMIENTO:
Limpieza con hipoclorito de sodio y etanol ya mencionado en las prácticas
pasadas.
Desinfección de las plantas o material vegetal a usar.
Lavado con agua corriente. Y luego En un matraz colocar en inmersión con etanol
70% por 30 (segundos), luego decantar
En este paso se
busca romper la
tensión
superficial.
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Añadir una solución de hipoclorito de sodio 2,5 % (lejía) por 3 minutos
Enjuagar con agua destilada (tres veces a más). luego decantar.
Realizar el corte a material vegetal seleccionado en este caso a las hojas de rosa
Antes de finalizar
los tres minutos
hay que introducir
el matraz en la
cámara de flujo
laminar
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Colocar los trozos de hojas en el medio (mushirague & skoog) y observar los
resultados obtenidos.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
los callos obtenidos formados en el tratamiento realizado y en las diferentes epocas de
evaluacion presentan color verde claro y una consistencia compacta, aparente
desarrolados a partir de mesofilo del tejido foliar.
Se formaron mayormente en el brote del explante aunque también se encontraron en la
superficie del mismo, sobre nervaduras.
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Se observo la presencia de contaminacion microbiana, principalmente por hongos es
una de las limitantes en el éxito del establecimiento aseptico de los cultivos in vitro. La
presencia de microorganismos contaminantes ocurre principalmente cuando la planta donante
crece directamente en el campo y está expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes, sin ningún tipo de control ambiental.
8. CONCLUCIONES:
Se determinó que la contaminación fúngica tuvo una incidencia del 25% en la inducción de organogénesis directa utilizando explantes tomados de las hojas de rosas
Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de atender esta problemática en
el cultivo in vitro de plantas y de desarrollar estrategias para su control, como la utilización de muestras producidas en condiciones in vitro.
9. CUESTIONARIO:
Enumera cinco especies vegetales micropropagadas por la técnica de cultivo in
vitro de hojas.
I. Girasol (Helianthus sp.)
II. Tabaco (Nicotiana s.p)
III. Helechos de canela (Osmunda cinnamonea)
IV. Hoja de violeta africana (Saintpaulia ionantha)
V. Hojas de begonia
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Describe y comenta la importancia del proceso de obtención de shikonina a partir
del cultivo de células vegetales
la shikonia es un pigmento que se extrae de las raices de Lithospermum erythorohyzon, la planta perenne nativa de Japon, China y el Suereste asiatico.
Esta planta esta sufriendo una rapida disminucion de en su poblacion , ademas su
rendimiento en shikonina depende de la distribucion geografica y del clima, lo que
hace muy variable la disponibilidad de este pigmento. Aunque este no se puede
sintetizar quimica, el proceso es economica inpracticable ya que se requiere de
doce pasos y tiene un rendimiento de 0.7% .
La biosisntesis de la shikonina por medio de cultivos celulares de
L.erythrorhyzon es el mejor ejemplo que se puede dar sobre aplicabilidad de la
tecnologia para la produccion y la sisntesis quimica del pigmento caracterizan el
tipo de problemas que el cuntivo in vitro puede resolver, y por otro lado, la
shikonia ya entro en la etapa de produccion a gran escala.
La estrategia para la produccion de shikonina por celualas cultivadas in vitro
consistio primero en el desarrollo de un sistema de cultivo de dos fases, una de
rapido crecimiento celular y la otra de produccion de pigmento; las dos fases
dieron dieron un incremento cuatro veces mayor que el obtenido en el sistemas de una sola fase.
10.BIBLIOGRAFIA:
Alvarado, Y. 1998. “Contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas”. En:
Pérez Ponce, J.N. (Ed), Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Santa Clara, Cap 5 pp 81-104
Baker, P. Fossard, R. y Bourne, R. 1979. “Progress towards clonal propagation of Eucalyptus species by tissue culture techniques”.
Bianchini, F. y Pantano, A. 1991. “Tudo verde, Guía de plantas e flores”. Sao Paulo:
Mehloramentos. 135 p.