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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA –
UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA
CURSO DE MICROBIOLOGIA
TUTORA: YAMILE CORTES [email protected]
Blog: http://labmicrobiologiayamileunad.wordpress.com
PRACTICA II DE MICROBIOLOGIA
GUIA DE LABORATORIO
OBJETIVOS
Afianzamiento en las habilidades para manejar el microscopio y analizar sus ventajas y
limitaciones en el trabajo científico.
Comprobar las propiedades que posee el microscopio.
Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.
Aprender a utilizar los métodos de esterilización disponibles en el laboratorio.
Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiología.
Comprender las normas de bioseguridad y aplicarlas en el desarrollo de la práctica.
Realizar un correcto montaje del material a examinar
Identificar morfologías bacterianas
Identificar morfologías en hongos
Diferenciar microorganismos Gram positivos y Gram negativos, con base en la coloración de
Gram.
EQUIPO SUMINISTRADO
Microscopio
MATERIALES APORTADOS POR LOS ESTUDIANTES
Toallas de papel
Agua de florero
Agua con residuos orgánicos
Agua estancada
Agua de lluvia
Sangre
Hojas de espinaca
Cultivo de hongos en
diferentes frutas.
Cultivo de hongos en plátano
maduro
Cultivo de hongos en galleta o
en pan (preferiblemente
integral).
Cultivo de hongos en queso
crema
Yogurt
Lugol
Palillo plano
Portaobjetos o láminas
Cubreobjetos o laminillas
Bisturí
Alfileres
Copitos
Objetos de aseo personal
Bata de laboratorio
Guantes
Alcohol
Tapabocas
500 ml de alcohol para
mecheros
Medio de cultivo, con su
siembra, preparado con
anterioridad.
Cristal Violeta
Safranina
alcohol de 90º
EQUIPO
Computador portátil para consulta
Los materiales se utilizan por grupos de 5 personas, cada grupo debe tener todo el material.
RECOMENDACIONES
Lea atentamente las recomendaciones y normas de bioseguridad y además tenga en cuenta:
No debe salir con la bata fuera del laboratorio.
Debe trabajar muy concentrado pues un pequeño error o descuido, puede dañar todo su
trabajo en el laboratorio y tener el riesgo de contaminarse con bacterias patógenas.
Se recomienda el uso constante del tapabocas para evitar la aspiración de esporas
perjudiciales para el sistema respiratorio.
ES RECOMENDABLE LA VISUALIZACION DE LOS VIDEOS QUE APARECEN EN LA GUIA DE
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA DE PLATAFORMA QUE PUEDAN SER OPORTUNOS Y
NECESARIOS PARA UN BUEN DESEMPEÑO DE LA PRACTICA.
Se debe recordar la aplicación de las Normas generales de Bioseguridad- Esterilización
desinfección y manejo de equipos de laboratorio en todas las prácticas de laboratorio.
CADA ESTUDIANTE DEBE ENTREGAR UN DIAGRAMA DE FLUJO ANTES DE INICIAR LA
PRÁCTICA
CONTENIDO TEORICO
LAS BACTERIAS
Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos
micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 µm) y diversas formas, incluyendo esferas, bastones y
hélices. Existen evidencias de que estos organismos procariotas fueron las primeras formas
vivas que habitaron el planeta.
La mayoría de las bacterias poseen pared celular compuesta de peptidoglucano. Muchas
disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son móviles; poca importancia se
presta, no obstante, a la producción de cápsula, pese a que el 99% de las bacterias viven en los
medios naturales embebidas en una matriz o biofilm que no es otra cosa que una "cápsula
colectiva". Son los organismos más abundantes del planeta, y, el haber sido sus primeros
pobladores, y subsistir hasta la actualidad, justifica su ubicuidad, encontrándose en todos los
hábitat terrestres, como el suelo, los manantiales calientes y ácidos, los desechos radioactivos,
las profundidades del mar y la corteza terrestre.
Algunas bacterias pueden sobrevivir en las condiciones extremas del espacio exterior. Se estima
que hay alrededor de 40 millones de células bacterianas en un gramo de tierra y un millón en
un mililitro de aguadulce. Se estima que hay aproximadamente 5×1030 bacterias en el mundo.
Tan exagerada cifra está plenamente justificada si se tiene en cuenta que estos organismos
unicelulares son imprescindibles para el reciclaje de los elementos y muchos pasos importantes
de los ciclos biogeoquímicos serían imposibles sin su presencia. Como ejemplo cabe citar la
fijación del nitrógeno atmosférico, la mineralización de péptidos y compuestos orgánicos
nitrogenados, imprescindibles para las plantas.
Las bacterias desempeñan un papel importante en el reciclado de muchos elementos y
compuestos químicos en la naturaleza, muchos de ellos con una elevada toxicidad. En ausencia
de dichas actividades bacterianas, la vida en la Tierra no sería posible. Las basuras y los
desperdicios nos inundarían si las bacterias no acelerasen la descomposición de las plantas y
animales muertos. Como resultado de su actividad, los restos de sustancias orgánicas de las
plantas y los animales se descomponen en partículas inorgánicas. Este mecanismo es una
fuente importante de alimento para las plantas. Además, las leguminosas enriquecen el suelo al
incrementar el contenido de nitrógeno gracias a la ayuda de la especie Rhizobium radicicola
bacteria que infecta las raíces de las plantas y origina nódulos de fijación de nitrógeno. El
proceso fotosintético en que se basan las plantas fue desarrollado, originalmente, en bacterias,
así, de acuerdo a la teoría endosimbiótica, los cloroplastos y las mitocondrias de las células
eucarióticas derivaron de bacterias primitivas que parasitaron a otras procariotas.
Actualmente el trabajo microbiológico con las bacterias ha conllevado a afrontar los grandes
problemas ambientales que se han venido presentando debido a la falta de conciencia de
muchas personas, investigaciones encaminadas a la biorremediacion se vislumbran como las
posibles soluciones a la escases de responsabilidad de nuestra especie.
Los hongos poseen una distribución cosmopolita y poseen un amplio rango de hábitats, que
incluyen ambientes extremos como los desiertos, áreas de extrema salinidad expuestas a
radiación o en los sedimentos de los fondos marinos, algunos son resistentes a la radiación UV y
cósmica presente en los viajes espaciales. La mayoría son terrestres, aunque algunos son
estrictamente acuáticos. Existen especies acuáticas propias del océano.
Se han descrito unas 100000 especies de hongos, aunque la diversidad global no ha sido
totalmente catalogada por los taxónomos.
Por la belleza que guardan los hongos, muchos se han usado con un fin estético y ornamental.
Quizá el primer empleo directo que se les dio a los hongos es el de alimento. Mucho se ha
discutido sobre el valor nutritivo de ellos, si bien es cierto a la mayoría se les puede considerar
con elevada calidad porque contienen una buena proporción de proteínas y vitaminas y escasa
cantidad de carbohidratos y lípidos, algunos son utilizados en el mejoramiento de forrajes.
Por su parte algunos hongos degradan material orgánico e inorgánico y lo regresan al ambiente
de diferentes maneras. Otros se aprovechan en la producción de diversas sustancias químicas,
en la elaboración de productos alimenticios como el pan, vino, cerveza y queso. Son una valiosa
fuente de alimentación para el ser humano como los champiñones, las setas, las trufas.
Algunas especies se utilizan en la industria para producir ácidos orgánicos, como el cítrico,
láctico o gálico. Otros son patógenos, para plantas, animales, y hombre (pié de atleta, tiña y
candidiasis)
y algunos son alucinógenos y se utilizaban en ritos indígenas.
Los hongos producen otras sustancias importantes. El hongo Penicillium produce antibióticos,
entre ellos la penicilina.
Los hongos tienen una gran importancia económica para los humanos: las levaduras son las
responsables de la fermentación de la cerveza y el pan, y se da la recolección y el cultivo de
setas como las trufas. Desde 1940 se han empleado para producir industrialmente antibióticos,
así como enzimas (especialmente proteasas). Algunas especies son agentes de biocontrol de
plagas. Otras producen micotoxinas, compuestos bioactivos (como los alcaloides) que son
tóxicos para humanos y otros animales. Las enfermedades fúngicas afectan a humanos, otros
animales y plantas; en estas últimas, afecta a la seguridad alimentaria y al rendimiento de los
cultivos. En otros, la manipulación genética ha conllevado a la generación de hongos que
degradan restos orgánicos.
MEDIOS DE CULTIVO
Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la
superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que
van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo
de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por
muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se
multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria
individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de
millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un
nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
Tanto las bacterias como los hongos, son susceptibles no sólo de crecer en medios preparados
con anterioridad y que requieren de equipos que en ocasiones son de difícil adquisición y
manejo, sino que lo hacen de forma espontánea y sencilla en medios de cultivos que se
encuentran en la naturaleza y resultan de fácil adquisición y manejo.
Esta práctica primero incluye una breve introducción del manejo del microscopio y
reconocimiento de sus partes para hacer más eficiente el desarrollo de la práctica y luego la
observación de diferentes medios de cultivo encontrados normalmente y con abundancia en la
naturaleza en sus propios y necesarios procesos de descomposición en los cuales tanto
bacterias como hongos juegan un papel muy importante.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado, experimentalmente, más de 10.000 medios
de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición
a los líquidos orgánicos del cuerpo humano.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se
licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado
por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento
como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El
suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo
Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias
Gram-positivas).
El medio de cultivo utilizado en esta práctica, es un polisacárido sin ramificaciones obtenido de
la pared celular de varias especies de algas rojas de los géneros Gelidium, Euchema y Gracilaria
entre otros actuando como pigmento que da un color característico a cada una. La palabra agar
viene del malayo agar-agar, que significa jalea.
Químicamente el agar es un polímero de subunidades de galactosa; en realidad es una mezcla
heterogénea de dos clases de polisacáridos: agaropectina y agarosa.1 Aunque ambas clases de
polisacáridos comparten el mismo esqueleto de galactosa, la agaropectina está modificada con
grupos ácidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacáridos de agar sirven como la
estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua caliente y enfriado se
vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en microbiología, otros usos son
como laxante, espesante para sopas, gelatinas vegetales, helados y algunos postres y como
agente aclarador de la cerveza.
También es conocido por los siguientes nombres: gelosa, gelosina, gelatina vegetal, gelatina
china, gelatina japonesa, cola de pescado japonesa, etc. que se utiliza en la mayoría de los
medios de cultivo ya que además no tiene valor nutritivo para los microorganismos.
CUESTIONARIO DE ENTRADA
1. ¿Qué es un medio de cultivo y de que están compuestos principalmente?
2. ¿Cómo se clasifican de acuerdo a su proporción de agar y el suministro de nutrientes?
3. ¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo?
4. ¿En qué se diferencia un caldo de un medio solido?
5. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?
6. ¿Por qué los medios en agar son los más utilizados?
7. ¿Cuál es la diferencia entre las bacterias Gram Positivas y las Gram Negativas?
ACTIVIDAD 1.
Recuerde las recomendaciones para el uso adecuado del microscopio. Realice un minucioso
estudio sobre las partes del mismo. Para analizar las diferentes muestras propuestas a
continuación, tenga en cuenta el siguiente procedimiento:
1. Reconozca y ubique cada una de las partes del microscopio señalando cada una de ellas.
2. Realice un dibujo del microscopio y señale cada una de sus partes.
3. Encienda la lámpara, mire por el ocular y gradúe el espejo hasta que los rayos de luz
lleguen en forma plena.
4. Extienda sobre una lámina la muestra, adiciónele una gota de agua y cúbrala con una
laminilla (cubreobjetos). La muestra debe ser lo más delgada posible.
5. Muestras a utilizar en esta sección:
o Agua de florero
o Agua con residuos orgánicos
o Agua estancada
o Agua de lluvia
o Sangre
o Hojas de espinaca
o Yogurt
6. Coloque la lámina con la muestra sobre la platina, que debe estar seca.
7. Empiece a realizar las observaciones con el objetivo más pequeño.
8. Baje la platina hasta el tope, utilizando el tornillo macrométrico.
9. Coloque los ganchos sobre la lámina para asegurarla.
10. Suba la platina lentamente hasta lograr ver la imagen en forma nítida, luego mejore aún
más esa imagen utilizando el tornillo micrométrico.
11. Consulte sobre la manera de utilizar otro objetivo.
12. Observe las diferentes formas celulares e identifique la mayoría de estructuras
características de cada célula. Dibújelas e indique sus partes explicando las diferencias
características en términos evolutivos.
ACTIVIDAD 2. OBSERVACION DE ESTRUCTURAS CELULARES.
A. UNICELULARES ACUATICOS PROTISTOS
Se tienen tres tipos de aguas: de florero, con desechos orgánicos, y estancada, tome una
gota de cada muestra y colóquela en una lámina portaobjetos, cubra con una laminilla.
Retire el exceso de agua por los bordes utilizando papel absorbente. Observe el montaje
realizado al microscopio en 4X, 10X y 40X. Dibuje sus observaciones anotando el aumento
utilizado.
Las aguas estancadas son consideradas como medios de cultivo líquidos en los cuales se
desarrollan tanto organismos eucariotas como procariotas, busque e identifique estos dos
grupos de organismos y señale sus estructuras características.
B. HONGOS EN FRUTAS
Tome una muestra de hongos que se encuentren en desarrollo sobre cada una de las frutas
disponibles en el laboratorio colocando un pedazo de cinta transparente, colóquela sobre
una lámina portaobjetos y observe al microscopio, realice en cada resolución un dibujo de
cada una de las observaciones indicando las estructuras que mejor pudo observar en el
microscopio.
C. HONGOS SOBRE ALIMENTOS
Realice una observación de hongos negros (moho negro del pan) creciendo sobre una
galleta. Esta observación se debe realizar con un microscopio e identifique estructuras
reproductoras de los hongos denominadas esporangios.
D. OBSERVACION DE BACTERIAS (Lactobacillos)
1. Tome una gota de yogurt, colóquela sobre un portaobjetos y cúbrala con una laminilla.
Observe al microscopio y dibuje.
2. Luego a otra gota de yogurt agréguele una gota de lugol y cúbrala con una laminilla.
Observe al microscopio e identifique estructuras propias de organismos procariotas.
3. Observe en el computador la rapidez a la cual estos organismos se reproducen.
E. CELULA ANIMAL
Observación de células del epitelio interno de la boca mediante un raspado con un copito o
hisopo, seguido de un extendido en la placa portaobjetos y con la aplicación de una gota de
Lugol. Lleve al microscopio.
INSTRUCCIONES
Para la realización de las ilustraciones se puede ayudar con las imágenes mostradas en el
computador que se encuentra en el laboratorio, con el que le será más fácil la ubicación de
estructuras a veces imperceptibles en algunos aumentos.
Debido a que en la primera práctica no se han conformado los grupos, cada estudiante debe
conseguir el mayor número de materiales de forma individual (si es el caso).
ILUSTRE Y REGISTRE CADA UNA DE LAS OBSERVACIONES REALIZADAS AL MICROSCOPIO,
INDICANDO EL OBJETIVO UTILIZADO (por ejemplo 10X, 40X). AL MENOS DOS DIBUJOS DE
CADA MUESTA E INDIQUE SUS PARTES.
Al finalizar el trabajo, deje el microscopio en su correcta posición, limpie los objetivos, colóquele
la funda y guárdelo en su respectivo puesto.
RECUERDE QUE AL FINAL DE LA PRÁCTICA, SE DEBE ENTREGAR UN INFORME COMPLETO Y
DETALLADO DE LOS ITEMS SOLICITADOS, INMEDIATAMENTE TERMINE LA ACTIVIDAD.
SE PUEDEN ORGANIZAR GRUPOS NO MAYORES DE CINCO (5) PERSONAS.
INFORME DE LABORATORIO
El informe de laboratorio debe incluir:
1. PORTADA:
a. Titulo de la práctica
b. Datos completos de los estudiantes(nombre, cédula, correo electrónico, cead,
grupo, tutor virtual)
c. Fecha y sitio de realización de la práctica
d. Nombre del tutor que oriento la práctica y correo electrónico.
2. OBJETIVOS
3. INTRODUCCIÓN
a. Procesos involucrados
b. Fundamento teórico en que se sustenta la experiencia.
c. Intención del trabajo e importancia
d. Contexto y aplicaciones
4. RESPUESTAS A LAS PREGUNTAS FORMULADAS EN LA GUÍA.
5. PROCEDIMIENTO
a. Descripción de lo realizado
b. Diagrama de flujo
6. MATERIALES Y MÉTODOS (los realmente empleados en la práctica)
a. Descripción paso por paso de lo realizado en la experiencia.
b. Registro cuidadoso, ordenado y completo de todos los datos e información
recopilados.
c. Experiementos en detalle
d. Mediciones, observaciones
e. Incidentes, accidentes, eventos inesperados
f. Tratamiento estadístico de los datos, unidades de medida
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS:
Presentar de forma ordenada los resultados obtenidos por cada práctica y realizar una
discusión sobre los resultados obtenidos.
8. CONCLUSIONES
Análisis de la calidad de los resultados obtenidos.
9. BIBLIOGRAFÍA
Consultar normas ICONTEC.