Práctica 5. Determinación actividades metabólicas en bacterias.

Introducción

El metabolismo bacteriano consiste en el conjunto de reacciones que realizan las bacterias durante su crecimiento. Todas estas reacciones son catalizadas principalmente por endoenzimas, que funcionan dentro de la célula, o bien por exoenzimas que son liberadas al medio externo para catalizar reacciones fuera de la célula bacteriana, principalmente reacciones hidrolíticas. En esta práctica se determinarán las actividades amilasa y gelatinasa, que consisten en la producción de exoenzimas hidrolíticas para degradar compuestos complejos como el almidón y la gelatina respectivamente.

Por otra parte, el agua es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para las bacterias, tres factores críticos son la presión osmótica, la disponibilidad del agua y la desecación. El total de agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad del agua (aw). Cada vez que se disuelven sustancias en el agua pura aumenta la presión osmótica y disminuye la cantidad de agua disponible. En esta práctica se determinará el efecto de la presión osmótica y la actividad del agua sobre el crecimiento bacteriano. Además se evaluará el efecto de la desecación.

Objetivos

1. Realizar pruebas para demostrar actividades metabólicas en bacterias.

2. Determinar el efecto de la presión osmótica, la actividad del agua y la desecación sobre el crecimiento bacteriano.

Materiales y métodos

I. Determinación de la actividad amilasa

Materiales

Cultivos bacterianos de prueba Marcador permanente Placas con agar almidón (10 g/l almidón; 5 g/l peptona; 8 g/l NaCl; 3 g/l extracto de

carne; 15 g/l agar; pH 6.5-7) Mechero Asa bacteriológica Lugol Gotero

Procedimiento

1. Utilizando un marcador permanente, divida la placa agar almidón por la parte de atrás en tres secciones.

2. Inocule dos secciones por estría simple con dos cepas diferentes y deje una sección sin inocular. Rotule adecuadamente la placa.

3. Incube a 35oC durante 24 h, o bien a temperatura ambiente durante 72 h. 4. Transcurrido el tiempo de incubación, determine la actividad de amilasas en las

placas agar almidón por la aparición de zonas claras alrededor de las colonias. Para visualizar mejor dichas zonas claras, agregue unas gotas de lugol a la placa. Compare las secciones inoculadas con la zona sin inocular.

II. Determinación de la actividad gelatinasa

Materiales

Cultivos bacterianos de prueba 3 tubos con 7ml de agar gelatina (5 g/l peptona; 3 g/l extracto de carne; 120 g/l

gelatina; pH 6.8) solidificados en forma recta Mechero Asa de punta Ácido tricloroacético al 5% (TCA) Gotero

Procedimiento:

1. Inocule dos tubos de agar gelatina con los cultivos de prueba por picadura recta y deje un tubo sin inocular.

2. Rotule adecuadamente e incube a 35oC durante 24 h, o bien a temperatura ambiente por 72 h.

3. Transcurrido el tiempo de incubación, observe la licuefacción del medio y agregue unas gotas de solución de TCA al 5%. Observe la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio. Compare con el tubo sin inocular.

III. Efecto de la presión osmótica, la actividad del agua y la desecación en el crecimiento bacteriano

Materiales

Cultivos bacterianos de pruebaAsa bacteriológica3 tubos de ensayo con 7ml de CN +10% sacacosa (p/v)3 tubos de ensayo con 7ml de CN +30% sacacosa (p/v)3 tubos de ensayo con 7ml de CN +60% sacacosa (p/v)3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 1% NaCl (p/v)

3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 5% NaCl (p/v)3 tubos de ensayo con 7ml de CN + 10% NaCl (p/v)3 tubos de ensayo estériles vacíosCN estérilMicropipetasPuntas azules para micropipeta estériles

Procedimiento

1. Para evaluar el efecto de la presión osmótica y la actividad del agua, inocule los cultivos de prueba en dos de los tres tubos de CN con diferentes concentraciones de NaCl y de sacarosa. Deje un tubo de cada concentración sin inocular. Rotule adecuadamente. Incube todos los tubos a temperatura ambiente durante una semana, realizando observaciones diarias. Compare los inoculados con el tubo sin inocular.

2. Para evaluar el efecto de la desecación, en dos de los tres tubos vacíos, inocule una gota de los cultivos de prueba. Deje uno de los tres tubos sin inocular. Incube los tres tubos a temperatura ambiente durante una semana. Transcurrido el tiempo de incubación, agregue 3 ml de CN estéril a cada uno de los tres tubos. Reincube todos los tubos a 35 ºC por 24 h o bien a temperatura ambiente por 72 h. Observe y compare los tubos inoculados con el tubo sin inocular.

Resultados

I. Determinación de la actividad amilasa

Complete el siguiente cuadro según se indica a continuación: No hay crecimiento (-), poco crecimiento (+), crecimiento intermedio (++), crecimiento abundante (+++), Actividad sobre sustratos (+ ó -).

ParámetroCultivos de prueba Tubo control sin

inocularCrecimiento

Color del medio con Lugol

Hidrólisis del almidón

II. Determinación de la actividad gelatinasa

Complete el siguiente cuadro según se indica a continuación: No hay crecimiento (-), poco crecimiento (+), crecimiento intermedio (++), crecimiento abundante (+++), Actividad sobre sustratos (+ ó -).

ParámetroCultivo de prueba Tubo control sin

inocularCrecimiento

Licuefacción del medioFormación de

nubosidad al agregar TCA 5%

Hidrólisis de gelatina

III. Efecto de la presión osmótica y la actividad del agua en el crecimiento bacteriano

Complete el siguiente cuadro según según se indica a continuación: No hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (+++).

Parámetro Cultivo de prueba Tubo control sin

inocular

Presión osmótica y actividad del agua

aw=0.990 Sacarosa 10%

NaCl 1%

aw=0.970 Sacarosa 30%

NaCl 5%

aw=0.970 Sacarosa 60%

NaCl 10%

Desecación

Cuestionario1. ¿Cuáles macronutrientes pueden ser aprovechados en el almidón y en la gelatina?2. ¿Qué relación hay entre aw y la humedad relativa?

BibliografíaAquiahuati, M. y Pérez, M. 2004. Manual de Prácticas del Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana. México D.F., México. 116p.