DISEO EXPERIMENTAL

Primeramente se prepararon o se obtuvieron los cultivos con diferentes cualidades o aportes al microorganismo, esto a fin de evaluar la participacin de los componentes propios de cada medio, en la tabla siguiente se muestra la distribucin de dichos componentes as como las condiciones de crecimiento.

Obtencin de Cultivos

MATRAZKNO3OLIGOELEMNTOSCONDICIONES

1-+Anaerbicas

2++Anaerbicas

3+-Anaerbicas

4++Aerbicas

Se observa la participacin de los oligoelementos (cofactores), del nitrato (componente para respiracin) y por ultimo las condiciones de medio que determinaran el proceso que realizara el microorganismo usando as determinadas enzimas, y evaluando su actividad.

Determinacin de la actividad de la formiato deshidrogenasa.

En la actividad de formiato deshidrogenasa se adiciono 2-6Diclorofenolindofenol siendo este un aceptor de electrones, sufriendo as una reduccin y cambiando su coloracin, por lo que el anterior compuesto utilizado adems de ser aceptor acta tambin como un indicador de la actividad enzimtica siendo que a mayor desaparicin de color mayor actividad enzimtica existir. Por otro parte se adiciono formiato de sodio (enzima), metasulfato de fenazina siendo este ltimo un acarreador de electrones, ya por ltimo se adicionaron los 4 diferentes extractos celulares y se evala la actividad enzimtica del microorganismo por variaciones de absorbancia a diferentes tiempos, tal que este sea comparable con una curva tipo realizada previamente. (La cual no tendr actividad Enzimtica). La oxidacin del formiato de sodio, catalizada por la FDH, genera electrones que reducen el compuesto metosulfato de fenazina (PMS) que posteriormente reducir la 2,6 diclorofenol indofenol (DCIP).

Determinacin de la actividad de nitrato reductasa.

Para la actividad de nitrato reductasa se adiciono nitrato el cual actuara de aceptor final de electrones sustituyendo as al oxgeno en condiciones de anaerobiosis, se adiciono benzil viologeno el cual es un acarreador que recibir los electrones provenientes del hidrosulfito y posteriormente transformara el nitrato a nitrito para las funciones metablicas del microorganismo, posteriormente se determin la actividad enzimtica del complejo compuesto de las 2 enzimas anteriores.Reduccin del bencil viologno:

Determinacin de Nitritos

Para ambas actividades se determin la presencia de nitritos por un mtodo espectrofotomtrico (Mtodo de Griess).

Determinacin de protena por el mtodo de LowryYa por ltimo se determin la protena por el mtodo de Lowry, a fin de cuantificar la actividad enzimtica por miligramo de protena presente en el medio dentro del cual se desarroll el microorganismo.

Mtodo de LowryEs un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de LambertBeer.Este mtodo consta de dos etapas: Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.