MÓDULO V. OBTENCIÓN DE MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS

PRACTICA 4: RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Cruz Hernandez Erandi, Mendieta Gonzalez Marisela, Ramirez Ceja Karen Arlette, Valtierra Gomez Nelly Elizabeth

INTRODUCCIÓN

Metabolitos Primarios:

Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.

Metabolitos Secundarios:

Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o lumínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo

secundario es una característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de actividad enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides.

FENILPROPANOS

Son sustancias naturales ampliamente distribuidas en los vegetales caracterizadas por un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados sintéticamente

del ácido shikimico, la cadena lateral puede presentar varios estados de oxidación e insaturación. El anillo aromatico generalmente esta sustituido en los carbonos 3,4 y 5 siendo estos sustituyentes grupos hidroxilo o metoxilo principalmente.

ACETOGENINAS

Las acetogeninas de anonáceas, son sustancias cerosas que resultan de la

combinación de ácidos grasos de cadena larga (C33 o C34), con una unidad de 2-ptopanol en el carbono 2 para formar una lactina.

Las acetogeninas pueden ayudar en la regeneración celular ya que en nuestro cuerpo las células se regeneran a cada segundo. La Graviola o guanábana es una planta de la cual puede aprovecharse no

sólo el fruto que contiene abundantes nutrientes y vitaminas, sino también las propiedades medicinales de sus diferentes partes, sobre todo las hojas.

TERPENOIDES

Los terpenoides son a menudo llamados isoprenoides teniendo en cuenta que el isopreno es su precursor biológico. Presentan una gran variedad estructural, derivan de la fusión repetitiva de unidades ramificadas de cinco carbonos basadas en la estructura del isopentenilo, son monómeros considerados como unidades isoprénicas y se clasifican por el número de unidades de cinco carbonos que contienen en mono, sesqui, di, tri, tetraterpenos,…. Los productos que provienen del

metabolismo del isopreno abarcan a los terpenos, los carotenos, las vitaminas, los esteroides, etc. La biogénesis de los terpenoides se puede dividir en cuatro etapas generales, que son:

Etapa 1: Síntesis del isopentenilpirofosfato (IPP): Vía ácido

mevalónico (MVA) o vía no de ácido mevalónico o vía de 1-desoxi-D-xilosa-5-fosfato (DOXP).

Etapa 2: Isomerización del IPP a dimetilalilpirofosfato (DMAPP), adición repetitiva de IPP y DMAPP.

Etapa 3: Elaboración de moléculas de prenilpirofosfato.

Etapa 4: Modificaciones enzimáticas de los esqueletos.

ESTEROIDES

Los esteroides, son lípidos simples no saponificables, en su mayoría de origen eucarionte, derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno.

Este grupo de compuestos presentan variadas acciones fisiológicas de gran importancia de un sistema de anillos fusionados que forman un esqueleto común a todos los compuestos esteroidales.

RECONOCIMIENTOS DE METABOLITOS:

El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un aducto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el

cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.

Reconocimiento de Alcaloides:

Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido orgánico.

Reconocimiento de Flavonoides:

Los Flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono, cuya estructura consta de 2

anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 – C3 – C6.

CATEQUINA

Reconocimiento de Cardiotónicos:

Una aglicona cardiotónica, estructuralmente está constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C–18 y C-19, un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico α-β insaturado de cuatro carbonos unido al carbono 17 del núcleo esteroidal.

Reconocimiento de Saponinas:

Las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua, que

tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial del agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina. La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosídico siempre se forma con el oxígeno del carbono 3.

Reconocimiento de Cumarinas:

Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólicos y tienen en común la estructura química de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan

fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

Reconocimiento de Taninos:

Los taninos son productos de excreción de muchas plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se encuentran más comúnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Químicamente los taninos son polímeros de

polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en:

Taninos Hidrosolubles o Pirogálicos: Son ésteres fácilmente hidrolizables formados por una molécula de azúcar (en general glucosa) unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledóneas.

Taninos no Hidrosolubles o Condensados: Tienen una estructura química similar a la de los flavonoides. Por hidrólisis dan azúcar y ácido elágico, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrólisis ácida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.

MATERIALES Y MËTODOS

Reactivos y materiales necesarios

150 ml HCl al 5% 1 ml peróxido de hidrógeno al

20%

50 ml Acetato de plomo al 4% con ácido acético al 0.5%

2 ml Urea 10M gotas de FeCl 3 al 10% 2 ml de ácido sulfúrico al 50% 2 ml de solución NaOH al 5%

con amoniaco al 2%

R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio.

R. gelatina-sal R. Kedde soluciones A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno

2 ml anhídrido acético Ácido sulfúrico concentrado Ácido clorhídrico concentrado 5 papeles de filtro Limaduras de magnesio Sulfato de sodio anhidro Centrifuga 2000 RPM y 2 -4

tubos Cuchillo.

RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES:

Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra esté en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño maría durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de quinina en solución ácida.

RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES:

Leucoantocianidinas y Cardiotónicos: En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al baño maría durante unos

5 minutos, con agitación constante. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual de solución de acetato de plomo al 4% que contenga ácido acético al 0.5 %, agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos.

ENSAYO PARA FLAVONOIDES:

Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de rutina o quercetina en solución acuo -alcohólica.

ENSAYO PARA LEUCOANTOCIANIDINAS: Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparición de coloraciones

rojas es prueba positiva de la existencia de leucoantocianidinas en la muestra.

ENSAYO PARA CARDIOTÓNICOS:

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra.

ENSAYO PARA SAPONINAS:

Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra.

ENSAYO PARA TANINOS:

Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Añadir 2 -3 gotas de solución de cloruro férrico al 10%. La formación de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparición de colores o precipitados verdes, azules o

negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra.

ENSAYO PARA TRITERPENOIDES Y/O ESTEROIDES:

Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitación. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgánico. Añadir 1 ml de anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar resbalar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides.

ENSAYO PARA QUINONAS:

Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca (ó 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fracción acuosa.

RECONOCIMIENTO DE ANTOCIANINAS

En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos 5 minutos. Filtrar.

Ensayo: En un tubo de ensayo colocar 2 ml de filtrado. Añadir 1 ml

de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Añadir unas 6 gotas de un ácido mineral diluido. Observar el color formado. - Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH.

RECONOCIEMIENTO DE CUMARINAS

En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la

boca del tubo de ensayo con un papel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullición el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y retirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm.

RESULTADOS

Reconocimiento de alcaloides

Ensayo de Boldo

Se observó turbidez en los dos tubos de ensayo que se prepararon con el reactivo de Drandorff y Meyer

Imagen 1

Imagen 2

Reconocimiento de Flavonoides, Leucoantocianidinas y Cardiotónicos

Ensayo con pétalos de rosa a) Flavonoides; la presencia de

color rosa indico que la prueba fue positiva y que hubo presencia de flavonoides en nuestra materia prima.

b) Leucoantocianidinas se presentó una ligera coloración

roja lo que determinó que la prueba fue positiva.

c) Cardiotónicos hubo presencia de coloración purpura y la prueba fue positiva.

Imagen 3

Ensayo de saponinas

Ensayo de penca de sábila

Se presentó espuma abundante de color blanco y eso indico que hubo presencia de saponinas en la muestra de sábila.

Imagen 4

Ensayo de Taninos

Ensayo de plátano

Hubo presencia de coloración, lo que indico que la prueba fue positiva y la muestra de plátano tenia metabolitos de taninos.

Imagen 5

Imagen 6

Ensayo para Triterpenoides y/esteroides

Ensayo de olivo

Se formaron colores azules, lo que determinó que la prueba es positiva

Imagen 7

Reconocimiento de Antocianinas

Ensayo de uvas

El primer filtrado con el NaOH diluido, presento un color café claro, como se observa en la imagen 8 (tubo derecho).

El ensayo con el ácido mineral diluido tuvo, un color entre rojo-rosado.

El ensayo nos indicó que hubo presencia de antocianinas en las uvas.

Imagen 8

Reconocimiento de Cumarinas

Ensayo de pétalos de rosas

El resultado que se debió obtener era una coloración fluorescente de color verde, amarilla o roja.

Imagen 9

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Los alcaloides identificados del boldo, presentaron turbidez en los tubos, con los reactivos que había disponible en el laboratorio, que fueron Dragendorff y Meyer. Lo que permitió identificar que había

alcaloides. Los flavonoides identificados de los pétalos de rosa, fueron los leucoantocianidina y cardiotónico, identificándose colores rosa, rojo y purpura. La sábila presento saponinas, y se obtuvo espuma color blanco dando positivo el ensayo. El ensayo de taninos fue

un poco tardado, debido a que no había centrifuga en el laboratorio, lo que se tuvo que dejar en sedimentación para que después se decantara el sobrenadante y poder continuar con el ensayo. Y el plátano dio positivo en prueba de taninos ya que hubo aparición de color en el tubo. El olivo mostro que tiene presencia de esteroides o triterpenoides debido a su coloración azul. El ensayo de quinonas no se

llevó a cabo debido a que no hubo muestra. Las antocianinas se presentaron en el ensayo con uvas, donde se pudo observar dos distintas coloraciones que fue un rojo, rosado y un café claro indicando que hay un pH distinto, por presencia de una base y un ácido. El reconocimiento de cumarinas no pudo ser concluida, por falta de tiempo y se dejó a la mitad y ya no se pudo observar el papel filtro con la luz ultravioleta.

CONCLUSIÓN

El reconocimiento de metabolitos secundarios es una prueba sencilla aunque se lleva un poco de tiempo en preparar las plantas de acuerdo a cada reconocimiento, se realizaron las pruebas para reconocer alcaloides, flavonoides, saponinas, taninos,

esteroides, y antocianinas, de las cuales en todas se obtuvo positivo en el reconocimiento, finalmente cumarinas, la cual no se concluyó por falta de tiempo y no se logró observar con la luz ultravioleta. La práctica se realizó correctamente y se obtuvieron los resultados esperados.