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Práctica 2 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE DIFERENTES FUENTES Dra. Yenizey M. Alvarez 26.08.13

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Page 1: Práctica 2

Práctica 2

EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE DIFERENTES FUENTES

Dra. Yenizey M. Alvarez

26.08.13

Page 2: Práctica 2

IntroducciónLa extracción y purificación de los ácidos nucleicos es el primer

paso en la mayoría de los estudios de Biología Molecular.

Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otroscomponentes celulares que pueden interferir con los experimentoscomo: proteínas, ARN y lípidos.

Page 3: Práctica 2

Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos nucleicos, los cuales son seleccionados según:

• El tipo de ácido nucleico

• El organismo de donde se extraerá

• El material de extracción

• Los resultados deseados

• La posterior aplicación

1.Amplificación

2.Clonación

3.Expresión

Page 4: Práctica 2

Es Importante Diferenciar dos Conceptos

• Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: – Lisis de las células que contienen a los AN– Inactivación de nucleasas– Clarificación: separación de los AN de los restos

celulares (debris).

• Purificación: Separación de AN:– De proteínas solubles – De otros AN no deseados– De Lípidos, carbohidratos– De sales y otros compuestos orgánicos

Page 5: Práctica 2

Para muchas aplicaciones que involucran manipulaciónde AN es necesario disponer de éstos en estado puro.

¿Por qué purificar?

El desafío es separar los ácidos nucleicos deseados desde unamezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN

•Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

•Nucleasas que se liberan al lisar las células degradanlos ácidos nucléicos.•Interferentes que inhiben a las enzimas que se usanen ingeniería genética.

Page 6: Práctica 2

Disgregación o fragmentación del tejido

Lisis celular

Clarificación

Purificación

AnálisisCualitativo

electroforesis

Cuantitativo

espectrofotometría UV

Etapas básicas de un procedimiento general para

Extracción y Purificación de AN

Estas etapas

deben ir

acompañadas de

medidas o

agentes que

inactiven

nucleasas

celulares

Durante todo el

procedimiento se

debe usar

soluciones y

material estéril, ademas

de guantesPrecipitación

Page 7: Práctica 2

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados

• Cantidad de material de partida – Número de copias de las moléculas de AN

– Cantidad de tejido

• Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)

• Contaminantes en el material biológico

• Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

Page 8: Práctica 2

1. Métodos de fragmentación y lisis celular para la extracción de AN

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para

romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida

para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

• Métodos físicos

– Homogenización mecánica,

– Homogenización en solución

– Molienda manual en mortero

– Bolitas de vidrio

– Sonicación

•Métodos químicos

– Detergentes

•Métodos enzimáticos

– Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglucano de la pared celular de bacterias

– Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras

– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.

Page 9: Práctica 2

2. Clarificación. Eliminación de restos celulares (debris)

– Centifugación

– Filtración

–Método mixto: enzimas + centrifugación

Page 10: Práctica 2

3. Purificación

• Desproteinización con fenol (denaturaliza proteínas)

• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)

• Cromatografía– De intercambio iónico– De adsorción a sílica– De filtración

• Extracción de DNA a partir de un gel de agarosa

Page 11: Práctica 2

Extracción Fenólica de proteínas

fenol

Page 12: Práctica 2

ADN total = ADN cromosómico = ADN plasmídico

Page 13: Práctica 2

Extracción de ADN plasmídico

Los plásmidos utilizados en Ingeniería genética sedenominan vehículos o vectores y pueden serutilizados para la clonación y la expresión de genes,entre otras aplicaciones.

Protocolos de extracción:

• La desnaturalización alcalina con SDS (dodecilsulfato de sodio),

• La precipitación sal-SDS • La ebullición rápida.

Page 14: Práctica 2

Solución I(almacenadas a 4°C)

Solución II(preparar antes de ser utilizada)

Solución III(almacenadas a 4°C)

Purificación

Page 15: Práctica 2

Cuantificación de ADN por espectrofotometría

Concentración de ADN puede ser determinada midiendola absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetroutilizando una cubeta de cuarzo.

– Medidas tomadas a una A260 deben estar entre 0.1 y 1.0.

– Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm correspondea 50 µg de ADN/mL

A260nm de DNA de cadena doble = 50 μg / mLA260nm de DNA de cadena sencilla = 33 μg / mLA260nm de RNA de cadena sencilla = 40 μg / mL

Page 16: Práctica 2

Pureza de ADN:

Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.)

ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5

Proporción A260/A230

A230 nm= Indica la presencia de sales caotrópicas o compuestos órganicos. Se desean proporciones mayores a 2.

Proporción A260/A280

Lecturas a 320 nm podrían indicar si hay turbidez en la solución “posible contaminación”

Page 17: Práctica 2

A260/A230 ≥ 2

A260/A280 =1.7-2.0

A230 nm= 0

Page 18: Práctica 2

Determinar el % de proteína y ADN en la muestra

Page 19: Práctica 2

NanoDrop

Page 20: Práctica 2

¿Qué es la electroforesis?

La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorios para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.

De frente móvil (en solución)

Tipos:

De zona (sobre un soporte)

Agarosa Poliacrilamida

(DNA) (DNA y proteínas)

Geles (a través de una matríz porosa)En papel Sílice

Page 21: Práctica 2

La movilidad del DNA depende de:

Factores extrínsecos a la partícula

[agarosa] o [poliacrilamida]

Voltaje

Buffer

Tiempo

Temperatura

pH

Factores intrínsecos a la partícula

Relación carga/masa

Conformación

Tamaño

Page 22: Práctica 2

Log(

PM

o K

bs)

m

0,5%

0,7%

1%

1,2%

% de agarosa

a b

m b > m a

[ ] Agarosa

A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye

A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta

Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.

Page 23: Práctica 2

% agarosa Rango separación

poliacrilamida 1-5 pb a 500 pb

0,5 700 pb a 25 Kpb

0,8 500 pb a 15 Kpb

1 250 pb a 12 kpb

1,2 150 pb a 6 kpb

1,5 80 pb a 4 kpb

Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante

Poliacrilamida

Alta resolución

NO para fragmentos grandes

Difícil de armar

Agarosa

Baja resolución (poros grandes)

SI fragmentos grandes

Fácil de armar

Si el % es muy bajo el gel es frágil

=

Page 24: Práctica 2

Voltaje aplicado

Voltaje típico = 10 V / cm de gel

Mejor resolución Voltajes menores (70 V)

(máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)

Buffer de corrida

ComposiciónTAE

TBE

Más usado. No puede reciclarse mucho.

Mayor capacidad buffer

Page 25: Práctica 2

Loading Buffer

Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra

Colorantes de corrida

(ubicar frente de corrida)

Azul de bromofenol

(corre como DNA 300 pb)

Xylene Cyanol(corre como DNA 4000 pb)

Orange G

(corre como DNA 50 pb)

Page 26: Práctica 2

Equipo de Electroforesis de Agarosa

Bio-Rad

• Cubetas de Electroforesis

• Fuentes de Electricidad

• Geles de agarosa preparados

PowerPac™

Junior PowerPac™

Basic

PowerPac™

HC PowerPac™

Universal PowerPac™

3000

Mini-Sub®

Cell GT Wide Mini-Sub Cell GT

Page 27: Práctica 2

Electroforesis

• Corriente

Fuente de Poder

Búfer

Tinta

Gel de agarosa

OCH2

O

P O

O

OBase

CH2

O

P

O

O

O

Base

OH

Azúcar

Azúcar

O

Page 28: Práctica 2

Conformación del DNA plasmídico

DNA circulares: 3 conformaciones posibles

CCC

Lineal

CA

Circular covalentemente cerrado

(superenrrollado)

Circular abierto

+

-

0,6 a 1% agarosa

Page 29: Práctica 2