PRACTIVA N 10

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACI ESBI Blgo. Mblgo. Daniel Machaca Mena

PRCTICA N 10: CICLO CELULAR Y MITOSIS

I. INTRODIUCCION

Dentro de las funciones que realiza la clula eucarionte, dos de las ms importantes: la regulacin y la reproduccin celular descansan en el ncleo. El ncleo contiene la mayor parte de la informacin hereditaria de la clula, es decir, las instrucciones necesarias para el desarrollo y el metabolismo de las especies. Este organelo es el encargado de duplicar su informacin gentica para transmitirla a las nuevas generaciones cuando la clula se reproduzca. Los procesos que se manifiestan desde la formacin de una clula hasta su propia divisin en dos hijas, son lo que se denomina ciclo celular. Este ciclo se divide en dos etapas principales: la interfase y la divisin celular, de acuerdo con los sucesos que se presentan en la clula. La interfase se caracteriza por una serie de procesos que implican la fabricacin activa de molculas tales como las protenas y la duplicacin del DNA. Mientras que la divisin celular consta de la mitosis en la que ocurre la condensacin y separacin de los cromosomas y de la citocinesis o divisin citoplsmica. II. OBJETIVOS

Identificar las diferentes fases del ciclo celular (interfase o divisin mittica) en clulas de raz de cebolla con el microscopio ptico.

III. MATERIAL

Materiales: Microscopios, laminas porta y cubre objetos, tijeras, pinzas, luna de reloj y tubos de ensayo. Material biolgico: Raz de cebolla (Allium cepa)Reactivos y colorantes: cido actico al 45%, HCl 1N, Orceina, Orceina A y B

IV. MARCO TEORICO

La mitosis es el mecanismo de divisin celular en eucariotas que subyace a cualquier fenmeno de proliferacin celular. La observacin microscpica de los cromosomas durante la mitosis es sencilla cuando se preparan extensiones de tejidos meristemticos, particularmente si se trata de meristemos radiculares de Allium cepa (cebolla), por la alta tasa de mitosis de este tejido, el tamao de sus clulas y la facilidad para preparar extensiones celulares sobre una porta. La tincin del material nuclear con orcena actica permite observar los cromosomas en diferentes momentos del ciclo mittico. La ordenacin cronolgica de estas figuras permite reconstruir los acontecimientos que tienen lugar en el ncleo celular durante el proceso, como si de una secuencia fotogrfica se tratara, e identificar cada una de las fases que tradicionalmente se establecen en la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase).

1. Interfase. No es una fase de la mitosis, es el perodo entre 2 mitosis sucesivas. En la interfase se distingue el ncleo con la cromatina y los nucleolos. La cromatina se defini, en principio, como la sustancia que constituye el ncleo interfsico y muestra ciertas propiedades de tincin por colorantes bsicos. La mayora de los autores la definen como la asociacin de ADN e histonas. La interfase se divide en tres subfases: G1, perodo anterior a la duplicacin de la cromatina.

S, perodo de sntesis de la cromatina o de replicacin del ADN y sntesis de histonas.

G2, fase posterior a la duplicacin de la cromatina y anterior al inicio de la siguiente mitosis.

La duracin relativa de G1, S y G2 vara de una especie a otra y depende as mismo de la clula de la que se trate. Durante estos 3 perodos se produce la sntesis de protenas. La sntesis de ARN se produce sobre todo en los periodos G1 y G2. Cuando una clula no va a dividirse de nuevo y el ncleo interfsico no entra en el perodo S se dice que la clula se halla en perodo G0.

2. Mitosis o cariocinesis. La mitosis es un proceso continuo y comprende:

1.1. Profase. La cromatina comienza a condensarse y espiralizarse formando los cromosomas. Los cromosomas desde el principio aparecen formados por dos cromtidas hermanas que son, gentica y morfolgicamente idnticas. Ambas cromtidas se mantienen unidas por el centrmero. Mientras la membrana nuclear est intacta y el o los nucleolos sean visibles, se dice que la clula est en profase. Al final del periodo profsico el nucleolo o nucleolos se desorganizan y la membrana nuclear se desintegra. Los cromosomas quedan libres en el espacio celular. Mientras tanto, en el citoplasma, los centriolos se han duplicado y cada diplosoma (par de centriolos), ha emigrado a un polo de la clula. A partir de los centriolos se organizan los microtbulos que forman huso acromtico o mittico, en los que se insertan los cromosomas por el centrmero y comienzan a emigrar hacia la placa ecuatorial.

1.2. Metafase. Los cromosomas han alcanzado su mximo grado de condensacin. Se disponen en crculo en la zona central en la zona llamada placa ecuatorial o metafisica con los centrmeros perfectamente orientados, con cada cromtida hacia un polo celular. Esta orientacin asegura la correcta separacin en la fase siguiente.

1.3. Anafase. En esta fase las cromtidas de cada cromosoma se separan y emigran hacia los polos, de manera que a cada uno van 2n cromtidas. Este movimiento se realiza gracias al huso acromtico o mitotico. Como ambas cromtidas son idnticas, porque se formaron por duplicacin de la fase S de la interfase, los polos celulares reciben, exactamente el mismo material gentico. El anafase concluye cuando todos los cromosomas han alcanzado los polos.

1.4. Telofase. Las cromtidas han terminado su migracin hacia los polos. El huso mitotico se desintegra. La membrana nuclear se reconstruye alrededor de las cromtidas, los nucleolos vuelven a formarse y las cromtidas se descondensan volviendo a formar la cromatina. Se han formado 2 ncleos hijos.3. Citocinesis. Es el proceso por el cual el citoplasma de la clula madre queda distribuido entre las 2 clulas hijas y estas se independizan por la formacin de la membrana celular. La separacin de las 2 clulas hijas es diferente en clulas animales y vegetales. En las clulas animales se produce la plasmocinesis, en la que a partir de la periferia de la clula el citoplasma se va estrangulando hasta que las clulas hijas se ponen en contacto. En las clulas vegetales se forman vesculas membranosas en la zona comprendida entre los ncleos hijos. Estas vesculas se fusionan unas con otras dando origen a la membrana plasmtica, quedando entre las membranas el contenido de las vesculas que constituir la pared celular.

V. PROCEDIMIENTOUnos cinco das antes de realizar la prctica, se colocar un bulbo de cebolla tapando la boca de un frasco, que se llena hasta que el agua toca la base de la cebolla. Se logra as el desarrollo de numerosas raicillas jvenes, cuando stas tengan una longitud de 3 centmetros es el momento adecuado para hacer la preparacin.A. La preparacin de las lminas se realizar de acuerdo al siguiente protocolo:

1. Lavar las races cortar con las tijeras unos 2-3 mm del extremo de las raicillas (pices) y depositarlo con una pizna en una placa petri con agua destilada por 5 minutos.2. Coloque las raicillas en un tubo de ensayo y aada cido actico al 50% de 1 a 30 minutos o HCl al 1N por 8 minutos para que el tejido radical se ablande. Lavar las races para eliminar el HCl, utilizando 3 cambios de agua destilada de 5 minutos cada uno, para un total de 15 min de proceso de lavado. Es importante el lavado del HCl pues ste interfiere con la coloracin de los cromosomas.

La maceracin con el cido provoca la disgregacin celular del tejido meristemtico, por degradacin de la lmina media de la pared celular, permitiendo una buena separacin de las clulas. Este paso es muy sensible al tiempo transcurrido: si se deja actuar demasiado al cido, ste digiere completamente la lamina media y penetra en el interior celular comenzando la degradacin del protoplasto y su contenido; por el contrario, si el tiempo de accin del cido no es suficiente, no se lograr la degradacin de la lamina media y la consecuente disgregacin del tejido meristemtico y las clulas no podrn por tanto disponerse en una monocapa luego de su separacin, por lo que los resultados sern lminas con clulas superpuestas, donde es imposible distinguir las diferentes fases mitticas.3. Colocar las raicillas en una luna de reloj y cubrirlas con orceina actica al 45%, realizar leves calentamientos con el mechero hasta el desprendimiento de vapores y dejar enfriar por 5 minutos. Repetir el calentamiento 2 veces. Procure que el colorante no se seque esto aadiendo ms orceina.4. Colocar en una lmina porta objetos las raicillas y aada una gota de colorante orcena, tape el preparado con un cubreobjetos teniendo cuidado que no entre aire y realiza un SPLASH.

Tcnica: sirve para extender la masa celular, coloque la lmina entre hojas de papel de filtro o una servilleta absorbente y presione suavemente con la yema del dedo pulgar firmemente contra la superficie plana y uniforme de una mesa, pero con cuidado de no romper la lmina, y sobre todo, de no mover lateralmente el cubreobjetos mientras se ejerce la presin; el movimiento lateral del cubreobjetos genera el enrollamiento de las clulas meristemticas formando capas lo que dificultara la observacin microscpica del preparado.5. Realice las observaciones bajo el microscopio con objetivo de inmersin, ubicar las agrupaciones de clulas meristemticas e identificar las distintas fases que caracterizan interfase y la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase)

B. Mtodo alternativo Corta con las tijeras el pice de una raz de cebolla (unos tres milmetros) y colcalo en un vidrio de reloj.

Aade unas gotas de orcena A de forma que el pice quede bien cubierto y calienta suavemente a la llama hasta que se desprendan vapores. Evita la ebullicin de la orcena y procura que el pice de raz no se quede seco.

Retira de la llama y mantn el pice sumergido en el colorante (orcena A) durante 10 minutos.

Coloca la raicilla sobre un portaobjetos, aade una gota de orcena B y espera dos o tres minutos.

Repita el paso 4 y 5 del mtodo anterior.

C. Realice los clculos siguientes:C.1. ndice Mittico (IM): Calcular el IM del tejido de Allium cepa a partir de la observacin de 50 clulas barriendo el campo microscpico y de acuerdo con la frmula: El IM da una idea de la velocidad de divisin de un tejido.

C.2. ndice de Fases (IF): Calcular la duracin relativa de cada etapa de la mitosis. Use la frmula: Debe observar 50 clulas de Allium cepa en divisin y anotar la etapa en que se encuentran. Luego calcule el IF de cada una de las etapas.

VI. RESULTADOSLa preparacin presenta el aspecto de una dispersin de clulas por todo el campo que abarca el microscopio. Se observarn clulas en distintas fases o estados de divisin celular. Con esta tcnica de tincin se ven los cromosomas impregnados por la orcena en color morado. A. Haz dibujos de las diferentes fases de la mitosis que hayas observado: B. Realice los clculos de IM Y IF

VII. DISCUSION

VIII. CONCLUSIONES

IX. BIBLIOGRAFIAX. CUESTIONARIO

1. Cul es la funcin del cido clorhdrico? 2. Cuntos cromosomas tiene las clulas de la cebolla?3. Qu diferencias existen entre la mitosis de una clula vegetal y una animal?

4. En que fase de la mitosis, los cromosomas llegan a su mxima condensacin?

5. En la metafase de la mitosis, como se llama la parte de la clula donde se localizan los cromosomas?

6. En que fase de la mitosis se separan las cromtidas?

XI. ANEXO

ORCEINA: Tincin de cromosomas.

A. Solucin A (Actica y clorhdrica):

Orcena...........................................................2 g

cido actico glacial.................................. 45 ml

Agua........................................................... 55 ml

cido clorhdrico concentrado................... 1 ml

Disolver el polvo de orcena en el cido actico caliente. Enfriar y aadir el agua. Dejar reposar 48 horas y filtrar. Finalmente aadir 1 ml de cido clorhdrico.

B. Solucin B (Actica):

Orcena............................................................2 g

cido actico glacial................................... 45 ml

Agua............................................................ 55 ml

Disolver el polvo de orcena en el cido actico caliente. Enfriar y aadir el agua. Dejar reposar 48 horas y filtrar. Sugerencia: preparar 200 ml de la solucin B y despus separar 100 ml de esta para obtener la solucin A al aadir 1 ml de HCl

NOTA: La Orceina A reblandece las membranas celulares y la B completa el proceso de tincin.