practica 01lab actividad enzimatica de la amilasa

8/17/2019 PRACTICA 01Lab Actividad Enzimatica de La Amilasa

1/6

MANUAL DELABORATORIO - Versión 2015

Practica N° 1:

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA

I. INTRODUCCIÓN.

La saliva es un fluido biológico de gran importancia, ya que, además de mantener la homeostasisen la cavidad oral, es un medio perfecto para monitorear la salud en general , debido a que estácompuesta de una variedad de proteínas, enzimas, hormonas, anticuerpos, constituyentesantimicrobianos y citosinas , muchos de los cuales pasan de la sangre a la saliva, a través desistemas de transporte intra y extracelular . entro del contenido proteico de la saliva, elcomponente de mayor concentración es la !"amilasa, la cual es secretada por el páncreas y por las glándulas salivales, ambas de carácter enzimático. La variabilidad en la concentración o

actividad de la !"amilasa salival o la pancreática permite detectar anomalías en los órganos que laproducen. La !"amilasa encontrada en la saliva humana #$$%&' es la suma de la secretada por las glándulas salivales y de la secretada por el páncreas que, por mecanismos de transportecelular, entra a formar parte de la saliva.

(l almidón es un polisacárido de una estructura comple)a está formado por dos tipos de cadenas*amilosa y amilo pectina. La amilosa abunda en las leguminosas y la amilosa en los cereales. Laspropiedades del almidón de una especie vegetal dependen del + relativo de cada cadena. %uestructura permite que al penetrar el yodo se forme una disolución en presencia de un color azulesta característica no permite identificar la presencia del almidón. (l almidón puede romperse ohidrolizarse por medios químicos o enzimáticos, por medio de la amilasa #saliva' y el )ugopancreático. La amilasa rompe los enlaces entre los azucares que conforman al almidón yfinalmente después de su acción de)a glucosa libre y maltosa.

Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las reaccionesmetabólicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir ellas cambios en suestructura. ara el proceso de digestión, las biomoléculas ingeridas en la dieta deben ser

degradadas a sus componentes más sencillos para ser absorbidas a nivel del tubo digestivo yasí llegar al lugar correspondiente a nivel celular donde participarán en diversos procesosmetabólicos indispensables para el mantenimiento de una adecuada homeostasis. La digestiónde los carbohidratos comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan con la $milasa salivalque degrada los enlaces del almidón liberándose -altosa, lucosa y dextrinas de almidón queposeen todos los enlaces. La acción de las enzimas, por sus características físico"químicas,puede afectarse por las condiciones presentes en el lugar de acción de éstas. (ntre losprincipales factores que pueden modificar la acción enzimática tenemos*

a. La temperatura* /odas las enzimas muestran cierta termolabilidad, aunque para muchas deellas el aumento de la temperatura, hasta cierto límite, acelera la velocidad de la reacción. %in

Escuela de Ingenier a A!"ien#al $%gina 1


2/6


embargo, por que la mayoría de éstas son estructuras proteicas, pueden ser desnaturalizadas amedida que se aumenta la temperatura y así perder su actividad biológica. La temperatura a lacual se observa la máxima actividad enzimática se denomina /emperatura 0ptima.b. (l p&* or su característica proteica, muchas enzimas por el p& de donde se encuentran

pueden cambiar desde un estado ionizado # 1on carga ' a uno no ionizado # sin carga',afectando así la actividad biológica de las mismas.1ada enzima posee un p& característico donde puede realizar su función# p& óptimo', cualquier variación del mismo puede afectar la acción enzimática y así afectar lavelocidad de las reacciones químicas.c. 2nductores e inhibidores* (xisten sustancias químicas que pueden afectar la interacción delsustrato y la enzima, ya sea aumentando la actividad enzimática #2nductores' o disminuyéndola#2nhibidores'. Los inhibidores tienen gran utilidad en bioquímica, ya que ayudan a determinar laespecificidad de la enzima por el sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en elmantenimiento de la estructura activa de la enzima. (stos compuestos no son alteradosquímicamente por la enzima. e acuerdo al tipo de inhibición que e)erzan estas sustancias, sehan clasificado en*3 2nhibidores 4eversibles.3 2nhibidores 2rreversibles

II. OBJETIVOS. eterminar cualitativamente la actividad enzimática de la $milasa que cataliza la

hidrólisis del almidón a maltosa #disacárido reductor'

III.EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.III.1. Mat ria! Bi"!#$ic".

$milasaIII.%. Mat ria! & ' E()i*"&.

ipetas /ubos de ensayos 5a6o maría 1ocina eléctrica 5alanza

III.+. M ,i"& , c)!ti-"&. %olución de almidón al 7+ en buffer fosfato 8.7 - p& 9.: conteniendo ;a1l

8.87 - %olución de enzima al 7+ &1l 8.8< - %olución c=prico alcalino yodada %ol. 1=prico alcalino %ol. >osfanolibdica

IV.PROCEDIMIENTO.

.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA (n un matraz colocar saliva aproximadamente ?8 "@8 -l



3/6


-ezclar a la misma proporción con buffer fosfato 1on una gasa o algodón proceder a filtrar la mezcla (l filtrado corresponde a la enzima

.%. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMILASICA%e procederá de acuerdo al siguiente sistema de incubación enzimática*

COMPONENTES T1 /t &ti$"0 T% /*r" ! 2a0%olución de almidón al 7+ #mL' ?.< ?.< $gua destilada #mL' ?.< ?.<

1olocar en ba6o maría a @AB1 por < minutos(nzima al 7+ #mL' """""" 8.<

1olocar en ba6o maría a @AB1 por 78 minutos

.+CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR SUSTRATO RESIDUAL%imultáneamente con el proceso de incubación de 78 minutos colocar &1l en dostubos adicionales y continuar de acuerdo al siguiente esquema

COMPONENTES T1 /t &ti$"0 T% /*r" ! 2a0&1l 8.8< - #mL' < <

e los tubos que fueron traba)adosen la etapa $ #mL' 8.< 8.<

%ol. Codada #mL' 8.< 8.<-(D1L$4

E5%(4F$4 (L 1ELE4 4(%GL$;/( (; 1$ $ /G5E C $;$L2D$4LE (H L21$; E %2 %( (-G(%/4$ $1/2F2 $(;D2-$/21$ E -E

. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR PRODUCTOS 3ORMADOS/a45car & r ,)ct"r &0%imultáneamente con el proceso de incubación de 78 minutos, en el tercer par detubos, procedes de acuerdo al sgte esquema. -ediante el método de >EL2;"IG

COMPONENTES B!a6c"T1

/t &ti$"0T%

/*r" ! 2a0 $gua destilada 7 8.< 8.</7 de la parte $ """"" 8.< """""/? de la parte $ """"" """" 8.<%l. 1=prica alcalina 7 7 7-ezclar y colocar en ba6o de agua hirviendo por J minutos. $l termino

de este tiempo enfriar en agua corriente%ol. >osfomolibdica 7 7 7

-ezclar enérgicamente y de)ar reposar @ minutos $gua destilada A A A

Escuela de Ingenier a A!"ien#al $%gina &


4/6


-ezclar por inversión y de)ar en reposo durante 78 minutos. (valuar los resultadosde manera cualitativa.

V. ESQUEMASOBTENCION DE LA AMILASA

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMISILICA

CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR SUSTRATO RESIDUAL

Escuela de Ingenier a A!"ien#al $%gina '

(e escu)ió en un *as+de )reci)i#ación ,as#a

+"#ener #20 !l desali*a

(e l#ró la sali*a c+n unalg+dón . un e!"ud+

(e e/#rae l+s #u"+s del"a + !ar a . se llena0 5!l de la en i!a T2

(e )r+cede lle*ar a"a + !ar a a una

#e!)era#ura de &34

(e )r+cede a *aciar2 5!l de al!idón end+s #u"+s de ensa.+

(e llena 0 5!l de la)ar#e A

(e )r+cede a llenar c+n5!l de 6 l l+s d+s#u"+s de ensa.+

(e agrega 0 5!l des+lución .+dada . se+"ser*a el ca!"i+ de


5/6


CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR PRODUCTOS 3ORMADOS

VI.RESULTADOS

VI.1. C"6tr"! , !a Acti-i,a, E64i27tica *"r SUSTRATO RESIDUALINDICADOR T1 /t &ti$"0 T% /*r" ! 2a0

1olor resultante Escuro 1laroresencia de almidón residual #abundante,

moderado, escaso, ausente' $bundante (scaso

iferencia entre testigo y problema#%2,;E'

%i %i

$ctividad amilásica #presente o ausente' $usente resente

VI.%. C"6tr"! , !a Acti-i,a, E64i27tica *"r PRODUCTOS 3ORMADOSINDICADOR T1 /t &ti$"0 T% /*r" ! 2a0

1olor resultante 1elste $zul oscurorecipitado #presencia y color' $marillo $zulinoresencia de azucares reductores ;o %iiferencia entre testigo y problema

#%2,;E'%i %i

$ctividad amilásica #presente o ausente' $usente resente

VII. DISCUSION.(n la actividad enzimática se agrega el almidón en dos tubos uno con la enzima amilasa y

se lleva al ba6o maria por 78 minutos para que vaya hidrolizándose con el almidón.


(e lle*a al agua,ir*iend+ )+r un #ie!)+

de 7 !inu#+s

(e llena en cada #u"+ deensa.+8 en el )ri!er+ agua

des#ilada9 el segund+ la T1 .la ul#i!a la T&

(e en:r a . se agrega la

s+lución :+s:+!ili"dica


6/6


(l ácido clorhídrico se encuentra presente en los )ugos gástricos, por lo tanto ayuda adegradar los carbohidratos #almidón'(n la solución yodada nos debió dar dos colores distintos, debido a que un tubo tienesustrato residual #almidón', mientras que el otro tubo no debió reaccionar con el yodo al no

encontrar sustrato. Lamentablemente en la práctica no se obtuvo la diferencia de color enlos tubosLa solución c=prica reacciona con los productos enzimáticos, que son los azucaresreductores como glucosa y maltosa, los cuales act=an sobre el cobre reduciéndolo. $l agregar solución fosfomolíbdica ocurre que al no encontrarse producto en el /7 noreacciona y se queda de color celeste, en el /? cambia a color azul oscuro debido a que laenzima hidroliza el almidón y como resultado se obtiene un producto.

VIII. CONCLUSIONES.• %e logró determinar cualitativamente la actividad enzimática de la $milasa• %e concluyó en la actividad de control de la actividad enzimática por

productos formados #az=cares reductores' de que cuando no hay actividadenzimática en el almidón se muestra la maltosa y la glucosa cualitativamente

I8. RE3ERENCIAS BIBLIO9RA3ICAS.

• 5ravo . #?877'. $ccion de la amilasa sobre el almidón . 8? de septiembre del ?871K?IG$a%fdMFxL$ oGmp%8MFi5bxvhNhf4-C

practica 01lab actividad enzimatica de la amilasa

Documents