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POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE MICROORGANISMOS

EN ECOSISTEMAS NATURALES Y AGROECOSISTEMAS

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE MICROORGANISMOS

EN ECOSISTEMAS NATURALES Y AGROECOSISTEMAS

Jimena Sánchez NievesEditora

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE MICROORGANISMOS EN ECOSISTEMAS NATURALES Y AGROECOSISTEMAS

© Copyright Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.© Copyright Todos los Autores 2007

1ª. Edición, marzo de 2007 100 ejemplares, 434 p.

Editora

Jimena Sánchez Nieves Profesor Asistente Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá

Asesoras de Edición

Jennyfer Mora Cristancho Bióloga Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá

Tiffany Sosa Rodríguez Bióloga Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá

El comité editor no asume ninguna responsabilidad por el contenido de los trabajos incluídos en esta publicación. Los autores se sometieron a las normas de edición previamente establecidas y garantizan la autoría y/o respectivo reco-nocimiento de las ideas, figuras y tablas aquí publicadas.

Diseño de imagen de portada: Diego Castellanos Suárez

Diagramación y diseño de portada: Andrea Kratzer M.

ISBN 958-701-571-1

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE MICROORGANISMOS EN ECOSISTEMAS NATURALES Y AGROECOSISTEMAS.

Editado por Jimena Sánchez Nieves. 1 ed. Bogotá: Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá, 2007.

434 p. ISBN 958-701-571-1 1. Microorganismos. 2. Potencial biotecnológico 3. Ecosistemas acuáticos 4. Agroecosistemas I. Sánchez Nieves, Jimena (editor).

Créditos

Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología - COLCIENCIAS.

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología - CONACYT. México.

División de investigación de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

Con el apoyo logístico de

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

Departamentos de Biología, Química y Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

Grupo de Microbiología Prokaria - Laboratorio de Microbiología del suelo. Departa-mento de Biología. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

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TABLA DE CONTENIDO

Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Comité científico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

I. ECOSISTEMAS ACUÁTICOS

i. MANGLARES

Manglares: una visión general del ecosistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Suelos de manglar en condiciones semiáridas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

ii. OTROS ECOSISTEMAS

Ecosistemas marinos y la importancia de los procesos microbianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

Ecología microbiana en ecosistemas costeros: arrecifes de coral, praderas de pastos marinos, estuarios y la zona litoral . . . . . . . . . . . . . 51

Procariotas, virus y protozoos en los ecosistemas acuáticos: aproximación a la ecología microbiana del Embalse del Neusa . . . . . . 69

II. PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LOS ECOSISTEMAS

i. GRUPOS FUNCIONALES EN MANGLARES

Microorganismos solubilizadores de fosfatos de manglares del caribe colombiano: aislamiento, evaluación y potencialidades . . . . . . 83

Microbiología del manglar y técnicas moleculares para su estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Bacterias promotoras de crecimiento vegetal, una estrategia para facilitar el crecimiento vegetal en suelos salinos . . . . . . . . . . . . . 104

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ii. OTROS ECOSISTEMAS

Microorganismos presentes en humedales: una alternativa en procesos de biorremediación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Indicadores biológicos de calidad del suelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Enzimas de suelo: ambiente y biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

Enzimas y su papel como bioindicadores en humedales . . . . . . . . . . 147

Generalidades del papel de los microorganismos en humedales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159

Microorganismos solubilizadores de fosfatos y bacteriasfijadoras de nitrógeno en páramos y región cálida tropical (Colombia) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

III. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LOS MICROORGANISMOS

i. BIOFERTILIZANTES/BIOPLAGUICIDAS

Experiencias en el estudio de sistemas Rhizobium-leguminosa para la producción de biofertilizantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187

Pruebas preliminares para producción por fermentación de nematodos entomopatógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197

Efecto de la bacteria Azotobacter sp. sobre el desarrollo vegetativo y rendimiento en la producción de flor en plantas de clavel (Dianthus sp.) y pompón (Dendranthema grandiflora) . . . . . . . . . . . 208

Nematodos entomoparasitos - experiencias y perspectivas de uso en Colombia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218

Endomicorrizas: ecología, papel funcional, aplicaciones . . . . . . . . . . . 223

Interacciones entre hongos formadores de micorrizas arbusculares y trichoderma sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239

Control biológico de insectos plaga: mito académico o realidad agrícola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248

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JIMENA SÁNCHEZ NIEVES - EDITORA

ii. FERMENTACIÓN DE MICROORGANISMOS

Producción de biofertilizantes y biocontroladores para una agricultura sostenible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

Determinación del valor fertilizante de bacterias solubilizadoras de fosfato asociadas a cultivos de arroz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270

iii. BIORREMEDIACIÓN /BIODEGRADACIÓN

Environmental genomic: biotechnological potential of uncultured microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281

Evaluación de la capacidad dehalogenante de un lodo anaerobio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292

Estrategias de biorremediación en ambientes acuáticos y terrestres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302

iv. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR MICROBIANA

Estudios en microbiología de suelos amazónicos colombianos relacionados con la fertilidad del suelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311

Yucomics: aplicaciones para la resistencia a la bacteriosis vascular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323

v. COMUNICACIÓN CELULAR

Quorum sensing: el lenguaje de las bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335

vi. OTRAS APLICACIONES

Bioprospección, avances y perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355

Bioprospección de sustancias bioactivas obtenidas de organismos marinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368

Detección de agentes etiológicos de enfermedades coralinas mediante el estudio de la composición bacteriana de la capa de mucopolisacáridos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377

Estudios de actividad antimicrobiana en esponjas marinas (porifera) del caribe colombiano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389

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Simbiosis y asociaciones en el medio marino: la importancia de los microorganismos en la producción de compuestos de origen natural con aplicaciones farmacéuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403

Bioactividad de extractos crudos de esponjas marinas y perspectivas de la línea de bioprospección marina del Invemar . . . . . . . . . . . . . . . 426

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a todos los autores de los diferentes capítulos del libro que amablemente compartieron sus conocimientos, experiencias y tiempo durante el desarrollo del curso: Potencial Biotecnológico de Microorga-nismos en Ecosistemas Naturales y Agroecosistemas a partir del cual se generó la presente publicación, así como a las instituciones que nos apoyaron y que enunciamos a continuación:

• Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México

• Fundación de Asesorías para el Sector Rural

• Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas. Grupo de Recur-sos Genéticos y Biotecnología

• Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras José Benito Vives de Andréis - INVEMAR

• Pontificia Universidad Javeriana (Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias. Unidad de Saneamiento y Biotecnología Am-biental. Departamento de Biología)

• Universidad de la Guajira

• Universidad Jorge Tadeo Lozano

• Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá (Departamento de Biología, Departamento de Farmacia, Departamento de Química, Facultad de Agronomía, Facultad de Ciencias, Facultad de Ingenie-ría, Instituto de Biotecnología)

• Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellín (Departamento de Ciencias Forestales, Escuela de Geociencias, Instituto de Estudios Ambientales, Laboratorio de Microbiología del Suelo)

• Universidad Popular del Cesar

Agradezco también a todas las personas que colaboraron en el desa-rrollo del curso, porque sin su apoyo este evento no hubiese sido posi-ble, ellos son: Diana Castellanos, Diego Castellanos, Elizabeth Contreras, Elkin Marcelo Ruiz, Flor Alicia Caro, Gina Esmeralda Hernández, Hector Gómez, Javier Martínez, Javier Vanegas, Jennyfer Mora, John Alejandro García, John Heyder Montiel, Lilia Carolina Mora, Lineth Beatriz Enciso,

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Nilson Enrique Castillo, Norfey Cano, Oscar Hernán Romero, Pilar Jimena Bahamon, Sandra Campos, Sandra Lucía Sánchez, Tania Galindo,Tiffany Sosa y Zayra Rodríguez. Así mismo, quiero dar un especial agradecimien-to a los profesores Ramón Mantilla, Amanda Lozano de Yunda, Daniel Uribe y Nubia Moreno de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.

Jimena Sánchez NievesLaboratorio de Microbiología del suelo

Departamento de BiologíaFacultad de Ciencias

Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

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PRESENTACIÓN

El curso Potencial Biotecnológico de Microorganismos en Ecosistemas Naturales y Agroecosistemas constituye sin duda el resultado de un pro-ceso de recopilación, actualización y presentación de los avances en la investigación biotecnológica con microorganismos en Colombia. La con-vocatoria de ponentes para éste curso permitió reunir especialistas que trabajan en diversas áreas de investigación, a quienes agradecemos su participación y disposición para dar a conocer sus trabajos en temas del conocimiento básico y aplicado, los cuales han sido compilados en este documento.

El primer y segundo capítulo de esta entrega constituyen una visión ge-neral que integra una breve introducción a los ecosistemas que han sido fuente de material biológico y la dinámica microbiológica característica en ecosistemas acuáticos (marinos y de agua dulce), enfatizando en las funciones que desempeñan los microorganismos en dichos ambientes, siendo estos, conceptos fundamentales para la propuesta y desarrollo de los temas de aplicación biotecnológica recopilados. En el tercer capítulo, se presentan los resultados y revisiones de algunas de las más recientes investigaciones realizadas en Colombia y en el mundo por grupos inter-disciplinarios sobre características biológicas y ecológicas de microorga-nismos de reconocida importancia por su participación en la dinámica de procesos en ecosistemas naturales y/o potencial utilización en procesos biotecnológicos en el campo agrícola, industrial y ambiental.

En cuanto a los temas de biorremediación y biodegradación, se pre-sentan los avances obtenidos con el desarrollo de la genómica ambiental y las estrategias de recuperación de la calidad de ambientes acuáticos y terrestres mediante bioprocesos. En secciones subsiguientes, la caracte-rización molecular microbiana y la comunicación celular son presentadas como herramientas de gran importancia para la investigación de micro-organismos. El módulo final de esta entrega contiene interesantes revi-siones sobre los avances y perspectivas en bioprosprección en Colombia, así como los logros alcanzados en la búsqueda de compuestos biológica-mente activos a partir de microorganismos y otras especies marinas.

Los manuscritos recopilados son una muestra de la diversidad de aplicaciones tecnológicas que tienen los microorganismos, la cual está siendo aprovechada activamente por diferentes grupos de investigación, quienes demuestran con su trabajo la posibilidad de utilizar dichos orga-

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nismos como instrumentos con aplicaciones múltiples, sin dejar de lado su importancia como base fundamental de los procesos esenciales en los ecosistemas.

Es nuestro deseo que esta iniciativa trascienda a todos los campos de la investigación biotecnológica con microorganismos y aún cuando somos concientes que aquí no se resumen todos ellos, consideramos que la realización de próximos encuentros y publicaciones, permitirá dar continuidad a la revisión de los temas de interés que nos convocan.

Comité Editorial

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COMITÉ CIENTÍFICO

Marina Correa de Restrepo. Botánica. MSc. Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá.

Emira Garcés de Granada. Bióloga. MSc. Departamento de Biología. Uni-versidad Nacional de Colombia sede Bogotá.

Jimena Sánchez Nieves. Bacterióloga. MSc. Candidato a PhD. Departa-mento de Biología. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá.

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I. ECOSISTEMAS ACUÁTICOS

i. Manglares

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MANGLARES: UNA VISIÓN GENERAL DEL ECOSISTEMA

MANGROVES: A GENERAL VIEW OF THE ECOSYSTEM

JAIME POLANÍA1

1Instituto de Estudios Ambientales. Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellín

[email protected]

RESUMEN

En las costas colombianas crecen manglares, considerados hu-medales naturales importantes, altamente productivos y expor-tadores de materia y energía a ecosistemas adyacentes. Sobre sus raíces crecen pequeños organismos: algas, hidrozoarios, es-ponjas, corales, anémonas, cirrípedos, gasterópodos, bivalvos, crustáceos, etc., que aprovechan el material orgánico en sus-pensión y luego son capturados por peces, jaibas, estrellas de mar y caracoles. Son también detoxificadores y mitigan inunda-ciones. Las especies abundantes en el país incluyen Rhizophora mangle (mangle rojo), Avicennia germinans (mangle negro), Laguncularia racemosa (mangle blanco), Conocarpus erecta (mangle botón), Pelliciera rhizophorae (mangle piñuelo) y el helecho Acrostichum aureum. Se presume que el cambio climá-tico y calentamiento aumentará el nivel del mar y los manglares estarán entre los primeros en sufrir el impacto. En consecuencia son ecosistemas estratégicos, susceptibles de ser conservados y, en algunos casos, restaurados.

Palabras clave: Manglar, fauna acompañante, cambio climático global.

ABSTRACT

Mangroves growth along the Colombian coasts. They are con-sidered one of the most important natural wetlands, they are highly productive and do export matter and energy to adjacent ecosystems. Small organisms use to growth over their prop roots: Algae, hydrozoa, sponges, corals, see anemones, cirripedia, gas-teropoda, bivalvia, crustaceans, etc., which take the organic sus-pended matter, and then are captured by fishes, cryfishes and

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gasteropoda. Mangroves are also detoxifiers and do ameliorate flooding situations. The most abundant species in the country are Rhizophora mangle (red mangrove), Avicennia germinans (black mangrove), Laguncularia racemosa (white mangrove), Conocarpus erecta (buttonwood), Pelliciera rhizophorae and the mangrove fern Acrostichum aureum. Since global climate change is supposed to raise sea level, mangroves are among the first to undergo the impact. Consequently mangroves are strategic ecosystems, conservation and, in some cases, restora-tion worthy.

Keywords: Mangroves, fouling communities, global climate change.

En las costas colombianas crecen los árboles que constituyen los bosques de manglar o, más sencillamente, manglares. Son considerados uno de los humedales naturales más importantes, porque son altamente productivos y exportan materia y energía a ecosistemas adyacentes. Pro-ducen tanta materia orgánica en forma de hojarasca que entre los eco-sistemas marinos sólo los aventajan los arrecifes de coral y se ha llegado a estimar que las 2/3 partes de las poblaciones de peces tropicales en el mundo dependen de las áreas de manglar y sus detritos.

Por su cercanía a las corrientes de agua de diferente origen, pueden exportar la materia orgánica, en cantidades que oscilan entre 0,3 y el 30% de la hojarasca producida. En las desembocaduras de los grandes ríos, los mangles crecen consolidando los terrenos formados a partir de la deposición de sedimentos, con lo cual estabilizan y construyen suelos a través de procesos de acreción que, de paso, evitan mayores descargas directas sobre otros ecosistemas costeros. Esto permite que los manglares desempeñen un papel esencial en la regeneración de nutrientes y en las cadenas tróficas costeras, en especial en el nivel mi-crobiano y en la dinámica del carbono en los sistemas litorales. Como representan ecosistemas anfibios entre las comunidades terrestres, las praderas de pastos marinos y los arrecifes coralinos, sostienen comu-nidades genéticamente diversas de fauna y flora en ambos ambientes. Por eso no extraña su gran diversidad, que incluye microorganismos e invertebrados en sus sedimentos ni que sean lugar de crecimiento y re-producción de algas, y de cría, refugio y alimentación de invertebrados, peces, aves y mamíferos. Sobre sus raíces crecen pequeños organis-mos: algas, hidrozoarios, esponjas, corales, anémonas, cirrípedos, gas-terópodos, bivalvos, crustáceos, que aprovechan el material orgánico

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en suspensión y luego son capturados por peces, jaibas, estrellas de mar y caracoles. Esto genera complejas redes tróficas que terminan en recursos pesqueros y forestales y, por si fuera poco, todo tipo de bienes y servicios.

Los manglares son propios de terrenos con relieve plano y fangoso en zonas costeras y ribereñas tropicales y subtropicales con influencia mareal, motivo por el cual estarán entre los primeros en experimentar las variaciones de nivel predichas en escenarios de cambio climático global. Las especies arbóreas y arbustivas que los componen presentan algunas características morfológicas y fisiológicas que responden al régi-men hídrico y por lo tanto, se asemejan unas a otras, aunque no estén emparentadas taxonómicamente. Tales características o adaptaciones in-cluyen: a) las que les permiten ocupar sustratos inestables (raíces zancos o tabloides); b) una marcada tolerancia al agua salada y salobre, aunque no son plantas halófitas obligadas, es decir que no requieren de la sal para sobrevivir (por ello se consideran extraordinariamente competitivas en ambientes poco favorables); c) las que sirven para intercambiar gases en sustratos con bajas concentraciones de oxígeno (estructuras denomi-nadas lenticelas y neumatóforos); y d) como estrategia de diseminación y propagación tienen semillas con alta tasa reproductiva y, frecuente-mente, reproducción por embriones (viviparidad) capaces de flotar, que se dispersan transportados por el agua.

Los mangles que son excelentes evapotranspiradores, suplen signifi-cativamente de humedad a la atmósfera y al hacerlo se tornan en fuente de enfriamiento natural a las comunidades cercanas. Actúan como sum-ideros naturales de CO2 y fuente de materia orgánica e inorgánica y se constituyen en eslabones importantes en la cadena trófica, por su fun-ción como transferidores de energía a los sistemas secundarios. Así mis-mo, son excelentes detoxificadores y amortiguadores de inundaciones. Debido a las duras condiciones a las que se enfrentan y a los estrechos rangos ambientales en los que se desarrollan, son comunidades poco diversas: en el nivel global poseen unas 54 especies, reunidas en 20 géneros y 16 familias, siendo los más diversos los manglares del Océano Índico y el Pacífico Occidental, mientras que en América, las costas del Pacífico y el Caribe cuentan con sólo siete y ocho especies respectiva-mente, para un total de 10 en el Nuevo Mundo. Las más abundantes en el país incluyen Rhizophora mangle (mangle rojo), Avicennia germinans (mangle negro), Laguncularia racemosa (mangle blanco), Conocarpus

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erecta (mangle botón), Pelliciera rhizophorae (mangle piñuelo) y el he-lecho Acrostichum aureum.

Los manglares poseen alta capacidad de regulación, aunque en su mo-mento se les catalogó como sitios inhóspitos, insalubres e improductivos. En el país su extensión es importante tanto en la costa caribe (más de 80000 ha) como en la pacífica (casi 300000 ha). La construcción de obras de infraestructura física desde mediados del siglo pasado (que incluyen la carretera que comunica Barranquilla con Ciénaga, un carreteable pa-ralelo al río Magdalena y el ‘Canal Naranjo’, que unió artificialmente los ríos Patía y Sanquianga, causando graves alteraciones en el ambiente de la región y amenazando a sus pobladores) y fenómenos naturales (como el cambio del curso del río Sinú en los años 30) alteraron los regímenes hídricos de manglares importantes del país como las 20.000 ha de la Ciénaga Grande de Santa Marta y los del Parque Nacional Natural de Sanquianga, por ejemplo. A su vez, en tiempos más recientes las auto-ridades se han empeñado en la recuperación de algunos de estos eco-sistemas visiblemente deteriorados y a través de un préstamo pactado con el Banco Interamericano de Desarrollo, que sumó unos 20 millones de dólares, generó varios proyectos científicos y de infraestructura para recuperar la Ciénaga Grande de Santa Marta, en un proceso que durará aún varios años.

Por otra parte, se presume que el calentamiento global aumentará el nivel mar y los manglares experimentarán tales cambios entre los prime-ros. De hecho, las tormentas, los huracanes o los ciclones condicionan su distribución, pueden causar mortalidad a gran escala o cambiar la dominancia de las especies, desencadenar procesos de sucesión y deter-minar las características estructurales y florísticas del bosque. En el delta del río Ranchería y otras zonas de la costa caribe colombiana el mar está ascendiendo y el litoral retrocediendo. En el primero se forman peque-ños cordones y una de las bocas del río cambia de posición, de manera que los organismos que crecen en la porción superior del rango mareal señalan el nivel medio del mar y pueden indicar el efecto del cambio climático sobre el manglar.

Por lo anterior los manglares son ecosistemas estratégicos susceptibles de ser conservados y en algunos casos, restaurados. En cualquier caso su conocimiento en el país es incipiente y por lo tanto, hace falta abordarlo desde todas las áreas posibles del conocimiento.

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SUELOS DE MANGLAR EN CONDICIONES SEMIÁRIDAS

SOILS OF MANGROVES UNDER SEMI-ARID CONDITIONS

MARTHA CASTELLANOS1

1Universidad de la [email protected]

RESUMEN

Se presentan resultados preliminares de la investigación que se está realizando en los suelos de manglar en La Guajira, ubi-cados en el delta del río Ranchería, lo cual supone una com-pleja dinámica hidrológica, climática, geomorfológica. Están presentes en la región cuatro especies de mangle: Rhizophora mangle, Laguncularia racemosa, Avicennia germinans y Cono-carpus erecta, cuya zonación y estructura de los bosques puede responder más a las variaciones de las propiedades del suelo, tanto físicas como químicas, sin descartar la influencia de la fauna del suelo presente. Por esta razón se planteó como ob-jetivo general estudiar los factores limitantes que condicionan el aporte de nutrientes del suelo y su disponibilidad para las plantas de mangle en estas condiciones, con el propósito final de desarrollar estrategias sustentables para el manejo de estos ecosistemas en el departamento de La Guajira.

Palabras clave: Suelos de manglar, condiciones semiáridas.

ABSTRACT

Preliminary results of the investigation are presented that is be-ing carried out in the soils of mangroves in the delta of the river Ranchería, that which supposes a complex hydrological, climatic dynamics, geomorphologic. There are in the region four man-grove species: Rhizophora mangle, Laguncularia racemosa, Avicennia germinans y Conocarpus erecta, whose zoning and structure can depend more by the variations of the properties of the soils, so much physical as chemical, without discarding the influence of the fauna presents. For this reason, it thought about as general objective to study the restrictive factors that condition

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the contribution of nutritious of the soils and their availability for the mangrove plants under these conditions, with the final purpose of developing sustainable strategies for the handling of these ecosystems in La Guajira.

Keywords: Soils of mangroves, semi-arid conditions.

INTRODUCCIÓN

El conocimiento de la influencia de las características del suelo ayuda a comprender mejor las condiciones en las cuales han evolucionado los mangles y los organismos que interactúan con ellos, particularmente en ambientes que presentan limitaciones de agua dulce y altas temperatu-ras, además de una gran presión antrópica.

La relación de los manglares con el suelo se ha interpretado desde dos perspectivas: la primera ha sido abordada por Odum (1972) y Hogarth (1999), quienes los han considerado como factores de formación del suelo por su sistema de raíces al facilitar la acumulación de sedimentos, situación más probable en zonas permanentemente inundadas; mien-tras que otros como McKee (1993, 1995b), Gueiros (2000), entre otros, consideran que las plantas de mangle son sensibles a los cambios físicos y químicos del sustrato, con relación a los factores y procesos que lo ori-ginan. En este sentido, Thom (1984) y Woodroffe (1992) proponen unos escenarios típicos geomorfológicos, agrupados así: los que tienen entra-das de sedimentos fluviales y los que forman minerales carbonatados por procesos de sedimentación. Estos escenarios se pueden encontrar en gran variedad de zonas, dependiendo del régimen climático regional y la dinámica oceanográfica que en su conjunto, establecen los límites de los procesos de los granos finos (Twilley et al., 1999).

Localmente la microtopografía, amplitud y rango de penetración de las mareas (Woodroffe, 1992), gradiente de salinidad, textura, estabili-dad del suelo, oferta de agua dulce, protección de la acción directa del oleaje, acarreo de sedimentos arenosos y flujo de nutrientes en el sis-tema, pueden generar variaciones estructurales en su desarrollo y en el establecimiento de plántulas para la regeneración del bosque (Hogarth, 1999; Lacerda et al., 2001) e influir sobre la zonación de los manglares desde la línea costera tierra adentro (Woodroffe, 1992). Alternativamen-te, con base en la ubicación topográfica y los patrones de inundación a escala local, Lugo y Snedaker (1974) identificaron tipos ecológicos en los

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manglares, los cuales fueron simplificados por Cintrón et al. (1980), en-tre otros. Una combinación de los tipos ecológicos de manglares puede presentarse en cualquier escenario geomorfológico (Thom, 1984; Woo-droffe, 1992), dependiendo de la distribución de los atributos del suelo y tensores ambientales. El gradiente en los procesos geofísicos de una región costera junto con los factores ecológicos locales, determinan los diversos patrones de flujo de energía y biogeoquímica en las unidades de suelos con manglares (Twilley et al., 1999). Sin embargo, hacen falta mayores estudios sobre la interacción entre factores abióticos y bióticos en el ambiente suelo (Polanía, 2002).

De otro lado, en los suelos con manglares, los microorganismos cum-plen un papel fundamental en la disposición de nutrientes para las mis-mas. Se ha encontrado que la rizósfera depende en gran medida de los exudados radiculares liberados por las plantas y a su vez, los exudados dependen de las condiciones ecológicas bajo las cuales se desarrollan ellas; es así como un mayor conocimiento sobre el medio pedológico da-ría mayor información sobre las condiciones en las cuales han evolucio-nado los microorganismos (Holguín et al., 1999; Vásquez et al., 2000).

ESTUDIOS REALIZADOS EN SUELOS DE LOS ECOSISTEMAS DE MANGLE

La mayoría de los estudios que se han hecho en suelos con mangla-res describen en general los primeros 15-20 cm porque corresponden a sitios que la mayor parte del tiempo permanecen inundados y se ha presumido que las especies de mangle, con sus sistemas radiculares, contribuyen a su formación por deposición de sedimentos (Odum, 1972; Holguin et al., 1999). Por lo tanto, en esta fracción ocurriría la mayor ac-tividad e interacción entre las plantas y el suelo. Sin embargo, en los úl-timos años se ha venido proponiendo que la presencia de los manglares está determinada en mayor medida por factores abióticos como el clima, geomorfología de costas, dinámica hidrológica de los diferentes cuerpos de agua que definen la calidad del sustrato suelo que soporta a la comu-nidad manglárica (Thom, 1984; Ukpong, 2000). Estas dos perspectivas buscan explicar los factores o tensores que definen la distribución de los manglares tanto en el nivel de especies como de comunidad, donde el punto de confluencia es el suelo, es decir, si la acción proviene de la zona de raíces aéreas de los mangles por deposición de sedimento o si provie-ne de la acción conjunta entre los factores pedogenéticos abióticos. De

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esta forma, el suelo adquiere una forma de arreglo dinamizada por una serie de procesos que sustentan la comunidad biótica, en este caso, el ecosistema manglar.

La salinidad se ha identificado como tensor natural y se ha estudiado en ambientes permanentemente inundados, en los cuales los manglares se han adaptado en forma diferencial (Clough, 1982; Prahl, 1989). La basicidad del suelo se debe a la presencia de sales solubles y/o altos niveles de sodio intercambiable y carbonatos de calcio y su origen natu-ral es el material parental y el clima. Las actividades humanas también causan este fenómeno cuando intervienen la regulación del agua. Se han establecido varios tipos de salinidad o basicidad, de acuerdo con el ión predominante que, a su vez, define los criterios de manejo por sus interrelaciones con otras propiedades del sustrato y sus efectos en el desarrollo vegetal (Garavito, 1979; Rowell, 1992).

Se ha observado que las especies de mangle tienen niveles de toleran-cia diferentes a la salinidad intersticial; por ejemplo, para el R. mangle se ha observado una alta tasa de crecimiento con salinidades entre 10 y 20% y en A. germinans tolerancia a salinidades entre 60 y 65%, (Ulloa et al., 1998). Ukpong (2000) encontró en la desembocadura de los ríos Imo y Kwa Ibo, Nigeria, con mayor influencia marina, altos niveles de Ca y predominaban las especies Avicennia africana (20,8 me/100 g de Ca) y Nypa fruticans (17,6 me/100 g de Ca); en los estuarios formados en la desembocadura de los ríos Calabar y Cross, eran más altos los niveles de P, y predominaba R. mangle; en ambientes con alto contenido de Mg predominaba la vegetación de porte bajo (<1 m de altura). Pero, en general, sobre manglares y su relación con contenido de nutrientes no están claramente definidos los rangos que permitan la zonación de las diferentes especies de mangle, particularmente en ambientes similares a los del estudio y de forma indirecta surge otra inquietud en el sentido de si las especies de mangle pueden indicar el tipo de salinidad del suelo predominante.

En las zonas de manglar del trópico húmedo, se descomponen gran-des cantidades de materia orgánica y por lo tanto, se encuentran valores de pH mucho más bajos que los del mar (7,0 y 8,3). Estas diferencias se deben a fenómenos biológicos (Schnetter, 1986). Los valores del pH en las áreas de manglares deben extenderse de zonas ligeramente ácidas hasta zonas ligeramente básicas (Pinto y Naranjo, 1993). Por lo tanto, es probable que no existan grandes diferencias en el crecimiento con

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valores de pH entre 4 y 8. Los suelos del manglar tienen un rango de pH entre 4,8 y 8,8 (Pannier y Pannier, 1974). Los suelos de R. mangle son generalmente más básicos que los de A. germinans cuando están satu-rados de agua. De acuerdo a Cintrón y Schaeffer-Novelli (1983), el pH de los suelos de R. mangle es de 6,6 mientras que el de A. germinans es de 6,2. Al secarse los suelos de R. mangle alcanzan valores de pH 3,0, pero los más evolucionados pueden llegar a valores aún más bajos (pH 2,2).

Aparentemente, en la costa Caribe, la salinidad del suelo junto con el clima son los tensores ambientales para los manglares, situación di-ferente en la costa Pacífica, donde el tensor parece ser la estabilidad del sustrato (Prahl, 1989). Los resultados de investigación de Polanía (2002) para el delta del río Ranchería, obtenidos en los primeros 15 cm de profundidad del sustrato, señalan en una primera etapa, que tanto la salinidad como la materia orgánica y la conductividad eléctrica son causantes de la distribución de las especies de mangle en los bordes de los brazos del río Ranchería. Sin embargo, los valores de salinidad fueron bajos debido posiblemente a la dinámica hidrológica y la geomorfología de la costa. No se observó correlación significativa para medios satura-dos, entre salinidad y las formas inorgánicas de N (NH4

+; NO2=; NO3

-) y P (en forma PO4

-3) ni tampoco con otras propiedades del suelo como granulometría, pH, CE, %CO. Una razón posible es porque precisamente estos suelos no permanecen inundados todo el año.

En los últimos años la reducción de cubierta vegetal en el delta del río Ranchería y otros sitios de la costa Guajira se ha incrementado más por la presión antrópica, en forma de deforestación para diversos usos y la acción de las cabras (Rosado, 2003). Además, la construcción de una represa en la parte alta de la cuenca del río Ranchería y la reducción de la cobertura vegetal boscosa en las montañas de la Sierra Nevada de Santa Marta son amenazas para la permanencia de cubierta vegetal en la desembocadura, sobre todo de manglares, que son importantes para los ciclos de vida de muchos organismos marinos. De acuerdo a varios estudios (Clough, 1982; Prahl, 1989; Lacerda et al., 2001), los manglares no requieren de inundación para establecerse, ya que son plantas que se originaron en ambientes terrestres y desarrollaron mecanismos de adap-tación para medios anegados y salobres. Igualmente, los manglares son plantas que toleran en forma diferencial la salinidad; de esta forma, son extremadamente interesantes por sus mecanismos de adaptación tanto a este tensor como a las inundaciones, dos fenómenos ligados con el cam-

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bio global climático. Comprender mejor cómo las propiedades del suelo inciden sobre el desarrollo, crecimiento y distribución de estas plantas y establecer cómo otras propiedades del suelo actúan como tensores ade-más de la salinidad, permitirá diseñar formas de manejo más eficaces.

DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO

El delta del río Ranchería se ubica en el departamento de La Guajira, al noroeste del municipio de Riohacha y suroeste del municipio de Man-aure. Vásquez (2000) menciona que la planicie deltáica del río Ranchería es una transición entre las zonas de vida de bosque seco subtropical (bs-ST) y matorral espinoso subtropical (me-ST), de acuerdo a la clasificación bioclimática de Holdridge (1978). La precipitación promedio anual es 854 mm (HIMAT, 1994), con distribución bimodal. La tendencia general de los períodos climáticos a nivel local son: seca mayor (diciembre-abril), lluviosa menor (mayo-junio), seca menor (julio-agosto) y lluviosa mayor (septiembre-diciembre) (Alvarez-León, 1995; Maza y Zárate, 2000; Mar-tínez y Ruiz, 2001; Arroyo, 2001). La temperatura oscila entre los 15°C y 38,5°C, con un valor promedio anual de 27°C (IDEAM, 1997); humedad relativa promedia anual de 73% y evaporación media de 2.293 mm/ a (HIMAT, 1994). El río Ranchería es el cauce superficial más importante del departamento, luego de un recorridos de 223 km, se conforma un delta compuesto por los brazos Riíto, Calancala y la Fita (llamada así por la población wayuú), Caimancito, que es intermitente y alimenta zonas de inundación (Maza y Zárate, 2001), además un pequeño sistema la-gunar donde se encuentran las lagunas Salada y Buenavista y una zona de inundación periódica, denominada valle de los Cangrejos (Contraloría Departamental de la Guajira, 1997), bañando una cuenca de 381.201 ha (CANDICON & CPT, 1988) (Figura 1).

Los suelos son de relieve plano, con sedimentos finos y salinos, inun-daciones periódicas y niveles freáticos relativamente altos (IGAC, 1988). La plataforma costera es ancha, con 40 km en promedio, una pendien-te suave de 0,2%; se presenta el fenómeno de surgencia -movimien-to ascendente de aguas subsuperficiales-, causada por los vientos que producen velocidades en superficie de 30-40 cm/s en dirección NE (Ál-varez-León et al., 1995), generando una reducción de la temperatura y un aumento de la salinidad y carga de nutrientes (Sánchez-Páez et al., 1997). De acuerdo con Martínez y Ruiz (2001), en el Valle de los Can-grejos los primeros centímetros corresponden a una capa de sedimentos finos pero, a medida que se profundiza, se nota un cambio total en el

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horizonte, predominando arenas un poco gruesas, materia orgánica y sedimentos arcillosos muy finos, y se forma una zona poco permeable, que contribuye a la retención de nutrientes.

La metodología incluye interpretación de fotografías aéreas, digitaliza-ción de imágenes y verificación en campo, para identificar las geoformas primarias o unidades fisiográficas. A lo largo y ancho del delta se tra-zaron 4 transectos, dentro de los cuales se realizaron calicatas, distan-ciadas aproximadamente 200 m, con profundidad hasta nivel freático, promedio de 1.50 m. Se describieron en campo las diferentes capas con parámetros de macromorfología y de éstas se tomaron muestras que se llevaron a laboratorio. Se secaron al aire y se les está realizando deter-minaciones de parámetros físicos y químicos (granulometría, textura, pH, capacidad de intercambio catiónico (CIC), bases solubles (BS) y bases intercambiables, aniones, conductividad eléctrica (CE), microelementos, densidad aparente, humedad gravimétrica).

DISCUSIÓN

Diversos estudios han encontrado que las especies de mangle tienen un patrón de distribución de acuerdo con algunas condiciones del sus-trato como salinidad intersticial, granulometría, carbono orgánico, etc. Sin embargo, en el análisis de los resultados se observa que la relación entre las condiciones del suelo y los parámetros vegetales seleccionados tienen valores del coeficiente de correlación menores de 0,65 (r2 < 0,65; Arroyo, 2001; Martínez y Ruíz; 2001; McKee, 1995; Tam y Wong, 1998; Ukpong, 2000), que pueden explicarse por las relaciones suelo-planta o bien que en la metodología es conveniente proponer muestreos acordes con la dimensión suelo-paisaje, como también parámetros vegetales que den mayores indicios de la acción de los tensores edafológicos, pero en escala de detalle.

De acuerdo con Ukpong (2000), los manglares exhiben zonación des-de tierra adentro hacia la línea costera, en los cuales se ha observado relación diferencial y de diferentes rangos entre manglares y nutrientes del suelo, de tal forma que se pueden identificar zonas monoespecíficas. Estableció la relación entre los gradientes de capacidad de intercambio catiónico (CIC), bases intercambiables, P y %CO sobre porcentaje área de cobertura y frecuencia y encontró una distribución diferencial de las especies de mangle y especies asociadas en respuesta a un tipo particu-lar de ión, con coeficientes de correlación inferiores a 0.62.

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Figura 1. Área de estudio.

1.000 m

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Los perfiles gráficos de la estructura de las comunidades vegetales del delta del río Ranchería describieron bien la composición específica a tra-vés de gradientes microambientales que condicionan el establecimiento y prosperidad de las especies de manglar, particularmente los niveles de inundación y salinidad (Vásquez, 2000). Esta distribución parece estar en consonancia con los postulados que consideran factores geomorfo-lógicos y, especialmente, los microrelieves originados por los agentes de transporte, evolución y dinámica del sustrato, vientos, sedimentación y colmatación, desborde de cauces, etc. como causales importantes del establecimiento y prosperidad de las especies de manglar (Cintrón et. al., 1980). R. mangle siempre se encontró en el margen de grandes canales de drenaje y/o en sitios altamente anegados, mientras que A. germinans apareció generalmente sobre sustratos secos y muchas veces compacta-dos, pero es particularmente interesante ver cómo los individuos mejor desarrollados de la especie perviven en sitios expuestos a la inundación periódica por obra del desborde de cauces y/o la intrusión mareal, con-trario a lo sugerido por Thom (1967).

Polanía (2002), en dos sectores del delta del río Ranchería, encontró que probablemente la dinámica del ciclo hidrológico explica las dife-rencias y variabilidad de las propiedades del suelo estudiadas (granu-lometría, textura, materia orgánica (MO), conductividad eléctrica (CE), salinidad, pH, amonio, nitrito, nitrato, fosfato) y presumiendo, además, que los contenidos de MO, salinidad y CE pueden explicar el agrupa-miento de las plantas en los sitios estudiados. Sin embargo, los valores de salinidad fueron bajos debido posiblemente a la dinámica hidroló-gica y la geomorfología de la costa. No se observó correlación signifi-cativa para medios saturados, entre salinidad y las formas inorgánicas de N (NH4

+; NO2=; NO3

-) y P (en forma PO4-3) ni tampoco con otras pro-

piedades del suelo, como granulometría, pH, CE, %CO; posiblemente porque precisamente estos suelos no permanecen inundados todo el año.

Díaz (2001) plantea que el establecimiento de plántulas de R. man-gle en el delta del río Ranchería puede estar relacionado también con propiedades granulométricas del suelo (textura, granulometría), por su preferencia a terrenos lodosos, no consolidados, con profundidades de 10-30 cm, como registraron anteriormente Pinto-Nolla y Naranjo (1993). De otro lado, en los sectores comprendidos entre los brazos del río (Riíto, Calancala, La Fita) se ha venido incrementando las poblaciones de Batis

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maritima y Sesovium portulacastrum, encontrando que la primera repre-senta más del 60% del sotobosque del manglar entre los brazos Riíto y Calancala (Lema, 2000; Vásquez, 2000, Rosado, 2003). Aparentemente se está presentando un incremento en el área de cobertura de estas es-pecies en vastos sectores del delta, dando indicios de la hipersalinización de los suelos.

Estos resultados preliminares plantean la necesidad de comprender la variación espacial de los atributos del suelo y su influencia sobre las comunidades vegetales establecidas, teniendo como base su posición geomorfológica y la dinámica del río.

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ii. Otros ecosistemas

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ECOSISTEMAS MARINOS Y LA IMPORTANCIA DE LOS PROCESOS MICROBIANOS

MARINE ECOSYSTEMS AND THE SIGNIFICANCE OF MICROBIAL PROCESSES

GABRIEL GUILLOT1

1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Bogotá. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Los ecosistemas marinos constituyen un complejo fundamental de la biosfera, por su extensión, biodiversidad y por las funcio-nes claves que desempeñan en los flujos de materia y ciclos biogeoquímicos a escala global. Los microorganismos son ubi-cuos en el mar; particularmente los virus y las bacterias. Los virus (femtoplancton, 20-200 nm) son los elementos biológicos más abundantes del mar; constituídos por cadenas de ácidos nucléi-cos recubiertas por capas proteínica y de lípidos, sin metabolismo propio; son importantes como factores de mortalidad bacteriana y fitoplanctónica que convierten las células en material detrítico y materia orgánica disuelta; evidencia reciente muestra que va-rios procesos ecológicos importantes en el ecosistema pelágico y bentónico están muy influenciadas por la presencia de virus. El bacterioplancton está dominado por formas pequeñas (0.2 - 1 μm). Las bacterias del plancton deben ser identificadas y enu-meradas usando epifluorescencia y técnicas moleculares. Hay una gran variedad de tipos metabólicos del bacterioplancton definidos por el tipo de sustratos energéticos (donadores y re-ceptores de electrones), las fuentes de carbono y los productos metabólicos; los cuales juegan un papel fundamental en todos los ciclos biogeoquímicos en los ambientes marinos.

Palabras clave: Ecosistemas marinos, biodiversidad, microorganismos.

ABSTRACT

Marine ecosystems conform a fundamental complex of the biosphere because their hughe size, biodiversity and key roles

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they play in matter fluxes and biogeochemical cycles al global scale. Microorganisms are ubiquos in the sea, mainly viruses and bacteria. Marine viruses (femtoplankton, 20-200nm) are the most abundant biological entities in the sea, they area con-formad by nucleic acid chains covered by a proeinic and lipidic layer, without independent metabolism.; as a mortality factor for bacteria and algae in the plankton, viruses contributes subs-tantially to detritic and dissolved organic matter pool in the sea; recent evidence shows that several ecological proccesses are strongly influenciated by virus presence. Marine bacteria (pico-plankton , 0.2 - 1 μm) must be quantified by epifluorescence and identified by molecular technics; there are a great variety of metabolic bacterial types defined by energetic sources (electron donors and acceptors), carbon sources and metabolic products; all of them are key part of biogeochemical cycles in the marine ecosystem.

Keywords: Marine ecosystems, biodiversity, microorganism.

INTRODUCCIÓN

Los ecosistemas marinos constituyen un complejo fundamental de la biosfera, por su extensión, biodiversidad y por las diferentes funciones que desempeñan en los flujos de materia y ciclos biogeoquímicos a esca-la global. La extensión de las masas oceánicas se indican en la Tabla 1.

Tabla 1. Extensión de las Masas Oceánicas (Kennish, 1996).

Oceano y áreas adyacentes

Area (X106 km2)

Volumen (X106km3)

Profundidad (m)Media Máxima

Pacífico 181,34 714,41 3940 11022Atlántico 106,57 350,91 3293 9219

Indico 74,12 284,61 3840 7455

La distribución de la afluencia sobre los océanos presenta amplias va-riaciones latitudinales, teniendo en cuenta el balance entre la precipita-ción, la evaporación y la escorrentía desde los continentes (Figura 1).

Los parámetros físicos fundamentales para caracterizar las masas de agua del océano son la temperatura y la salinidad; las variaciones latitu-dinales a nivel superficial (Figura 2).

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Figura 1. Balance entre la precipitación, la evaporación y la escorrentía en los océanos.

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Figura 2. Perfiles verticales medios de parámetros fundamentales que caracterizan el océano.

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Los microorganismos, categoría informalmente definida que se refiere usualmente a procariontes son ubicuos en el mar; particularmente los virus y las bacterias.

VIRUS

Son los elementos biológicos más abundantes del mar; se trata de par-tículas del orden de 20-200 nm (femtoplancton), consisten de material genético DNA o RNA en cadena simple o doble recubierto por una capa proteínica y de lípidos, sin metabolismo propio; presentan densidades del orden de 1010 partículas virales por litro y han sido detectados en todo tipo de aguas y sedimentos marinos, encontrando una disminución en la abundancia (5-10 veces) entre las aguas eufóticas a las profundas y de 10 veces de aguas costeras a oceánicas; sus abundancias están más correlacionadas con las de bacterias que con las de algas. Infectan todo tipo de organismos (entre 1 y 5% de las células), solo son detectables vi-sualmente en la fase lítica final de la infección. Causan entre un 10-40% de mortalidad bacterial al aumentar experimentalmente la fracción de ta-maño 2-200nm reduciendo la tasa fotosintética hasta en 50%. Su tasa de renovación está entre una hora y varios días, siendo más rápida en aguas más ricas, pudiendo perder su infectividad antes de degradarse, el factor de degradación más conocido es la exposición al UV-B solar, donde llega a 40-80% por hora. Los cianófagos infectan a cianobacterias; otros virus infectan fitoplancton eucariótico incluyendo varias HA que causan flora-ciones algales tóxicas (Aureococcus, Chrysophyta; Heterosigma, Rhaphi-diophyta), hasta 50% de infección en floraciones de Emiliania huxleyi.

Los virus son importantes por ser factores de mortalidad bacteriana y fitoplanctónica que convierten las células en material detrítico y materia orgánica disuelta. Se generan ciclos semicerrados bacteria-materia or-gánica disuelta- bacteria, que liberan nutrientes mineralizados y a la vez ejercen un redireccionamiento de la producción de biomasa hacia las formas particuladas de más pequeño tamaño y hacia el pool de materia orgánica disuelta.

A nivel del efecto sobre el metabolismo en la columna de agua, se ha encontrado que la respiración, la distribución por tamaños, las tasas de sedimentación, biodiversidad bacteriana y algal, el control de floraciones algales, la formación del dimetil sulfuro y diversas transferencias genéti-cas, están muy influenciadas por la presencia de virus.

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BACTERIAS

La producción bacteriana en sedimentos varía ampliamente de acuer-do con el tipo de ambiente y para el caso de sedimentos en sistemas costeros presenta valores característicos (Tabla 2).

Tabla 2. Producción bacteriana en sedimentos costeros, de acuerdo a Kemp (1990).

Hábitat Producción mg C/m2/día

Playas arenosas 2,5 -3,7Manglares 200 – 700Arenas de arrecifes coralinos 300- 950Marismas 20 – 450Praderas de fanerógamas 40 -85Estanques de salinas 1200Estanques de acuicultura 250 – 500

BACTERIOPLANCTON

El bacterioplancton está dominado por formas pequeñas (longitud: 0,2 - 1 μm; volumen: 0,01 – 0,2 μm3). La formas más frecuentes son: co-cos, vibrios, bacilos, colonias y filamentos (5- 50μm). El pastoreo influye en la distribución de tamaños del bacterioplancton pues los filtradores depredan las formas grandes y dejan las formas menores (<1μm). Cuan-do se retiran los filtradores de protozoos, estos aumentan y consumen preferentemente las bacterias pequeñas y entonces se incrementan las formas mayores (filamentos>3 μm).

Las bacterias del plancton deben ser identificadas y enumeradas usan-do epifluorescencia y técnicas moleculares (secuencias de RNA riboso-mal); estas técnicas muestran que muchas bacterias nunca aparecen en los medios de cultivo convencionales. La abundancia está entre 105 y 106 células por mililitro; siendo un poco más baja en aguas oligotróficas.

TIPOS METABÓLICOS

Hay una gran variedad de grupos funcionales del bacterioplancton defini-dos por el tipo de sustratos energéticos (donadores y receptores de electro-nes), las fuentes de carbono y los productos metabólicos; como se puede ver en la Tabla 3, todos estos grupos funcionales juegan un papel funda-mental en todos los ciclos biogeoquímicos en los ambientes marinos.

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Tabla 3. Grupos funcionales del bacterioplancton definidos por el tipo de sustrato energéti-co, la fuente de carbono y los productos metabólicos.

Tipo Donador de e-

Aceptor de e-

Fuente de C

Producto final Organismo

Auto

trofo

foto

sinté

ticos Cianobacterias Luz, agua

Agua

CO2

O2

Plantas, aerobias

Bacterias fotosintéticas

Luz, H2S, S, S2O3, H2

S, SO4 , H2O

Bacterias del azufre púrpura y verde (anaerobias)

Autó

trofo

s qu

imio

sinte

tizad

ores

H2S, S, S2O3 , NH3, NO2,Fe+2, H2, Mn+2

O2, NO3, CO2

H2O, S, SO4 CH4, NO3, N2, Fe+3 , H2, Mn+4

Nitrificantes, incoloras del azufre, metanogénicas (anaerobias y aerobias)

Heterótrofos fotosintetizadores

Luz, sustancias orgánicas

AguaSustancias orgánicas

AguaBacterias púrpura (anaerobias)

HeterótrofosSustancias orgánicas

O2

Sustancias orgánicas

Ácidos orgánicos, alcohol

Bacterias heterótrofas y animales

La biomasa y producción aumentan con la mayor disponibilidad de re-cursos pero es menos eficiente a niveles elevados (sistemas eutróficos). Las bacterias heterotróficas compiten con las algas del fitoplancton por nutrientes limitantes como el nitrógeno y el fósforo.

Los depredadores del bacterioplancton son los nanoflagelados heteró-trofos, ciliados y algas fagotróficas. Esto constituye una red trófica com-plementaria a la convencional de pastoreo y depredación del plancton, que se denomina el bucle microbiano (Figura 3).

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Figura 3. Integración de las redes tróficas.

El carbono orgánico disuelto (DOC, por sus siglas en inglés) está siem-pre presente en el agua y está constituido principalmente por ácidos húmicos y fúlvicos de alto peso molecular, además contiene aminoá-cidos y oligopoli sacáridos, que son el recurso básico de alimento para el bacterioplancton; tiene un fracción recalcitrante antigua (>40 años) proveniente del suelo y otra lábil proveniente de la descomposición re-ciente del mantillo; ambas se lixivian hacia los cuerpos de agua.

Las razones C:P y C:N en la materia orgánica determinan la disponibi-lidad de alimento para el bacterioplancton y la eficiencia de conversión (biomasa bacteriana producida por gramo de Carbono orgánico utiliza-do); esta se incrementa con una mayor disponibilidad de fósforo y/o nitrógeno que hacen bajar las razones C:P y C:N.

La materia orgánica usada en las redes tróficas microbianas se respira casi totalmente en el loop bacteriano y no está muy disponible para los niveles tróficos superiores; en cuyo proceso se liberan y reciclan los nu-trientes.

Las bacterias fotosintetizadoras verdes (bacilos y vibrios del azufre Chlorobiaceae) y púrpura (del azufre: Chromatiaceae y no del azufre: Rhodospirillaceae) realizan fotosíntesis en condiciones de anoxia obli-gada dado que el oxígeno inhibe la síntesis de la bacterioclorofila. La fotosíntesis anoxigénica (no libera oxígeno) depende de la presencia

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y disponibilidad de formas reducidas del azufre. El CO2 se reduce con la oxidación del azufre reducido (H2S, S0, S2O3

-3) en presencia de luz y ausencia de oxígeno. Las bacterias fotosintetizadoras suelen ser de gran tamaño y tienen flagelos o vacuolas de gas que les permites cierto grado de movilidad a través de las quemoclinas (oxiclina) en la columna de agua; forman capas densas en la base de la oxiclina en lagos meromícti-cos con suficiente irradiancia profunda; también en estanques de evapo-ración de salinas, donde la elevada hipersalinidad reduce fuertemente la solubilidad del oxígeno.

BIBLIOGRAFÍA

FUHRMAN J. A. 1999. Marine viruses and their biogeochemical and eco-logical effects. Nature. 399: 541-548.

KEMP P.F. 1990. The fate of benthic bacterial production. Rev. Aquat. Sci. 2:109.

KENNISH M. J. (editor). 1996. Practical Handbook of Marine Science. 2 ed. CRC Press.

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ECOLOGÍA MICROBIANA EN ECOSISTEMAS COSTEROS: ARRECIFES DE CORAL, PRADERAS DE PASTOS MARINOS, ESTUARIOS Y LA ZONA LITORAL

MICROBIAL ECOLOGY IN COASTAL ECOSYSTEMS: CORAL REEFS, SEAGRASS MEADOWS, ESTUARIES AND THE LITTORAL

ZONE

MONICA PUYANA1

1Dirección de Investigaciones. Universidad Jorge Tadeo Lozano. Bogotá. Colombia

[email protected]

RESUMEN

Los microorganismos marinos juegan un papel preponderante en los ciclos biogeoquímicos del planeta a escalas geológicas, son esenciales en los procesos de reciclaje de nutrientes y en las cadenas tróficas del océano y sirven como alimento para una gran cantidad de organismos filtradores. Una gran diversidad de microorganismos marinos estan involucrados en asociaciones simbióticas con invertebrados mientras que otros grupos han estado implicados en enfermedades y mortandades masivas de organismos marinos generando cambios significativos en la es-tructura de las comunidades afectadas. En este capítulo se des-cribirán brevemente cuatro ecosistemas costeros importantes en Colombia: arrecifes coralinos, praderas de pastos marinos, sistemas laguno-estuarinos y la zona litoral y se destacarán al-gunos aspectos relevantes de la ecología microbiana en cada uno de estos ecosistemas.

Palabras clave: Ecología microbiana marina, red microbiana, zooxante-las, biopelículas microbianas.

ABSTRACT

Marine microorganisms fulfill significant roles in biogeochemi-cal cycles over geological time, are essential in nutrient recycling and trophic webs in the ocean and are also used as food by many filter feeding organisms. A great diversity of marine mi-

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croorganisms are involved in symbiotic interactions with many invertebrates whereas other groups have been implicated in widespread disease and mortality events, generating significant changes in the affected communities. In this chapter, four Co-lombian coastal ecosystems will be described: coral reefs, sea grass meadows, estuaries and coastal lagoons and the littoral zone. Some relevant aspects on the microbial ecology in each one of these ecosystems will be highlighted.

Keywords: Marine microbial ecology,-microbial loop, zooxanthellae, mi-crobial biofilms.

INTRODUCCIÓN

La gran variedad de hábitats, recursos y condiciones ambientales del medio marino han tenido una influencia significativa en la diversificación y distribución de los microorganismos en el océano (Jensen y Fenical, 1994). Resulta complicado definir y caracterizar todos los “microorganis-mos” presentes en un medio tan heterogéneo en el cual coexisten una gran diversidad de formas, con hábitos de vida y características metabó-licas y fisiológicas únicas. Si nos atenemos a una visión tradicional en la cual se consideran como microorganismos aquellos organismos uni-celulares microscópicos, entonces tendremos que en el medio marino están ampliamente representados los tres grandes dominios de la vida: Prokarya (Eubacteria y Cianobacterias) (Partensky et al., 1999; Rappe et al., 2000; Mincer et al., 2002), Archaea (DeLong et al., 1999; Karner et al., 2001) y Eukarya (Moon-van der Staay et al., 2001; López-García et al., 2001). Este último dominio incluye grupos tan heterogéneos como las llamadas “microalgas” que comprende grupos de afiliación taxonómica diversa como las diatomeas y dinoflagelados, así como algunos protis-ta y otros grupos anteriormente considerados como “hongos inferiores” (Massana et al., 2004).

Los microorganismos marinos también pueden clasificarse según su función en el medio. Los más conocidos por su importancia y diversidad de formas son los microorganismos fototótrofos, es decir, aquellos micro-organismos que realizan la fotosíntesis. Este grupo incluye formas muy diversas que emplean diferentes estrategias y pigmentos para captar la energía lumínica y realizar el proceso de la fotosíntesis y la síntesis de materia orgánica siendo responsables de más del 90% de la producti-vidad primaria en el océano. Entre los fototótrofos mas importantes se

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encuentran las cianobacterias (Prokarya), los dinoflagelados y las dia-tomeas (Eukarya). En el medio marino existen otro tipo de microorga-nismos que gracias a sus habilidades metabólicas favorecen el reciclaje de nutrientes. Aquellos microorganismos que descomponen la materia orgánica mediante la excreción de enzimas se conocen como mineraliza-dores y son supremamente importantes porque mediante los procesos de descomposición permiten que aquellos detritus orgánicos que nor-malmente no son digeribles para un buen número de organismos sean transformados en formas más disponibles y nutritivas. Entre los minerali-zadores más importantes se encuentran algunos hongos inferiores y una gran diversidad de bacterias heterótrofas. Por último, aunque no menos importantes, tenemos a los microorganismos quimiautrótofos los cuales están en capacidad de sintetizar materia orgánica a partir de energías “no tradicionales”. Muchos de estos microorganismos se encuentran en ambientes extremos y sus capacidades metabólicas les permiten derivar energía a través de procesos químicos como la reducción del sulfato, la oxidación del sulfuro y la oxidación del metano. Sólo se conocen bacte-rias y Archaea con capacidades quimioautotrófas.

Los microorganismos marinos pueden formar parte del plancton bien sea en la superficie del océano como ocurre con las formas fotosintéticas o a lo largo de la columna de agua como ocurre con muchas otras formas heterótrofas (Long y Azam, 2001). Sin embargo otros microorganismos se encuentran asociados a superficies de diversa naturaleza, como epi-biontes, endobiontes, sobre y entre los sedimentos. Es así como la gran variedad de los procesos microbianos en el medio marino son vitales para los ecosistemas someros y profundos, afectan los alimentos que el hombre deriva del océano, los desechos que arroja a éste, ofrece opor-tunidades biotecnológicas que recién empiezan a vislumbrase y posible-mente tienen la clave del origen de la vida en el planeta (Yayanos, 1995). Los microorganismos también están implicados en procesos de meteo-rización del suelo marino y por lo tanto estas comunidades microbianas son en parte responsables de su transformación (Edwards y Rutenberg, 2001; Edwards et al., 2003).

Dadas las limitaciones de las técnicas tradicionales y la imposibilidad de cultivar la mayor parte de los microorganismos marinos, solo reciente-mente se han logrado descubrimientos importantes en cuanto a la diver-sidad, relaciones filogenéticas, fisiología y ecología de las comunidades microbianas en ambientes naturales. Estos avances se han logrado gra-

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cias al desarrollo e implementación de metodologías novedosas como diversas tecnicas moleculares, microscopia avanzada y análisis con isóto-pos, entre otras (DeLong, 2001).

Aquellos microorganismos asociados a superficies inmersas en el medio marino revisten especial importancia ya que tienden a formar biopelícu-las sobre las superficies a las cuales se fijan. La formación de biopelículas es un proceso supremamente importante que puede determinar entre otros, el asentamiento larval y metamorfosis de una gran cantidad de in-vertebrados marinos (Pawlik, 1992; Webster et al., 2004), la inducción de la morfogénesis algal o el desarrollo de interacciones entre macroalgas y bacterias fijadoras de nitrógeno (resumido en Harder et al., 2003) y la colonización de superficies por invertebrados y algas (Davis et al., 1989 Fusetani, 1997). La formación de biopelículas sobre organismos vivos se conoce como epibiosis (Wahl, 1989), mientras que el proceso que se desarrolla sobre superficies inanimadas se conoce como fouling, aun-que los términos en ocasiones se usan indistintamente. La epibiosis y el fouling son procesos naturales que resultan de la necesidad que tienen micro y macroorganismos bentónicos de asentarse, desarrollarse y vivir sobre superficies adecuadas disponibles en el medio. En algunos casos, la epibiosis microbiana puede tener connotaciones negativas ya que en organismos que carecen de defensas físicas y tienen tejidos blandos una biopelícula microbiana no debidamente regulada puede estar implicada en procesos de enfermedades y necrosis tisular (Harder et al., 2003, Ge-ffen y Rosenberg, 2005).

La formación de biopeliculas implica una compleja interacción de fe-nómenos biológicos, físicos y químicos, tanto orgánicos como inorgáni-cos. Tradicionalmente este proceso se ha descrito de forma sucesional con tres elementos consecutivos: la formación de películas moleculares, el asentamiento y desarrollo de una biopelícula microbiana y el asenta-miento posterior de esporas de algas, invertebrados y material particu-lado (Davis et al., 1989; Wahl, 1989). El proceso “clásico” comienza una vez un objeto es sumergido en el medio marino, donde su superficie es, en cuestión de minutos, recubierta por material orgánico e inorgánico particulado en un proceso regulado por fuerzas físicas y que se conoce como fouling molecular o película molecular. Después de este acondi-cionamiento previo, se presenta la formación del microfouling o biopelí-cula microbiana. Se consideran como biopelículas microbianas, aquellos consorcios microbianos que se desarrollan en interfases sólido-líquido,

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sólido-aire y líquido-aire (Flemming, 2002). En el caso del fouling mari-no, esta biopelícula se encuentra constituida inicialmente por bacterias y en estadios posteriores por diatomeas y protista (flagelados, ciliados etc.). Las bacterias se aproximan y asientan sobre la superficie mediante procesos que involucran fuerzas físicas tales como el movimiento brow-niano, interacciones electrostáticas, gravedad y fuerzas de van der Waals. Esta fijación puede ser temporal y reversible y se denomina “adsorción” (Wahl, 1989). Una vez las bacterias han detectado la superficie ideal para fijarse, se adhieren irreversiblemente a ésta usando sustancias poliméri-cas extracelulares (EPS por sus siglas en inglés) tales como mucus, pro-teínas, polisacáridos u otros adhesivos naturales (Flemming, 2002) en un proceso que se denomina “adhesión” (Wahl, 1989). La sucesión que se presenta en la formación de biopelículas microbianas depende de las características biológicas y los requerimientos fisiológicos de las dife-rentes formas microbianas involucradas en el proceso (Wahl, 1989). La biopelícula microbiana constituida por células vivas y muertas, así como sus productos extracelulares de adhesión junto con la película molecular se denomina la película o biopelícula primaria y durante esta fase las propiedades de la interfase sustrato/agua cambian drásticamente (Wahl, 1989).

Después de la formación de la biopelícula primaria sigue el macro-fouling, es decir, la fijación de esporas de algas y larvas de invertebrados proceso que está influenciado por una combinación de factores físicos, químicos y biológicos (resumido en Clare et al., 1992). Los modelos tradicionales que describen los procesos de macrofouling sugieren un componente sucesional muy marcado, sin embargo, el proceso no es linear y el factor mas determinante en este proceso es la cantidad rela-tiva, en la columna de agua, de larvas y propágulos de organismos que potencialmente pueden asentarse sobre un sustrato disponible. En el estudio hacia el entendimiento de las condiciones bajo las cuales las larvas de invertebrados seleccionan un sustrato, se fijan a éste y sufren metamorfosis para seguir su desarrollo como juveniles, se ha obtenido sólida experiencia experimental que indica que para muchos organis-mos, se requiere de una previa adecuación de la superficie mediante la formación de la biopelícula microbiana (resumido en Johnson et al., 1997). Algunas larvas, sin embargo, pueden fijarse sin la necesidad de un acondicionamiento previo de la superficie (resumido en Clare et al., 1992). La naturaleza de las interacciones entre las bacterias presentes en la biopelícula y las larvas de invertebrados es sumamente variable y no se

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constituyen simplemente en respuestas positivas o negativas a una bio-película primaria. Las bacterias pueden alterar la energía de la superficie o bien sus características físicas, químicas o biológicas y generar respues-tas en las larvas mediante productos solubles del metabolismo bacterial o por compuestos asociados a la superficie de sus células (Clare et al., 1992; Pawlik, 1992; Johnson et al., 1997). Por lo tanto, el asentamiento y fijación de larvas obedece a la percepción de señales químicas particula-res producidas por los organismos que constituyen la biopelícula o bien se asocian a ésta. Estos compuestos pueden tener una influencia negati-va disuadiendo el asentamiento o positiva estimulando el asentamiento (Steinberg et al., 2001).

Sea cual fuere la definición que quiera dársele a los microorganismos marinos, sabemos que éstos son abundantes en el océano (Eilers et al., 2000), juegan un papel preponderante en los ciclos biogeoquímicos del planeta a escalas geológicas (Petsch et al., 2004, Edwards et al., 2005) son esenciales en los procesos de reciclaje de nutrientes (Corredor et al., 1988; Zehr y Ward, 2002), son la base de las cadenas tróficas del océano (Valiela, 1995; Azam et al., 1983) y se constituyen como alimento para una gran cantidad de organismos filtradores (Díaz, 1996; Sorokin, 1993). Los microorganismos marinos son también muy importantes en asocia-ciones con invertebrados lo cual les ha permitido a éstos adquirir va-riadas capacidades metabólicas en diversos ambientes marinos (Fisher, 1990; Santavy, 1995; Wilkinson, 1987). De otra parte, microorganismos como bacterias y algunos hongos han estado implicados en enfermeda-des y mortandades masivas de plantas y animales marinos (Geiser et al., 1998; Harvell et al., 1999; Lessios, 1988; Richardson, 1998) cuyo impacto genera cambios significativos en la estructura de las comunidades afec-tadas (Garzón-Ferreira y Zea, 1992; Guzmán y Cortés, 1984; Nagelkerken et al., 1997).

A continuación se hará una breve descripción de los aspectos más importantes de los cuatro ecosistemas costeros más importantes en Co-lombia como son arrecifes coralinos, praderas de pastos marinos, los sistemas lagunoestuarinos y la zona litoral. No se incluirán los manglares que están estrechamente ligados con los estuarios, dado que ese tema será tratado en detalle en otro capitulo. Esta es una revisión general en la cual solo se destacarán algunos aspectos relevantes de la ecología mi-crobiana en cada uno de estos ecosistemas.

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ARRECIFES CORALINOS

Los arrecifes de coral son el producto de la secreción de exoesqueletos de carbonato de calcio por parte de los pólipos coralinos que son las uni-dades modulares de los corales. Las masivas construcciones arrecifes que vemos hoy en día son el producto de la actividad de millones y millones de pólipos durante miles de años. Los corales que construyen arrecife se conocen como corales hermatípicos, este término tiene una connotación funcional más no taxonómica ya que se consideran como corales her-matípicos aquellos del orden Scleractinia así como a los hidrocorales del orden Milleporina. Aunque el andamiaje arrecifal es construido por cora-les hermatípicos, en los arrecifes coralinos coexisten una gran cantidad y variedad de organismos que han sido producto de numerosos procesos de especiación y diversificación favorecidos por la altísima diversidad de nichos en este ecosistema. Por su complejidad ecológica y su diversidad en forma y función, los arrecifes coralinos son frecuentemente equipara-dos con las selvas o bosques tropicales.

Los factores físicos y ambientales controlan el desarrollo y crecimiento de arrecifes coralinos en una localidad determinada, los rangos de dis-tribución y diversidad de las especies que construyen y que habitan en el arrecife e influyen en la variación morfológica de tales especies. Estos factores han sido desde tiempos inmemoriales determinantes en los pro-cesos de evolución de las especies arrecifales. Entre los factores físicos dependientes de la latitud más importantes tenemos la luz, la tempe-ratura, las corrientes, los procesos de circulación y la disponibilidad de hábitats. Otros factores que también son importantes para el desarrollo arrecifal aunque no dependen de la latitud son la circulación superficial, la disponibilidad del sustrato, la calidad del agua, el aporte de nutrientes, los procesos ecológicos regionales y las barreras de dispersión.

La temperatura es el factor mas importante en la distribución horizon-tal de los arrecifes coralinos, estando restringidos a la zona tropical entre los 24° N y 24° S. Existen temperaturas mínimas efectivas por debajo de las cuales a pesar de que los corales pueden sobrevivir, la construcción arrecifal no puede ser sostenida. La temperatura óptima para el creci-miento y desarrollo coralino varía según la disponibilidad de nutrientes en el medio y tiene efectos sinérgicos con la salinidad pero se considera óptimo un rango entre 26 y 28°C (Veron, 1995).

La luz es el factor físico mas importante que ha permitido la construc-ción de arrecifes a lo largo del tiempo y a su vez limita la distribución

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vertical de corales y arrecifes. Esto obedece al hecho que la construcción arrecifal sólo se da gracias a la asociación simbiótica de los pólipos de corales hermatípicos con microorganismos, específicamente dinoflagela-dos conocidos como zooxantelas. Las zooxantelas mediante el proceso de fotosíntesis usan la energía solar para sintetizar compuestos orgánicos a partir de CO2, nutrientes inorgánicos y agua y son primordiales para el proceso de calcificación mediante el cual es posible la deposición del exoesqueleto de los corales hermatípicos. En esta asociación simbiótica aproximadamente un 90% del carbono fijado por la zooxantela es translo-cado al pólipo coralino como glicerol, glucosa y alanina. Nutrientes como el nitrógeno y el fósforo que provienen de los desechos metabólicos del pólipo son compartidos con la zooxantela. Se tienen evidencias de que la simbiosis con zooxantelas data del Silúrico (420 m.a.) (Cowen, 1988) y hoy en día sabemos que las zooxantelas son un grupo muy diverso y que en un mismo individuo se pueden encontrar varios tipos de simbiontes a lo largo del gradiente de irradiación (Rowan y Knowlton, 1995). Esta distribución polimórfica de los simbiontes a nivel de individuo delimita la distribución y ecología del blanqueamiento de los corales (Rowan y Knowlton, 1995; Rowan et al., 1997; Toller et al., 2001).

La cantidad de radiación solar que puede penetrar en la columna de agua para permitir el proceso de la fotosíntesis por las zooxantelas de-pende principalmente de la latitud, la profundidad y la claridad del agua. Por esta razón la distribución vertical de la parte viva del arrecife esta limitada a los primeros 10 a 50 metros de profundidad. La luz no solo limita el crecimiento arrecifal sino que es importante en la morfología de los corales, los cuales a mayor profundidad crecen de forma tal que maximizan su acceso a la luz. De igual forma, la luz es importante en los procesos de competencia por espacio con las algas ya que estas últimas pueden crecer mucho mas rápido que los corales bajo condiciones ópti-mas de irradiación y en ausencia de herbívoros desplazar a los corales.

PRADERAS DE PASTOS MARINOS

La gran mayoría de plantas que se encuentran en el medio marino son conocidas como “algas” término que incluye varios grupos filogenética-mente distantes. Sin embargo, en el medio marino también se cuenta con la presencia de los pastos marinos, término que describe a varios grupos de fanerógamas que viven sumergidas en ambientes someros marinos y estuarinos. Los pastos generalmente se encuentran en praderas de ex-tensión variable que para su desarrollo requieren buena luz, circulación

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moderada y salinidad alta. Las praderas de pastos están distribuidas en zonas tropicales y subtropicales donde suelen tener un intercambio im-portante de materia y energía con ecosistemas adyacentes. En el caso de las praderas de pastos en la zona tropical, este intercambio se realiza en grado variable con los manglares y los arrecifes de coral favoreciendo el desarrollo de redes tróficas complejas. La productividad de los pastos marinos se ve afectada por la disponibilidad de la luz, la cual determina su abundancia y rango de profundidad a la cual los pastos pueden crecer y desarrollarse. Otros factores importantes que influyen en el desarrollo de praderas de pastos son el régimen hidrodinámico predominante, la herbivoría y la disponibilidad de nutrientes (Ibarra-Obando et al., 2004).

Los pastos marinos son importantes porque sus hojas reducen la ve-locidad de las corrientes y los sedimentos en suspensión se asientan y quedan atrapados entre las raíces y estolones que comunican las diferen-tes plantas, consolidando así el sustrato. Estas raíces albergan una alta di-versidad de fauna. Las praderas de pastos pueden contribuir a mejorar la calidad del agua a nivel local porque actúan como trampas de nutrientes y a su vez proveen de alimento, refugio y hábitat a una gran diversidad de especies importantes en un contexto ecológico así como a otras de importancia económica como tortugas, manatí, langostas, erizos y varias familias de peces. Muchos de los organismos que se alimentan en las praderas de pastos provienen de los arrecifes adyacentes y las praderas de pastos también sirven como refugio de especies que son fuertemente depredadas en los arrecifes coralinos como ocurre con ciertas algas y esponjas o con los estadios juveniles de algunos peces arrecifales.

De otra parte los pastos son productores primarios de importancia a nivel local y sus hojas sirven de sustrato a una gran cantidad de epífitos incluyendo microorganismos, algas e invertebrados. A pesar de que la producción por parte de los epífitos puede ser significativa, un exceso de éstos puede impedir o afectar la fotosíntesis por lo cual algunos pastos secretan ácidos fenólicos que impiden la fijación de microorganismos y cirripedios (Todd et al., 1993) o bien secretan otro tipo de compuestos mas complejos para evitar la degradación microbiana in vivo (Jensen et al., 1998).

Las raíces de los pastos marinos proveen una compleja red de oxigena-ción de las capas superficiales del sedimento que permiten la respiración aeróbica y la oxidación del metano que resulta de la descomposición de la materia orgánica (Valiela, 1995). Sin embargo, el oxígeno es rápida-

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mente consumido en la superficie de los sedimentos y la mayor parte de la materia orgánica es mineralizada bajo condiciones anóxicas. Los sulfatos y minerales de hierro son abundantes en los sedimentos y una porción sustancial de la oxidación del carbono en estos ambientes pa-rece estar ligada a la reducción del sulfato y/o la reducción del hierro férrico (Roychoudhury et al., 2003).

LOS SISTEMAS LAGUNO-ESTUARINOS

Los sistemas laguno-estuarinos son ecosistemas costeros que tienen una conexión permanente o efímera con el mar y en los cuales el agua de mar se diluye con los aportes del drenaje terrestre. Los estuarios como tal son sistemas que geomorfológicamente no tienen barreras como en el caso de la desembocadura de los ríos, mientras que las lagunas cos-teras suelen ser sistemas semicerrados, los cuales están separados del mar por islas de barrera producto del sedimento aportado por los ríos. En los sistemas laguno estuarinos la mezcla de agua salada y dulce no es constante debido a que hay patrones de circulación complejos que de-penden de la geomorfología costera, los aportes de agua de mar y agua dulce, el régimen predominante de mareas y el régimen y dirección de los vientos.

Los ecosistemas lagunoestuarinos se caracterizan por tener altas tasas de producción primaria y secundaria, por esta razón pueden soportar po-blaciones importantes muchas de las cuales revisten importancia comer-cial para el hombre. La alta productividad de estos ecosistemas se debe a que a éstos tienen diversos subsidios de energía y un aporte elevado de nutrientes los cuales tienen una alta permanencia en el ecosistema debido a que los patrones de circulación son relativamente limitados. La variabilidad ambiental de los estuarios y lagunas costeras hace que es-tos sistemas sean inestables y tengan condiciones poco predecibles, así estos ambientes pueden funcionar como sumideros (sinks) de material orgánica o bien como reservorios de ésta permitiendo la exportación y fertilización de ecosistemas costeros adyacentes.

El balance entre la acumulación y exportación de materia orgánica en sistemas lagunoestuarinos depende, además de factores físicos, de la de-gradación y la utilización de la material orgánica disponible por parte de organismos heterótrofos. Estos procesos están en gran parte controlados por la red microbiana bentónica (microbial loop) (resumido en Manini et al., 2003). Las bacterias y protozoos bacteriófagos son los componentes

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principales de la red microbiana y entre estos últimos son los nanoflage-lados quienes ejercen una mayor influencia en la estructura de las comu-nidades bacterianas (Wu et al., 2004, Matz y Jurgens, 2005).

El carbono orgánico disuelto (COD) es la forma más común de carbo-no en ambientes acuáticos. Las formas de alto peso molecular del COD incluyen polisacáridos lábiles que pueden ser rápidamente degradados por bacterias. Sin embargo otras formas de alto peso molecular que no se descomponen fácilmente son los ácidos húmicos y el material vege-tal, especialmente en ecosistemas donde la influencia de la vegetación vascular es abundante. Entre los componentes de bajo peso molecular del COD se incluyen azucares, aminoácidos así como material refractario producto de la degradación microbiana de moléculas de gran tamaño (resumido en Covert y Moran, 2001).

La composición de la materia orgánica que llega a los sedimentos va a determinar en gran medida la capacidad de la red microbiana en trans-ferirla a niveles superiores de la cadena trófica ya que la cantidad y ca-lidad de la material orgánica en los sedimentos controla las tasas de la degradación y regeneración de ésta y su utilización por los organismos bentónicos heterótrofos. La calidad se refiere a la proporción de material refractorio vs material utilizable y el contenido de carbohidratos y proteí-nas hidrolizables por la acción enzimática de los microorganismos. Los productos provenientes de la degradación de la materia orgánica por parte de los microorganismos, se hacen entonces disponible para las bacterias y metazoarios bentónicos (meiofauna principalmente), los cua-les serán a su vez fuente de alimento para el macro bentos y estos a su vez para el necton. De esta forma se reciclan los nutrientes en la cadena trófica aunque es posible que las bacterias compitan con la meiofauna por la utilización de la materia orgánica disponible y cuando esto sucede la transferencia de carbono orgánico a los niveles tróficos superiores es menos eficiente (Manini et al., 2003).

LA ZONA LITORAL

La zona litoral se refiere a aquella zona costera que se constituye en la interfase tierra-mar bien sean playas fangosas, playas arenosas o acan-tilados rocosos. Esta definición puede hacerse un poco más específica y hablamos de zona intermareal como aquella porción de la zona litoral la cual está constantemente sometida a las variaciones del nivel de marea y la acción del oleaje. Los organismos que habitan en la zona intermareal

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tienen adaptaciones morfológicas y fisiológicas o bien comportamientos que les permiten vivir en un ambiente sometido a extremos de tempera-tura, salinidad y desecación.

En la zona intermareal existe una zonación marcada dependiendo del resultado de la acción mareal sobre los diferentes tipos de organismos que allí habitan y su tolerancia a soportar la exposición al aire, la dese-cación y los extremos de temperatura. Sin embargo hay otros factores de orden biológico que también tienen una marcada influencia en la zona-ción del intermareal y son la depredación y herbivoría, la competencia por espacio y la disponibilidad de sustrato adecuado para el asentamien-to larval.

El tipo de sustrato de la zona intermareal tiene una marcada influencia sobre el tipo de fauna, flora y microbiota que allí se encuentra. Así en costas rocosas tendremos un predominio de formas incrustantes y con estructuras de sujeción fuertes mientras que en playas arenosas o fan-gosas, donde el sustrato es muy inestable, tendremos un predominio de formas enterradoras. En el caso de las playas, el tamaño del grano que compone los sedimentos es de particular importancia para el desarrollo de la infauna y la microbiota. En las playas las partículas son atrapadas en las capas más superficiales y ahí se desarrolla una comunidad de bacte-rias y protozoos. Por debajo de las capas superficiales, la flora bacteriana se adhiere a los granos de arena removiendo una porción del carbono orgánico disuelto y sustentando la meiofauna que consiste principalmen-te de nematodos y copépodos (Bernan, 2001).

Los microorganismos juegan un papel preponderante en la producción primaria y en la remineralización de nutrientes de la zona intermareal y muchos de los procesos biológicos y geoquímicos mediados por micro-organismos en esta zona se desarrollan a nivel de biopelículas. Además de la compleja dinámica microbiana que ocurre en las biopelículas, éstas se constituyen como un microambiente protector para los microorganis-mos ya que las secreciones poliméricas extracelulares permiten que haya una adherencia de partículas de sedimento y detritus los cuales sirven de anclaje a las células y además brindan protección contra los extremos de temperatura, salinidad, irradiación y desecación. Las biopelículas tam-bién sirven como una matriz para concentrar iones y moléculas orgáni-cas en cercanía de las células, o bien como una matriz para almacenar compuestos y moléculas secretados por los microorganismos los cuales varían enormemente en sus propiedades físicas y químicas y tienen un

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amplio rango de funciones biológicas y ecológicas en las poblaciones y comunidades de la zona intermareal. Algunas biopelículas pueden fa-vorecer la aparición de gradientes geoquímicos abruptos. Dado que las biopelículas tienen la capacidad de concentrar las actividades enzimá-ticas de los microorganismos, su desarrollo y permanencia influyen en la dinámica y velocidad de los procesos de remineralización de la zona intermareal. La secreción de polímeros en las biopelículas puede ayudar a estabilizar sedimentos fangosos en la zona intermareal y a nivel de la columna de agua, la secreción de estas sustancias en biopelículas que se desarrollan sobre partículas en suspensión, puede contribuir a que éstas se constituyan en refugios que pueden favorecer la supervivencia y propagación de microorganismos patógenos provenientes de ríos y el medio terrestre. Otras implicaciones en la salud ambiental y humana de las biopelículas en la zona intermareal están relacionadas con el hecho que metales pesados y contaminantes pueden ser adsorbidos por éstas actuando como un vehiculo para la entrada de estos contaminantes a las cadenas tróficas (resumido en Decho, 2000).

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PROCARIOTAS, VIRUS Y PROTOZOOS EN LOS ECOSISTEMAS ACUÁTICOS: APROXIMACIÓN A LA ECOLOGÍA MICROBIANA DEL EMBALSE DEL NEUSA

PROKARYOTES, VIRUSES AND PROTOZOA IN AQUATIC ECOSYSTEMS: APPROACH TO MICROBIAL ECOLOGY OF

NEUSA`S DAM

JUAN PABLO NIÑO1, AMPARO CANOSA1

1Facultad de Biología Marina. Laboratorio de Microbiología. Grupo de Microbiología Acuática

Universidad Jorge Tadeo Lozano. Bogotá. Colombia [email protected]

RESUMEN

La hipótesis del loop microbiano resalta la importancia de los procariotas y las interacciones microbianas en la columna de agua y sus implicaciones para la productividad acuática. Este do-cumento muestra como la bacteriovoría, la lisis viral y la produc-ción del fitoplancton controlan la abundancia y producción del bacterioplancton, cómo estas interacciones afectan las transfe-rencias de materia y energía en los ecosistemas acuáticos. Una vez planteada esta problemática se describe como, desde esta perspectiva, el Grupo de Microbiología Acuática de la Universi-dad Jorge Tadeo Lozano ha abordado el estudio de los microor-ganismos acuáticos, utilizando las técnicas de epifluorescencia e hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH).

Palabras clave: Loop microbiano, interacciones microbianas, bacteriovo-ría, control viral, FISH.

ABSTRACT

Microbial loop hypothesis shows the significance of prokaryotes and microbial interactions in water column and its consequen-ces on aquatic productivity. Control through bacterivory, viral lysis and phytoplankton production on bacterioplankton com-munity is illustrated in this document. It is also explained how these interactions could influence matter and energy transfer in aquatic ecosystems. Finally, the approach followed by Grupo

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de Microbiología Acuática from Universidad Jorge Tadeo Lozano is described with an emphasis on epifluorescence microscopy methodologies and fluorescence in situ hybridization (FISH).

Keywords: Microbial loop, microbial interactions, bacterivory, viral con-trol, FISH.

Hace más de dos décadas se demostró una abundancia inesperada del bacterioplancton en ambientes de agua dulce y marina, lo que llevó a proponer que esta comunidad cumple un papel más importante en el flujo de materia y de energía en el ecosistema acuático de lo que se pensaba hasta el momento (Azam et al., 1983; Pomeroy, 1974).

Usualmente se consideraba que el fitoplancton constituía la base fun-damental de las redes tróficas acuáticas y que los procariotas cumplían su papel como remineralizadores de nutrientes inorgánicos favoreciendo la productividad primaria, sin embargo, la propuesta de la hipótesis del loop microbiano (Azam et al., 1983) sugirió un cambio de paradigma. Los procariotas heterotróficos del plancton y aquellos adheridos a las partículas suspendidas, además de remineralizar aportan a la producción secundaria del sistema como consecuencia de la incorporación de mate-ria orgánica disuelta (MOD) en la biomasa procariota que se transfiere a través del consumo de células por parte de los flagelados heterotróficos (Cole y Pace, 1995).

En consecuencia, uno de los factores que influyen sobre la abundancia procariota es la disponibilidad de nutrientes provenientes del fitoplanc-ton o de otras fuentes externas, de hecho, existe una tendencia a encon-trar mayor abundancia y biomasa procariota en sistemas acuáticos con mayores productividades primarias (Coveney y Wetzel, 1995; Fuhrman y Azam, 1980). No obstante, la variación de la abundancia es pequeña comparada con los cambios en la producción bacteriana en diferentes sistemas (Ducklow, 2000; Canosa y Pinilla, 1999, 1998; Reche et al., 1998; Kirchman et al., 1982; Ray y Hill, 1980) lo que sugiere que existen otros mecanismos de homeostasis que podrían compensar las tasas de producción del bacterioplancton.

La presión que ejercen por pastoreo los heterótrofos nanoflagelados es otro elemento de control propuesto. De hecho, constituye el principal mecanismo de transferencia entre la biomasa procariota y la de otros or-ganismos del micro y metazooplancton en la columna de agua. El impac-

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to de la bacteriovoría, como se ha denominado al proceso de ingestión de bacterias por estos organismos del nanoplancton, se ha documentado tanto con estudios experimentales como de campo (Fu et al., 2003; Hahn y Hofle, 2001; Pedrós-Alió et al., 2000; Strom, 2000; Guixa-Boixereu et al., 1996). Aunque algunos de estos trabajos han demostrado que hay un control efectivo por parte del nanoplancton heterótrofo y que las ta-sas de pastoreo pueden llegar a igualar las de producción procariota, sus amplios rangos de variación en una escala estacional y sus interacciones con otros grupos de microorganismos como las algas y los consumidores del microplancton no han permitido definir irrefutablemente la magnitud y el efecto de este proceso sobre los procariotas del plancton.

Por otra parte, el hallazgo de gran cantidad de virus suspendidos en la columna de agua generó muchos cuestionamientos sobre la pro-puesta del control casi exclusivo del nanoplancton heterótrofo sobre los procariotas y el papel de las partículas virales en los ciclos biogeo-químicos (Fuhrman, 1999; McManus y Fuhrman, 1988). Debido a que las partículas virales generan la lisis masiva de células del bacterioplanc-ton y del fitoplancton (10-20% de la abundancia total) y teniendo en cuenta su alta especificidad en la infección, el virioplancton afecta tanto la abundancia como la composición de las comunidades microbianas del agua favoreciendo el desarrollo de las poblaciones menos abundantes (Fuhrman, 2000; Thingstad, 2000; Pinhassi et al., 1997). Su potencial efecto se ha venido evaluando en los últimos años y lo que se ha encon-trado es que puede balancear la producción procariota hasta en un 50% (Steward, 1996; Weinbauer y Hofle, 1998). Al igual que para el caso de la bacteriovoría, la lisis viral ha mostrado variar ampliamente en su efecto sobre el bacterioplancton tanto en una escala espacial como temporal.

Establecer la importancia relativa de estos factores en el control del bacterioplancton y sus patrones de variación en diferentes escalas es uno de los retos de la ecología microbiana acuática hoy en día. Si los procari-otas son el punto de conexión entre la materia orgánica disuelta y otros niveles tróficos, sólo las medidas de la cantidad de materia que es asimi-lada por las células del bacterioplancton (producción) con respecto al total que consumen (eficiencia) y las tasas de transferencia a través de la bacteriovoría podrán darnos una idea real de la importancia en magnitud de estos microorganismos en el agua (Strom, 2000; Thingstad, 2000); esto implica un conocimiento de los rangos de variación de las comuni-dades involucradas en estos procesos y un entendimiento de los factores

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ambientales que las afectan. Es claro que en aquellos sistemas donde la bacteriovoría sea numéricamente mayor, el bacterioplancton puede ac-tuar como un punto de transferencia de materia hacia otros niveles y por lo tanto favorecer la productividad secundaria de dichos sistemas (Strom, 2000). Por el contrario, un predominio de la lisis viral implica un reciclaje continuo de la misma materia entre virus y procariotas; esto, sumado a que las eficiencias de la incorporación de materiales a la biomasa celular están siempre por debajo del 100%, implica una pérdida de materia del sistema a través de la respiración, lo que indicaría que el bacterioplanc-ton puede convertirse en este caso en un sumidero de materia (Fuhrman 2000, MacManus y Fuhrman, 1988). Por lo tanto, establecer generaliza-ciones de la magnitud de estos procesos y su variación podría aportar a un mejor entendimiento de los ecosistemas acuáticos y en consecuencia generar mejores herramientas conceptuales para su gestión.

Con el desarrollo de las técnicas moleculares y el auge de la diversi-dad biológica, se ha hecho posible una aproximación al análisis de los cambios que ocurren en la estructura de la comunidad procariota; esta perspectiva incluye otro aspecto afín con la problemática de la comuni-dad procariota en los ecosistemas acuáticos, el efecto de los cambios en la composición de especies y la función de los ecosistemas. Muchas de las adaptaciones de los procariotas a las condiciones del medio están relacionadas con aspectos bioquímicos del metabolismo celular; la gran diversidad metabólica de estos microorganismos hace pensar que gra-dientes espaciales y cambios temporales puedan ser amortiguados por modificaciones en la estructura y por tanto la función de una comunidad específica (Giovannoni y Rappé, 2000). Esta hipótesis ha sido corroborada en sistemas experimentales simples sometidos a perturbaciones, donde se ha demostrado que la estabilidad de los procesos microbianos se mantiene gracias a los cambios en la estructura de las comunidades que lo llevan a cabo (Fernández et al., 1999, 2000). Aunque se ha encontrado que diferentes factores como la salinidad, el tipo de fuente de carbono, la bacteriovoría y la lisis viral tienen efecto sobre la comunidad procari-ota del agua (Hornak et al., 2005; Weinbauer y Rassoulzadegan, 2004; Van Hannen et al., 1999; Yannarell, 2003); en sistemas abiertos donde el grado de complejidad es mayor, la situación no ha podido resolverse. Es posible que los avances de la Genómica y la Transcriptómica nos lleven algún día a comprender mejor la expresión de los genes microbianos en los ambientes acuáticos. Sin embargo, conocer los cambios en la com-posición de especies de los ensamblajes procariotas en el tiempo y el

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espacio y poder explicar su relación con los cambios en el entorno físico y químico nos dará por lo pronto una idea sobre la medida en que dichos cambios afectan la producción procariota, la eficiencia de asimilación y el aporte de este grupo a la productividad acuática.

En síntesis, cada vez es más evidente que procariotas, nanoflagelados heterótrofos, virus y fitoplancton interactúan en la columna de agua y que el resultado de esa relación tiene consecuencias sobre el funcionamiento del ecosistema acuático. Sin embargo, los hasta ahora escasos esfuerzos investigativos y las dificultades técnicas relacionadas con la carencia de métodos unificados para el estudio de estas comunidades y de aquellos que permitan hacer una exploración rápida de las interacciones en una escala espacial - temporal amplia, han limitado las investigaciones en estos temas a unos pocos sistemas. Como consecuencia de esta situ-ación no ha sido posible definir modelos generales que expliquen el papel cuantitativo de los microorganismos en los ecosistemas acuáticos. Aunque se han venido desarrollando técnicas rápidas como el análisis de imágenes, la citometría de flujo, el análisis automatizado de la región in-tergénica ribosomal (ARISA) y la secuenciación automática, que comple-mentan a las ya tradicionales técnicas de fluorescencia y de fingerprinting que han permitido ampliar la escala de estudio de los organismos del nanoplancton, bacterioplancton y virioplancton, se requiere una gran in-versión en el recurso humano interesado en esta problemática. Se debe insistir en la necesidad de integrar a estas comunidades en el estudio de la ecología acuática, pero esto solo se logrará en la medida que podamos definir con claridad su función e importancia en los ecosistemas.

El grupo de Microbiología Acuática de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano ha desarrollado algunos trabajos que han permitido hacer una aproximación a la problemática planteada anteriormente. Para 1995, los estudios de las comunidades microbianas del agua en Colombia eran prácticamente inexistentes y los pocos realizados se enfocaban más hacia el problema de los indicadores de calidad sanitaria a través de los tradi-cionales métodos de cultivo. Por lo tanto, la primera necesidad a resolver era introducir una metodología que permitiera hacer una aproximación más directa de estas comunidades. La técnica de epifluorescencia que permite hacer un recuento directo de los microorganismos presentes en una muestra de agua, utilizando fluorocromos como la naranja de ac-ridina (AO) y el DAPI que se unen específicamente a los ácidos nucleicos de las células, permitieron dar este primer paso (Canosa y Pinilla, 1998).

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Con el uso de esta metodología no solo fue posible corroborar la sub-estimación que los medios de cultivo hacían de la abundancia procariota, sino que además se reafirmó la importancia de estudiar este compo-nente microbiano, como uno de los más abundantes en los ecosistemas acuáticos.

La aplicación de la técnica introducida permitió verificar la escasa vari-ación de los recuentos procariotas y establecer sus rangos de fluctuación en algunos ecosistemas de la región Andina. Sin embargo, ésta estrate-gia no permitió definir con claridad los factores que podían explicar el comportamiento encontrado. Con la evidente necesidad de buscar ex-plicaciones al comportamiento de la abundancia de los procariotas y sus implicaciones en los ecosistemas acuáticos Andinos y con la introducción de fluorocromos más brillantes y estables como el YOPRO-1 y el Sybr Gold se extendió el uso de la microscopía de epifluorescencia al estudio de las abundancias virales, que demostraron la importancia numérica del virioplancton, y del nanoplancton heterótrofo y autótrofo (Canosa, 2002; Canosa et al., 2000). Estos estudios permitieron identificar que los virus son uno a dos órdenes de magnitud mayores en abundancia que las bac-terias y que sufren cambios relacionadas con los periodos hidrológicos, lo que confirmó su posible participación en el comportamiento homeos-tático de las comunidades procariotas del agua. Con la disponibilidad de las técnicas mencionadas y con la implementación del análisis de imágenes para la estimación semiautomática de la biomasa procariota fue posible abordar otra táctica en la evaluación de la importancia de los microorganismos en el agua.

Hasta ese punto, el desconocimiento de las metodologías adecuadas no había permitido llevar a cabo un estudio en el que se integraran los posibles factores que afectan la variación del bacterioplancton en los ecosistemas acuáticos. Teniendo en cuenta que el fitoplancton, los het-erótrofos nanoflagelados, los virus y las variables físicas y químicas del ambiente pueden tener un efecto sobre el bacterioplancton, se planteó la posibilidad de un estudio en un ecosistema modelo: el embalse del Neusa. El estudio de la variación espacial y temporal de las variables que afectan al bacterioplancton permitirá generar un modelo explicativo de las relaciones existentes entre todas las variables y podría ser la base de futuros trabajos que corroboren las observaciones encontradas. Debido a que el efecto de las variables podría no solo verse reflejado en los cam-bios de la abundancia, sino también de la composición de la comunidad

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procariota fue necesaria la introducción de una nueva metodología para el estudio de la estructura de la comunidad bacteriana la hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) (Canosa y Niño, 2003).

Se puede entender la composición o estructura de las comunidades procariotas como la abundancia de los taxa, filotipos o ribotipos que la conforman o simplemente como el número de taxa presentes en una muestra. Para analizar esta estructura, se han utilizado varias aproxima-ciones que incluyen el uso de técnicas moleculares como el análisis de fragmentos de restricción del DNA ribosomal amplificado (ARDRA), la electroforesis en gel de gradiente denaturalizante o térmico (DGGE o TGGE), la construcción de librerías genómicas, el ARISA y las técnicas de hibridación (Giovannoni y Rappé, 2000; Amann et al., 1996). Las limita-ciones de estas técnicas en el estudio de las comunidades procariotas in situ son: 1) requieren una previa extracción y amplificación de los ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), inclu-so para análisis comparativos a nivel de especies es necesaria la secuen-ciación; y 2) no es posible cuantificar con certeza la abundancia relativa de los taxa que componen una comunidad. Por el contrario, FISH, que es una técnica directa de hibridación, permite hacer un análisis detallado de la abundancia de taxa específicos a través del uso de sondas marcadas con blancos específicos en el RNA ribosomal sin ruptura celular (Glock-ner et al., 1999; Amann, 1995). Entre las ventajas de esta metodología se encuentran: 1) su capacidad para resolver la estructura espacial de algunas comunidades microbianas, 2) la posibilidad de hacer un análi-sis de la morfología celular y por tanto del biovolumen y la biomasa de grupos específicos y 3) emplea el principio de epifluorescencia, lo que facilita su aplicación en el Laboratorio. Además, con ciertas modificacio-nes como el uso de la reacción catalizada de reporteros (CARD-FISH) o la combinación con microautorradiografía (Micro-FISH) puede utilizarse en el estudio de la actividad celular específica (Pernthaler y Amann, 2004; Pernthaler et al., 2002; Lee et al., 1999). Adicionalmente con el uso del análisis de imágenes y de la citometría de flujo es posible hacer un aná-lisis automatizado de las muestras lo que permite aumentar la escala de estudio de las comunidades procariotas (Sekar et al., 2004; Pernthaler et. al, 2003).

Con la implementación de FISH para el estudio de los cambios en la estructura de la comunidad procariota fue posible analizar su compor-tamiento junto con el de la abundancia y biomasa del bacterioplancton

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en relación a las otras variables analizadas. El análisis de la información obtenida con esta perspectiva ha mostrado que la variación del bac-terioplancton se relaciona tanto con los cambios en la abundancia de heterótrofos nanoflagelados como de los virus y el fitoplancton. Sin em-bargo, la intensidad de estas relaciones cambia temporalmente y puede depender del ciclo hidrológico y el funcionamiento hidráulico del em-balse. En cuanto a la estructura de la comunidad ha sido posible establ-ecer que esta sufre cambios a lo largo del ciclo anual, sin embargo hasta ahora no se ha podido identificar que factores son los responsables de esta variación en el tiempo.

Este trabajo, que se encuentra aún en proceso, facilitará establecer las relaciones generales entre los factores estudiados. Sin embargo, el desarrollo de experimentos e incubaciones en campo permitirán definir la magnitud de las interacciones. Se espera que la combinación de las dos perspectivas brinde una medida más directa de la importancia de los procesos que llevan a cabo en los ecosistemas acuáticos ya que estas incubaciones hacen posible estimar las tasas de producción así como la eficiencia y las tasas de transferencia de materiales a través de la bio-masa procariota.

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i. Grupos funcionales en manglares

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MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS DE MANGLARES DEL CARIBE

COLOMBIANO: AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y POTENCIALIDADES

PHOSPHATE SOLUBILIZING MICROORGANISMS FROM CARIBBEAN COLOMBIAN MANGROVES: ISOLATION,

EVALUATION AND POTENTIALITIES

TANIA GALINDO1, JIMENA SÁNCHEZ1

1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Los bosques de manglar son ecosistemas costeros que presen-tan características especiales como alta productividad, salini-dad sódica del sustrato, altas temperaturas edáficas y periodos diarios o estacionales de inundación. Allí es posible encontrar microorganismos rizosféricos solubilizadores de fosfatos (MSF) los cuales pueden ser seleccionados para estudiar su potencial biofertilizante, el cual tiene perspectivas en procesos de restau-ración y conservación de manglares. Adicionalmente esta pro-piedad es susceptible de ser aprovechada en cultivos de zonas afectadas por altas salinidades edáficas. Se presentan algunas metodologías de obtención y evaluación de MSF provenientes de manglares colombianos así como su utilidad en conserva-ción y agricultura.

Palabras clave: Fósforo, manglares, biofertilizantes.

ABSTRACT

Mangroves are coast ecosystems with special features like high productivity, salinity, high temperatures and daily or seasonal inundation periods. In mangroves, it is possible to found rizos-pheric phosphate solubilizing microorganisms (MSF) that can be isolated in order to study their biofertilizer potential, which have perspectives in mangroves restoration and conservation

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processes. Additionally, this characteristic can be used to impro-ve cultures of high-salinity affected zones. Some isolation and evaluation methodologies for MSF and their useful in agricultu-re conservation as well are presented.

Keywords: Phosphate, mangroves, biofertilizers.

INTRODUCCIÓN

Una cantidad considerable de especies de microorganismos, especial-mente los que se encuentran asociados a la rizósfera, incluidos hon-gos y bacterias, tienen la capacidad de promover el crecimiento vegetal. Dentro de los mecanismos por lo cuales los microorganismos ejercen dicho efecto benéfico está el aporte de macronutrientes como nitrógeno y fósforo (Rodríguez y Fraga, 1999). De este último se estima que en general, está presente en grandes cantidades en el suelo, sin embargo su disponibilidad en la forma en que puede ser tomado por las células es baja (Rodríguez y Fraga, 1999). Bajo condiciones favorables y con la intervención de microorganismos, las formas insolubles de fósforo pue-den pasar a formas solubles (Alexander 1981; Kucey, 1989; Rodríguez y Fraga 1999). Los microorganismos que producen altas cantidades de ácidos orgánicos y/o que poseen enzimas fosfatasas que intervienen en la solubilización de fosfatos en el medio en donde crecen se denominan solubilizadores de fosfatos (MSF) (Osorio, 2004).

Esta propiedad ha sido aprovechada en la elaboración de inoculan-tes que han demostrado ser efectivos en el aumento de productividad, crecimiento y toma de nutrientes de plantas, especialmente de cultivos comerciales. Como resultado de la búsqueda y mejoramiento de esta capacidad se han desarrollado biofertilizantes y preparados basados en microorganismos benéficos como MSF. Aunque el desarrollo de esta tec-nología a nivel mundial se ha visto estimulada por el sector agropecua-rio principalmente, otra aplicación y fuente de nuevas cepas eficientes es el estudio de estos grupos en ecosistemas naturales (Holguín et al., 2001).

Las técnicas de obtención y caracterización de MSF provenientes de ecosistemas de manglar, así como las perspectivas que se abren gracias al estudio de este grupo de microorganismos, con énfasis en el Caribe colombiano, se discutirán a continuación. Cabe anotar que las técnicas que aquí se presentan han sido adaptadas en gran parte, a partir de las

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aplicadas en agroecosistemas y otros ecosistemas diferentes de mangla-res y que sus mejoras o modificaciones igualmente pueden implemen-tarse en los dos casos.

MANGLARES COLOMBIANOS

Los manglares son ecosistemas de zonas litorales tropicales y subtropi-cales compuestos por varias especies de árboles y arbustos dominantes, cuyas especies más abundantes en Colombia son Rhizophora mangle (mangle rojo) y Avicennia germinans (mangle negro) (Sánchez-Páez et al., 2000). La importancia de estos ecosistemas radica en que albergan gran diversidad de microorganismos e invertebrados en sus sedimentos y son lugar de cría, refugio y zona de alimentación de peces, moluscos, tunicados, poliquetos, algas, crustáceos y aves, principalmente. De estos ecosistemas dependen diferentes especies de peces en su proceso de desarrollo y maduración, así como muchas especies de camarones de importancia comercial que pasan parte de su estado juvenil dentro del manglar. Son sistemas altamente productivos y se considera que expor-tan materia y energía a ecosistemas adyacentes (Holguín et al., 2001; Sánchez-Páez et al., 2000). Los ecosistemas de manglares en Colombia cubren aproximadamente 379.954 ha, de las cuales el Caribe colom-biano tiene 87.230 ha, localizados discontinuamente, destacándose los deltas del Sinú, el Atrato, Magdalena y el canal del Dique (Sanchez- Paez et al., 2000).

Al igual que en el resto del mundo, la situación de estos ecosiste-mas en el Caribe colombiano, es crítica ya que se calcula una superficie aproximada de más de 40.000 ha de manglares entre alteradas y dete-rioradas. La principales causas de dicho estado son actividades humanas tales como alteración de flujos hídricos, turismo, construcciones civiles, contaminación y sobreexplotación (Sánchez-Páez et al., 2000; Alongi, 2002).

FÓSFORO EN EL SUELO Y MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS (MSF)

El fósforo es el segundo nutriente inorgánico requerido tanto por plantas como por microorganismos, su principal función fisiológica está relacionada con la acumulación y liberación de energía durante el metabolismo celular (Alexander, 1981). Actividades específicas de mi-croorganismos como la fijación biológica de nitrógeno, requieren altos

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contenidos de fosfatos debido a los altos requerimientos energéticos (Sylvia et al., 1998). Se estima que está presente en el suelo en concen-traciones entre 4000 y 1200 mg/kg; sin embargo, la célula toma el fós-foro principalmente en forma de HPO4

2- y H2PO4-. Estas formas solubles

del fosfato se encuentran en concentraciones generalmente bajas en el suelo (cercanas a 1 ppm) (Rodríguez y Fraga, 1999).

Por otro lado, el fosfato en su forma soluble puede ser fijado por algu-nos suelos haciéndose no disponible para las plantas. Los mecanismos de inmovilización del fósforo en el suelo involucran: adsorción no espe-cífica, cuando hay atracción electroestática por parte de cargas positivas de la superficie de los minerales y adsorción específica, que consiste en la sustitución de grupos OH- por grupos H2PO4

- en la superficie de los minerales arcillosos. Estos procesos de fijación y precipitación de fósforo dependen en gran medida del pH y del tipo de suelo. En suelos alcali-nos de origen calcáreo como los presentes en algunos manglares del Caribe colombiano, el fósforo se inmoviliza con calcio (Bohn et al., 1993; Koch y Snedaker, 1997). Bajo condiciones favorables y con la interven-ción de microorganismos, las formas insolubles de fósforo pueden pasar a formas solubles, principalmente mediante la producción microbiana de ácidos orgánicos que compiten con el fosfato y forman complejos con los cationes que lo inmovilizan, liberando fosfato a la solución de suelo (Alexander 1981; Kucey, 1989; Rodríguez y Fraga 1999). La pro-ducción de enzimas fosfatasas también es un mecanismo de liberación de fósforo, aunque éstas actúan sobre moléculas de origen orgánico que en últimas llegan a mineralizarse y a constituirse en fósforo inorgánico susceptible de sufrir adsorción y/o precipitación en la solución de suelo. Los microorganismos que producen cantidades considerables de fosfa-tasas también contribuyen a aumentar los niveles de fósforo en el suelo (Rodríguez y Fraga, 1999).

Entre los géneros bacterianos de reconocida capacidad solubilizadora de fosfato ya sea por que produzcan altas cantidades de ácidos orgá-nicos o de fosfatasas ácidas o alcalinas se encuentran Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agro-bacterium, Micrococcus, Aereobacter, Flavobacterium, Erwinia, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, y Serratia (Rodríguez y Fraga ,1999). Entre los gé-neros de hongos que poseen actividad solubilizadora de fosfato se en-cuentran Aspergillus spp, Penicillium spp y algunas levaduras (Whitelaw, 1999; Vázquez et al., 2000; Vassilev et al., 2001).

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Aislamiento de MSF provenientes de manglar

Los MSF rizosféricos se obtienen a partir de muestras de suelo o raí-ces las cuales se someten a incubación en un medio selectivo (Madigan et al., 1999). En teoría, cualquier medio de cultivo que tenga todos los nutrientes y factores de crecimiento microbiano, cuya única fuente de fósforo sea alguna sal insoluble de fosfato (p.e. Ca3(PO4)2, FePO4), o algún mineral que la contenga, es útil en el aislamiento de este tipo de microor-ganismos. La técnica de enriquecimiento resulta útil en la estimulación y aumento de las concentraciones de MSF rizosféricos. Esta técnica consiste en incubar muestras de raicillas jóvenes, en lo posible no lignificadas, libres de sustrato (lavadas previamente con agua de mar esterilizada), en medio selectivo líquido. El periodo y condiciones de incubación pue-den variar de acuerdo al tipo de microorganismos que se deseen aislar. Para bacterias se pueden incubar muestras durante cinco días a 30ºC y 150 rpm agitación constante, mientras que para favorecer crecimiento de hongos puede hacerse a 25ºC sin agitación, por 21 días. Al cabo de estos periodos se toman muestras del medio, el cual debe presentar notable turbidez, y se transfieren a cajas de Petri con el mismo medio sólido (adi-ción de agar al 16%). Entre los dos y diez días se pueden obtener colonias que presentan halos de solubilización a su alrededor, considerando que son MSF. El medio SRS formulado por Sundara-Rao y Sinha (1963) tiene la ventaja de permitir visualizar halos de solubilización y de acidificación ya que contiene un indicador de pH, el púrpura de bromocresol; cuando los MSF crecen se pueden observar halos transparentes de solubilización y amarillos sobre el fondo púrpura lo que indica una acidificación del medio. Adicionalmente a este medio se le debe adicionar NaCl al 2% con el fin de aislar bacterias y hongos halotolerantes y/o halófilos como los presentes en los manglares y ambientes marinos (Vázquez et al., 2000; Galindo-Castañeda et al., 2005 resultados no publicados). La presencia de halos de solubilización en el medio sólido es la primera evaluación cualitativa que se hace de la actividad de MSF. Sin embargo, se ha encon-trado que el diámetro de los halos no siempre se correlaciona con la so-lubilización medida cuantitativamente en medio líquido, por lo que esta técnica sirve preferiblemente para aislar inicialmente MSF mas no para cuantificar su actividad (Rodríguez y Fraga, 1999).

Otras técnicas que pueden ser utilizadas son las diluciones seriadas para cuantificar MSF y microflora total, y siembra de partículas de suelo en medios selectivos sólidos para recuperación de micelio activo (Cepe-da y Gamboa, 2001).

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Medición de la capacidad solubilizadora de fosfatos inorgánicos

La evaluación de la capacidad solubilizadora de fosfatos inorgánicos se hace cuantitativamente utilizando la técnica colorimétrica de detección de fosfatos solubles mediante el método del molibdovanadato, luego de incubación en medio líquido sin fuente de fosfatos solubles ni coloran-tes (Cunningham y Kuiack, 1992; Vassilev et al., 1995). Una alícuota de preinóculo (solución salina que contiene células del microorganismo de interés) ajustado a una concentración celular o conidial conocida, se adi-ciona a tubos o matraces que contienen el medio sobre el cual se realiza la medición. Este generalmente contiene Ca3(PO4)2 o FePO4. La lectura de fosfato soluble en el medio puede hacerse a partir de las 24 h de in-cubación, luego de retirar las células del líquido mediante centrifugación y descarte del pellet (Vázquez et al., 2000).

MSF Y MANGLARES

Los manglares son ricos en materia orgánica. Sin embargo, en térmi-nos generales son deficientes en nutrientes (especialmente en nitrógeno y fósforo); no obstante, a escala global estos ecosistemas están entre los más productivos (Sengupta y Chaudhuri 1991; Holguin et al., 1992; Alon-gi et al., 1993; Vazquez et al., 2000). Esta paradoja puede ser explicada mediante un eficiente reciclaje de materia que mantiene los nutrientes en el sistema, mediante la participación de microorganismos en el fun-cionamiento y transformación de nutrientes a su interior (Holguín et al., 2001; Kathiresan y Bingham, 2001). Nair et al. (1991) y Sengupta y Chau-dhuri (1994) (en Kathiresan y Bingham, 2001) y Vazquez et al, (2000) han encontrado en rizósfera de mangle microorganismos (bacterias y hongos), que probablemente promueven el crecimiento vegetal gracias a que hacen disponible para las plantas el fósforo.

Algunos géneros de bacterias SF encontradas en manglares son Baci-llus, Paenibacillus, Vibrio, Xanthobacter, Enterobacter, Kluyvera, Pseudo-monas, Chryseomonas (Vázquez et al., 2000). Los hongos encontrados en manglares que poseen actividad solubilizadora de fosfato son Asper-gillus niger (Vázquez et al., 2000), Penicillium spp y algunas levaduras entre las que está el género Debaryomyces (Galindo-Castañeda et al., 2005 resultados no publicados), estos tres últimos encontrados en el Ca-ribe colombiano. Se ha documentado también la presencia de micorrizas las cuales posiblemente aumentan la toma de fosfatos solubilizados por los MSF en el ambiente rizosférico de manglares (Sengupta y Chaudhuri,

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2002); sin embargo, éstas no han sido buscadas en manglares colom-bianos.

Los MSF más eficientes en pruebas in vitro de solubilización de fos-fatos han sido Vibrio proteoliticus y Xanthobacter agilis (Vázquez et al., 2000); respecto a los evaluados para manglares colombianos su eficien-cia alcanza niveles de solubilización in vitro suficientes para suplir las necesidades de una plántula terrestre (Holguín et al., 2001), especial-mente los presentados por A. niger y un hongo del género Penicillium (alrededor de 220 mg/L24h) (Galindo-Castañeda et al., 2005 resultados no publicados).

POTENCIALIDADES DE MSF PROVENIENTES DE MANGLARES

Dentro de las estrategias para la restauración de los manglares en Co-lombia se ha encontrado que el mejor método para repoblar zonas de-terioradas es el de transplante de plántulas germinadas y mantenidas por un tiempo (2-4 meses) en vivero, en donde se ha sugerido que las razones principales de la efectividad son la consolidación de un sistema radicular capaz de soportar las condiciones propias de la costa y un me-jor estado fitosanitario en las plantas germinadas en vivero; sin embargo, generalmente, estos procesos son relativamente lentos (Cañón y Rodrí-guez,1994; Chan,1995; Guevara, 1998; Rodríguez, 1998; Sánchez-Páez et al., 2000). Una forma de agilizar dichos procesos de restauración es la aplicación de biofertilizantes preparados a partir de MSF. Dentro de este mismo orden de ideas, la implementación de manglares artificiales podría verse favorecida por la aplicación de biofertilizantes (Holguín et al., 2001).

De otro lado, la coinoculación de MSF y bacterias fijadoras de nitróge-no (BFN) ha mostrado resultados satisfactorios en crecimiento y toma de nutrientes en plántulas de mangle (Holguín et al., 2001); este potencial podría verse aumentado si adicionalmente se comprueba la acción con-junta de MSF y micorrizas, ya que es bien sabido que estos dos grupos hacen un trabajo complementario en la toma y translocación de fosfatos por las plantas (Osorio, 2004).

Los MSF aislados en manglares tienen la especial propiedad de so-portar salinidades cercanas al 2% de NaCl, valores que normalmente no podrían soportar microorganismos aislados de ecosistemas exclusiva-mente terrestres. Esta característica los hace potencialmente útiles en la

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producción de biofertilizantes que pueden ser aplicados en cultivos de productos comerciales que presenten problemas de salinidad. Sin em-bargo, esto debe manejarse siempre dentro del marco de programas que promuevan el uso racional de los recursos costeros. Es de especial interés el caso de San Andrés isla, Colombia; allí la condición de reserva de biosfera no permite la aplicación de fertilizantes químicos en los pe-queños cultivos de sostenimiento ubicados en la zona rural; por lo tanto estos son de baja productividad. Sumado a esto se presentan en la isla problemas de seguridad alimentaria. Bajo estas condiciones tan especia-les, la aplicación de biofertilizantes provenientes de manglar en cultivos comerciales se constituye en solución parcial para las bajas productivida-des de los cultivos costeros insulares.

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MICROBIOLOGIA DEL MANGLAR Y TÉCNICAS MOLECULARES PARA SU ESTUDIO

MICROBIOLOGY OF MANGROVE AND MOLECULAR TECHNIQUES FOR ITS STUDY

GINA HOLGUIN1, ANA FLORES1, ANATOL EBERHARD2, STEPHEN WINANS2, ALFONSO DAVILA-LULE1, CLAUDIA

VILLICAÑA1, NADIA GERALDO1, MACARIO BACILIO1, YOSSEF LÓPEZ DE LOS SANTOS1, MANUEL RUIZ1

1Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR). [email protected]

2Department of Microbiology. Cornell University (CU)

RESUMEN

El manglar es un ecosistema sostenido principalmente por la comunidad bacteriana. Conscientes de esto hemos desarrolla-do un proyecto de investigación enfocado al estudio de la mi-crobiología del manglar, orientando el trabajo a aquellos grupos bacterianos involucrados en el ciclo de N, P y C, en particular a bacterias diazotróficas, desnitrificantes, solubilizadoras de fos-fato y sulfato reductoras. Hemos encontrado que al crecer las cepas en cultivo mixto, las propiedades benéficas de las cepas se magnifican por lo que ahora intentamos descifrar el com-plejo lenguaje químico a través del cual estas bacterias se co-munican y manipular ese conocimiento que generemos para el diseño de mejores inoculantes. Sin embargo, no son las bacte-rias las únicas platicadoras en el manglar. Existen también entre las plantas y las bacterias mecanismos sutiles de comunicación química que las ayudan a coordinarse entre sí y optimizar nu-trientes para beneficio de ambas.

Palabras clave: Manglares, técnicas moleculares.

ABSTRACT

Mangroves are ecosystems mainly sustained by the bacterial community. Conscious of this we have a project to study the microbiology of mangroves, oriented to those microbial groups involved in the N, P, and C cycles, in particular to diazotrophic,

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denitrifying, phosphate solubilizing, and sulphate reducing bac-teria. We have found that when we grow our strains in mixed culture, the beneficial properties of the bacteria magnify as compared to pure cultures. For this reason we are working on deciphering the complex chemical language the bacteria use to communicate and manipulate the information we generate to design better inoculants. However, the bacteria are not the main gossipers in this system. There are, between bacteria and plants, subtle mechanisms of communication that facilitate co-ordination between them to optimize the use of the few avai-lable nutrients.

Keywords: Mangroves, molecular techniques.

INTRODUCCIÓN

Los manglares, a través de la cadena del detritus, sostienen una exten-sa red alimenticia de la cual dependen numerosos organismos, muchos de ellos de importancia económica, llegando a sostener las pesquerías tanto costeras como de profundidad y aún la pesca deportiva. Son ecosis-temas muy productivos que contribuyen con materia orgánica a ecosis-temas adyacentes y mantienen los arrecifes coralinos libres de partículas en suspensión. Además de esto, sirven de refugio, protección, alimen-to y reproducción a aves migratorias y residentes y en algunos casos a mamíferos, siendo corredores ecológicos para sistemas terrestres. Otra contribución de los manglares es protección a las costas de huracanes, inundaciones y tormentas, lo que repercute en ganancias indirectas de millones de dólares para los países que cuentan con la suerte de tener manglares.

En México perdemos manglares a una tasa excesiva, de hasta 6000 hectáreas por año, lo que nos obliga a acelerar los mecanismos lega-les y científicos para lograr su protección y restauración, estableciendo además colaboración con países latinoamericanos como Colombia que enfrentan problemas similares.

Es imposible comprender los mecanismos de desarrollo y sostenimien-to del ecosistema de manglar sin abordar el estudio de su microbiología, sobre todo de las bacterias que lo habitan; su estudio nos ha permitido visualizar al manglar como un ecosistema sostenido principalmente por actividad microbiana.

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En este texto, después de discutir la importancia de las bacterias en ecosistemas de manglar, se abordará el tema de inoculantes bacterianos en mangle, así como las ventajas de utilizar cultivos mixtos sobre el uso de monocultivos. A continuación se discutirá el tema de comunicación celular entre bacterias, luego las interacciones planta-bacteria y se descri-birán técnicas de biología molecular que nos permiten abordar el estudio de la ecología microbiana y sus aplicaciones para el diseño de inoculan-tes para la agricultura y para mangles.

LA COMUNIDAD BACTERIANA EN ECOSISTEMAS DE MANGLAR

Las comunidades bacterianas que habitan el ecosistema de manglar sostienen al manglar a través de tres mecanismos principales: i) la mine-ralización de la materia orgánica bajo condiciones principalmente anae-robias y microaerofílicas, ii) altas tasas de fijación biológica de nitrógeno que llegan a contribuír con un 40-60% de los requerimientos de nitró-geno del ecosistema, y iii) la presencia de bacterias asociadas a raíces que brindan al mangle y a otras plantas halófitas asociadas, nutrientes y sustancias tales como fuentes de nitrógeno, fósforo, hierro y fitohormonas (Holguin et al., 2001).

La fijación de N2 es uno de los procesos bacterianos de mayor impor-tancia en manglares, sobre todo de zonas áridas y semiáridas y se ha encontrado asociada a raíces principales, aéreas, sedimentos, rizosfera, corteza y hojas en proceso de descomposición. Es un proceso exclusiva-mente procariota, estrictamente regulado por la concentración de fuen-tes de nitrógeno y oxígeno en el medio y ampliamente distribuido dentro de las divisiones taxonómicas en bacterias, lo que argumenta a favor de su transferencia lateral (Holguin et al., 2001).

Un análisis de la literatura referente a la concentración de amonio en aguas intersticiales de manglares en diferentes regiones del mundo re-vela que generalmente su concentración es baja, insuficiente para satis-facer las necesidades de N por parte de las plantas. Ahí la importancia de la fijación de N2 para estos ecosistemas. Se ha encontrado que las tasas más altas de fijación de nitrógeno ocurren en raíces vivas (Zuberer y Silver, 1978), probablemente debido a la alta tasa de exudación de las raíces que provee a las bacterias de la rizosfera de fuentes de carbono y energía para realizar este proceso. Un análisis de los exudados radicu-lares del mangle negro revela una gran cantidad de ácidos orgánicos y moléculas señal tales como ácido málico, láctico, succínico, vanilato y siringato, entre otros (Holguin y Bacilio, resultados no publicados).

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Además de la importancia de los exudados radiculares como fuentes de carbono y energía para las bacterias que habitan la rizosfera, se ha en-contrado que en algunas plantas terrestres los exudados pueden activar la expresión de genes bacterianos resultando en beneficios para ambos participantes de la interacción (para una revisión del tema ver Somers et al., 2004).

Otro grupo de bacterias de gran importancia en manglares son las bacterias solubilizadoras de fosfato inorgánico, las cuales a través de la producción de ácidos orgánicos disuelven formas de fosfato que se en-cuentran inmovilizadas por cationes de calcio, aluminio y hierro, libe-rándolas en solución y permitiendo así su asimilación por parte de las plantas. Estudios in vitro sobre la producción de acidos orgánicos por bacterias asociadas a la rizosfera del mangle revelan que por lo general las cepas producen varios tipos de ácidos orgánicos, entre ellos ácido acético, propiónico, isovalérico, isobutírico y valérico. Una de las cepas puede solubilizar hasta 350 mg/L diarios lo que sería suficiente para sa-tisfacer las necesidades de fósforo de un día para una planta pequeña (Vazquez et al., 2000).

Los sedimentos del manglar constituyen un ambiente principalmente anaerobio y microaerofílico, por eso la degradación de la materia or-gánica en sedimentos es llevada a cabo principalmente por bacterias desnitrificantes y sulfato reductoras (Alongi, 1994). Es considerable, en-tonces, la importancia de estos dos grupos bacterianos en el reciclaje de nutrientes dentro del ecosistema. Es interesante notar que a pesar que las bacterias desnitrificantes degradan una gran parte de la materia or-gánica en el manglar utilizando el NO3 como aceptor de electrones, ésto parece no traducirse en una pérdida de N por esta vía ya que los man-gles no presentan una deficiencia de N. Nuestro grupo ha llevado a cabo aislamientos de bacterias desnitrificantes en rizosfera del mangle y fue-ron identificadas por secuenciación del gen 16S ribosomal como: Vibrio sp. 9b, Oceanomomas sp. 5a, Corynebacterium sp. 12a, Arthrobacter sp. 61k, y Pseudomonas stutzeri 63k (Flores-Mireles, 2005) (es importante puntualizar aquí que tanto estas cepas como otras cepas aisladas de raí-ces de mangle con potencial de ser bacterias promotoras del crecimiento vegetal, no han podido ser identificadas a nivel especie, por lo que se tratan de especies nuevas). Al mezclar en cultivo mixto alguna de estas cepas desnitrificantes con fijadoras de N2, Flores-Mireles (2005) encontró que la producción de moléculas señal tipo acilo homoserina lactonas en

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el cultivo se incrementa hasta 5 veces. Estos resultados indican que las bacterias desnitrificantes y fijadoras de N2 interactúan entre sí por medio de la producción de moléculas señal. Se desconoce el significado de estos resultados.

En cuanto a las bacterias sulfato reductoras en manglares, además de contribuir con la degradación de la materia orgánica bajo condiciones anaerobias, muchas de ellas fijan N2 (Zuberer y Silver, 1978). Aislamien-tos preliminares de este grupo de bacterias asociadas a raíces del mangle negro revela que algunas de nuestras cepas fijan N2 mientras que otras producen acilo homoserina lactonas (López-de los Santos, 2005, resulta-dos no publicados).

INOCULANTES BACTERIANOS PARA MANGLES Y HALÓFITAS ASOCIADAS

Estudios de inoculación de plántulas de mangle negro con la cianobac-teria Microcoleus sp. aislada de raíces aéreas del mangle revelaron que la fijación de N2 es mayor cuando la bacteria está asociada a la planta que cuando se encuentra sola. Enriquecimiento con 15N2 de viales con-teniendo plántulas de mangle negro y análisis por espectrometría de ma-sas de los tejidos vegetales, revelaron que las plántulas asimilaron dentro de sus tejidos el N2 fijado por la cianobacteria (Bashan et al., 2001).

Numerosos estudios realizados por nuestro grupo de investigación han revelado que al crecer las bacterias en cultivos mixtos, la fijación de N2, la solubilización de fosfato y otros procesos se magnifican, al comparar con resultados obtenidos usando cultivos puros (Holguin et al., 2001). Esto parece indicar que las condiciones creadas al crecer las bacterias en cultivos mixtos i) induce el intercambio de sustancias nutritivas, ii) induce la producción de moléculas señal que intensifican esos procesos metabólicos, o iii) modifica las propiedades del cultivo de manera que se promueven tales procesos. Cualesquiera que sea la explicación a tal fenómeno, sugiere el uso de inoculantes mixtos en lugar de inoculantes compuestos por una sola cepa. Esta hipótesis fue confirmada al inocular plántulas de Salicornia bigelovii con cultivos puros y mixtos de bacterias aisladas de raíces del mangle (Bashan et al., 2000).

REFORESTACIÓN DE MANGLARES

Un análisis del éxito de reforestación artificial a pequeña escala de una zona del manglar de Balandra, BCS, México, con plántulas y semillas

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de mangle negro, realizado en 1994, reveló que después de 10 años no existen diferencias en la estructura del bosque de manglar entre la zona reforestada y áreas naturales adyacentes. Tampoco se observó diferencia en las especies y número poblacional de cangrejos encontrados entre las zonas, ni en las características del sedimento (MacNair et al., resultados no publicados).

CARACTERIZACIÓN DE COMUNIDADES BACTERIANAS POR MÉTODOS MOLECULARES

Se cree que solamente del 1-2% de las bacterias presentes en el am-biente son cultivables; consecuentemente, para conocer la composición de comunidades microbianas en determinados ambientes se requiere de técnicas moleculares basadas en amplificación de ADN por la técnica de PCR. Una de éstas técnicas llamada T-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo terminal en la longitud de fragmentos de restricción) fue utilizada para conocer la diversidad y composición de bacterias desnitrificantes y fijadoras de N2 asociadas a raíces del mangle negro (Flores- Mireles, 2005). Considerando que los genes que codifi-can para ambos procesos metabólicos están sujetos a transferencia la-teral, se decidió no trabajar con genes 16S ribosomal sino con los genes responsables de estos procesos metabólicos (nirS y nirK para bacterias desnitrificantes, y nifH para bacterias diazotróficas). Los resultados re-velaron que la diversidad de bacterias diazotróficas es mayor que la de desnitrificantes.

COMUNICACIÓN CELULAR

El uso de técnicas de biología molecular en estudios de ecología mi-crobiana empieza a revelar la complejidad y sofistificación de los me-canismos utilizados por las bacterias para responder a cambios en el ambiente que las rodea. Esta sorprendente capacidad de respuesta, in-cluye la habilidad de las bacterias para comunicarse entre sí a traves de un lenguaje químico, y así coordinar las actividades de cada componente de la población (Dunny y Winans, 1999).

Estudios de la última década revelan que las bacterias se comunican entre sí utilizando moléculas “señal” extracelulares producidas por ellas mismas. Estas moléculas señal, “acilo homoserina lactonas” o AHLs en bacterias gram negativas, y péptidos en bacterias Gram positivas, son permeables a la membrana celular y una vez que alcanzan cierta con-

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centración, activan la expresión de diferentes genes involucrados en im-portantes procesos celulares. Algunos ejemplos de procesos celulares activados por las moléculas señal son síntesis de antibióticos, esporula-ción, asimilación de nitrógeno, conjugación, expresión de genes relacio-nados con virulencia, síntesis de enzimas degradadoras de pared celular, respuesta a inanición, transición a fase estacionaria, producción de me-tabolitos secundarios, entre otros (Dunny y Winans, 1999).

Se ha encontrado que en bacterias asociadas a plantas la producción de AHLs es común (Cha et al., 1998). Sin embargo, la mayor parte de los estudios se han enfocado a estudiar el papel de estas moléculas en bac-terias patógenas. En el caso de bacterias asociadas a plantas utilizadas como control biológico, también hay amplia información en la literatu-ra. Por ejemplo, en Pseudomonas aureofaciens (bacteria del suelo que inhibe el crecimiento del hongo Gaeumannomyces graminis) la expre-sión genética del antibiótico fenazina esta controlada por una N-acilo homoserina lactona (Pierson et al., 1998). Sin embargo, en cuanto a la participación de las AHLs en mecanismos bacterianos de promoción del crecimiento vegetal tales como fijación de N2, solubilización de fosfato, síntesis de fitohormonas, etc., no hay información.

Esta falta de información nos llevó a plantearnos la pregunta ¿Las bac-terias que se asocian a raíces de mangle producen AHLs? Y si lo hacen, ¿con qué objeto? Resultados preliminares demostraron que de 20 cepas de bacterias promotoras del crecimiento vegetal aisladas de raíces de mangle, aproximadamente un 50% produjeron AHLs. La mayoría de las cepas produjeron varios tipos de estas moléculas a la vez, predominan-do la producción de AHLs de cadena corta tales como C4-HL y C6-HL (Holguin et al. resultados no publicados). Intereresantemente, la síntesis de éstas moléculas estuvo determinada por la composición del medio de cultivo: el extracto de levadura y la glucosa, inhibieron la síntesis de AHLs en la mayoría de las cepas (Flores-Mireles, 2005). Al llevar a cabo extracción de AHLs de suelo de rizosfera de mangle, se lograron detectar AHLs demostrándose así que las condiciones in situ son apropiadas para la síntesis de AHLs por parte de las bacterias que habitan este ambiente (Holguin et al. resultados no publicados). Para detectar la producción de AHLs en cepas silvestres se utilizó la cepa sensora A. tumefaciens KYC55 (pJZ372) (pJZ384) (pJZ410), la cual presenta la más alta sensi-bilidad y espectro de detección de AHLs reportada hasta ahora (Zhu et al., 2003).

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INTERACCIONES MOLECULARES PLANTA-MICROORGANISMO

Existen en la literatura estudios que demuestran que puede existir en-tre la planta y la bacteria una comunicación basada en señalización quí-mica. En Rhizobium sp., flavonoides específicos producidos por la planta inducen la formación de nódulos por parte de la bacteria, la cual se al-berga ahí y lleva a cabo la fijación biológica de N2. En Agrobacterium tumefaciens, bacteria patógena que induce tumoración en plantas dico-tiledóneas, la acetosiringona exudada por la planta actúa como molécula señal induciendo la expresión de los genes de virulencia de la bacteria. Por otro lado, se ha encontrado que la producción de antibióticos por parte del agente de control biológico Bacillus cereus, está controlada por los exudados radiculares de la planta (Somers y Vanderleyden, 2004).

Existen técnicas de biología molecular que nos permiten abordar este interesantísimo tema de investigación. Para ello se utilizan genes repor-teros como el gfp (proteína verde fluorescente), lacZ (β-galactosidasa), gusA (β-galactosidasa), y luxCDABE (luminiscencia). Por ejemplo, si que-remos estudiar si los exudados radiculares del mangle activan la expre-sión del gen nifH (codifica para la dinitrogenasa) en la cepa diazotrófica Pseudomonas sp. LR6A, se reemplaza la región promotora nativa del gen gfp por la región promotora de nifH. Después de clonar el constructo en un plásmido, se transfiere éste a la cepa. Si la cepa emite fluorescencia al exponer el cultivo a una solución que contenga los exudados radicula-res, significa entonces que los exudados pueden activar la expresión del gen nifH. La fluorescencia emitida estará en función de la concentración de la proteína GFP producida por la cepa, por lo que la intensidad de la fluorescencia será indicativa del grado de inducción por parte de los exudados. El constructo servirá también para medir el efecto de condicio-nes ambientales sobre la expresión de nifH, tales como temperatura, pH, concentración de oxígeno, etc. En lugar del gen gfp como reportero se puede usar el gen lacZ. La producción de β-galactosidasa es cuantificable ya sea utilizando como sustrato el x-gal, o el MUG (4-methylumbelliferyl β-D-galactoside). Si se utiliza este último la actividad de la enzima se mide por fluorometría.

Las cepas que contienen estos constructos pueden inocularse en plan-tas crecidas en macetas con suelo estéril o no estéril y determinar si bajo condiciones cercanas a las naturales se observa el mismo fenómeno, i.e., se activa la expresión del gen gfp. Antes de utilizar estas cepas que contienen genes introducidos artificialmente es importante evaluar si la

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expresión del gen extraño impone en la cepa una carga metabólica ex-cesiva alterando algún proceso metabólico esencial tal como movilidad, quimiotaxis, tasa de crecimiento, etc.

Otra aplicación de los genes reporteros es el marcaje de bacterias con el fin de detectarlas en suelo, en raíces, o en otro órgano vegetal, o con el fin de realizar estudios de su permanencia en el tiempo.

Con el fin de detectar las regiones promotoras de todo el genoma de Pseudomonas sp. LR6A que son activadas por exudados radiculares, se genera una biblioteca de regiones promotoras utilizando plásmidos lla-mados “promoter trap vectors” o vectores para atrapar regiones promo-toras. La técnica consiste en digerir el genoma bacteriano con enzimas de restricción y clonar los fragmentos en un vector de éste tipo, el cual con-tiene el gen gfp al que le ha sido cortada la región promotora y además contiene uno o varios genes de resistencia a antibióticos que facilitan el proceso de selección. Los plásmidos generados son transferidos a E. coli y aquellos clones que resistan los antibióticos serán los que conten-gan fragmentos del genoma de nuestra cepa. Para determinar cuáles de nuestros clones contienen regiones promotoras inducibles por exudados radiculares, se crecen los clones en medio nutritivo, se les agrega el exu-dado y aquellos clones que emitan fluorescencia contendrán las regiones promotoras que buscamos. Una vez seleccionados los clones, se mandan secuenciar y se analiza la secuencia con el fin de determinar la homolo-gía de la secuencia con genes conocidos y almacenados en el banco de datos o en el Genbank.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto apoyado por CONACYT No. 41367 - Z y al proyecto financiado por CONACYT – COLCIENCIAS (en el programa de colaboración México – Colombia).

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BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL, UNA ESTRATEGIA PARA FACILITAR EL CRECIMIENTO VEGETAL EN SUELOS SALINOS

PLANT GROWTH-PROMOTING BACTERIA OF MANGROVE, A STRATEGY TO FACILITATE PLANT GROWTH IN SALINE SOILS

JAVIER VANEGAS1

1Facultad de Ciencias. Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia

[email protected]

RESUMEN

Los suelos salinos son un enorme problema para la agricultura de irrigación. Los procesos de suelos naturales en regiones cá-lidas y áridas frecuentemente producen suelos salinos de baja potencialidad agrícola. En aquellas áreas la mayoría de cultivos crecen bajo un inadecuado manejo de irrigación conduciendo a salinización secundaria que afecta al 20% de la tierra irrigada del mundo. Adicionalmente, el agua salina es considerada una fuente alternativa de irrigación para la agricultura en países que sufren de carencia de agua dulce. Un problema de salinidad existe cuando se acumula en la zona de la raíz una concentra-ción que cause daño al cultivo y reduzca la producción debido al desbalance osmótico suelo/planta. El uso de bacterias pro-motoras de crecimiento vegetal aisladas de la rizósfera de raí-ces de manglar, puede proveer una útil estrategia de desarrollo para facilitar el crecimiento vegetal en suelos salinos y pueden ser usadas para la promoción de crecimiento en plántulas de manglar en programas de restauración o aún para crear man-glares en pantanos costeros.

Palabras clave: Bacterias promotoras de crecimiento vegetal, estrés sa-lino, manglares.

ABSTRACT

Soil salinity is an enormous problem for agriculture under irri-gation. Natural soil forming processes in warm and dry regions frequently produce saline soils with low agricultural potential. In

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these areas most crops are grown under inadequate irrigation management leads to secondary salinization that affects 20% of irrigated land worldwide. Additionaly, saline water is considered to be an alternative source of irrigation for agriculture in coun-tries suffering from a shortage of fresh water. A salinity problem exists when salt accumulates in the root zone to a concentra-tion that causes crop damage and reduces the yield due to soil/plant osmotic imbalances. The use of plant growth-promoting bacteria isolated from the rhizosphere of mangrove roots may prove useful in developing strategies to facilitate plant growth in saline soils and can be use to promote the growth of mangrove plantlets in reforestation programs or even to create mangrove in coastal wetlands.

Keywords: Plant growth-promoting bacteria; salt stress, mangrove.

INTRODUCCIÓN

Procesos de formación natural de suelos en regiones áridas y secas frecuentemente conducen a suelos salinos con bajo potencial agrícola. En aquellas áreas la mayoría de cultivos crecen bajo inadecuados siste-mas de irrigación que conducen a salinización secundaria, afectando al 20% de las tierras irrigadas de todo el mundo. Los suelos salinos son un enorme problema para la agricultura irrigada donde el uso de bac-terias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) pueden ser útiles para el desarrollo de estrategias que faciliten el crecimiento vegetal en suelos salinos (Mayak et al., 2004). Las estrategias para la disminución de la ten-sión salina involucran el desarrollo de variedades vegetales resistentes a la salinidad, lixiviación del exceso de sales solubles de la parte superior del suelo al fondo de esté, vaciando tierras a la superficie de los suelos salinos, reduciendo la sal cosechando las partes aéreas de plantas acu-muladoras de sal y mejora de tierras salinas cultivando y lixiviando. Una alternativa experimental es aliviar la tensión de sal por inoculación de semillas y plántulas con varios microorganismos tales como Rhizobium sp., Azospirillum spp. y micorrizas (Mayak et al., 2004).

El exceso de sales en 300 mil hectáreas de suelos colombianos, es la causa de la disminución de la productividad de los cultivos sembrados allí. Desde el sur de la Guajira hasta las vertientes de los Montes de María, en el valle del río Cesar, con una extensión aproximada a 2 millones 500 mil hectáreas, hacen de la Costa Atlántica la región colombiana con

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mayor salinidad en sus suelos. El problema también se presenta en 120 mil hectáreas de tierra en el Valle del Cauca y en menor proporción en el Valle del Magdalena (distritos de riego totalmente salinizados en Saldaña y Coello), en Cundinamarca, especialmente en Fusa, Mosquera, Facata-tiva y últimamente en los Llanos Orientales por la explotación petrolera que sube los límites de aguas salinas.

La aplicación de BPCV que soporten altas concentraciones salinas y aumenten la disponibilidad de nutrientes, se convierte en una estrategia para minimizar gastos, reducir problemas ambientales asociados a la fer-tilización y fomentar un desarrollo sostenible. Por ejemplo, la fertilización nitrogenada representa la mayor inversión en cultivos comerciales, sin embargo su eficiencia es muy baja al presentar pérdidas de hasta el 50% por volatilización del amonio en cultivos como el arroz (Vlek y Craswell, 1979). El desprendimiento de NH3 genera problemas fitotóxicos, afectan-do severamente la germinación o emergencia de las plántulas. Por otra parte, la solubilidad de estos fertilizantes genera pérdidas por lixiviación que van a representar contaminación de acuíferos y cuerpos de agua generando importantes problemas por eutrofización. Adicionalmente, la fertilización nitrogenada contribuye al aumento de gases de invernadero por la emisión de N2O.

REFORESTACIÓN DE MANGLARES

La cobertura de los ecosistemas de manglar se reduce en muchas partes del mundo como resultado de proyectos de acuicultura, tala de árboles para obtención de leña y taninos, cultivo de tierras, construccio-nes costeras y contaminación, entre otras (Lacerda et al., 2001). Estos disturbios afectan adversamente tanto a los microorganismos como a la macrofauna del manglar y dificultan su funcionamiento, reforestación y rehabilitación (Holguín., 2001). Los anteriores factores hacen de los manglares ecosistemas frágiles y susceptibles de beneficio mediante el empleo de técnicas de restauración.

En Colombia, una de las estrategias que se han estudiado para la refo-restación de manglares ha sido la aplicación exógena de poliaminas, es-timulando el crecimiento vegetal y disminuyendo la fase de crecimiento lento en plántulas de Rhizophora mangle (Mendoza, 2000). La aplicación de putrescina y espermina activó el crecimiento de las plántulas e indujo cambios favorables en diferentes parámetros de desarrollo; no obstante, los resultados no son contundentes y esta estrategia resulta costosa.

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González et al. (1995) utilizaron el acodo aéreo como técnica para repoblar con mangle rojo, logrando supervivencias del 64,4% y enraiza-miento en el 80,2% de los casos, pero la supervivencia de las plántulas fue nula al cabo de 40 días de efectuado el transplante.

El proyecto manglares del Ministerio del Medio Ambiente de Colombia obtuvo resultados satisfactorios con plántulas en vivero, con tasas de su-pervivencia mayores al 70% luego de cuatro meses del transplante a zo-nas deterioradas, pero con un crecimiento lento (Ulloa et al., 1998) que en condiciones poco favorables (sedimentos inestables, la salinidad y las corrientes marinas), pueden presentar una baja tasa de supervivencia y recuperación de manglares (McKee, 1993).

INOCULANTES BACTERIANOS EN MANGLARES

Algunas de las cepas más importantes de diazótrofos identificadas has-ta el momento en ecosistemas terrestres pertenecen a especies de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Rhizobium, Clostridium y Klebsiella, las cuales han sido aisladas de sedimentos, rizósfera y de la superficie de las raíces de varias especies de manglar (Sengupta y Chaudhuri, 1991). De sedimentos y rizósfera de R. mangle, Avicennia germinans y Lagun-cularia racemosa se han aislado varias cepas de diazótrofos como Vibrio campbelli, V. aestuarianus, Listonella anguillarum y Phyllobacterium sp. (Holguín et al., 1992).

Las BPCV específicas para el ecosistema de manglar son desconocidas, sin embargo, se han realizado inóculos con cianobacterias diazotróficas de manglar como M. chthonoplastes y BPCV como Azospirillum sp. (Bas-han y Holguín, 2002). Adicionalmente, estudios de microscopía electró-nica revelan una densa población de A. brasilense y A. halopraeferans colonizando las raíces de A. germinans al cabo de cuatro días de la ino-culación (Puente et al., 1999). Así mismo, la inoculación de A. germinans con la cianobacteria diazótrofa Microcoleus chthonoplaste incrementó la actividad de fijación de N y la concentración total de nitrógeno en plántulas inoculadas, siendo significativamente mayor que las plántulas no inoculadas. Esta asociación soporta el uso de M. chthonoplaste como inoculante para la reforestación y rehabilitación de manglares parcial o totalmente destruidos (Holguín, 2001).

El inóculo con la mezcla de Phyllobacterium sp. (diazótrofo) y Bacillus licheniformis (solubilizador de fosfato) aislados de la rizósfera de mangle,

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aumentó la fijación de N por parte de Phyllobacterium sp. de 160 nmoles etileno/cultivo/hora a 470. La inoculación simultánea de plántulas de mangle con estas dos bacterias incrementó la incorporación de N en las hojas a casi al doble del incorporado individualmente por el diazótrofo (Holguín, 2001).

La inoculación con varias bacterias obtenidas de la rizósfera de man-glar en semillas de Salicornia bigelovii (planta halófita de pantanos sala-dos del norte de América) aumentó su crecimiento de un 44% a 102% en peso seco, en un 500% el contenido de N y proteínas y en un 94% el de ácidos grasos. Estas bacterias incluyen a Vibrio aestuarianus (dia-zótrofo) con la bacteria solubilizadora de fosfato (BSF) V. proteolycus y a Phylobacterium myrsinacearum (diazótrofo) con BSF B. lichenifor-mis. Este estudio demostró la viabilidad de usar inoculantes bacterianos para promover el crecimiento de cultivos halotolerantes con agua de mar (Bashan et al., 2000).

Ravikumar et al. (2004) aislaron de manglares tres especies de Azo-tobacter: A. chroococcum, A. vinelandii y A. beijerinckii encontrando alto crecimiento, fijación de nitrógeno y producción de auxinas bajo condi-ciones salinas de 30 g/L. Las cepas de Azotobacter fueron inoculados en plántulas de Rhizophora mangle obteniendo incrementos promedios sig-nificativos en biomasa de raíces (98.2%), biomasa de vástago (29.49%), longitud de raíz (48.45%), área foliar (277.86%) comparada con los con-troles. Igualmente encontraron aumentos significativos en los niveles de clorofila (151%) y carotenoides (158%). Así, el uso de Azotobacter sp. es benéfico para el aumento del vigor de plántulas de manglar.

INOCULACIÓN DE BACTERIAS DE MANGLAR EN PLANTAS COMERCIALES

La búsqueda de microorganismos promotores de crecimiento vegetal en las plántulas de manglar presenta tres importantes fases. 1. Ecología microbiana. 2. Búsqueda de cepas que permitan aumentar el desarrollo de plántulas de manglar (reforestación de ecosistemas deteriorados) 3. Evaluación de cepas promotoras en cultivos comerciales bajo condicio-nes de baja disponibilidad de nutrientes y estrés salino.

Los suelos salinos se presentan como los lugares más inhóspitos para las plantas, especialmente cuando la humedad es baja. Vanegas (2004) encontró aumentos significativos en los parámetros de crecimiento vege-

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tal en plántulas de tomate (Lycopersicon esculentum) sometidas a estrés salino al ser inoculada con el diazótrofo Azotobacter sp. cepa G10 aislado desde plántulas de manglar (Figura 1) Similares resultados se encontra-ron al inocular dicha cepa en plántulas de R. mangle, A. germinans y semillas de Cucumis melo, patilla.

Figura 1. Efecto del inóculo bacteriano sobre la biomasa seca de las plántulas de tomate variedad Río Grande sometidos a 4 tratamientos. Salinidad (Alta: 4.8 dS/m y Baja: 2.2 dS/m), Nitratos (Bajos 46 % y Altos 72%) frente a sus respectivos controles (I. Inoculados y N. No inoculados). Las barras grises representan el efecto total, las barras negras el efecto sobre raíces y las barras con franjas horizontales el efecto sobre vástago. Las barras representan la desviación estándar y letras distintas, diferencias P<0.05.

Los experimentos realizados permitieron concluir que el diazótrofo G10 promueve el crecimiento vegetal de plántulas de tomate de la va-riedad Río Grande bajo condiciones salinas (CE de 2,2 dS/m), logrando mayores resultados en concentraciones de nitratos de 16 meq/L (72%). Bajo condiciones de salinidad de 4.8 dS/m, las plántulas de tomate de esta variedad presentan una fuerte limitante en su crecimiento con di-ferencias no significativas en la promoción del crecimiento al ser inocu-ladas con la cepa G10. Sin embargo, todas las plántulas inoculadas sin importar el grado de salinidad presentaron una diferencia significativa en la longitud de las raíces con respecto a aquellas no inoculadas.

En dicho estudio, el diazótrofo G10 se postula como un importante candidato en la agricultura de agua de mar, definida como aquellos cul-tivos de crecimiento tolerante a la salinidad usando tierras irrigadas con agua de origen marino. A pesar que una porción sustancial de suelo en el

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mundo es susceptible de ser irrigada con agua de mar (por ejemplo, de-siertos costeros, el interior de desiertos salinos, alrededores de lagunas salinas y algunas zonas áridas), el desarrollo de la agricultura de agua de mar no ha tenido mayores progresos (Glenn et al., 1998).

Bacilio et al. (2004) encontraron que el diazótrofo Azospirillum lipo-ferum JA4::ngfp al ser inoculado en plántulas de trigo sometidas a estrés salino, reducía los efectos perjudiciales del NaCl incrementando signifi-cativamente la altura, peso seco de las raíces y vástago con relación a las plantas no inoculadas. La reducción del estrés salino al inocular el trigo con el diazótrofo fue atribuido a un mejoramiento en la toma de agua de las plantas al ser inoculadas.

Mayak et al. (2004) demostraron que bacterias provenientes de am-bientes salinos promotoras de crecimiento vegetal con actividad deami-nasa, incrementaron los parámetros de crecimiento vegetal en plántulas de tomate sometidas a condiciones salinas (172mM de NaCl). Bajo es-trés salino, las bacterias con actividad deaminasa pueden restringir la producción de etileno mitigando el efecto salino sobre la planta.

Mergulhão et al. (2001) investigaron el efecto de diferentes niveles de salinidad sobre B. humidicola, encontrando que ésta tolera la salinidad cuando es sujeta a un suelo con C.E de 8 dS/m al ser inoculada con la micorriza Glomus etunicatum.

Boddey y Victoria (1986) demostraron que Brachiaria decumbens y B. humidicola pueden beneficiarse de la asociación de bacterias fijadoras de nitrógeno, sugiriendo un ingreso de 30-40 kg N/ha por año.

La inoculación de plántulas de tomate con micorrizas (Glomus mosseae) ha demostrado un aumento en los parámetros de crecimiento vegetal, al someterse a estrés salino por una incremento en la capacidad de toma de nutrientes y agua por parte de las plantas micorrizadas (Al-Karaki, 2000; Al-Karaki et al., 2001).

La búsqueda de microorganismos promotores de crecimiento vege-tal en plántulas de manglar, se perfila como una alternativa para la res-tauración de ecosistemas deteriorados y para el desarrollo de cultivos comerciales en suelos improductivos por alta salinidad y bajos niveles nutricionales. El desarrollo de biofertilizantes de manglar involucra el em-pleo de microorganismos que pueden adaptarse a condiciones tropicales y de salinidad, dando respuesta a un grave problema de seguridad ali-

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mentaría que afronta el Caribe colombiano, garantizando así el uso de una tecnología limpia, sostenible y económica.

El potencial de nuestros ecosistemas y su biodiversidad es descono-cido y puede llegar a subsanar los graves problemas de seguridad ali-mentaria, contaminación agrícola, baja productividad y rentabilidad del sector agrícola. El gobierno ha iniciado un importante avance al desarro-llar sus políticas de bioprospección, la cual tiene como objeto evaluar el potencial de nuestra diversidad (especies vegetales, animales y micro-organismos) para el mejoramiento y desarrollo de los diversos sectores comerciales del país.

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ii. Otros ecosistemas

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MICROORGANISMOS PRESENTES EN HUMEDALES: UNA ALTERNATIVA EN PROCESOS DE

BIORREMEDIACIÓN

MICROORGANISMS IN WETLANDS: AN ALTERNATIVE IN BIORREMEDIATION PROCESS

MARÍA M. MARTÍNEZ1

1Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias.

Pontificia Universidad [email protected]

RESUMEN

Los humedales son considerados ecosistemas naturales con alta capacidad de depuración de contaminantes por lo que se hacen interesantes como fuente de organismos, incluyendo mi-croorganismos con alta capacidad para degradar o transformar compuestos provenientes de fuentes industriales o domésticas. Entre los principales contaminantes se encuentran los metales pesados, cuya dinámica en el ecosistema es el resultado de procesos biológicos y microbiológicos como bioacumulación, reducción y metilación entre otros.

Palabras clave: Humedales, metales pesados, biotransformación, micro-organismos.

ABSTRACT

Wetlands are natural ecosystems wich can reduce the environ-mental impact causes by different pollutant substances from industrial and domestic sources. This effect is a result of organis-ms, including microorganisms with high transformation capacity, specially respect to heavy metals, by means of bioaccumulation, ox-reduction process and metilation.

Keywords: Wetlands, heavy metals, biotransformation, microorgan-isms.

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BIOTECNOLOGÍA Y AMBIENTE

La palabra Biotecnología esta formada por dos vocablos: “Bio que viene del griego bios que significa vida y technologia que significa el estudio de las herramientas, máquinas y materiales.”(Collectif et al., 1975) Históri-camente aparecen varias generaciones de esta bioindustria. La primera, que se limita a productos de fermentaciones tradicionales (cervezas, vi-nos sidras, productos lácteos), que representan cifras importantes en las inversiones industriales de muchos países como Francia, desde los años 40´s.

Posteriormente, se distinguen las bioindustrias de la segunda gene-ración, en las que se destaca la producción de antibióticos y medi-camentos refiriéndose a la salud (vitaminas, hormonas), junto con aminoácidos, enzimas, derivados del maíz, proteínas unicelulares, biopesticidas, etanol, butanol, acetona y semillas. A partir de ellas se deriva toda la industria de la ingeniería genética, para descubrir en los 80´s que los desarrollos en este campo serán susceptibles de ser apli-cados a las biotecnologías incluyendo las de la primera generación, sin límite posible de trazar.

En referencia exclusivamente con microbiología ambiental, es impor-tante remontarse a los hallazgos de Pasteur (1859) en donde se pone en evidencia la existencia de microorganismos en la atmósfera, o los de Koch (1877) quien menciona algunas formas bacterianas con inclusiones termoresistentes. Así mismo, se podría mencionar a Winogradsky (1880) quién realizó el descubrimiento de la naturaleza biológica de la nitrifi-cación (amoníaco a nitrito y después a nitrato, por bacterias nitrificantes). Quince años después se dan a conocer las bacterias fijadoras libres de ni-trógeno como Azotobacter sp., Azospirillum sp. y Beijerinkia sp., descrita esta última por Beijerinki en 1888 (Bashan Y. 1998, Scriban R. 1985) Estos microorganismos fueron aislados de diferentes ecosistemas, pero el agua y el suelo se convirtieron entonces en el principal proveedor ha-ciendo que los humedales se perfilen como ecosistemas potencialmente útiles en diferentes procesos ecológicos.

HUMEDALES Y SU POTENCIAL EN BIORREMEDIACIÓN

Los humedales incluyen diversos hábitats interiores, costeros y ma-rinos que comparten ciertas características. De hecho, existen más de cincuenta definiciones diferentes en relación con los humedales en este

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momento. La más amplia de ellas es la que utiliza la Convención de Ra-msar, que define los humedales como “extensiones de marismas, pan-tanos, tuberas o aguas de régimen natural o artificial, permanentes o temporales, estancadas o corrientes, dulces, salobres o saladas, incluyen-do las extensiones de agua marina cuya profundidad en marea baja no exceda de seis metros”.Son en general áreas semilacustres con carácter pantanoso y características físicas y biológicas que los hacen sistemas ecológicamente muy ricos pero a la vez muy frágiles. Se conocen siete unidades paisajísticas que corresponden a humedales o de las que los humedales son componente importante y que por lo tanto definen el marco de planificación para la conservación de humedales. Estas unida-des son: costas abiertas, llanuras de inundación, pantanos de agua dulce, lagos, turberas y bosques de inundación.

Su importancia se relaciona con ser ecosistemas donde los peces lle-van a cabo alguna etapa de su ciclo de vida, en tanto que millones de cabezas de ganado y de herbívoros silvestres se alimentan del pasto que crece en llanuras de inundación. Además, los humedales tienen una gran variedad de funciones, como el control de inundaciones, la purificación del agua, la estabilización de la línea costera, recarga y descarga de acuí-feros, control de la erosión, cortina rompevientos, retención detoxifica-ción y eliminación de materia orgánica y sustancias tóxicas, retención de nutrientes, exportación de biomasa, estabilización de microclimas, trans-porte por agua, recreación y turismo.

En Colombia, los pantanos y lagunas de la Sabana de Bogotá y del altiplano Cundiboyacence en general incluyendo el Lago de Tota, cons-tituyen el sistema de humedales más importante de los Andes desde el norte de Perú hasta Venezuela. Estos son uno de los tres principales centros de origen de aves acuáticas y uno de los patrimonios natura-les únicos de nuestro país. Lamentablemente estos humedales han sido profundamente modificados por la acción antropogénica, en donde por ejemplo, los bosques de alisos que rodeaban fueron talados, extensas zonas de pantanos fueron desecados para convertirlas en tierras de la-bor, las aguas de las lagunas se tornaron turbias como consecuencia los efectos de la erosión y la introducción de peces exóticos y los pantanos asociados al Río Bogotá se encuentran severamente contaminados.

Desde los años cincuenta se inició el proceso de crecimiento acelerado de la población urbana en Santafé de Bogotá, el cual ha estado acompa-ñado de una fuerte presión sobre las tierras de bajo costo para ofrecer a

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la población inmigrante. Los suelos pantanosos eran en ese contexto una excelente oportunidad de incorporar nuevas áreas, por lo cual se rellena-ron miles de hectáreas de pantanos para satisfacer las crecientes necesi-dades de vivienda (Ortiz, 1991). A finales del siglo pasado y principios de la legislación colombiana consideraba como obras de beneficio público la desecación de los pantanos (Amaya y Jaramillo 1937). Actualmente los cuerpos de agua se encuentran legalmente protegidos y son conside-rados propiedad de la nación, situación que poco ha servido ya que los rellenos continúan haciéndose ilegalmente en los pozos y pantanos que aún subsisten además de la disminución del nivel friático en la sabana, con consecuencias negativas sobre la actividad agropecuaria.

Como resultado de lo anterior, los humedales del Distrito Capital han sido declarados como reservas naturales ambientales y se han definido sus zonas de manejo y preservación ambiental. Este estudio representa un esfuerzo adicional de la comunidad y las entidades responsables ha-cia la recuperación y preservación ambiental de los humedales. Entre los principales contaminantes que han sido detectados en humedales se en-cuentran los metales pesados cuya dinámica en el ecosistema hace parte de los ciclos biogeoquímicos y cuyos efectos en la flora y fauna presentes en los sistemas incluyen biacumulación, biomagnificación y metilación, entre otros (Sulfita, 1993).

El Humedal La Conejera, ubicado en el noroccidente de Bogotá, reci-be vertimientos industriales, domiciliarios y hospitalarios, pero gracias a su gran potencial de autodepuración soportado en macrófitas, algas y microorganismos, es capaz de reducir de forma importante la DBO del efluente. Desde 1998 la Pontificia Universidad Javeriana ha venido desarrollando una serie de investigaciones relacionados justamente con este potencial biorremediador. Aldana et al., (1998), Calderón et al., (1999), González et al., (2000), y Hernandez et al., (2000), aislaron de sus aguas más de 22 cepas diferentes de bacterias y otro número igual de actinomycetes, con potencial biodegradador los cuales mostraron ser eficientes agentes en la remoción de BTX (benceno, tolueno, xileno, naf-taleno), carbamatos (P. putida, P. cepacia, P. fluorescens., Enterobacter sp.) y mercurio (P. putida, P. fluorescens y P. aurefaciens).

Pseudomonas fluorescens, perteneciente al grupo de Pseudomonas fluorescentes ha sido estudiada para procesos de detoxificación de mer-curio en medios acuáticos, por tener la capacidad de producir mercurio reductasa, una flavoproteína que cataliza la reducción de Hg+2 a mercurio

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metálico Hg0, en presencia de NADPH, en el citoplasma celular. Posterior-mente, la elevada presión de vapor del mercurio elemental resulta en su volatilización, haciendo que este proceso enzimático crítico de detoxifica-ción del mercurio se presente en las zonas aeròbicas de los ecosistemas acuáticos (Ogunseitan, 1998). También pueden participar en la detoxi-ficación mecanismos tales como procesos de acumulación intracelular, asociación con pared celular, interacción sideróforo-metal, movilización o inmovilización extracelular, interacciones con polímeros extracelulares y transformación y volatilización del compuesto. (Ford y Mitchel, 1992 Baldi et al., 1995; Ehrlich, 1997).

En el Humedal La Conejera las concentraciones de mercurio (0,1μg/L) a pesar de encontrarse dentro de los parámetros nacionales (0,02mg/L – DAMA, 1997) e internacionales (0,001mg/L – Comunidad Económica Europea-2000) para aguas residuales, no son despreciables en especial si se tiene en cuenta que se trata de un ecosistema donde los procesos de bioacumulación son irreversibles.

Estos microorganismos detoxificadores metales son potencialmente útiles en tratamiento de aguas en especial si se tiene en cuenta su capa-cidad de adherencia a diferentes sustratos, lo que hace que subproductos agroindustriales, naturales y de baja biodegradabilidad, se perfilen como soportes de adhesión o absorción de células para su inmovilización y posterior biosorción. Micelio vivo o muerto, tierra de diatomeas, carbón activado, escoria, celulosa, presentan características físicas y químicas que permiten su empleo como atrapadores de íones metálicos y su uso potencial como material filtrante de aguas residuales, especialmente de origen industrial. (Cañizales, 2000).

BIORREMEDIACIÓN Y DETOXIFICACIÓN DE METALES

La biorremediación es un proceso que explota las habilidades cata-bólicas de organismos vivos con el ánimo de acelerar o mantener la destrucción de contaminantes, y se ha convertido en una importante he-rramienta de mitigación de los impactos y contaminación del ambiente. Este proceso incluye además la descomposición o inmovilización del con-taminante por medio de procesos metabólicos que ocurren en muchos casos, en microorganismos con excepcionales características, producto de la selección que ejerce el medio sobre ellos, o de la introducción de genes que codifican para estas funciones metabólicas.

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Interacciones metal-microorganismos

Las reacciones químicas que ocurren entre los metales y los microor-ganismos incluyen cuatro procesos diferentes (Wood, 1974):

• Acumulación intracelular: La concentración de metales con bacterias y otras células microbianas puede ser resultado de la interacción con ligandos de superfice seguidos de un transporte lento hacia la célula. Esta puede ser una forma importante de detoxificación o una forma de incorporar específicamente metales en enzimas. En este caso la movi-lidad del metal está directamentamente dependiendo de la movilidad y fisiología de la célula.

• Asociación a la pared microbiana: Muchos metales establecen uniones estrechas con las paredes celulares como resultado de la presencia de grupos funcionales, que cambian protones por cationes divalentes, en una asociación estrecha entre la célula y el metal.

• Interacciones metal-sideróforo: Los sideróforos son agentes quelantes excretados por muchos microorganismos que facilitan la toma de iones férricos, formando uniones muy fuertes que no permiten reacciones químicas del metal con otros elementos. También se ha encontrado especificidad con otros elementos como cobre o molibdeno.

• Movilización e Inmovilización extracelular por metabolitos bacterianos: Este proceso está basado en la producción de metabolitos secunda-rios, tipo ácidos orgánicos, que, al unirse con óxidos de hierro o man-ganeso, determinan la formación de sales insolubles. Este mecanismo ocurre en la formación de sulfuros como bioproducto de la actividad de bacterias sulfato-reductoras.

El mercurio es un elemento que se se puede encontrar en la natura-leza, en los tres estados, líquido, sólido y gaseoso y químicamente se presenta como Hg0 y Hg+2, o en forma metilada como metil (CH3Hg) o dimetil (CH3Hg)2 mercurio. El pH es uno de los factores más importantes dentro de los procesos de movilización de metales pesados. Así mismo, factores como bajas concentraciones de selenio en el medio, la presencia de sulfatos, bajos niveles de carbono orgánico disuelto y la concentración de materia orgánica en descomposición, hacen que se incremente la ve-locidad de metilación de mercurio en sistemas acuáticos.

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Mecanismos enzimáticos

Los mecanismos enzimáticos de los microorganismos con potencial detoxificador incluyen la vaporización, proceso que se puede lograr bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas a partir de compuestos azufrados como HgS por oxidación del sulfito a sulfato. Una vez el Hg *2 se hace soluble, puede ser reducido a Hg0 por un mecanismo enzimático presen-te en diversos géneros bacterianos. Bacterias y hongos pertenecientes a los géneros Pseudomonas spp., Bacillus spp., Staphylococcus spp., As-pergillus spp. y Neurospora spp., producen cantidades considerables de CH3Hg+ aeróbicamente cuando crecen en presencia de Hg(II) y las bacte-rias metanogénicas lo generan también anaeróbicamente. Generalmente se sostiene que el proceso de metilación del Hg es totalmente químico y se lleva a efecto por donantes como la cianocobalamina y por tanto la participación microbiana es indirecta. Recientemente el desarrollo de es-trategias de remediación ha estado soportado por la reacción de reduc-ción del Hg+2 a Hg0, empleando mecanismos bacterianos de resistencia (Hgr) al mercurio, dependiente de la actividad de la enzima mercurio re-ductasa. Las bacterias Hgr ivolucran la presencia de la mercurio reductasa, un sistema específico de transporte de mercurio y una liasa organomer-curial que cliva los enlaces carbono-mercurio. En el sistema, los eventos sucesivos entre la liasa y la reductasa acompañan la resistencia tanto a compuestos organomercuriales como a iones de mercurio.

Los genes estructurales de la resistencia están codificados por un ope-rón simple regulado por el producto del gen merR, el cual es transcrito continua, pero en dirección opuesta, al operón merTPABD. Los productos de merT y merP están involucrados en la toma transporte de Hg+2, merA codifica para la mercurio-reductasa y merB codifica para la liasa organo-mercurial. merD es el gen identificado como más distante del promotor, y está asociado a la función coregulatoria de la transcripción. Cepas de Pseudomonas putida, perteneciente al grupo de las fluorescentes han sido seleccionadas como promisorias en procesos de remediación por presentar sobreexpresión del los genes merTPAB. La metilación y demeti-lación consiste en la conversión del Hg+2 en metil y dimetilmercurio. Este proceso se puede realizar también por la mediación de coenzimas como son la S-adensilmetionina. Los dos primeros no son capaces de transfe-rir grupos metil al Hg+2 porque para estos cofactores el grupo metil se transfiere como CH3

+. La rata de metilación depende de factores bióticos y abióticos. La reacción se lleva a cabo a pH óptimo, tanto para condicio-

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nes de laboratorio, como en campo, de 4.5. El dimetil mercurio es volatil y una vez en la atmósfera es degradado por fotólisis (luz ultravioleta) a Hg0, metano y etano.

Figura 1. Mecanismos de detoxificación.

La oxidación y reducción enzimáticas, formación de complejos insolu-bles (sales del metal) sideróforos, aminoácidos o metaloproteínas son otros de los mecanismos microbianos empleados así como la precipi-tación no específica, mecanismo indirecto en el cual se forman sales a partir de la reducción de compuestos. Como ejemplo se encuentra la producción de sulfuros metálicos por reducción de H2S, en condiciones de anaerobiosis (Cañizales, 2000).

Mecanismos no enzimáticos

Igualmente se cuenta con sistemas de biosorción en especial con biomasa fúngica viable y no viable la cual es empleada como material biosorbente que se puede emplear a nivel industrial. (Zhou, 1999). Los tratamientos de biosorción se optimizan cuando las células están inmo-vilizadas, la técnica de inmovilización mas utilizada con los hongos es la adsorción que compromete la interacción entre el microorganismo y el soporte; los hongos son microorganismos que actúan como buenos

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sorbentes y además presentan velocidades de crecimiento rápidas sin re-querimientos nutricionales especiales, por no utilizar sustratos costosos para su crecimiento. (McLean y Beveridge, 2001).

Por todo lo anterior, los ecosistemas de humedal pueden ser explora-dos en procesos de bioprospección, pues su potencial microbiano es aún desconocido.

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INDICADORES BIOLÓGICOS DE CALIDAD DEL SUELO

BIOLOGICAL INDICATORS OF SOIL QUALITY

CLAUDIA CRISTINA MORATTO SANTOS1

1Microbióloga Industrial. Magíster en Ciencias-Microbiología. Facultad de Ciencias.Universidad Nacional de Colombia.

[email protected]

RESUMEN

La industrialización de la agricultura y por consiguiente, la nece-sidad de protección del ambiente y la calidad de los alimentos, ha impulsado muchas investigaciones para conocer el impacto de las prácticas de manejo agronómico sobre la calidad del sue-lo. Se realizó la revisión de los aspectos generales de la calidad del suelo y los factores que la influencian, incluyendo propieda-des físicas, químicas y biológicas (principalmente microbianas) utilizadas para monitorear la calidad de un suelo.

Palabras clave: Calidad del suelo, uso del suelo, bioindicadores.

ABSTRACT

The agricultural industrialization and therefore, the necessity for environmental protection and food quality, have impelled a great number of research in order to know the impact of agronomic management experiences related to soil quality. In this docu-ment, were made a revision of general aspects of soil quality and influential factors, including physical, chemical and biologi-cal (mainly microbial) properties, used to monitor soil quality.

Keywords: Soil quality, land use, bioindicators.

INTRODUCCIÓN

La intensificación de las prácticas agrícolas durante las pasadas déca-das ha generado paulatinamente cierta preocupación, en relación con los cambios que pueden ocurrir sobre la calidad del suelo a largo plazo, con efectos que pueden llegar a ser incluso irreversibles como la reducción de la fertilidad de los suelos (Anderson, 2003), pérdida de biodiversi-dad, contaminación de aguas superficiales con pesticidas y eutrofización (Nielsen y Winding, 2002).

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Existen propiedades edáficas y biológicas que pueden ser utilizadas como indicadores del estado de la calidad de un suelo. Estas propieda-des deben ser identificadas y cuantificadas en cada ambiente en parti-cular, para poder documentar los cambios que suceden a corto y largo plazo, como consecuencia de las prácticas de manejo que se aplican (Masera et al., 1999). Lo anterior obedece a que aún no existen estánda-res universales de calidad del suelo y por tanto no se tiene un conjunto específico de indicadores de calidad. Sin embargo, en la actualidad pue-de ser determinado a través de la cuantificación de los cambios relativos de las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo (Nielsen y Winding, 2002).

Por su parte, los bioindicadores permiten analizar la situación actual de un sistema e identificar los puntos críticos con respecto a la sustentabili-dad (Masera et al., 1999) y por tanto son una herramienta muy útil para la toma de decisiones. Debido a que la calidad del suelo esta influenciada por el manejo y uso que se le de al mismo (Doran y Zeiss, 2000), dichos indicadores se seleccionan según el uso del suelo (agrícola, ganadero, forestal), reflejando condiciones tales como acidez, salinidad, contenido de humedad, entre otros parámetros.

Los microorganismos del suelo cumplen con un amplio rango de fun-ciones ecológicamente significativas, las cuales son esenciales para un buen funcionamiento y salud de los suelos. Ellos juegan un papel impor-tante en el flujo de energía, transformación de nutrientes y ciclaje de ele-mentos en el ambiente (Hoffman et al., 2003), debido a que contribuyen a mantener la transferencia de materia y energía en ambientes terrestres (Filip, 2002).

Adicionalmente, los microorganismos en suelos agrícolas influyen di-rectamente sobre el estatus de fertilidad de los suelos, principalmente en la disponibilidad de nutrientes y en la supresión de enfermedades para las plantas nativas presentes (Van Elsas et al., 2002). Dentro de las inte-racciones benéficas que se dan en la rizósfera, las mas estudiadas corres-ponden a las asociaciones micorrícicas, microorganismos involucrados en promoción de crecimiento vegetal, fijación biológica de nitrógeno y el ciclaje de nutrientes (Kennedy, 1998). Esto demuestra que el componen-te microbiológico de los suelos es importante en el funcionamiento del ecosistema y por esta razón, son potencialmente uno de los marcadores biológicos más sensibles para evidenciar disturbios o perturbaciones en el ecosistema (Pankhurst y Doube, 1997).

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CONCEPTOS DE SALUD Y CALIDAD DEL SUELO

La salud del suelo es el resultado de continuos procesos de conser-vación y degradación, dada la capacidad de éste para funcionar como un ecosistema viviente, en donde el balance de componentes químicos, físicos y biológicos (incluyendo los microbianos), contribuye a mante-nerla (Nielsen y Winding, 2002). En general, la salud del suelo puede ser entendida en términos de su capacidad microbiológica para contrarrestar o reprimir la actividad de microorganismos patógenos de plantas (Van Elsas et al., 2002), la cual se focaliza principalmente en los componentes bióticos, en el mantenimiento de los organismos del suelo y en su fun-cionamiento como reguladores del ciclaje de nutrientes y por tanto de la fertilidad del suelo (Anderson, 2003).

La calidad del suelo puede adoptar una característica abstracta, pues-to que depende de factores externos tales como: uso y prácticas de manejo, interacciones entre el ecosistema - ambiente y propiedades socioeconómicas (Doran y Parkin, 1996; Pankhurst y Doube, 1997), re-presentando un valor integral de la composición estructural y de las funciones naturales del suelo (Filip, 2002). Sin embargo, como la cali-dad del suelo no se puede medir directamente, se efectúan inferencias a partir de atributos o propiedades que sirven como indicadores de su calidad (Brejda et al., 2000), cuyos cambios pueden sugerir si las con-diciones están mejorando, declinando o se encuentran estables, con respecto a los cambios en el manejo, uso o prácticas de conservación (Brejda y Moorman, 2001).

Según (Brejda et al., 2000), dentro de las funciones del suelo que influyen en la calidad del mismo se encuentran: habilidad para acep-tar, mantener y liberar nutrientes, agua y otros constituyentes químicos, promover y sostener el crecimiento de raíces, mantener sostenible el hábitat biótico, responder a las prácticas de manejo y resistir a la degra-dación.

Es así como se han propuesto muchas definiciones de calidad del suelo, pero la más adoptada ha sido la dada por Doran y Parkin, 1994, quienes proponen que: “La calidad del suelo hace relación a la continua capacidad del suelo para funcionar como un sistema vital dentro de un ecosistema y sostener o mejorar la productividad biológica para promo-ver la calidad del aire y ambientes acuáticos manteniendo la salud de plantas, animales y del hombre”.

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Las propiedades de los suelos varían de manera natural a través del tiempo debido a factores que determinan su formación tales como: preci-pitación, material parental, organismos que lo habitan, actividad antropo-génica, entre otros y en consecuencia, no existe una sola medida biológica o química para determinar el estado de salud y calidad de un suelo (Do-ran, 2000). No obstante, los indicadores de calidad de suelo sirven para valorar los impactos humanos y naturales sobre los suelos y para identifi-car las prácticas sostenibles de manejo y uso (Doran y Parkin, 1994).

INDICADORES DE CALIDAD DE LOS SUELOS

La búsqueda de indicadores que puedan ser usados como herramien-tas cuantitativas para asegurar la calidad de los suelos es un gran desa-fío tanto para científicos como para agricultores. Los indicadores deben ser robustos y significativos, además de fáciles de medir e interpretar (Pankhurst y Doube, 1997). Muchos indicadores se relacionan con el ciclaje de materia orgánica, puesto que es un componente importante para la disponibilidad de nutrientes, estructura del suelo, infiltración de are y agua, retención del agua, erosión y el transporte o inmovilización de contaminantes (Knoepp et al., 2000: Brejda et al., 2000).

Dentro de los parámetros incluidos como indicadores y que son utili-zados actualmente para evaluar cambios en la calidad de los suelos, se encuentran las propiedades físicas, químicas y biológicas (Tabla 1).

Tabla 1. Algunos indicadores utilizados para monitorear la calidad del suelo.

INDICADORES FÍSICOS INDICADORES QUÍMICOS INDICADORES BIOLÓGICOS

Textura (% arcilla, arena y limo)Capacidad de intercambio catiónico

Composición de la microbiota

Densidad aparente Conductividad eléctrica Carbono orgánico

Tasa de infiltración N total N mineralizable

Retención de humedad P disponible Respiración

Resistencia a la penetración pH Biomasa microbiana

Profundidad capa arable

Sistema radicular

Estabilidad de agregados

Tomado de Calderón et al., 2002.

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Los procesos biológicos están íntimamente ligados con el manteni-miento de la estructura y fertilidad del suelo y son potencialmente más sensibles a cambios en el suelo que indicadores basados en propiedades físicas y químicas (Pankhurst y Doube 1997). Las propiedades biológicas, como los indicadores ecológicos, son más dinámicas y por tanto, tienen la ventaja de servir como señales tempranas de degradación o de mejo-ría de los suelos (Calderón et al., 2002), puesto que las poblaciones bio-lógicas influyen en la fertilidad del suelo en diferentes vías, cada una con efectos preventivos sobre el suelo principalmente dirigido a la producti-vidad (Swift, 1997) tales como: efectos de la simbiosis con micorrizas y rizobios que incrementan la eficiencia de adquisición de nutrientes por las plantas; un amplio rango de hongos, bacterias y animales participan en los procesos de descomposición, mineralización e inmovilización de nutrientes y por tanto influyen en la eficiencia del ciclo de nutrientes; los organismos del suelo median la síntesis y descomposición de materia orgánica influyendo así en la capacidad de intercambio catiónico, reserva de azufre, nitrógeno y fósforo, acidez y toxicidad del suelo, capacidad de retención del agua; las actividades de transporte de partículas por la fau-na del suelo y agregación de partículas por hongos y bacterias influyen sobre la estructura y regímenes de humedad en el suelo.

Los bioindicadores son en un sentido ecológico amplio, organismos que pueden ser usados para detección y caracterización cualitativa y/o cuantitativa de ciertos factores ambientales o de un complejo de los mismos en diferentes ecosistemas, cuya indicación es dependiente de la biología de los organismos, especialmente de algunas propiedades fisio-lógicas (Foissner, 1999). Estos indicadores sirven para monitorear funcio-nes básicas (Knoepp et al., 2000) tales como: Desarrollo de la estructura del suelo, reserva de nutrientes y actividad biológica.

INDICADORES MICROBIANOS DE CALIDAD DEL SUELO

El tamaño y composición de las poblaciones microbianas han sido usados para ver los cambios en la biota del suelo en respuesta al uso y por tanto son indicadores de su estatus biológico (Pankhurst y Doube, 1997) al construir parámetros que describen funciones, cantidad y diver-sidad de microorganismos (Doran y Parkin, 1996).

La definición de indicador microbiano descrita por Nielsen y Winding, 2002 comprende: “Un parámetro microbiano que representa propieda-des del ambiente (estados variables) o impactos del ambiente, los cuales

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pueden ser interpretados más allá de la información que representa la medición o parámetro observado como tal”, es así como una variedad de parámetros microbianos tienen el potencial para ser usados como indicadores de calidad del suelo (Tabla 2).

Tabla 2. Lista de parámetros e indicadores microbianos para monitorear la calidad del suelo.

Parámetro del ecosistema suelo Indicador y/o función microbiana

Biodiversidad Diversidad genéticaDiversidad funcional (microorganismos celulolíticos, solubilizadores de fosfato, bacterias diazótrofas, entre otros)

Análisis de lípidosCiclo del Carbono Respiración del suelo

Cociente metabólicoDescomposición de materia orgánicaUtilización de celulosaActividad de enzimas del sueloOxidación de metanoMetanótrofos

Ciclo del nitrógeno Fijación de nitrógeno

Amonificación (primer paso de la mineralización del nitrógeno)

NitrificaciónDenitrificación

Biomasa microbiana Hongos Biomasa microbiana: Métodos directosBiomasa microbiana: Métodos indirectosCociente microbianoProtozoos

Actividad microbiana Síntesis bacteriana de DNASíntesis de proteínas bacterianasMediciones de RNAFisiología del crecimiento de la comunidad microbianaBacteriófagosActividad deshidrogenada

Adaptada de Sicardi et al., 2004; Anderson, 2003; Filip, 2002; Nielsen y Winding 2002.

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Mediciones del estatus y actividades de comunidades microbianas específicas (grupos funcionales de microorganismos, biomasa microbia-na, niveles enzimáticos, productos finales enzimáticos y presencia y/o regulación de genes), poseen el potencial para proveer un medio rápido y sensible para caracterizar cambios en la calidad del suelo (Pankhurst y Doube, 1997; Bending et al., 2004). Los grupos funcionales microbianos que participan en ciclos de carbono, fósforo y nitrógeno están presentes en todos los ambientes, sin embargo, en el suelo estos elementos son factores limitantes del crecimiento microbiano y vegetal (Aldén et al., 2001; Vance et al., 2002), por esta razón muchos bioindicadores se re-lacionan con el ciclaje de estos elementos que pueden reflejar mejor las funciones dentro del ecosistema.

En cuanto a los microorganismos que pueden actuar como indicado-res de calidad de suelo, éstos pueden tener diferentes grados de sensibi-lidad a distintos cambios y que permiten medir el grado de desequilibrio ecológico causado por el contaminante. Dichos organismos son funda-mentales debido a los siguientes criterios: al ser sensibles pueden ser úti-les para monitorear los cambios que puedan darse en los suelos, cuando son sometidos a procesos de contaminación o recuperación; permiten evaluar la incidencia de acciones diversas sobre el suelo y su influencia en la calidad biológica y bioquímica del suelo; su estudio contribuye de manera significativa a conocer los cambios de sustratos y los procesos de mineralización que se producen en los suelos, en particular cuan-do el estatus de dicho suelo se ve alterado por acciones exógenas no usuales (acumulación de plaguicidas y metales pesados), que en un mo-mento dado pueden constituir un elemento que disturba su equilibrio (Pankhurst y Doube, 1997).

Basado en numerosos estudios sobre la influencia de agroquímicos sobre la microflora del suelo, Domsch et al., 1983 en Anderson, 2003 propuso los siguientes grupos microbianos sensibles: grupo de alta sensi-bilidad (bacterias nitrificantes, Rhizobium sp. y actinomycetes); grupo de sensibilidad media (poblaciones generales de algas, bacterias y hongos); grupo de baja sensibilidad (poblaciones de Azotobacter sp., amonifican-tes, proteolíticos y fijadores de nitrógeno). Las poblaciones de individuos sensibles son usadas como bioindicadores de los amplios cambios en la calidad del suelo resultado de alguna perturbación del mismo, en tanto que los microorganismos de alta sensibilidad podrían ser usados para detectar cambios en la calidad del suelo por perturbaciones menores,

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mientras que cambios en poblaciones de baja sensibilidad podrían indi-car perturbaciones altas con potenciales efectos a largo plazo (Pankhurst y Doube, 1997).

La búsqueda para asegurar la calidad de un suelo puede incluir en tér-minos ecológicos investigaciones de poblaciones individuales de micro-organismos del suelo. Filip (2002), evaluó la sensibilidad relativa de más de 20 parámetros microbiológicos y bioquímicos para el aseguramiento de la calidad del suelo a largo plazo en 49 suelos Europeos, concluyendo que las bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN), entre otros parámetros como son biomasa microbiana total, respiración del suelo y actividad deshidrogenada, sirven como indicadores sensibles de la calidad del sue-lo. Es conocida la determinación de la actividad de fijación biológica de nitrógeno para caracterizar los cambios en la calidad y propiedades del suelo, como consecuencia de las prácticas en los sistemas agrícolas y/o por la contaminación del suelo (Simon, 2003).

En un estudio adelantado por Moratto et al., 2005, se evaluaron dos grupos funcionales de microorganismos específicos: BFN y hongos so-lubilizadores de fosfatos (HSF), relacionados con cuatro condiciones de uso de suelos del Páramo de Guerrero-Colombia. Se comprobó el efecto significativo de la condición de uso del suelo sobre los recuentos de las poblaciones de BFN, obteniendo los mayores recuentos en los suelos que se han acompañado de periodos de descanso y rotación de cultivos con respecto a los suelos con cultivos activos. En cuanto a los hongos ais-lados, se evidenció la selección de morfotipos por efecto del uso del sue-lo, siendo predominantes los mucorales en suelos de bosque. En cuanto a la eficiencia de solubilización, los valores más altos se encontraron en hongos aislados de suelos que se encontraban en período de descanso, así como aquellos suelos de bosque no intervenidos.

De otro lado, se ha observado que al cambiar las condiciones de uso del suelo, los resultados no siempre concuerdan. Sicardi et al (2004), encontraron que la enumeración de grupos funcionales tales como Azo-tobacter spp., microorganismos celulolíticos y solubilizadores de fosfato, presentaron un efecto marcado de la estación en la cual se realizaron los muestreos, mientras que las actividades enzimáticas evaluadas (activi-dad deshidrogenasa, hidrólisis de diacetato fluoresceína, fosfatasa ácida y alcalina), fueron indicadores sensibles y confiables de los cambios bio-químicos generados por el cambio en el uso del suelo, mientras que en otras investigaciones los parámetros microbianos (colonización de mi-

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corrizas arbusculares, biomasa y respiración microbiana, contenido de quitina, ATP) pudieron ser indicadores mas efectivos y consistentes de cambios inducidos por el manejo que los parámetros bioquímicos (Ben-ding et al., 2004).

Lo anterior demuestra que para seleccionar indicadores sensibles que comparen los impactos del uso y manejo sobre la calidad del suelo, se deben evaluar varios parámetros que incluyan propiedades físicas, quí-micas y biológicas, teniendo en cuenta que cada parámetro depende de los fines que se buscan y del grado de sensibilidad que se quiere obte-ner, estando sujetos al tipo de manejo agronómico y uso del suelo.

En Colombia son pocas las investigaciones hechas al respecto y sola-mente mediante el estudio de las interacciones microbianas que ocurren naturalmente en los suelos y aprovechando su potencial como bioferti-lizantes gracias al ciclaje de nutrientes, se pueden diseñar sistemas pro-ductivos con una tendencia clara hacia una agricultura sostenible.

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ENZIMAS DE SUELO: AMBIENTE Y BIOTECNOLOGÍA

SOIL ENZYMES: ENVIRONMENT AND BIOTECHNOLOGY

Laura Cerón Rincón1

1Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Básicas e Ingeniería Dirección postal (Km 12 vía Puerto López,

vereda Barcelona, Villavicencio. Meta)[email protected], [email protected]

RESUMEN

La remediación de suelo y agua contaminados con hidrocarbu-ros policíclicos aromáticos, plaguicidas y metales pesados, es considerada actualmente como prioridad para el mejoramiento de la calidad ambiental, ya que la presencia de estos agentes tóxicos representa un serio riesgo para la salud animal, huma-na y del ambiente. En este contexto, se puede considerar mas importante para la productividad y estabilidad de los ecosiste-mas la diversidad funcional que mantengan las comunidades microbianas que habitan el suelo, que la diversidad taxonómica de las mismas; donde el seguimiento de la catálisis biológica del suelo a través de usos o alteraciones que pueda experimen-tar un ecosistema, puede proveer información para el entendi-miento de los procesos responsables de mantener funciones como la remediación de contaminantes.

Palabras clave: Ambiente, contaminación, biorremediación, enzimas de suelo.

ABSTRACT

The remediation of Soil and water polluted with polycyclic aro-matic hydrocarbons, plaguicides and heavy metals is considered as a priority in the enhancement of the environmental quality, because the presence of these toxic agents is a serious risk for the animal, human and environmental health. In this context, the functional diversity that is due to the microbial communities of the ecosystems is an issue that is considered more important that the taxonomic diversity to maintain the productivity and

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stability of these systems, where the monitoring of the biologi-cal catalysis can be done measuring the use and alterations that the ecosystem can suffer, can give us some information about the understanding of the processes that are responsible of the supporting of activities as the xenobiotic remediation.

Keywords: Environment, pollution, bioremediation, soil enzymes.

INTRODUCCIÓN

La remediación de suelo y agua contaminados con hidrocarburos po-licíclicos aromáticos, plaguicidas y metales pesados, es considerada ac-tualmente como prioridad para el mejoramiento de la calidad ambiental, ya que dicha presencia de estos agentes tóxicos representan un serio riesgo para la salud animal, humana y del ambiente. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos y plaguicidas pueden ser transformados (Dodor et al., 2004) y/o utilizados como fuente de nutrientes (Chaudhry y Ali, 1998) por diversos microorganismos, consiguiendo así su degradación, no obstante, los metales pesados no se pueden degradar pero son sus-ceptibles a la transformación y acumulación microbiana.

En la búsqueda de estrategias para la recuperación de suelos con problemas por este tipo de contaminación se ha estudiado ampliamen-te la identidad y los mecanismos de degradación (Van Hamme et. al., 2003; Rehmann et al., 2001), de microorganismos capaces de catabo-lizar compuestos tóxicos, además las investigaciones se han encamina-do ha encontrar maneras de incrementar la tasa de degradación de los compuestos tóxicos y así desarrollar diferentes tecnologías biocorrectivas alternativas, como el uso directo de los microorganismos en el ambiente o la aplicación sus enzimas en los procesos de remediación (Dodor et al., 2004); ya que presentan ventajas frente a las metodologías químicas convencionales, para la recuperación de suelos degradados. Dichas téc-nicas han ofrecido buenos resultados en la recuperación de los suelos, sin embargo, caben otros interrogantes acerca del impacto por el tipo de alternativa empleada. La aproximación a la dilucidación de estos interro-gantes dependerá del tipo de variable respuesta escogida como indica-dor, de los antecedentes del suelo (inherentes y dinámicos), del diseño experimental y la interpretación de los resultados y estará limitada por la sensibilidad de la medidas, las escalas espacio temporales y el conoci-miento que se tiene para interpretar las funciones del ecosistema (Cerón y Melgarejo, 2005).

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El suelo es un recurso vital, de cuya condición y funcionamiento de-pende la capacidad de funciones tan importantes como las de filtrar, amortiguar y transformar la materia, para proteger el ambiente y los nacimientos de agua de la contaminación, entre otras, funciones que incluyen procesos metabólicos microbianos implicados en la descom-posición de materiales orgánicos y la detoxificación de xenobióticos; procesos donde la catálisis del suelo posee un papel fundamental. Para aproximarse al entendimiento de los niveles de actividad microbiana responsables de los procesos que implican biorremediación y degra-dación de contaminantes y xenobióticos y el estado de los ciclos de los nutrientes durante el desarrollo de tales procesos, se estudian las activi-dades enzimáticas del suelo, ya que participan en procesos metabólicos de descomposición de materiales orgánicos y detoxificación de xeno-bióticos, siendo sensibles a los cambios generados por contaminación y están relacionadas directamente con otros factores biológicos, químicos y físicos. Con el desarrollo de la civilización, los factores antropogénicos han tomado el papel principal en los cambios que pueden sufrir los ecosistemas, por ello se requiere definir cómo y en qué intensidad los afectan, por lo cual las investigaciones en torno al tema hacen parte de los esfuerzos para enmarcar un uso sostenible que asegure la conserva-ción del recurso suelo.

LA CATÁLISIS BIOLÓGICA DEL SUELO

Las plantas y otros organismos liberan enzimas al suelo por secreción y por lisis celular posterior a su muerte (Burns, 1982), sin embargo, estas llegan a un ambiente inhóspito, donde sufren procesos de desnaturali-zación y degradación, observando que solo un bajo porcentaje de estas proteínas quedan inmovilizadas y estabilizadas en interacción con dife-rentes componentes de la fase sólida de suelo (Joinville et al., 2004). Las enzimas proceden de células proliferantes, latentes o restos de ellas, la mayor producción de enzimas extracelulares se le atribuye principalmen-te a los microorganismos por su gran biomasa, su alta actividad meta-bólica y su corto ciclo de vida (Dick y Tabatabai, 1992), en contraste con otros organismos que también habitan este ambiente, dado esto, se con-sidera que las actividades enzimáticas de suelo son la expresión directa de los requerimientos metabólicos y de la disponibilidad de nutrientes de la comunidad microbiana y representan una medida del estado me-tabólico de la comunidad.

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Las fuentes y estado de las enzimas en el suelo se resumen en la figura 1 (Cerón y Melgarejo, 2005). (i) Enzimas intercelulares, (ii) Enzi-mas periplasmáticas, (iii) Enzimas unidas a la superficie exterior de las membranas celulares, (iv) Enzimas liberadas durante el crecimiento y la división, (v) Enzimas dentro de células latentes (esporas, quistes, semi-llas, endosporas), (vi) Enzimas unidas a células muertas y detritos, (vii) Enzimas liberadas de células intactas o de células lisadas, (viii) Enzimas temporalmente asociadas a complejos enzima-sustrato, (ix) Enzimas ad-sorbidas en la superficie de minerales arcillosos, (x) Enzimas formando complejos con coloides húmicos.

La catálisis enzimática en el suelo posee un papel mediador en las transformaciones bioquímicas involucradas en la descomposición de re-siduos orgánicos y contaminantes, en el ciclaje de los nutrientes y su seguimiento bajo diferentes usos o alteraciones que pueda experimentar el ecosistema, provee información para el entendimiento de cómo los procesos responsables de mantener funciones como la producción de biomasa, la remediación de contaminantes y el ciclaje de nutrientes su-fren cambios y si estos son positivos, negativos o iterativos (Cerón y Mel-garejo, 2005), ya que poseen un papel determinante en dichos procesos

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al catalizar las reacciones bioquímicas implicadas, propiedad que se ha explotado para el desarrollo de tecnologías dirigidas al uso directo en procesos ambientales como la remediación de contaminantes, en proce-sos industriales y en diversas aplicaciones de interés técnico.

CONTAMINACIÓN

Es reconocido que la introducción de sustancias contaminantes como hidrocarburos, plaguicidas y metales pesados al suelo ejercen influencia sobre la microbiota, para describir esta influencia se emplean parámetros que puedan describir la condición general de esta y su potencial como agentes en remediación. Baran et al. (2004) estudiaron el efecto por contaminación del aceite diesel en una base aérea localizada en Yugos-lavia, a través de la introducción de un índice biológico de fertilidad Mw, que se trata de la combinación de las actividades (ureasa, deshidroge-nasa, fosfatasa ácida y alcalina) y el carbono orgánico total. Este último regula la persistencia y degradación de residuos orgánicos (Fenton et al., 1999). La presencia de los hidrocarburos estimuló la mayoría de las actividades estudiadas, se encontraron correlaciones significativas entre la cantidad y composición de los contaminantes y el índice de fertilidad Mw, demostrando la relación entre las actividades y la degradación par-cial de los hidrocarburos. En algunos casos se pueden formar combina-ciones muy estables con la materia orgánica, por tanto los contaminantes no están disponibles para los microorganismos y así se puede retardar su efecto tóxico sobre la micro y mesobiota, sin embargo, por efecto de esta inmovilización los procesos de biorremediación quedan limitados, así como otros factores (disponibilidad de nutrientes y pH) son necesa-rios para que se de la utilización de tales contaminantes como fuente de carbono.

En suelos mediterráneos contaminados con hidrocarburos provenien-tes de las cercanías de una refinería de aceite también se observaron incrementos, respecto al control, en las actividades enzimáticas (ureasa, deshidrogenasa y fosfatasa) en la porosidad, la velocidad de minerali-zación del N y el contenido metabólico (Caravaca y Roldán, 2003)- este último se utiliza como parámetro ecofisiológico-, reflejando la reducción en la eficiencia microbiana debida al efecto tóxico de los hidrocarbu-ros, lo cual permitió indicar que existe una lenta incorporación de los hidrocarburos a la biomasa microbiana y por tanto el proceso de mine-ralización de tales contaminantes también es lento, debido a su comple-jidad estructural y al estrés al que están sometidas las comunidades. Se

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han documentado (Monkiedje et al., 2002) algunos cambios que puede sufrir la comunidad microbiana por la aplicación de plaguicidas. Luego de la aplicación de los fungicidas mefenoxam y metalaxyl se registraron descensos significativos en las actividades deshidrogenasa, β-glucosida-sa, fosfatasa alcalina, en los recuentos de bacterias fijadoras de nitrógeno y estimulación en el recuento total de bacterias y en los niveles de amo-nificación, estos resultados indicaron un efecto nocivo por la aplicación de los fungicidas sobre las propiedades biológicas del suelo. Los efectos adversos por elevadas concentraciones de metales pesados, pueden pro-ducir cambios en la estructura de la comunidad bacteriana y por lo tanto, causar alteraciones en algunas funciones microbianas en el suelo; es así como en suelos contaminados por cadmio se registraron (Renella et al., 2004) incrementos significativos en el contenido metabólico y descensos en las actividades enzimáticas (fosfatasa alcalina, arilsulfatasa y proteasa) y biomasa microbiana, sin embargo, la estructura de la comunidad bac-teriana (utilizando técnicas PCR-DGGE) no presentó cambios, así como las actividades fosfatasa acida, β-glucosidasa, ureasa, y en los recuentos totales de bacterias. Lo anterior indica efectos nocivos sobre la funciones de la comunidad microbiana, es posible que se produzcan adaptacio-nes fisiológicas a la presencia de metales pesados mas que selección bacteriana, adaptaciones que se dan por las condiciones de estrés que conllevan a una demanda de energía adicional, lo cual podría explicar la reducción en las actividades enzimáticas y el aumento en el contenido metabólico.

Cabe anotar que se considera mas importante para la productividad y estabilidad de los ecosistemas la diversidad funcional que las comu-nidades microbianas mantienen, que la diversidad taxonómica de las mismas (Caldwell, 2005), por lo que se hace necesario el desarrollo de aproximaciones para acceder a la diversidad funcional, para así conocer mas acerca de las redes o vínculos que existen entre, la disponibilidad de recursos, estructura y función de la comunidad microbiana y el proceso del ecosistema, información que puede aportar la determinación de las enzimas del suelo.

POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO

Actualmente han cobrado importancia los avances biotecnológicos di-rigidos a la aplicación de enzimas en los procesos de remediación, por-que esta tecnología presenta ventajas frente a las metodologías químicas convencionales como: aplicación de materiales recalcitrantes aplicables

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a altas y bajas concentraciones de contaminantes, bajo un amplio rango de pH, temperatura y salinidad, entre otras. La introducción al suelo de enzimas oxidativas (peroxidasas, lacasas, polifenol oxidasas) o de orga-nismos que las produzcan pueden transformar fenoles clorados y anilinas de forma parcial (Durán y Esposito, 2000; Junghanns et al., 2005), o de forma total a través de la polimerización oxidativa con la consecuente mineralización de estos xenobióticos. El potencial de esta tecnología, uti-lizando procesos enzimáticos, se ha demostrado para el tratamiento de aguas residuales contaminadas con fenoles (Junghanns e a.l, 2005). Para determinar el impacto y el potencial remediador del ecosistema frente a este tipo de contaminantes, se hace necesario medidas relacionadas con el estado metabólico de la comunidad, dado que la influencia de dichos contaminantes sobre las comunidades microbianas, así como en la ca-pacidad de las mismas para utilizarlos como fuente de nutrientes, están relacionados y dependen de otras propiedades del suelo, como la dispo-nibilidad de nutrientes y el contenido de materia orgánica; es así como las actividades enzimáticas se presentan como parámetros que se relacionen de igual forma y por lo tanto pueden aportar dicha información.

CONCLUSIONES

Los organismos que habitan el suelo influyen directamente sobre el mantenimiento de sus funciones, así que su biomasa y actividad se han convertido en elementos para el seguimiento de cambios ambienta-les. Varios factores tienen influencia en la actividad enzimática de los suelos, factores naturales (cambios climáticos, condiciones geográficas, profundidad, propiedades físicas, químicas y biológicas) y factores an-tropogénicos (contaminación, manejo agrícola). Es mas importante para la productividad y estabilidad de los ecosistemas la diversidad funcional que mantengan las comunidades microbianas que habitan el suelo que la diversidad taxonómica de las mismas (Caldwell, 2005), encontrando que las enzimas del suelo proveen aproximaciones para acceder a esta diversidad funcional de modo que se conozca mas acerca de las redes o vínculos que existen entre la disponibilidad de recursos, estructura y función de la comunidad microbiana y el procesos del ecosistema.

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ENZIMAS Y SU PAPEL COMO BIOINDICADORES EN HUMEDALES

ENZYMES AND THEIR ROLE AS BIOINDICADORS IN WETLANDS

LUZ M. MELGAREJO LUZ M. MELGAREJO1, JIMENA SÁNCHEZ1,1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Un ecosistema saludable está definido por la integración de los ciclos de nutrientes, flujos de energía y por la estabilidad y elas-ticidad frente a una alteración o estrés, encontrando que las acti-vidades enzimáticas representan un indicador sensible de dichas condiciones (Cerón y Melgarejo, 2005). En particular, su deter-minación en humedales naturales o construidos, resulta de gran utilidad para el monitoreo de las condiciones allí existentes.

Palabras clave: Enzimas, humedales, indicadores de salud y calidad del suelo.

ABSTRACT

A broad definition of a healthy ecosystem includes the inte-gration of the nutrients and energy flows, and by the stability - elasticity to tolerate any disturb or stressing situations. Enzy-matic activities are a sensitive indicator of these situations (Ce-rón y Melgarejo, 2005), and in punctual cases, their measuring in both natural and artificial wetlands is a powerful tool for the monitoring of the conditions in these ecosystems.

Keywords: Enzymes, wetlands, soil health and quality indicators.

INTRODUCCIÓN

Las propiedades de los suelos varían a través del tiempo por factores que determinan su formación y por ello, no existe una sola medida bio-lógica o química para establecer el estado de salud y calidad de un suelo (Doran, 2002).

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El concepto de indicadores de salud y calidad del suelo hace referen-cia a un conjunto de parámetros que buscan establecer estándares de calidad para dicho recurso y que deben ser lo suficientemente sensibles, como para reflejar las condiciones existentes o los cambios que suceden en un ecosistema durante un período de tiempo corto de la manera más cercana posible a lo que ocurre en la realidad (Doran, 2002). Dentro de éste conjunto, el papel de las enzimas es de gran importancia ya que son sensibles a los cambios generados por el uso del suelo (Cerón y Melgarejo, 2005) y permiten evaluar los cambios dados en su actividad (estimulación o inhibición) en un ecosistema en particular, por diversos factores tales como lluvia ácida, presencia de metales pesados o xeno-bióticos, entre otros (Sosa et al., 2006).

Las enzimas se definen como catalizadores biológicos de naturaleza proteica que actúan sobre sustratos específicos transformándolos en nuevos productos y cuyo papel es esencial para todos los procesos bio-lógicos, debido a su elevada especificidad y actividad en condiciones ambientales moderadas, además de su alta eficiencia en la conversión sustrato-producto; encontrando que aún cuando son elaboradas por las células vivas, pueden actuar independientemente de éstas (Bolaños, 2006; Ahmad et al., 2001).

En ecosistemas de humedal se ha reportado que aún cuando es bien conocido que las enzimas microbianas son de gran importancia en pro-cesos de descomposición de biomasa muerta, son pocos los estudios efectuados sobre su actividad enzimática, la cual se ha establecido que es usualmente baja. Lo anterior puede generar acumulación de turba de-bido a la descomposición parcial del material vegetal y acumulación de nutrientes inorgánicos en la biomasa vegetal que pueden quedar reteni-dos en el humedal, generando procesos de eutrofización y de enlace de las enzimas a sustratos orgánicos en la matriz de turba. Adicionalmente, en suelos anegados bajo condiciones controladas se ha observado que las enzimas influyen en los procesos biogeoquímicos de los humedales, existiendo por lo general una correlación entre la actividad de la enzima β-glucosidasa, la liberación de CH4 y la concentración de carbono orgáni-co disuelto (Freeman et al., 1997).

Así mismo, se ha observado que la actividad enzimática en humedales puede ser afectada por la carga de nutrientes que se encuentren biodis-ponibles, ya que éstos pueden potencialmente disminuir su actividad (Wright y Reddy, 2001).

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CASOS DE ESTUDIO A NIVEL MUNDIAL EN LA EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS EN HUMEDALES NATURALES

Según Lahora (2006), “un humedal puede considerarse como un reac-tor biológico (tipo biopelícula sumergida) con aireación natural, en el que las plantas emergentes toman oxígeno de su parte aérea para intro-ducirlo en la sumergida a través de los rizomas; creando un mosaico de zonas aerobias y anaerobias próximas entre si, que favorecen los proce-sos de descomposición de la materia orgánica, nitrificación, desnitrifica-ción, precipitación de fosfatos y muerte de patógenos”.

Por lo general, en los suelos de los humedales se encuentra una gran diversidad de comunidades microbianas que son muy importantes en procesos de descomposición de materia orgánica, ciclaje de nutrientes y mitigación de niveles tóxicos de contaminantes. Así mismo, una buena proporción de la materia orgánica de los humedales y de los sistemas acuáticos está constituida por compuestos poliméricos de alto peso mo-lecular de los cuales, solo una pequeña parte está realmente disponible para las comunidades microbianas que los utilizan mediante la actividad de enzimas extracelulares, encontrando que la carga de nutrientes puede potencialmente alterar la actividad de dichas enzimas (Wright y Reddy, 2001).

Según Kang et al. (2005), los humedales juegan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos globales y de igual forma, los efectos de los cambios climáticos globales sobre estos ecosistemas son de gran importancia, por lo cual evaluaron el impacto de niveles elevados de CO2 sobre la actividad enzimática de muestras de suelo colectadas en diferentes tipos de humedales en el Norte de Gales y Korea, las cuales fueron incubadas bajo condiciones ambientales (370 ppm) o en con-diciones elevadas de CO2 de 2 – 4 meses. Encontraron que los niveles elevados de CO2 incrementaron las concentraciones de carbono orgá-nico disuelto en los poros acuosos, lo cual puede afectar la población microbiana, adicionalmente, no evidenciaron efectos adversos sobre la actividad β-glucosidasa en ninguno de los suelos, en contraste con el incremento significativo en las actividades N-acetilglucosaminidasa y fosfatasa detectada en algunos suelos; concluyendo que la actividad enzimática relacionada con la mineralización de N o P únicamente in-crementa bajo condiciones elevadas de CO2 cuando existen fuertes limi-taciones de nutrientes.

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El papel de los microorganismos es esencial en el ecosistema de hu-medal. En un estudio realizado por Álvarez (2002) en una serie de la-gunas someras pertenecientes al Parque Nacional y Natural de Doñana (España), se evaluaron las características funcionales de dichos hume-dales con especial atención en la descomposición de materia orgánica de tipo microbiano, encontrando una variación en las actividades enzi-máticas extracelulares: en las lagunas mas permanentes y con mayor contenido de materia orgánica particulada fina predominó la actividad oxidativa bacteriana, en tanto que para las lagunas mas temporales, con mayor abundancia de materia orgánica particulada gruesa y condiciones de alcalinidad menor predominó la actividad celulolítica fúngica.

De otro lado, Münster et al. (1992) evaluaron enzimas extracelulares con sus respectivos sustratos naturales procedentes de lagos polihúmi-cos ácidos, encontrando alta actividad para fosfatasas (100–150 nmol 1−1 h−1), glucosidasa (70–120 nmol 1−1 h−1) y aminopeptidasas (20–30 nmol l−1 h−1), observando que su actividad fue parcialmente modificada por las condiciones existentes en el agua (temperatura, materiales húmicos, acidez) y que dichas enzimas son de gran importancia como reguladores en el procesamiento microbiano de detritus.

Así mismo, Newman et al. (2003) evaluaron la actividad de la enzima fosfatasa como un indicador de eutrofización en humedales, en un expe-rimento en donde adicionaron diferentes concentraciones de fósforo (0, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 y 12.8 g P m–2 yr–1) a un mesocosmos colocado en una comunidad de pantano compuesta por Cladium jamaicense Crantz, Eleocharis spp. y un tapete de perifiton calcáreo; observando que la ac-tividad fosfatasa (AF) expresada con base en la biomasa específica, no fue un indicador sensible de enriquecimiento por P por perifiton epifitico creciendo sobre fragmentos de acrílico o flotando sobre el tapete de pe-rifiton. No obstante, la superficie del área específica de la AF constituyó un indicador sensible de enriquecimiento por P luego de 2-3 semanas de haber iniciado la aplicación de las dosis de P, observando que la su-perficie del área específica de la AF de perifiton no enriquecido tuvo un rango entre 0.42 – 0.7 nmol cm–2 min–1, mientras que la AF del perifiton creciendo en la dosis mas alta (12.8 g P m–2 yr–1) tuvo un rango de 0.11 - 0.29 nmol cm–2 min–1, concluyendo que la AF es un indicador poten-cialmente valioso cuando se usa en conjunto con otros indicadores com-plementarios tales como productividad primaria de perifiton y contenido de P presente.

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También fue evaluada la actividad de las enzimas fosfatasa y arilsulfa-tasa, en un estudio realizado durante 12 meses en tres suelos de hume-dal (pantano y ciénaga) en el Norte de Gales, observando que la ciénaga mostró una alta actividad fosfatasa, mientras que la actividad arilsulfatasa tuvo pequeñas diferencias entre los sitios de ciénaga y pantano. La con-centración de iones hidrógeno fue un factor dominante que controló la actividad fosfatasa en todos los sitios y se encontró una relación negativa entre la actividad fosfatasa y el contenido de fosfato cuando se efectua-ron las comparaciones con base en la ubicación espacial (Kang y Free-man, 1999).

Dada la importancia de la evaluación de la actividad enzimática en humedales, se han estandarizado métodos para su detección principal-mente en sedimentos de humedales tal como el efectuado por Kang y Freeman (1997), quienes modificaron el método tradicional para la determinación de fosfomonoesterasa usando como sustrato metilumbe-liferil mediante HPLC con detección UV.

Por su parte, Kang et al. (2005), utilizaron como sustrato fluorogénico metilumbeliferil-N-acetilglucosamina para medir la actividad de la enzima N-acetilglucosaminidasa en suelos de humedal de agua fresca y de agua salada, encontrando valores bajos en áreas de pantano y más altos en pantanos de agua fresca y pastizales inundados. Adicionalmente, obser-varon que únicamente en las muestras con turba, la actividad enzimática específica para la materia orgánica mostró una correlación significativa con la actividad N-acetilglucosaminidasa, sugiriendo su importancia en la dinámica de la materia orgánica en éstos ecosistemas.

Dentro de este contexto, en Colombia se efectuó un estudio (Melga-rejo et al., en revisión) para evaluar el potencial de las enzimas como indicadores de calidad en sedimentos y suelos aledaños al humedal de Jaboque, ubicado en la localidad de Engativá, Bogotá, D.C., el cual pre-senta en sus alrededores una alta densidad en construcciones urbanas e intervención antrópica. Se determinaron parámetros biológicos (bio-masa de C y N, relación de las medidas de respiración con la biomasa microbiana por carbono), actividades enzimáticas (fosfatasa ácida y al-calina, arilsulfatasa, deshidrogenasa, hidrólisis del diacetato de fluores-ceína, proteasa, ureasa, β-glucosidasa, celulasa) y parámetros químicos (nitrógeno total, porcentaje de carbono orgánico total, pH, capacidad de intercambio catiónico, amonio).

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Dentro de los resultados obtenidos se destaca que los sitios mues-treados con mayor efecto antrópico presentaron alto contenido de car-bono y de nitrógeno total, así como inhibición de la actividad proteasa, por lo cual en general se sugieren como indicadores de calidad para los sedimentos del humedal las actividades fosfatasa alcalina, deshidroge-nasa, proteasa y β-glucosidasa, junto con los parámetros químicos de porcentaje de carbono orgánico, porcentaje de nitrógeno total y amo-nio; en contraste con los sugeridos para los suelos aledaños al humedal (pastizales, suelos de uso agrícola con cultivos de papa y fresa), donde se registraron altos contenidos de nitrógeno en suelos de uso agrícola y se destaca la actividad deshidrogenasa como indicadora del estado de calidad del suelo según su uso, planteando como indicadores para los suelos aledaños: actividades deshidrogenasa, proteasa y tasa metabólica, junto con los parámetros químicos de porcentaje de carbono orgánico y porcentaje de nitrógeno total.

CASOS DE ESTUDIO A NIVEL MUNDIAL EN LA EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS EN HUMEDALES CONSTRUIDOS

La regulación de la actividad de enzimas extracelulares en humeda-les construidos, por ejemplo en humedales artificiales para tratamiento de aguas residuales, no ha sido bien elucidada, por lo cual en un es-tudio realizado por Shakle et al. (2000) se evaluaron tratamientos con muestras de suelo de un humedal construido, al cual se les suministro carbono (celulosa o glucosa) en diferentes concentraciones (10 y 100 mg l-1), teniendo agua libre de carbono como control o con efluente de alcantarillado. Se monitoreó la actividad de las enzimas β-D-glucosidasa, fosfatasa y arilsulfatasa en el suelo durante 54 días usando como sustra-to metilumbeliferil, el cual es degradado únicamente vía extracelular. Al comparar los controles que no recibieron carbono, la actividad fosfatasa no mostró diferencias significativas en todos los tratamientos durante el experimento, en tanto que la actividad sulfatasa se redujo significativa-mente por la adición de glucosa, celulosa y efluente de alcantarillado. La actividad β-D-glucosidasa incrementó gradualmente en respuesta a la adición de celulosa y decreció luego de la adición de efluente de al-cantarillado en un 84 % en los controles. Por lo tanto, se evidenció que la manipulación de la calidad y cantidad del suministro de carbono en humedales construidos puede ser útil para modificar la actividad de las enzimas extracelulares para maximizar la eficiencia en el tratamiento del agua.

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Los humedales han sido ampliamente utilizados para mejorar la cali-dad del agua. Es así como Kang et al. (1998) evaluaron la actividad enzi-mática en procesos de descomposición en dos humedales construidos, partiendo de la hipótesis que dicha actividad es más baja en sedimentos del humedal que se encuentran adyacentes a la parte más elevada y que la baja actividad enzimática del suelo es en alguna proporción responsa-ble del mejoramiento en la calidad del agua. Se evaluó la actividad β-glu-cosidasa, β-N-acetilglucosaminidasa, fosfatasa y arilsulfatasa, así como la actividad microbiana (sistema de transporte de electrones) y la hidro-química en el influjo y eflujo del humedal, en un área delimitada por un transecto desde suelos elevados hasta los sedimentos. Se encontró que la actividad enzimática fue significativamente mas baja en los sedimen-tos que en el suelo adyacente mas elevado, lo cual puede ser de gran importancia en la función de mejoramiento de la calidad del agua. Res-pecto a la hidroquímica, se encontró que las concentraciones de fosfato y nitrato descendieron significativamente en el agua de eflujo.

En un estudio realizado por Hunt et al. (2003) se afirma que es pro-bable que el tratamiento de aguas residuales porcícolas en humedales construidos involucre un proceso de desnitrificación substancial y para probarlo, midieron la actividad enzimática nitrificadora y desnitrificado-ra en relación con: comunidades de plantas, carga de N, limitaciones de carbono y nitrógeno, profundidad del agua, para lo cual conectaron dos “celdas de humedal” en serie (3.6 m de ancho por 35.5 m de lar-go). Un grupo de celdas fueron plantadas con juncos (Juncus effusus, Schoenoplectus tabernaemontani, Schoenoplectus americanus, Scirpus cyperinus) y el otro grupo fue plantado con cañas y eneas (Sparganium americanum, Typha latifolia, Typha angustifolia).

En dicho estudio, la desnitrificación y actividad enzimática fueron me-didas por el método de inhibición con acetileno en bloques de suelo in-tactos y en muestras de suelo con disturbio que fueron tomadas durante 4 años (1994 -1997). Auque la actividad enzimática en las muestras con disturbio fue mayor que la desnitrificación en las muestras en bloque, las mediciones estuvieron altamente correlacionadas. La actividad enzimáti-ca fue mayor en la celda de juncos que en la celda de eneas (con 0.516 y 0.210 mg de N kg-1 de suelo h-1 respectivamente) y se vio incremen-tada con la aplicación acumulativa de N. Adicionalmente, la actividad enzimática media fue equivalente a 9.55 kg de N ha-1 d-1 en las celdas de juncos. De esta forma, se confirmó que la actividad enzimática evaluada

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estuvo en general limitada por el nitrato más que por el carbono y que uno de los factores más influyentes fue la profundidad del agua del hu-medal, por lo cual, dicha actividad enzimática es muy significativa en el uso de humedales construidos para el tratamiento de aguas residuales porcícolas.

De otro lado, Giraud et al. (2001) utilizaron humedales construidos a escala piloto para el tratamiento de agua contaminada con hidrocar-buros policíclicos aromáticos (PAHs), particularmente fluoranteno y se investigó el posible papel de los hongos presentes en esos ecosistemas, observando que la actividad biodegradora no estuvo relacionada con su actividad fenoloxidasa extracelular como se pudo haber pensado en un inicio del experimento.

Por su parte, Shackle et al. (2006) afirman que las enzimas extracelu-lares juegan un papel importante en la degradación de contaminantes orgánicos en humedales construidos para tratamiento de aguas resi-duales, al adicionar de manera suplementaria las enzimas nativas que se encuentran allí en condiciones naturales para acelerar la remoción de sustancias contaminantes presentes o promover la degradación de nuevos contaminantes que sean incorporados. En el experimento reali-zado, adicionaron celobiohidrolasa y glucosidasa a suelos esterilizados incrementando la actividad enzimática de 375 a 4210 %, observando que dicha actividad declinó luego de 10 – 15 días y que si la población microbiana no está activa, probablemente la actividad enzimática tenga un período de duración corto. No obstante, aún cuando gracias a los microorganismos nativos presentes se mantuvo una adecuada capacidad de biodegradación, la adición de las enzimas mencionadas produjo un incremento significativo en su actividad (173 – 530 %) y en su persis-tencia (6 semanas), evidenciando que la utilización de una cantidad de enzimas adicional conlleva a un mejor proceso de biodegradación.

De otro lado, Freeman et al. (1997) evaluaron las posibles interaccio-nes dadas entre las enzimas del suelo y la biogeoquímica de humedales en un experimento de simulación de periodos de sequía, bajo condi-ciones controladas de anegación. Se encontró una correlación entre la actividad de la enzima β-glucosidasa y dos propiedades asociadas con el ciclo del carbono tales como la liberación de CH4 y la concentración de carbono orgánico disuelto, en contraste con la transición de condicio-nes de sequía, en donde se observó una correlación entre la actividad α-glucosidasa y procesos de mineralización, con liberación de Mg y Ca.

155


Adicionalmente, la actividad sulfatasa se correlacionó con cambios en la concentración de sulfato durante la simulación del periodo de sequía. Los autores concluyeron que al incrementar la abundancia de la enzima β-glucosidasa, se podría estimular la emisión de trazas de gas e incre-mentar la concentración de Mg y Ca y el incremento en la abundancia de la enzima sulfatasa, causa una supresión de la emisión de metano.

Así mismo, se ha observado que en un humedal o ecosistema acuático con limitaciones de P, la actividad fosfatasa alcalina (AFA) juega un papel importante en la regeneración del P inorgánico a través de la catálisis del rompimiento de los ésteres de P orgánicos a P inorgánico, ya que hasta el 90% del P orgánico puede estar en forma monoéster y por esta razón es importante en la regeneración de P del suelo, no obstante, di-cha actividad se puede reprimir por la presencia de grandes cantidades de P reactivo disuelto en un proceso que se conoce como inhibición por retroalimentación. De manera similar, las enzimas arilsulfatasa (de gran importancia en el ciclaje del azufre, la cual cataliza la hidrólisis de los és-teres de sulfato con liberación de SO4

2-) y proteasa participan en el ciclaje de nutrientes, regenerando las formas inorgánicas SO4

2- y NH4+ desde la

materia orgánica (Wright y Reddy, 2001).

El impacto de la carga de P en un ecosistema de pantano en Florida (E.E.U.U.) se ha correlacionado con cambios observados en los patro-nes de vegetación, tasas de acreción de la turba y otras propiedades físico–químicas, por lo cual, en un trabajo efectuado por Wright y Reddy (2001), se determinó la influencia de la carga (entrada de P) sobre las actividades de varias enzimas extracelulares a lo largo de un gradiente de enriquecimiento con P y su relación con parámetros físico – químicos del suelo. Se observó que la actividad fosfatasa alcalina se afectó por la carga de P, presentando una correlación negativa con las concentraciones de P en el suelo y de carbono - fósforo de la biomasa microbiana, en tanto que las actividades arilsulfatasa, β–D–glucosidasa, proteasa y fenoloxida-sa, no resultaron afectadas por la carga de P y no estuvieron relacionadas con los contenidos de C, N, S y P que fueron medidos en el suelo, ni con los parámetros físicos y químicos; pudiendo concluir que todas las actividades enzimáticas fueron mayores en la capa superficial de detritus y disminuyeron con la profundidad del suelo. Debido a las relaciones significativas entre la fosfatasa alcalina, los parámetros del suelo y el P microbiano, dicha enzima representa un buen indicador para la determi-nación del impacto del enriquecimiento con P en suelos de humedales.

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CONCLUSIONES

Se destaca el papel de los microorganismos en el ciclaje de nutrien-tes en ecosistemas de humedal y en particular el de las enzimas como indicadores de alta sensibilidad para el monitoreo de las condiciones ambientales allí presentes, así como de las posibles fluctuaciones en su dinámica por intervención antrópica, entre otros factores.

Teniendo en cuenta los reportes aquí expuestos se encuentra que los análisis de actividades enzimáticas junto con otros parámetros físicos, químicos y biológicos en humedales tanto naturales como construidos son una herramienta útil para monitoreo del sistema, como agentes indi-cadores y en varios casos como biodegradadores de contaminantes que pudieran estar presentes.

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GENERALIDADES DEL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN HUMEDALES

HERNANDO VALENCIA, JIMENA SÁNCHEZ, DIANA CASTELLANOS, ALEJANDRO RODRÍGUEZ, MARIEM VILLAMIL.

Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

La gran riqueza de los componentes bióticos y abióticos de los humedales hace que se encuentren entre los ecosistemas más complejos y productivos del planeta. Poseen una gran variedad de hábitats intermedios entre ambientes terrestres y acuáticos en donde interactúan diferentes componentes (agua, suelos, topografía, microorganismos, plantas y animales), cuya relación promueve la conservación de la biodiversidad y el beneficio del ser humano. Allí se destaca el papel esencial de los microor-ganismos, principalmente en el ciclaje de nutrientes mediante ciclos biogeoquímicos, biodegradación de xenobióticos y res-tauración del ecosistema, procesos que a su vez están influen-ciados por las interrelaciones entre macrobiota, microbiota y el hombre.

Palabras clave: Humedales, microorganismos, ciclos biogeoquímicos.

ABSTRACT

The great richness and diversity of the biotic and abiotic com-ponents in the wetlands makes them to be among the most complex and productive ecosystems in the planet. They possess a great variety of intermediate habitats between the terrestrial and aquatic atmospheres, and therefore, they play an important role in the conservation of the biodiversity and in the economic development. The complex processes and existent interactions among the components of the wetlands (soils, topography, mi-croorganisms, plants and animals) generate a series of values and benefits for the human population. The microorganisms play an essential part inside of these ecosystems, as a vital com-ponent for they balanced operation, like the nutrients cycle (as

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a biogeochemical cycle), xenobiotic compounds biodegradation and ecosystem restauration, because all of these are processes that are under the influence of the macrobiota, microbiota and man interactions.

Keywords: Wetlands, microorganisms, biogeochemical cycles.

INTRODUCCIÓN

Los humedales son ecosistemas con terrenos transitorios entre siste-mas acuáticos y terrestres, donde el nivel freático está usualmente por encima o cerca de la superficie del suelo. Cumplen funciones de impor-tancia ecológica tales como: amortiguación de inundaciones, reducción de la erosión, soporte o descargue de aguas subterráneas, filtración de contaminantes, lavado de nutrientes a través de procesos físicos (filtra-ción, sedimentación), físico-químicos (adsorción por el suelo y sustratos orgánicos) y bioquímicos (degradación, nitrificación, desnitrificación, des-composición y captación por las plantas). Adicionalmente, son lugares de reserva de una elevada diversidad biológica y refugio de organismos, incluidos en algunos casos especies endémicas o en peligro de extinción (Novotny, 1994; Lee, 1999; Moliner, 2002).

En el contexto de los sistemas acuáticos y en especial de los hume-dales, es de gran relevancia la participación de los microorganismos en procesos de descomposición de diversas sustancias (Deni et al., 1999; Solano et al., 2000; Eriksson et al., 2001), detoxificación de metales pe-sados y en la degradación de derrames de hidrocarburos, entre otros contaminantes.

PROCESOS DE DESCOMPOSICIÓN MICROBIANA

La descomposición de materia orgánica es uno de los procesos indis-pensables en el funcionamiento de los todos los ecosistemas, incluidos los acuáticos. Constantemente, las plantas y los microorganismos autó-trofos (productores primarios) realizan la fijación de carbono orgánico, mientras que prácticamente la misma cantidad de la materia orgánica es descompuesta completando el ciclo global del carbono. No obstante, aunque la descomposición constituye un proceso ecosistémico de im-portancia comparable a la fijación de carbono, es más lo que se conoce sobre ésta última, que lo relativo a los procesos de descomposición y especialmente, al papel que llevan a cabo los microorganismos en ellos.

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Las plantas poseen celulosa como uno de sus principales componentes y su descomposición microbiana es importante dentro del flujo del car-bono a nivel global, no obstante, en algunas casos (como por ejemplo en ambientes acuáticos) altos contenidos de biomasa de celulosa y de ligni-na son recalcitrantes, observando que para su degradación es muy efecti-va la utilización de consorcios de microorganismos aerobios y anaerobios con su respectiva actividad enzimática hidrolítica (Lynd et al., 2002).

Debido a la complejidad implicada en analizar la fracción microbiana (que desarrolla la mayor parte de los procesos de descomposición), el desarrollo de técnicas para estudiar el funcionamiento in situ de estas comunidades es relativamente reciente. Dichas técnicas pueden contri-buir en la comprensión del ciclo del carbono y procesos relacionados como el cambio climático y los mecanismos de intercambio de carbono entre la atmósfera y los ecosistemas acuáticos y terrestres, procesos es-pecialmente importantes para los humedales, que constituyen uno de los sistemas más productivos del planeta y donde la mayoría de carbono se acumula en forma de materia orgánica que entra en la vía detrítica (Álvarez, 2005).

En estudios realizados por Sahrawat (2003) se ha observado que la acumulación y descomposición de materia orgánica en suelos inundados (anaeróbica) y en sedimentos difiere con aquella que ocurre median-te procesos aeróbicos, de tal forma que en condiciones de inundación, la degradación de materiales orgánicos es incompleta y la humificación de la materia orgánica se encuentra disminuida. Su acumulación puede obedecer a efectos deletéreos sobre la actividad microbiana de produc-tos de reducción producidos, tales como sulfuro de hidrógeno o ácidos grasos volátiles y concentraciones tóxicas de amonio, aluminio, hierro y otros cationes en la solución del suelo. La ausencia de aceptores de elec-trones en suelos sumergidos y sedimentos de lodo, baja la tasa de oxida-ción y mineralización de la materia orgánica. Es así como la formación de moléculas orgánicas complejas recalcitrantes con fracciones de materia orgánica hace que esta última esté menos disponible para su utilización por microorganismos.

De otro lado, resulta interesante el hecho que la transformación de la materia orgánica no se realiza indistintamente por todos los microor-ganismos. Así por ejemplo, en una investigación efectuada por Álvarez (2002) sobre la descomposición de materia orgánica en lagunas y hu-medales del parque nacional y natural de Doñana (España), se determi-

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nó que predominaba la actividad oxidativa bacteriana sobre la materia orgánica particulada fina y que en donde había mayor abundancia de materia orgánica particulada gruesa había mayor prevalencia de activi-dad celulolítica fúngica.

METANOGÉNESIS Y SU RELACIÓN CON LOS PROCESOS DE DESCOMPOSICIÓN MICROBIANA

El ciclo del metano, como otros ciclos, representa dentro de la eco-logía microbiana un importante campo de investigación, siendo la me-tanogénesis una de las principales vías terminales de mineralización de la materia orgánica en ambientes húmedos. Según Álvarez (2002), el metano generado por los humedales representa del 15-20% del metano atmosférico. Adicionalmente, su importancia trasciende como indicador ecológico que permite evaluar el impacto de actividades humanas, de forma tal que el estudio de su regulación ha sido investigado en diferen-tes sistemas, latitudes y temperaturas (Castro et al, 2005).

Las emisiones de metano han sido consideradas como indicadores de la tasa de degradación anaerobia de detritos vegetales. En ocasio-nes se busca reducir o limitar la emisión de metano y en la actualidad se han planteado estrategias para su control tales como crecimiento de bacterias metanogénicas (que producen metano), contrarrestando la emisión al aprovechar el consumo del mismo por parte de las bacterias metanotróficas (oxidación de metano), controlando temperatura (a ma-yor temperatura mayor eficiencia en la metanogénesis) y concentración de oxígeno (mayor rendimiento de metanotróficas). Adicionalmente, el estudio de estas estrategias tiene implicaciones en el conocimiento que se logre del ciclo del carbono en ambientes de humedales naturales e incluso en la ecología microbiana. Se conocen datos sobre la oxidación de metano en sedimentos de humedales que in vitro alcanzan rangos entre 0 - 0.5 y 0 - 0.45 umol/mL/h, siendo menores a los obtenidos in vivo (Boon y Alison, 1995).

Los datos obtenidos en diversos estudios son muy variables y depen-den mucho de las condiciones ambientales predominantes, sin embargo, se conocen algunos datos como los obtenidos en el Sureste de Australia con climas mediterráneos, en los cuales muestras de sedimentos fue-ron analizadas para evaluar in vitro la tasa metanogénica observándose rangos de metanogénesis (por medición de emisiones de metano de 1nmol/cm3/h a 19 nm/ cm3/h), que se elevaban con el aumento de la

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temperatura. También se encontró que experimentalmente, la tasa de metanogénesis fue menor al 3% en sistemas aeróbicos comparada con los sistemas anaeróbicos. Adicionalmente, se ha demostrado que esta vía puede verse inhibida por concentraciones elevadas de nitratos (supe-riores incluso a 0.01mM) (Boon y Alison,1995; Sizova et al., 2003).

En el contexto de la ecología microbiana, es de gran utilidad tener en cuenta el establecimiento de consorcios que favorezcan determina-dos procesos. En dichos consorcios se establece una relación síntrófica entre los microorganismos, en la cuál un grupo microbiano produce un producto metabólico que otro grupo utiliza como sustrato. Tal es el caso de las fermentaciones microbianas, en las que la materia orgánica es transformada en primera instancia por microorganismos fermentadores, produciéndose diferentes ácidos orgánicos que sirven de sustrato para microorganismos reductores, que los transforman en acetato. Dado que dichos procesos no son termodinámicamente favorables, se hace nece-saria la participación de un tercer grupo, los microorganismos metanó-genos, que utilizan como sustrato el acetato producido en una reacción con alta energía libre, que en conjunto hace al proceso fermentativo de la materia orgánica termodinámicamente favorable y por ende posible (Díaz, 2006, com pers).

El grado de simbiosis es tan elevado en dichos consorcios, que el ais-lamiento de microorganismos sintróficos en cultivo puro no es fácil de lograr. No obstante, se ha realizado el aislamiento de consorcios meta-nogénicos altamente enriquecidos y ampliamente distribuidos. Dentro de este grupo vale la pena destacar que han sido identificados en con-sorcios (mediante técnicas moleculares) varios géneros de microorgan-ismos no cultivables in vitro, situación que es comprensible teniendo en cuenta la situación descrita antes, soportada por algunas evidencias en las cuales se ha visto que varias especies metanogénicas son incapaces de degradar compuestos como los ácidos tanínicos, los cuáles deben ser degradados previamente por otras bacterias de la vía fermentativa para continuar con el proceso de metanogénesis. Del mismo modo, son cruciales las interacciones competitivas que pueden llegar a determinar la disponibilidad de sustratos que sostengan dicha vía, ya que diferentes grupos de microorganismos pueden competir por la utilización de un mismo sustrato; éste es el caso del uso del acetato por los microorgan-ismos sulfatoreductores y los metanógenos. Algunos de los géneros mi-crobianos reconocidos por su actividad metanogénica y que han sido

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aislados de humedales son Methylosella, Methylocapsa y varios organis-mos de la familia Methanosarcinacea (Sizova et al., 2003).

Por otra parte, Roslev y King (1996) encontraron que bacterias metan-otróficas nativas presentes en humedales son relativamente tolerantes a condiciones de anoxia, según experimentos realizados con Methylosinus trichosporium cepa OB3b, en donde la oxidación de metano aeróbica tuvo una mayor regulación en la emisión de metano estacional en el humedal investigado. Así mismo, el cambio de la condición óxica a una anóxica in situ tuvo un mínimo efecto sobre la viabilidad de bacterias metanotróficas y en sí sobre el potencial de oxidación de metano.

USO POTENCIAL DE HUMEDALES EN PROCESOS DE DESCONTAMINACIÓN

La contaminación de un cuerpo de agua por elevado crecimiento de material orgánico estimulado por nutrientes inorgánicos, se conoce como eutroficación (Winkler, 1998). La eutroficación es el proceso por el cual una masa de agua pasa de la condición de baja productividad a una elevada productividad. Es un desequilibrio o alteración significativa de los ecosistemas naturales, provocado por la introducción de elemen-tos en concentraciones anormales (Branco, 1984). Una de las posibles consecuencias ecológicas de la eutroficación de los humedales, radica en la excesiva proliferación de algas y macrófitas. Al morir, este exceso de algas y plantas se depositan en el fondo, en donde aumenta el problema de consumo de oxígeno. La acumulación de dicha materia orgánica su-mada a los sedimentos de origen alóctono que llegan al cuerpo de agua, provocan una colmatación progresiva que puede hacer desaparecer el ecosistema (Roldan, 1992).

Las medidas correctivas para evitar este proceso de eutroficación del agua de los humedales presentan inconvenientes económicos y técnicos, por lo cual las medidas preventivas destinadas a reducir las fuentes de aporte de nutrientes son principalmente: gestión integral de la cuenca para minimizar los aportes por escorrentía debidos a la erosión del suelo y los fertilizantes agrícolas, identificación de las zonas críticas en cuanto a contaminación difusa, uso de detergentes con bajo contenido en polifos-fatos, gestión de los residuos agrícolas y ganaderos, reducción del uso de fertilizantes, tratamiento adecuado de las aguas residuales domésticas e industriales y uso de filtros verdes para la protección del dominio público (Lahora, 1999).

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Finalmente y teniendo en cuenta la gran importancia de los microor-ganismos en estos ecosistemas, vale la pena destacar una opción deri-vada de la diversidad microbiológica de los humedales naturales, que consiste en la exploración de dicha diversidad para aprovecharla de man-era sostenible en eventuales procesos de descontaminación y biorreme-diación. Se sugiere que esta búsqueda debería constituir la primera etapa en cualquier proyecto de esta índole. En nuestro país ya se están realizan-do esfuerzos en este sentido. Adicionalmente, es importante considerar que los seres vivos tienen requerimientos ecológicos, esto es, un rango de condiciones en las que pueden vivir y una necesidad de determina-dos recursos y conociendo los requerimientos de determinados grupos de organismos, la presencia y abundancia de estos puede ser utilizada para evaluar el estado ecológico del medio en el que viven, pudiendo ser utilizados como bioindicadores de procesos específicos (Moliner, 2002). Un buen ejemplo de dicha situación son los microorganismos, ya que los cambios en factores ambientales tales como aireación, potencial redox, pH, entre otros, derivan en cambios de las poblaciones de microorganis-mos en los ciclos biogeoquímicos (Winkler, 1998) que son susceptibles de ser detectados y cuantificados.

En este contexto, dentro de un macroproyecto realizado en Colombia financiado por la Empresa de Acueducto y Alcantarillado de Bogotá y lid-erado por el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá en el humedal El Jaboque1 para la caracterización de su componente biótico en tres zonas determinadas por el nivel de in-fluencia e intervención de actividades humanas (conservada, intermedia e intervenida), se buscó determinar la presencia de grupos funcionales de microorganismos nativos que participan en procesos de degradación (principalmente de material orgánico y sustancias xenobióticas) y mante-nimiento, en las tres zonas. En términos generales, se obtuvieron recuen-tos altos de células viables por gramo de sedimento de actinomycetes, bacterias aerobias y anaerobias en las zonas intervenida e intermedia, en comparación con la zona conservada, en tanto que el recuento de hongos filamentosos permaneció estable para todas las zonas evaluadas. Así mismo, se obtuvieron diferentes poblaciones de microorganismos amonificantes, nitrificantes, proteolíticos, lipolíticos, fijadores biológicos de nitrógeno, solubilizadores de fosfatos y sulfatoreductores según grado de intervención, algunos de los cuales presentan potencial para ser uti-

1 Disponible en: www.icn.unal.edu.co/investigadores/OrlandoRangel/proyectos.html, 2005.

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lizados principalmente en procesos de aumento en la descomposición de materia orgánica y degradación de xenobióticos contaminantes en el humedal y que podrían contribuir con la disminución del fenómeno de eutrofización en este ecosistema particular (Valencia et al., 2005-datos no publicados).

Estudios similares a éste, también son posibles con la ayuda de herra-mientas moleculares. Así por ejemplo, Brofft et al. (2002) determinaron la diversidad bacteriana presente en un humedal con diferentes zonas de contaminación (alta, media y no contaminada) por la presencia de dese-chos de carbón con altos contenidos de azufre, de metales pesados, aci-dez y escurrimiento salino, mediante la generación de librerías de clones 16S rDNA, observando que la mayor diversidad se obtuvo en las zonas con escurrimiento ácido y reportando la presencia de Thermoplasma sp., Acidiphilium sp., Acidobacterium capsulatum, Ferromicrobium acidophi-lium, Leptospirillum ferrooxidans, entre otros. Trabajos como este son útiles como evidencia para direccionar caracterizaciones más específicas en estudios como el desarrollado en el humedal El Jaboque.

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MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS Y BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

EN PÁRAMOS Y REGIÓN CÁLIDA TROPICAL (COLOMBIA)

PHOSPHATE SOLUBILIZING MICROORGANISMS AND NITROGEN FIXING BACTERIA IN MOOR AND TROPICAL

LANDS (COLOMBIA)

1Hernando Valencia, 1Jimena Sánchez, 1 Diana Vera, 1Nelson Valero, 1Martha Cepeda, 1Ana M. Gamboa, 1 Esperanza Guerra,

1Patricia Bohorquez, Yerly Useche, 2Claudia Moratto, 2Luis Vargas1Departamento de Biología.

Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá 2Pontificia Universidad Javeriana

[email protected]

RESUMEN

Se estudió la presencia de microorganismos solubilizadores de fosfatos en ecosistemas diferentes y en suelos de cultivos, así como de bacterias diazotróficas. En los páramos y zonas de bosque húmedo tropical los suelos se caracterizaron por su reacción ácida (pH 3.8 - 4.4) y bajos contenidos de fósforo y nitrógeno disponible. Entre los hongos solubilizadores de fos-fatos, aislados en estado de micelio activo, sobresalen especies de Penicillium y de mucorales en páramos de El Granizo y el Guerrero y de Paecilomyces y algunas especies de Aspergillus en las zonas cálidas (sabana Guaviare y selva de la amazonía). En los páramos característicamente no se aislaron micelios ac-tivos de Aspergillus sp. y se postula un efecto inhibitorio sobre Aspergillus sp., en estos suelos. En bacterias solubilizadoras de fosfatos cepas del género Pseudomonas y tipo Athrobacter, se encontraron asociados a Calamagrostis sp. y Espeletia sp. en paramos, así como levaduras. Por su parte en suelos de la amazonia se aislaron especies de Pseudomonas, Enterobacter y Chromobacterium. En bacterias fijadoras de N2 se aislaron espe-cies Azospirillum en cultivos (papa, caña y arroz) y Azotobacter en caña y arroz. Aislamientos de Pseudomonas sp. presentaron

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la distribución más amplia al presentarse en los páramos y cul-tivos considerados.

Palabras clave: Microorganismos, solubilizadores de fosfatos, fijadores de nitrógeno, páramos.

ABSTRACT

The presence of phosphate solubilizer microorganisms and diazotrophic bacteria from soils of different ecosystem and cultures was studied. Acid soils (pH 3.8-4.4) with low concen-trations of phosphorus and nitrogen available were founded in high mountain and tropical rain forest. The most important fungi phosphate solubilizers (isolated from active mycelium) were Penicilium and mucorales from El Granizo and El Guer-rero (high mountain ecosystem) and Aspergillus from high temperature ecosystem (grassland from Guaviare and Amazon tropical rain forest). From high mountain soils weren’t possible isolated active mycelium of Aspergillus, we proposed an inhibi-tion effect in those soils. Pseudomonas strains and other ones like Athrobacter (phosphate solubilizers) as well as yeasts were found associated to Calamagrostis and Espeletia plants in high mountain ecosystem. Pseudomonas, Enterobacter and Chro-mobacterium were isolated from Amazon soils. Azospirillum and Azotobacter (nitrogen-fixing bacteria) were isolated from potato, rice and ‘caña de azúcar’ cultures. Azotobacter was only in rice and ‘caña de azúcar’ cultures. Pseudomonas was widely distributed in both ecosystems.

Keywords: Phosphate solubilizing microorganisms, nitrogen fixing bac-teria, moor, tropical lands.

INTRODUCCIÓN

Hoy en día se reconoce el papel fundamental de los microorganismos como motores de los ecosistemas por sus funciones en la descomposi-ción de sustratos y el ciclaje de nutrientes. Para las plantas el nitrógeno y el fósforo son macronutrientes esenciales y su falta o baja disponibilidad se convierten en factor limitante de la productividad vegetal (Russell, 1973), de ahí el interés en el estudio de los grupos funcionales, solubi-lizadores de fosfatos y fijadores biológicos de nitrógeno. Varios estudios han aportado al conocimiento de la función de los microorganismos para

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proveer fósforo disponible para las plantas, por diversos mecanismos en-tre los que se cuentan: el desplazamiento del equilibrio de sorción (fosfa-tos retenidos en coloides) que resulta en un aumento de la transferencia de los iones de fosfato a la solución del suelo; procesos metabólicos que permiten solubilizar fosfatos de compuestos inorgánicos poco o no solubles, mediante la producción de ácidos orgánicos y protones asocia-dos, que son efectivos para la solubilización de fosfatos minerales como las formas precipitadas de fosfatos de Aluminio y fosfato de hierro, que se forman en suelos ácidos, o de fosfatos de Calcio en suelos alcalinos. Algunos ácidos orgánicos actúan como agentes quelantes y ayudan a so-lubilizar fosfatos de Al, Fe, Ca y Mn (Tinker, 1980; Richardson, 2001). Una vez liberados los ortofosfatos asimilables (H2PO4

-, HPO42-) a la solución

del suelo son tomados por las raíces o transferidos a través de micorrizas. También enzimas de microorganismos y plantas, mineralizan fosfatos de fuentes orgánicas. En ecosistemas naturales los microorganismos solubi-lizadores de fosfatos inorgánicos, bacterias y hongos, constituyen una es-trategia para el suministro de fosfatos solubles, tanto para la microbiota como para las plantas, en especial en suelos pobres en nutrientes. En zo-nas templadas se ha registrado, entre los microorganismos eficientes en esta función, especies de Penicillium y Aspergillus (Cunningham y Kuiack, 1992; Withehaw, 1999) y de bacterias primordialmente rizosféricas, tales como especies de Bacillus, Micrococcus y Pseudomonas (Tinker, 1980). En zona tropicales especies de Penicillium, y Paecilomyces ejercen un papel importante en esta función (Vera et al., 2002; Cepeda et al., 2005; Moratto et al., 2005).

La fijación biológica de nitrógeno realizada por fijadores simbióticos o asimbióticos ayuda a restituir el nitrógeno disponible en los sistemas bio-lógicos (Weaver et al., 1994; Coyne, 2000). Entre las bacterias diazotrófi-cas de vida libre en suelos ácidos predominan especies de Azospirillum, Beijerinckia y Derxia (Bashan 1999), mientras especies de Azotobacter crecen usualmente a un pH mayor de 6.0. Según el comportamiento con el oxígeno y mecanismos de protección de la nitrogenasa, existen especies aerobias, facultativas, microaerofíicas y anaerobias, presentes en diferentes microhabitats y condiciones de suelo.

En el presente trabajo se recopilan los resultados de varias investigacio-nes (Vera, D., Valero, N., Guerra, E., Moratto, C., Bohorquez, S., Rodríguez, N., Rubiano, M.E. Vargas, L., Cepeda, M.L. ,Gamboa, A.M., Sanchez, N. y Useche, Y.) sobre bacterias y hongos solubilizadores de fosfatos inorgáni-

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cos, así como de bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno, realizadas en ecosistemas y agrosistemas ubicados en zonas contrastantes, con el propósito de estudiar su presencia y distribución.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se seleccionaron muestras de suelos de los primeros 20 cm de profun-didad, medio kg por sitio o asociada a raices. Se tamizaron por criba de 2 mm y se realizaron diluciones decimales a partir de 10 g de suelo en base seca para el aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfatos en medio de Sundara, Rao y Sinha (SRS) y en medios Nfb-libre de nitrógeno y de Ashby, para bacterias fijadoras de nitrógeno. (Dobereiner, 1995). Para hongos solubilizadores de fosfatos minerales se aplicó la técnica de siembra de partículas lavadas de suelo en medio SRS: Se colocan 20 g de suelo en tamiz de 1.5 mm y debajo de este uno de 0.6 mm. Se hace fluir 6 L de agua destilada esterilizada para la extracción de esporas y propá-gulos latentes. Las partículas retenidas en el tamiz fino se colocan sobre papel de filtro y una vez secas se transfieren con pinzas a las placas con el medio selectivo (cinco por caja), todo en condiciones asépticas y mínimo 100 partículas por submuetra de 3 replicaciones. Las placas sembradas se incuban a temperatura ambiente 14 +/- 5 oC por 3-8 días. Pasado este periodo se realizaron repiques para purificar aislamientos y pruebas bioquímicas para bacterias con paneles para identificación BBL Crystal® como pruebas complementarias. Para los hongos se usó en especial las claves del compendio de hongos del suelo de Domsch et al. (1980).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En las Tablas 1 y 2 se indican los microhongos obtendidos a partir de micelios activos (no de propágulos latentes) registrados de investigacio-nes realizadas en ecosistemas naturales y en cultivos de papa en alta montaña y en zonas cálidas tropicales. Los hongos del suelo aislados de regiones de alta montaña, páramos el Granizo y El Guerrero pertenecen a las clases Deuteromycetes, Zygomycetes y a micelio estéril (Tabla 1). Sobresalen especies de Penicillium y de mucorales. Las especies de Mu-cor y de Zygorhynchus son más típicas de bosque de páramo, mientras los aislamientos de Trichoderma se encontraron en pastizal de zonas de cultivo de papa en descanso. Especies de Mortierella usualmente se encuentran en sitios de vegetación abierta como el pastizal-frailejonal de páramo y se aisló asociada con Espeletia grandiflora. Al comparar los hongos solubilizadores aislados de regiones de páramo con los obteni-

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dos en regiones cálidas, sabanas del Guaviare y bosque húmedo tropical de la Amazonia, sobresale el hecho de encontrarse una alta proporción de aislamientos del género Paecilomyces, cuatro taxa, tanto en la ve-getación abierta de sabanas como en la vegetación de selva, rastrojo y pastizal de la Amazonia; acompañada esta ultima con diversas especies de Trichoderma, tales como T. aueroviride, T. viride y T. longibrachiatum, además de dos especies no determinadas. En los sitios en referencia se encontraron especies de Aspergillus, así: A. aculeatus, A. flavo-clavatus y A. oryzae en el Guaviere y A. niger en suelos amazónicos. (Vera, 2002; Useche, 2004, Cepeda et al., 2005).

En los sitios contrastantes de regiones de páramo y cálida tropical se aprecia una diferencia importante y es el hecho de no encontrar especies de Aspergillus en zonas de alta montaña, aspecto que ha venido cons-tatando el autor en diversos trabajos relacionados con micoflora de pá-ramo (ver Tabla 1). Esto permite formular la hipótesis de constituirse los suelos de páramo, en suelos que suprimen o inhiben el crecimiento de especies de Aspergillus en estado de micelio activo o donde su presencia es extremadamente baja. Este aspecto resulta interesante de resaltar, si se tiene en cuenta la metodología aplicada en los diversos trabajos, o la técnica de lavado de partículas de suelo, en la cual las muestras de suelo son procesadas para aislar hongos que se encuentran como hifas adheridas o micelios activos en la partículas o agregados de suelo, y no a partir del método de diluciones, el cual no permite diferenciar hongos obtenidos de conidias, esporas y propágulos latentes de los de micelios activos. (Gams y Domsch 1967; Parkinson et al., 1971).

El método selectivo para hongos activos es fundamental, debido a que es la condición micelial viva de los hongos, la que juega un papel impor-tante en la descomposición y otros procesos importantes en el suelo. También en el páramo de Chisacá, en donde se realizó una exhaustiva in-vestigación de la micoflora con más de 1600 aislamientos y 62 especies registradas, no se obtuvo especies de Aspergillus (Gualdrón et al., 1997). Si bien se aisló una especie de Emericella rugulosa, se trata de un estado sexual (meioespórico o el telemorfo de Aspergillus, -Alexopoulos y Mims, 1979), pero no propiamente estados asexuales, que son prácticamente cosmopolitas y altamente frecuentes en diferentes sustratos y microhábi-tats, tanto en zona templada como tropical. (Cole y Kendrick 1981; Dixon et al., 1998). El hongo Emericella produce dos tipos de esporas, conidias y ascoesporas, además de las células de envoltura (Huelle Zells) (Carlile y Watkinson, 1994), lo que aumenta su capacidad de dispersión.

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Tabla 1. Hongos solubilizadores de fosfatos inorgánicos aislados de ecosistemas de alta mon-taña tropical.

Lugar / aislamiento Procedencia Características Referencia

Páramo El Granizo3.250 m.s.n.m.pH 4.4 Textura:Franco arenosa

Cepeda et al., 2005

Cladosporium cladosporioides Espeletia grandiflora

Epicoccum purpurascens Espeletia

Mucor circinelloides EspeletiaPenicillium canescens EspeletiaPenicillium spinulosum EspeletiaZygorrhinchus heterogamus Espeletia

Rhodotorula sp. Calamagrostis efusa Sanchez, et al., 2005

Penicillium restrictus Espeletia grandifloraTrichoderma sp. Calamagrostis efusa

Páramo El Guerrero Moratto, et al., 2005

Acremonium sp. PastizalCircinella sp. BosqueGilmaniella humicola PastizalGilmaniella sp. PastizalGliocladium catenulatum BosqueHumicola grisea BosqueMortierella sp. PastizalMucor sp1 BosqueMucor sp2 BosqueMucor racemosus PastizalPenicillium frecuentans BosqueP. glabrum BosquePenicillium BosquePenicillium BosqueTrichocladium asperum PastizalT. canadiense PastizalTrichoderma koningii PastizalZygorrhinchus sp. BosqueMicelio esteril sp.1 PastizalMicelio esteril sp.2 PastizalMicelio esteril sp.3 PastizalMicelio esteril sp.4 BosqueMicelio de basidiomycete Bosque

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No se puede considerar a las especies de Aspergillus completamente ausentes en los ecosistemas de páramo y es así como en estudios reali-zados sobre microhongos endófitos, Pardo (2001), obtuvo aislamientos de Aspergillus niger y A. fumigatus en hojas de dos especies de Espeletia (E. grandiflora y E. corymbosa) en el páramo de Cruz Verde y en Chisacá. Por su parte, Garces et al., 2005 encontraron Aspergillus niger en hojas muertas (necromasa) de E. grandiflora en el páramo El Granizo, lo que guarda relación con el hecho de encontrarse como endófito en frailejo-nes. En esta misma investigación los autores aislaron Aspergillus niger en muestras de suelo, pero obtenido a partir de la técnica de diluciones, que como ya se ha comprobado favorece el crecimiento de hongos a partir de conidias y esporas y no de micelios activos en el suelo (Gams y Domsch, 1967). Una posible explicación con base a los resultados regis-trados anteriormente, es el provenir el inóculo de Aspergillus a partir de conidias presentes en el aire o el aeroplancton para su posterior desarro-llo en el interior de las plantas como microorganismos endófitos en estos ecosistemas paramunos de alta montaña tropical.

En general las especies de Aspergillus se encuentran corrientemente en suelos en climas cálidos, en compost, en materiales vegetales en des-composición y en granos almacenados; un número alto son osmotole-rantes, característica que puede contrastar con las especies en referencia y las condiciones de suelos distróficos de los páramos.

A. niger presenta una amplia distribución y cepas de esta especie se han aislado de suelos de cultivos que por efecto de la fertilización pre-sentan sales y diversos ecosistemas incluyendo manglares, en los que se aprecia su alta tolerancia a la salinidad. Por su parte, Rodríguez y Rubiano (2003) comprobaron en un aislamiento de A. niger procedente de culti-vos de arroz, alta tolerancia a la presión osmótica elevada, condición que como ya se indicó no es propia de suelos de páramo.

Vera et al. (2002) registraron en la zona cálida en suelos de cultivos de arazá varias especies de Trichoderma con actividad solubilizadora de fos-fatos inorgánicos (Tabla 2), demostrando una potencialidad importante de estos microorganismos, además de su función bien conocida como biocontroladores de hongos patógenos (Papavizas, 1985; Baker, 1989; Garcés et al., 2005). Se constata además que un 20% de las partículas colonizadas por hongos presentaron actividad solubilizadora de fosfatos (de calcio y de hierro), demostrando la importancia que estos microor-ganismos tienen en estos cultivos.

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Tabla 2. Aislamientos de hongos solubilizadores de fosfatos inorgánicos de ecosistemas de zona cálida tropical (Guaviare y Amazonia).

Lugar / aislamiento Observación Referencia Lugar /

aislamiento Observación Referencia

Guaviare200-300 m.s.m.pH: 4.7 texturaArcillo-arenosa

Vera et al.,2002

Amazonia Useche, 2003

Aspergillus aculeatus

Aspergillus niger

Aspergillus flavo-clavatus

Chaetomium sp.

Aspergillus oryzae

Paecilomyces sp.1

Fusarium oxysporum

Paecilomyces sp.2

Fusarium redolens

Paecilomyces sp.3

Gliocladium catenulatum

Paecilomyces sp.4

Gongronella butleri

Penicillium sp.1

Paecilomyces sp.1

Penicillium sp.2

Paecilomyces sp.2

Penicillium sp.3

Paecilomyces sp.3

Penicillium sp.4

Paecilomyces sp.4Penicillium janthinellum

Trichoderma aureoviride

Trichoderma viride

Trichoderma longibrachiatum

Trichoderma sp.1Trichoderma sp.2

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Tabla 3. Bacterias solubilizadoras de fosfatos ailadas de zonas de páramo y Amazonia.

Lugar / aislamiento Procedencia Características Referencia

Nevado Santa Isabel4.520 m.s.n.m.pH 5.5 arenal

Vargas, 2005

Pseudomonas aeruginosa Lupinus alopecoroides

Burkholderia cepacia Arenal

Páramo El Granizo Sanchez et al., 2005

Pseudomonas aeruginosa Espeletia grandiflora*

Enterobacter sp. Espeletia grandiflora*

Pseudomonas sp. Espeletia grandiflora

Bohorquez, 2003

Bacillus sp.

Tipo - Arthrobacter

Amazonia200-300 mpH 4.5-5.1franco arcillosa

Useche, 2003

Pseudomonas sp.

Burkholderia cepacia

Chromobacterium sp.Stenotrophomonas maltophilia

* suelo rizosférico.

Aislamientos de bacterias solubilizadoras de fosfatos

Especies de Pseudomonas se encuentran entre las bacterias solubi-lizadores de fosfatos más representativas, presentes incluso a grandes alturas como lo comprobó Vargas (2005), en el volcán nevado de Santa Isabel en la cordillera central de los Andes a 4.500 msnm. El autor des-taca la importancia de este tipo de bacterias, para la posible explicación de la colonización vegetal en arenales periglaciares, con plantas como la leguminosa Lupinus alopecuroides, que cuenta además con bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno. Así mismo en regiones de páramo y la Amazonia se registraron especies de Pseudomonas, bacterias de gran significancia ecológica en ambientes terrestres, marinos y acuáticos por su gran su versatilidad fisiológica y genética, que les permite tener un

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amplio intervalo de nichos ecológicos (Spiers et al., 2000). La viabilidad de especies de Pseudomonas en bajas y altas temperaturas con capaci-dad de solubilizar fosfatos, indica la existencia de ecotipos adaptados a las condiciones climáticas como las de páramos y selvas amazónicas.

Asociadas a plantas de páramo (Espeletia sp.) se encontraron especies de Bacillus y tipo Arthrobacter (Bohorquez, 2003). Esta última presentó un ciclo de bacilo Gram positivo y coco Gram negativo, semejante al de Arthrobacter, aunque no exclusivo de este solo género; y aunque cons-tituyen una fracción importante de la microflora nativa, su presencia dis-minuye con la acidez del suelo (Jones y Keddie 1992), razón por la que se le considera tipo Arthrobacter.

Bacterias fijadoras biológicas de nitrógeno

Las bacterias fijadoras biológicas de nitrógeno o diazotróficas ayudan a restituir el nitrógeno asimilable del suelo, utilizado por las plantas y microbiota o perdido por lixiviación o desnitrificación (Weaver y Danso, 1994). Estos microorganismos están en todos los ambientes y en sitios de colonización y formación de suelo, ya sea como sistemas simbióticos u organismos de vida libre. Se indican a continuación aislamientos de diazótrofos de algunos ecosistemas y sistemas agrícolas estudiados.

En los suelos de ecosistemas con reacción ácida es común la presen-cia de especies de Azospirillum y Pseudomonas en partes altas y bajas, así como en los cultivos considerados (papa, caña de azúcar panelera y arroz), mientras especies de Azotobacter se presentan en los cultivos de la zona cálida en caña y arroz, con un intervalo de pH ácido a neutro.

CONCLUSIONES

En los ecosistemas de páramo se encontraron diversas especies de mi-croorganismos solubilizadores de fosfatos, factor importante para la nutri-ción de las plantas en suelos con la baja disponibilidad de fósforo. En los hongos aislados de micelios activos, predominan especies de Penicillium y de mucorales en páramos y cultivo de papa y de Paecilomyces y algunas especies de Aspergillus en las zonas cálidas (sabana Guaviare y selva de la amazonía). En los suelos de páramos no se aislaron especies de Aspergi-llus, lo que permite inferir un efecto inhibitorio sobre Aspergillus en estado de micelio activo (o bien una frecuencia extremadamente baja) en estos suelos. En bacterias fijadoras de N2 se aislaron especies de Azospirillum en cultivos (papa en páramo, caña y arroz) y de Azotobacter en caña y arroz

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de zonas cálidas. Aislamientos de Pseudomonas presentaron la distribu-ción más amplia al encontrarse en los páramos y cultivos considerados.

Tabla 4. Aislamientos de bacterias fijadoras biológicas de vida libre obtenidas de ecosistemas y cultivos.

Lugar-Habitat / Aislamiento Procedencia Características Referencia

Páramo El Guerrero 3800 msn.m, pH 3.4-5.4 textura, franco arcillosa

Moratto, 2005

Azospirillum sp. PastizalAzospirillum lipoferum PastizalBeijerinckia indica PastizalDerxia sp. PastizalAzospirillum lipoferum BosqueBeijerinckia sp. BosquePseudomonas saccharophila Bosque

Pseudomonas sp. Cultivo de papaPseudomonas saccharophila Cultivo de papa

Cultivo de caña de azúcar panelera

1460 msnm, pH 7.4 textura, franco

Valero et al., 2000

Azotobacter chroococcum Rizósfera

Azotobacter vinelandiiAzospirillum Beijerinckia sp.

Cultivo de arroz Lérida 400 msnm., pH 5.2-6.1, P= 22-34 ppm

Guerra, 2003

Azotobacter sp. RizósferaAzospirillum sp. Endófito-raíz Azospirillum sp. SueloPseudomonas sp. Suelo

Cultivo de arroz Villa Nueva pH 4.8, Espinal pH 5.8, Saldaña pH 6.0

Valero, 2003

Klebsiella pneumoniae Rizósfera (vega) Villa Nueva (Llanos)Klebsiella sp. Suelo (vega) Villa Nueva (Llanos)Enterobacter kloacae Suelo (vega) Villa Nueva (Llanos)Bacillus sp. Rizósfera(sabana) Villa Nueva (Llanos)Pseudomonas sp. Endófito Villa Nueva (Llanos)Azospirillum sp. Rizósfera sabana Villa Nueva (Llanos)Azospirillum sp. Endófito Villa Nueva (Llanos)Azotobacter sp. Suelo distrito riego Espinal (Tolima)Azotobacter sp. Suelo distrito riego Saldaña (Tolima)Azospirillum sp. Rizósfera Saldaña (Tolima)

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III. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LOS MICROORGANISMOS

i. Biofertilizantes/bioplaguicidas

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EXPERIENCIAS EN EL ESTUDIO DE SISTEMAS Rhizobium-LEGUMINOSA PARA LA

PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTES

EXPERIENCES IN Rhizobium - LEGUMES SYSTEMS STUDIES FOR BIOFERTILIZERS PRODUCTION

AMANDA LOZANO DE YUNDA1

1Profesora Pensionada. Facultad de Ciencias. Departamento de Química.

Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá[email protected]

RESUMEN

El trabajo presenta una síntesis de las experiencias en el estudio de diversos sistemas fijadores simbióticos promisorios para la producción de biofertilizantes en el país. Incluye resultados de investigaciones realizadas durante cerca de 20 años en el área de Química Agrícola del Departamento de Química de la Uni-versidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Reúne resultados sobre interacción microorganismo-hospedero, implementación de métodos de reconocimiento de cepas para estudios de com-petencia, efecto de factores del suelo que afectan la fijación e interacción con micorrizas; con ensayos realizados a nivel de cámara de crecimiento, invernadero y campo. La mayoría de los trabajos fueron realizados por estudiantes de pregrado de la carrera de Química bajo la dirección de la autora, los resultados se presentaron en congresos nacionales de la ciencia del suelo y algunos de ellos se publicaron en las revistas Suelos Ecuato-riales y Revista Colombiana de Química.

Palabras clave: Rhizobium, Bradyrhizobium, leguminosas, biofertilizan-tes.

ABSTRACT

This work presents a synthesis of the experiences in the studies of promising symbiotic nitrogen fixing systems for biofertilizers production in Colombia. It includes research results realized du-ring near 20 years, in the Agricultural Chemistry section of the

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Universidad Nacional de Colombia, Chemistry Department, in Bogotá. The results refer about host-microrganism interactions, implementation of characterization strains methods used for competition studies, effects of fixation soil factors constraints and mycorrhizas interaction. The assays were been made in growing chambers, greenhouse or in the field. Most works were developed by graduate students of Chemistry and the author. The results were presented in national congress of soil science and were published in Suelos Ecuatoriales and Revista Colom-biana de Química.

Key Words: Rhizobium, Bradyrhizobium, legumes, biofertilizers.

INTRODUCCIÓN

La utilización agronómica de los biofertilizantes rizobiales requiere del desarrollo de productos de alta eficiencia en la captación del nitrógeno atmosférico para beneficio de la planta y de su producción, lo cual solo se puede asegurar si se ha realizado un trabajo de investigación pre-via que estudie el comportamiento del sistema medio ambiente-bac-teria–planta de tal manera que se pueda asegurar el comportamiento del producto en las condiciones de su uso. Los estudios tendientes a la producción de inoculantes rizobiales en Colombia, motivados por los efectos ecológicos adversos que se observaron del uso excesivo de fer-tilizantes nitrogenados durante la llamada “revolución verde” fueron ini-ciados en la Universidad Nacional en los años 70, en el departamento de Química, por la profesora Nery Mora de González; quien había cono-cido los sistemas fijadores de nitrógeno en Argentina. En dicho país, el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria INTA producía bacterias radicícolas seleccionadas para inocular semillas de alfalfa y otras legu-minosas desde los años 50. La línea de investigación liderada por la pro-fesora Mora de González, incluyó adicionalmente estudios de aspectos bioquímicos básicos de la interacción Rhizobium-planta dirigidos por el Dr. Gerardo Pérez y se desarrolló durante más de una década con la financiación de la Organización de Estados Americanos OEA y COLCIEN-CIAS, además de los recursos e infraestructura aportados por la misma universidad. Se realizaron varias publicaciones (Ver Bibliografía) presen-taciones en congresos nacionales e internacionales y trabajos de grado y posgrado (incluyendo el de la autora). Este programa fue la semilla para la organización -posteriormente- de un grupo interdisciplinario a nivel de la universidad que propuso la producción de inoculantes rhizobianos

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como proyecto básico del Instituto de Biotecnología IBUN, idea que no recibió acogida para su financiación y condujo al retraso que aun hoy en día se presenta en Colombia en la investigación básica de la utiliza-ción de biofertilizantes rizobiales pero que afortunadamente tiende a subsanarse con las nuevas tendencias de la agricultura sostenible en el país, la inquietud de muchos investigadores de las ciencias agrícolas y las herramientas biotecnológicas actuales que ofrecen resultados mas seguros y a más corto término.

El siguiente es un panorama de los problemas de investigación que surgen en el desarrollo de un buen biofertilizante y los resultados y expe-riencias obtenidas a lo largo del trabajo con diferentes sistemas legumi-nosa-Rhizobium, en los que se contó además con el apoyo financiero y técnico de entidades como el Servicio Nacional de Aprendizaje SENA, la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca CAR y la Corporación de Investigación Agrícola CORPOICA.

INTERACCIÓN MICROORGANISMO-HOSPEDERO

La selección de cepas nativas o foráneas altamente eficientes en la fijación de nitrógeno con la leguminosa de interés es una etapa previa esencial en los programas de desarrollo de inoculantes rizobiales pues-to que con frecuencia se encuentra en la naturaleza interacción cepa/ variedad de la planta, que puede llevar a fracasos en la utilización de la tecnología por los agricultores. Los experimentos pueden ser realizados en una cámara de crecimiento o invernadero sobre sustrato estéril (are-na cuarcítica, vermiculita, perlita, agar, etc). Las bacterias nativas pueden ser aisladas de plantas de las zonas de producción y las foráneas soli-citadas a ceparios nacionales o internacionales (Universidad de Hawaii proyecto NifTAL, Departamento de Agricultura de los estados Unidos USDA, Empresa Brasileira de de Pesquisa Agropecuaria, EMBRAPA, Uni-versidad Autónoma de México-Departamento de Genética Molecular CFN-UNAM entre otros). Se pueden utilizar diferentes parámetros de evaluación según el nivel del ensayo y su objetivo, entre otros: produc-ción de grano, rendimiento de materia seca o verde foliar y de toda la planta antes de la floración, nitrógeno total, número y peso de nódulos, actividad de nitrogenasa, contenido de clorofila, etc. Los ensayos deben incluir un testigo sin inocular y un control con fertilización química que permitan comparar los efectos de la inoculación. La selección se puede realizar con la aplicación de un análisis de varianza y de comparación de medias adecuado.

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Las leguminosas se pueden clasificar en tres grupos de acuerdo con su interacción con las cepas de Rhizobium. El primer grupo lo conforman leguminosas que forman una simbiosis efectiva con un gran número de cepas y son noduladas por Bradyrhizobium o R. sp. “cowpea”, son muy abundantes en las zonas tropicales y por lo tanto su respuesta a la inocu-lación es muy baja. Un ejemplo de este caso son los resultados de Vera (1993) en un suelo del municipio de Girardot (Cundinamarca) quien encontró una población abundante de Bradyrhizobium que infecta tres variedades y 4 líneas de cowpea, cuya actividad fijadora se incrementa con la aplicación de una fertilización básica con P y K. Sin embargo, en algunos casos, leguminosas de este grupo pueden mostrar alguna es-pecificidad en la asociación formada, como es el caso del experimen-to realizado en un suelo de Guataquí (Cundinamarca) en donde existe una población nativa de Bradyrhizobium que infecta maní (Arachis hy-pogaea) y guandul (Cajanus cajan) pero la mejor efectividad simbiótica se presentó con cepas introducidas seleccionadas (Lozano et al., 1991). El segundo grupo está formado por leguminosas muy específicas en la interacción con cepas de Rhizobium, en estos casos se presenta general-mente muy buena respuesta a la inoculación con cepas seleccionadas. El tercer grupo intermedio esta formado por leguminosas que nodulan con muchas cepas de Rhizobium pero fijan efectivamente solo con algunas de ellas; en este caso la inoculación puede fallar si la cepa introducida es poco competitiva con las cepas nativas; se presenta con frecuencia en nuestro medio y se puede ilustrar con los resultados de Barrera y Lozano (1988) con arveja (Pisum sativum) ,Ballesteros y Lozano (1994), Reyes (1994) con fríjol (Phaseolus vulgaris), Alarcón (1997), Layton et al. (1999) con Acacia decurrens y retamo (Teline monspesulana) quienes encon-traron respuestas diversas a la inoculación con cepas seleccionadas de Rhizobium.

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS

Uno de los obstáculos de la eficiencia de los biofertilizantes es la com-petencia con los organismos nativos, esto ha sido extensamente demos-trado y es un problema muy complejo ya que dicha población afecta la magnitud de la respuesta del inoculante principalmente en el caso de las leguminosas del tercer grupo. Una cepa eficiente introducida debe ser por tanto competitiva por los sitios de infección frente a la población nativa, menos eficiente. Por lo tanto, es necesario que las cepas seleccio-nadas puedan diferenciarse a nivel bioquímico o molecular, de tal ma-

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nera que su presencia en los nódulos de las plantas inoculadas y por lo tanto su competitividad, pueda ser comprobada. Algunas ejemplos con las técnicas utilizadas en estos estudios son:

a) caracterización fenotípica con la ayuda de programas estadísticos como dendrogramas utilizada por Alarcón et al. (1997) con aislamien-tos de Acacia y retamo.

b) serológica, con técnicas como inmunodifusión utilizada por Barrera y Lozano (1991) con cepas que nodulan arveja y Reyes (1994) con ce-pas para fríjol, ELISA estandarizada y utilizada por Triviños (1994) con Rhizobium leguminosarum biovar viceae.

c) perfil de resistencia intrínseca a antibióticos que fue aplicada a nivel de invernadero por Vera (1993) en ensayos con maní.

d) patrones electroforéticos aplicados en el trabajo de Barrera y Lozano (1991).

e) perfiles de plásmidos utilizados por Reyes (1994) con cepas que no-dulan fríjol quien después de la comparación de dichas metodologías concluyó que el método mas discriminante es éste ultimo, seguido de la resistencia intrínseca a antibióticos y en menor grado la serología.

Actualmente la biología molecular permite una identificación más segura utilizando por ejemplo patrones de restricción y tipificación de secuencias de inserción, sin embargo su utilización requiere de mayor costo e infraestructura.

FACTORES LIMITANTES

Para que una leguminosa fije nitrógeno eficientemente se necesita además de una buena compatibilidad con el simbionte, de unas condi-ciones ambientales (luz, temperatura, humedad) adecuadas que asegu-ren un óptimo crecimiento de la planta. Además, la adecuada nutrición de ésta cumple un papel muy importante en el funcionamiento del sistema. Dado que la planta obtiene los demás nutrientes del suelo, las condicio-nes de éste se convierten en muchos casos en un limitante importante de la efectividad de la simbiosis. Los suelos de Colombia presentan con mucha frecuencia pH ácido, presencia de toxicidad por Al, baja disponi-bilidad de P y de otros elementos como Mo y B indispensables para la actividad de la dinitrogenasa, enzima que realiza la reducción del nitró-

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geno elemental a la forma amoniacal en el interior del nódulo. Los traba-jos realizados con diferentes asociaciones en suelos con la problemática señalada permiten concluir que es necesario asegurar la corrección de las deficiencias del suelo para asegurar los buenos resultados de la ino-culación. A manera de ejemplo, los resultados de González et al. (1984) demuestran la necesidad de un suministro adecuado de fósforo para lograr la efectividad de la fijación de nitrógeno por la simbiosis del trébol blanco (Trifolium repens) en un suelo de Mosquera (Cundinamarca); resultados similares fueron encontrados por Vera (1993) con cowpea y Puentes (1992) con maní (Arachis hypogaea) en suelos del Alto Mag-dalena. La práctica del encalado, por tanto, al neutralizar el aluminio dis-ponible y aumentar la disponibilidad de fósforo en suelos ácidos, puede conducir a mejorar la eficiencia de la fijación de nitrógeno (González y Lozano, 1982).

En los trabajos mencionados también se comprobaron las consecuen-cias de la aplicación de fertilización nitrogenada adicional, la cual puede llegar a inhibir completamente la nodulación y por ende la fijación de nitrógeno. A nivel práctico, ya que en ocasiones es necesario agregar en suelos poco fértiles algo de nitrógeno para asegurar el crecimiento inicial de la planta, se recomienda inocular con cepas resistentes a contenidos bajos de nitrógeno en el suelo. El trabajo de Lozano y González (1981) ilustra el efecto combinado de la aplicación de molibdeno y nitrógeno encontrando la mayor actividad fijadora del trébol (Trifolium repens) con la aplicación de 750 g/ha de molibdato de amonio y sin nitrógeno adi-cional.

INTERACCIÓN CON MICORRIZAS ARBUSCULARES (MA)

Dado que la efectividad de la fijación de nitrógeno está limitada por el suministro de fósforo, las MA cuya presencia permite una mayor área de exploración de las raíces de las plantas y particularmente contribuyen en la absorción y transporte de fosfatos hacia la planta, constituye un complemento natural para la efectividad de la simbiosis. Rodríguez et al. (1993) encontraron que no es necesario introducir Acaulospora appen-dicula en un Andisol de la sabana de Bogotá para mejorar el suministro de fósforo para el funcionamiento de la simbiosis alfalfa (Medicago sa-tiva L.)-Rhizobium meliloti puesto que las micorrizas nativas presentes en el suelo y la aplicación de roca fosfórica suplieron las necesidades del sistema fijador. En un experimento realizado por Layton et al. (1999) en las instalaciones del vivero Tisquesusa de la CAR en Madrid (Cundi-

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namarca) con acacia y retamo se encontró que la inoculación doble con un producto comercial a base MA (Glomus fasciculatum) y Rhizobium no mejoró la fijación de la acacia mientras que en el retamo se presentó efecto positivo con una de las cepas de Rhizobium aislada de la mis-ma especie. Estos resultados merecen comprobaciones a nivel de otros sistemas fijadores, en las condiciones de los suelos de Colombia, dado que la literatura aporta numerosos ejemplos de aplicaciones exitosas de la inoculación dual; sin embargo su práctica requiere de un conoci-miento de cada uno de los componentes de la asociación y del medio ambiente.

COMENTARIOS

A pesar del conocimiento actual sobre los sistemas fijadores y de los desarrollos de la biología molecular que hacen posible alterar la compo-sición genética de los organismos vivos y darles atributos deseados por el hombre, la falta de entendimiento de cómo estos organismos interac-túan con y dentro de sus ambientes hace difícil modelarlos a la orden. Un ejemplo de ello son los esfuerzos que se han realizado a nivel mundial en los últimos años para inducir la modificación de las raíces de cereales como maíz y trigo con el fin de que se desarrollen estructuras semejan-tes a los nódulos de las leguminosas que puedan albergar la población bacterial y el ambiente necesario para que ocurra la fijación de nitrógeno como en las leguminosas y que sin embargo están aun lejos de ser com-pletamente exitosos. (Azam, 2002). Los resultados aportados por los tra-bajos reseñados aquí muestran que su efectividad esta muy afectada por la interacción hospedero-planta y las condiciones ambientales locales, lo cual estimula la investigación del funcionamiento de estos sistemas en nuestras condiciones tropicales.

En Colombia, se requiere por tanto de una política agrícola que esti-mule la utilización de la fijación de nitrógeno, basada en un conocimien-to de la problemática ecológica local con respecto a las restricciones de la eficiencia en los diferentes ambientes y que desarrolle biofertilizantes eficaces y controlados para que los agricultores los utilicen en mayor proporción como en otros países de Latinoamérica. El reto para los inves-tigadores es cubrir las deficiencias de conocimiento de nuestros sistemas para que a nivel práctico se pueda explotar más eficientemente la fijación de nitrógeno que en algunos casos puede estar funcionando de manera natural pero que debe ser optimizada para beneficio de los agricultores, los consumidores y el ecosistema.

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CONCLUSIÓN

La fijación de nitrógeno es un excelente ejemplo en el que la investi-gación básica puede contribuir a muy corto término en el bienestar de la comunidad. La experiencia acumulada de los trabajos realizados con los diferentes sistemas fijadores de nitrógeno con leguminosas aquí re-señados son un ejemplo para que las nuevas generaciones propongan trabajos enfocados a la producción de biofertilizantes eficientes en los diferentes ecosistemas productivos del país y tengan en cuenta todos los factores que afectan el proceso con el fin de optimizarlo y generar la confianza de los agricultores en la utilización de ésta tecnología.

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PRUEBAS PRELIMINARES PARA PRODUCCIÓN POR FERMENTACIÓN DE NEMATODOS

ENTOMOPATÓGENOS

PRELIMINARY TESTS FOR FERMENTATION PRODUCTION OF ENTOMOPATHOGENIC NEMATODES

OSCAR J. MARTÍNEZ1

1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Los nematodos entomopatógenos (géneros Steinernema y Heterorhabditis) son utilizados como un agente promisorio de control biológico, debido a que matan insectos con ayuda de una bacteria mutualista. La asociación nematodo-bacteria es producida en masa para su uso como biopesticida empleando métodos in vivo e in vitro. La producción in vivo que involucra la cría del nematodo dentro del insecto huésped, presenta baja tecnología y bajos costos y da como resultado nematodos de alta calidad. Los métodos in vitro, que pueden ser en cultivo sólido o líquido, ofrecen otras posibilidades para la producción masiva de nematodos. El método sólido ofrece un nivel de tec-nología algo mayor que el método in vivo aunque puede ser mejorado por mecanismos de automatización. El cultivo líquido es el método comparativamente más eficiente y a más bajo costo, pero requiere una gran inversión de arranque y la calidad de los nematodos producidos puede disminuir. Este método puede ser optimizado mediante un progreso en el desarrollo del medio con pruebas preliminares, recuperación del nemato-do y diseño del biorreactor.

Palabras clave: Nematodos entomopatógenos, control biológico, bio-pesticidas.

ABSTRACT

Entomopathogenic nematodes (genera Steinernema and He-terorhabditis) are employed as powerful weapons in biological

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control, due their ability to kill insects with the aid of mutualistic bacteria. The nematode – bacteria complex is mass produced for use as biopesticides using In vivo or in vitro methods. In vivo production (culture in live insect hosts) is low technology, has low startup costs, and resulting nematode quality is high. In vitro methods, solid or liquid culture, offer other chances for nematode mass production. Solid culture presents an interme-diate level of technology and costs, although it can be improved by automatization means. Liquid culture is the most relatively low cost-efficient method but requires large startup cost and nematode quality may be reduced. Liquid culture may be im-proved through progress in media development by preliminary tests, nematode recovery, and bioreactor design.

Keywords: Entomopathogenic nematodes, biological control, biopesti-cides.

INTRODUCCIÓN

Desde hace aproximadamente dos décadas, se ha incrementado el interés en el uso de nematodos para controlar eficazmente una am-plia variedad de plagas económicamente importantes para la agricul-tura. Un amplio rango de insectos del suelo, que incluyen la mayoría de sus órdenes (Poinar, 1990), pueden ser controlados de manera efectiva por nematodos entomopatógenos (NE) básicamente de dos géneros: Steinernema y Heterorhabditis. (Young et al., 1998). Dentro de estos dos géneros se incluyen la mayor cantidad de especies entomopatógenas que han sido detectadas en numerosas regiones de todo el mundo (Wo-odring y Kaya, 1988; Wrigth y Patel, 1996). Como ejemplo de la alta especificidad, los steinernematodos se encuentran asociados con bac-terias del género Xenorhabdus, mientras que los heterorhabditidos esta asociados con Photorhabdus.

Los NE poseen una característica altamente patogénica de una elevada especialización debido a que han desarrollado la capacidad de transpor-tar en su intestino, introducir y liberar en el interior del insecto una bac-teria simbionte, la cual se reproduce dentro del hospedero causándole una septicemia letal (Boemare y Akhurst, 1988). El juvenil infectivo (JI) de estos nematodos, es el único estado que se encuentra libre en el suelo; de esta manera, los NEs entran en el hospedero por medio de cu-alquier abertura natural como boca, ano, espiráculos y ocasionalmente a

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través de la cutícula del insecto usando medios mecánicos y enzimáticos. Una vez dentro del insecto, el nematodo lanza la bacteria al hemocele, donde ésta prolifera, mata al insecto y establece las condiciones apro-piadas para la reproducción del nematodo proveyéndolo de nutrientes, produciendo antibióticos y toxinas que inhiben microbios competitivos, todo esto dentro de 24 a 72 horas (Smigielski et al., 1993). Los nemato-dos pueden permanecer de una a tres generaciones dentro del cadáver, luego de lo cual los JIs migran para encontrar nuevos huéspedes (Poinar, 1990).

El éxito de la implementación de NEs en el control de insectos plaga se debe en gran medida, al desarrollo de métodos de producción in vitro, los cuales reducen el alto costo de trabajo que involucra los métodos de producción in vivo (Friedman, 1990; Ehlers, 2000). Los NE pueden ser reproducidos masivamente en medios sólidos o líquidos (Poinar, 1990). Los avances en la tecnología de cultivo, han permitido desarrollar méto-dos de producción a escala comercial básicamente produciendo JIs en cultivo líquido sumergido en fermentadores tipo airlift. La investigación en el cultivo líquido de nematodos se ha enfocado en mejorar la tasa de producción, calidad y costos; lo cual puede ser logrado optimizando las condiciones del medio y del cultivo como tal. Para tal fin, se han estu-diado los nutrientes esenciales para el cultivo de nematodos, tales como proteínas (Buecher et al., 1970), lípidos (Hatab y Gaugler 1999) y factores de crecimiento (Hieb y Rothstein 1968; Vanfleteren, 1974); además de las condiciones de cultivo como temperatura, inóculo y tasa de aireación. El proceso de cultivo líquido in vitro puede ser separado en dos fases: la de la bacteria simbionte y la del nematodo (Gil et al., 2002).

COLECCIÓN Y REPRODUCCIÓN

Actualmente son conocidas dos formas fundamentales de colectar NE: en el suelo, a través de técnicas de flotación, decantación o extracción húmeda y mediante la colecta por medio de hospedantes infestados naturalmente o con insectos trampa. La implementación local de estos nematodos en suelo, hace necesaria la colección y el aislamiento de cepas nativas, lo cual asegura que las condiciones del medio no serán desfavorables para su establecimiento y patogenicidad. En el método de trampeo se emplean insectos altamente susceptibles, como Galleria mellonella en el último instar, a fin de concentrar los nematodos del am-biente natural, aprovechando la capacidad de búsqueda del hospedante que tienen. Según Bedding y Akhurst (1975) la toma de muestras se

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realiza tomando suelo del hábitat en cuestión a 10-15 cm de profundi-dad. El suelo, que debe estar húmedo, se coloca en placas de Petri en cuyo fondo se depositan larvas de G. mellonella. Las placas se incuban revisando diariamente aquellas que posean síntomas de infección. La infección con Heterorhabditis se evidencia con una tonalidad carmelita rojiza, mientras que las infectadas con Steinernema poseen una tonali-dad carmelita claro. Las larvas con síntomas se lavan cuidadosamente y se ponen en trampas White (White, 1927) y se realizan disecciones para comprobar si están presentes los nematodos. Los nematodos detectados deben ser identificados por especialistas.

MÉTODOS DE REPRODUCCIÓN

Los métodos in vivo son más apropiados para mantenimiento de cepas y producción de juveniles infectivos para ensayos de laboratorio y de campo a pequeña escala. Para las producciones a gran escala, los métodos in vitro son más prácticos. Los steinernemátidos tienen mejores cualidades para almacenamiento. La producción in vivo de grandes can-tidades de heterorhabditidos en un intervalo de tiempo corto para evitar largos periodos de almacenamiento, puede ser un proceso difícil.

PRODUCCIÓN IN VIVO

Para este tipo de producción se utiliza frecuentemente la lepidóptera G. mellonella por ser de fácil adquisición, con probabilidades de ser criada con pocos recursos y ser un hospedante muy susceptible. La producción promedio de juveniles infectivos por larva de insecto es entre 30 y 50000 con los métodos tradicionales. El método básico tiene tres partes:

• Infección de Galleria (Bedding y Akhurst, 1975): Consiste en dejar la suspensión de los juveniles acondicionarse a la temperatura del am-biente local y cerciorarse de que están vivos. La suspensión debe estar cerca de 200 nematodos/mL. Cuidadosamente se distribuye esta sus-pensión en papel de filtro dentro de una placa de Petri y se añaden larvas de G. mellonella para lograr aproximadamente 20 nematodos/larva (muchos nematodos producen poca progenie por competición o contaminación). Este recipiente puede mantenerse en una bolsa plás-tica para mantener la humedad. Las larvas infectadas se deben poner en trampas a los 5-7 días para luego cosechar, teniendo cuidado de no tomar aquellas con apariencia y olor putrefacto para no contaminar la producción completa.

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• Cosecha. Las trampas se preparan usando placas y papel de filtro es-terilizados en autoclave. Se deposita agua destilada estéril en la pla-ca y se pone sobre otro recipiente más pequeño o vidrio de reloj el papel de filtro, de forma que tome contacto con la superficie líquida. Se colocan las larvas típicamente infectadas en el papel de filtro. A los 10-12 días comenzarán a salir los juveniles hacia el agua y esto puede suceder durante 3-4 días más, cuando esta actividad empieza a decaer. Para cosechar, se quita el recipiente con las larvas, se recogen los nematodos en un Beaker y se añade nuevamente agua destilada estéril a la placa antes de reponer el recipiente con las larvas.

• Almacenamiento. Deben quitarse todos los tejidos y estadios no infec-tivos presentes a través de filtrados y sucesivas decantaciones. Pueden almacenarse en agua destilada con formalina 0,1 % (si hay contamina-ciones recurrentes) o con algún agente humectante para evitar que se peguen a los bordes del recipiente. Si no hay aireación, pueden con-centrarse en recipientes con no más de 10000 - 20000 nematodos/mL con una altura de agua menor a 1 cm. Los steinernemátidos pueden almacenarse a 4-10ºC de 6-12 meses, pero los heterorhabditidos sólo pueden llegar a 2-4 meses con la misma temperatura.

PRODUCCIÓN IN VITRO

Obtención de un cultivo axénico de la bacteria simbionte. La bac-teria simbionte se obtiene aislándola de la hemolinfa de G. mellonella de ultimo instar infectada con NEs según la metodología descrita por Akhurst (1980). Los aislamientos se caracterizan en medio NBTA (Agar nutritivo + 0,0025% azul de bromothimol + 0,004% de cloruro de trife-niltetrazolio) y en agar McConkey, medios que permiten evidenciar las dos formas de las bacterias asociadas. La ocurrencia de las dos formas ha mostrado ser característica del genero Xenorhabdus (Boemare y Akhurst, 1988). La primera forma o fase I está definida como la que es transpor-tada dentro del nematodo infectivo. Esta forma es inestable y da lugar a la segunda forma que puede subsecuentemente revertirse. Estas formas, que difieren en su efecto sobre la reproducción del nematodo in vivo e in vitro, se distinguen gracias a su pigmentación diferencial, la adsorción del azul de bromotimol en agar y en medio líquido (Akhurst, 1987; Parada et al., 2005) y a su actividad antimicrobial. Para establecer el inóculo de bacterias que se debe emplear en las fermentaciones, se requiere de la realización de cinéticas de crecimiento; de esta forma se puede estimar la concentración de bacterias en un tiempo determinado de incubación

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y analizar su influencia sobre la fermentación y la duración de las fases de crecimiento.

Selección del medio de cultivo. El medio de cultivo debe cumplir con requisitos nutricionales que satisfagan las necesidades tanto de la bac-teria como del nematodo. La composición nutricional del medio es un componente importante en la producción de JIs y puede determinar su producción final en la fermentación (Friedman, 1990). Una composición que no sea óptima dará lugar a una baja producción de bacteria que re-sultará en una pobre calidad del nematodo, tanto en patogenicidad como en reducida estabilidad de almacenamiento (Hatab y Gaugler, 2001). La selección del medio involucra variables biológicas, bioquímicas (Hatab y Gaugler, 2001), fisicoquímicas y operacionales en la optimización de la calidad y producción. Sin embargo, una buena aproximación consiste en realizar cinéticas de crecimiento de la bacteria asociada para conocer su comportamiento a lo largo de un periodo de fermentación aprovechable para el nematodo. Dicha cinética aporta información vital debido a que las dos fases de la bacteria presentan una correspondencia con las fases de crecimiento bacteriano, la fase I se presenta en el periodo de creci-miento exponencial mientras que la fase II esta adjudicada al crecimiento estacionario. Dado que la fase I es donde se produce la mayor actividad bacteriana en cuanto a metabolitos como toxinas y antibióticos (Boema-re y Akhurst, 1988; Martínez et al., 2005), es de esperar que en un buen medio de cultivo se presente un mayor crecimiento en esta fase, que el tiempo de duración se alargue al máximo posible y que sus componen-tes no limiten la producción enzimática y antibiótica. Por tanto, durante la selección del medio de cultivo es necesario realizar pruebas de anti-biosis y antagonismo de la bacteria simbionte, producción de enzimas y aprovechamiento de nutrientes disueltos en el medio. También es nece-sario un análisis de extractos que permita conocer la actividad bacteriana durante la fermentación.

Un aspecto que se debe resaltar en la composición del medio de cul-tivo es el suplemento de aceites de origen vegetal, del cual depende el crecimiento del nematodo en el medio. (Hatab y Gaugler, 2001). Se ha reportado que en medios suplementados con aceite de maíz y aceite de hígado de bacalao aumenta la proporción de ácidos grasos poliinsatura-dos, los cuales pueden incrementar la fluidez de las membranas de los NEs (Fodor et al., 1994 citado por Hatab y Gaugler, 2001). Los NEs que poseen un incremento en la fluidez de la membrana pueden ser menos

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activos en sus condiciones normales y a temperaturas elevadas y de esta manera, menos efectivos como agentes de control biológico (Hatab y Gaugler, 2001).

Establecimiento del cultivo monoxenico. El cultivo monoxenico del nematodo y la bacteria se ha establecido en cajas de agar lípido como se describe por Lunau et al. (1993). Las hembras grávidas o hermafroditas, son colectadas de disecciones de G. mellonella de ultimo instar luego de 3 a 7 días de infestación. Los huevos son extraídos de los nematodos mediante lisis alcalina usando NaOH 0,4 M (Gil et al., 2002) y puestos en las cajas de Petri con agar lípido por dos días. Luego de 6 a 7 días de incubación a 25°C, los nematodos son transferidos a Erlenmeyers con cultivos axénicos de la bacteria simbionte de 2 días de fermentación y se cultivan por 2 a 3 semanas hasta alcanzar la concentración de nemato-dos deseada.

Cultivo sólido. La producción en cultivo sólido surgió como una ne-cesidad de hacer más económica y productiva la obtención de los ne-matodos. Los factores importantes son: la necesidad que el cultivo sea monoxénico (donde los nematodos y su bacteria asociada sean los úni-cos agentes bióticos), el uso de la forma primaria de la bacteria, una su-perficie grande para que los nematodos puedan crecer en biomasa, una fuente de esterol y una base alimentaria para las bacterias que depende del medio de cultivo seleccionado.

El método más famoso es el de Beeding (1986) que utiliza medio de homogenados de vísceras de aves, placas de polimetano para material de adecuada superficie y frascos grandes de vidrio o bolsas que pueden ser procesadas en autoclave para contenedores. El proceso puede ser semiautomatizado, aunque sus críticos le señalan problemas en su esta-bilidad de producción, por la consistencia de los materiales usados y su fácil contaminación.

Las ventajas del cultivo sólido in vitro reposan en que este método es un intermediario entre la cría in vivo y el cultivo en medio líquido. El nivel de capital requerido para comenzar y el nivel de experiencia para este proceso caen en un intermedio entre esos dos procesos. El escalamiento para producción puede ser limitado por diferentes factores, como espa-cio (tamaño del autoclave) o contaminación. Se ha reportado que la pro-ducción masiva de nematodos usando métodos sólidos in vitro facilita en gran medida la calidad de los nematodos producidos en comparación

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con los métodos in vivo (Shapiro y Gaugler, 2002). Sin embargo, Yang et al. (1997) reportaron una reducción en la calidad de Steinernema car-pocapsae producida en cultivo sólido en comparación con el proceso in vivo.

La producción de nematodos en cultivo sólido no ha tenido un au-mento substancial en las últimas décadas debido a que sin una sofis-ticada automatización, estos métodos no ofrecen ventajas en cuanto a eficiencia relativa de costos comparado con la producción in vivo.

Cultivo líquido o fermentación. Este método tiene la mayor actua-lización en la producción por fermentaciones líquidas usando cultivos monoxénicos de nematodos y es el foco principal de atención de la pro-ducción comercial a gran escala. Tiene muchos aspectos positivos, aun-que por ser objeto de patentes de las firmas comerciales, la información está restringida. Son de escalado fácil, confiables, se emplean materiales estables y uniformes; sin embargo se conoce que con los steinernema-tidos está más adelantada su producción y se producen corrientemente, incluso en fermentadores de 80000 litros. El tiempo de cultivo está in-versamente relacionado con la temperatura y debe ser optimizado para una máxima producción de cepas base. El incremento del tamaño del inóculo del nematodo puede incrementar su tasa de crecimiento y dis-minuir el tiempo de cultivo (Shapiro y Gaugler, 2002). Cultivos más du-raderos pueden proveer altas producciones, sin embargo, la mortalidad puede incrementarse con el tiempo, así que se debe sopesar el tiempo de cultivo contra el costo de espacio. En procesos de una generación, esto se puede lograr incrementando la densidad del inóculo (Ehlers et al., 1998).

A pesar que los steinernematidos y heterorhabditidos toleran básica-mente una adecuada aireación, las estrategias para maximizar la pro-ducción de estos dos géneros en cultivo líquido divergen debido a sus diferencias en ciclo de vida y biología reproductiva. Además de la ai-reación, la optimización en la producción depende del grado de recu-peración de JIs. Recuperación es un término empleado que describe el paso del desarrollo en que los JIs mudan para iniciar el crecimiento. La recuperación es iniciada por un proceso señal aparentemente mediado por la comida y puede ser afectado positivamente por un incremento en los niveles de aireación, CO2 y contenido de lípidos en el medio, sin embargo, puede ser afectado negativamente por incrementos en la temperatura.

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En las fermentaciones se realizan dos procesos simultáneos, la produc-ción de nematodos y el desarrollo de la bacteria asociada, que se ino-cula en un momento dado del desarrollo de la fermentación. Se utilizan homogenados de riñones y extractos de levadura o medios conteniendo harina de soya, extracto de levadura, aceite de maíz y yema de huevo, los cuales llegan a producir rendimientos tan altos como 100000 juveniles/mL. Como resultado del progreso tecnológico y los distintos procesos in-volucrados en la aplicación, el costo de los tratamientos por nematodos oscila entre 50 y 400 dólares/ha (depende de la dosis e incluso del mer-cado), aunque el mejoramiento de la técnica a gran escala hace pensar en una disminución.

Estudios recientes han analizado las propiedades óptimas requeri-das para el aprovechamiento del cultivo en fermentadores tipo airlift. Young et al, (1998) analizaron diferentes propiedades para la produc-ción de nematodos, entre ellas la composición tanto biológica como de nutrientes y detritos del medio con fines de separación por méto-dos físicos. La viscosidad, el tamaño de partícula, la densidad y la ve-locidad fueron medidos para construir un diseño basado en la precisa caracterización del material a ser separado. En cuanto a producción de JIs, Ehlers et al. (2000) reportan 457000 JIs mL.-1 como el mayor valor reportado hasta el momento en cultivo líquido de nematodos entomo-patógenos con Heterorhabditis indica, lo que comparado con sistemas de cultivo sólido parece tener una superior capacidad de producción y calidad.

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EFECTO DE LA BACTERIA Azotobacter sp. SOBRE EL DESARROLLO VEGETATIVO Y

RENDIMIENTO EN LA PRODUCCIÓN DE FLOR EN PLANTAS DE CLAVEL (Dianthus sp.) Y POMPÓN (Dendranthema grandiflora)

FUNDASES. Fundación de Asesorías para el Sector [email protected]

RESUMEN

En dos cultivos (clavel y pompón) de la Sabana de Bogotá se realizó esta investigación con el fin de probar el efecto sobre plantas y producción de flores de un biofertilizante formado por diferentes cepas de Azotobacter sp. (bacteria de vida libre, fijadora de nitrógeno atmosférico y productora de sustancias estimuladoras del crecimiento). Se manejaron tres niveles de fertilización nitrogenada: 100, 50 y 30 por ciento y dos mezclas de cepas de Azotobacter. El análisis estadístico no mostró dife-rencias significativas entre los diversos tratamientos en el desa-rrollo vegetativo, producción de ramos y calidad de flor, aunque este trabajo sugiere que el tratamiento con estos microorganis-mos puede representar beneficios económicos y ambientales prometedores.

Palabras clave: Biofertilizantes, plantas ornamentales, Azotobacter sp.

ABSTRACT

In two cultures (carnations and pompón) of Bogota´s Savannah was developed this investigation with the purpose of proving the effect on plants and flowers production of a biofertilizante composed by different strains of Azotobacter sp. (Free living bacteria, nitrogen atmospheric fixer and growth prometed substances producer). Three levels of nitrogen fertilization were handled: 100, 50 and 30 percents and two mixtures of strain of Azotobacter. The statistical analysis did not show significant differences between the diverse treatments in the vegetative development, production of branches and quality of flower, nevertheless, this work sugests that Azotobacter sp. inoculation

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can represent very promising economic and environmental benefits.

Key words: Ornamental plants, Biofertilizers, Azotobacter sp.

INTRODUCCIÓN

El tema de los biofertilizantes en Colombia ha incrementado su im-portancia por dos razones principales: primera, el costo de los fertili-zantes químicos se incrementa constantemente y segunda, la toma de conciencia ecológica por parte de las personas vinculadas a la actividad florícola que hace que se busquen soluciones ecológicas a problemas concretos. Esta investigación combina el uso de los fertilizantes químicos nitrogenados en diferentes dosis con la aplicación de un biofertilizante constituido por una rizobacteria, Azotobacter sp., de vida libre y fijadora de di-nitrógeno atmosférico que además sintetiza sustancias estimulado-ras de crecimiento. Se escogieron dos cultivos diferentes que permitieron obtener resultados en un corto plazo: pompón (Dendranthema grandi-flora) y clavel (Dianthus sp.) en primer pico de cosecha. El manejo de las plantas durante la investigación se siguió según lo establecido en el cultivo, variando únicamente las dosis de fertilizantes químicos y las apli-caciones de los biofertilizantes. Se determinó que el uso de Azotobacter en enraizamiento resulta más eficiente en la última etapa del proceso cuando las plántulas ya tienen raicillas. Los resultados demuestran que tanto en clavel como en pompón la aplicación de Azotobacter sp., tiene efecto positivo en crecimiento y producción. Así mismo, su aplicación es compatible con la fertilización nitrogenada.


Materiales

Material VegetalPompón (Dendranthema grandiflora), variedad Vero (blanco margari-

ta), que tiene un ciclo total de 3 meses y Clavel (Dianthus sp.) variedad Nelson.

Localización

El ensayo de pompón se realizó en los invernaderos de Jardines de los Andes, localizados en el municipio de Madrid, departamento de Cundina-marca, a una altura de 2550 m.s.n.m. y una temperatura promedio anual

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de 14,7°C. El ensayo de clavel se montó en Colibrí Flowers, localizado en el municipio de Facatativa, departamento de Cundinamarca a una altura de 2600 m.s.n.m. y una temperatura promedio anual de 12,4°C.

Inoculo bacteriano

Se evaluaron seis cepas nativas de Azotobacter sp. que fueron suminis-tradas para la investigación por el laboratorio de FUNDASES. Se confor-maron dos biofertilizantes, cada uno de ellos con tres cepas, las cuales se fermentaron de manera independiente en medio Ashby y se mezclaron al momento de la inoculación. La población estimada fue de 1 * 108 uni-dades formadoras de colonias / mL de cada inoculo. Con los dos biopre-parados y tres dosis diferentes de fertilizantes nitrogenados se montaron 6 tratamientos (Tabla 1).

Distribución en el invernadero

Pompón: Las 6 camas escogidas para pompón se dividieron en rec-tángulos. Se eliminaron los dos de los extremos, tomando finalmente para el ensayo 3 rectángulos por cama. De esta manera quedó uno libre entre cada tratamiento. Se tomaron 3 réplicas por cada tratamiento. Para manejar el riego con fertilización nitrogenada, que va al suelo por man-gueras de goteo, se taparon las salidas de los tratamientos 4, 5 y 6. Cada vez que se requería, estos rectángulos se fertilizaron manualmente con regadera.

Tabla 1. Conformación de los 6 tratamientos en pompón y clavel.

FERTILIZACIÓN NITROGENADA BIOPREPARADO

1 Tradicional = 100% Sin biopreparado

2 Tradicional = 100% No. 1

3 Tradicional = 100% No. 2

4 La mitad = 50% No. 1

5 La mitad = 50% No. 2

6Sin nada = 0% en pompón30% en clavel

No. 1 + No. 2

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Clavel: La distribución de los tratamientos y sus réplicas en clavel se diferenció de la de pompón solamente porque aquí se utilizó para cada réplica una cama completa. Para efectos del riego fertilizado con la fór-mula al 50 y 30% se colocó una tubería paralela a la del invernadero que salía de un tanque donde se prepararon las dos fórmulas. Esta tubería se abrió en las camas con tratamientos 4, 5 y 6. Los otros tratamientos (1, 2, 3) se regaron con la fórmula que lleva normalmente la tubería del cultivo.

Parámetros de cosecha

Ocho días antes de la cosecha en pompón se tomaron las muestras para peso fresco y peso seco total, (15 plantas por tratamiento). Los análisis de suelos, medidas de pH, conductividad eléctrica y pruebas de florero se realizaron mediante el método Kjeldahl (IGAC, 1990).

Análisis estadístico

Todos los datos fueron analizados con el programa SPSS versión 7.5 para Windows 95 y Stat Graphics versión 5.0. Se realizaron análisis de varianza de un factor para determinar diferencias significativas entre tratamientos. Se trabajó con un nivel de significancia de 0,05 y cuan-do se encontraron diferencias significativas se realizó una prueba de Tukey.


Análisis foliares Pompón

Se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos 2 y 4, así como entre el 3, 4 y 6 para el primer muestreo. Para el segundo, el análisis estadístico no mostró diferencias significativas. En el primer muestreo se encontraron dos tratamientos con niveles altos de nitrógeno: 2 y 3 (tratamientos con fertilización nitrogenada completa más los biofer-tilizantes N1 y N2 respectivamente). Este resultado es muy interesante, teniendo en cuenta que la actividad de Azotobacter sp. como fijador de N2 (Abbass y Okon, 1993) es más efectiva cuando se mezcla con pocas cantidades de fertilizantes nitrogenados, ya que, según Gonzalez y Llunch (1992) la producción de sustancias bioactivas por parte de Azotobacter sp., se ve influenciada por el estado fisiológico de la bacteria y del cultivo, demostrándose que la presencia de nitrógeno combinado modifica la generación de auxinas y giberelinas. Se cree que los valores observados

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en el primer muestreo son la respuesta a las sustancias estimuladoras de crecimiento, más los biofertilizantes N1 y N2 respectivamente.

Análisis foliares Clavel

A pesar de no existir diferencias significativas entre los tratamientos en relación con los contenidos de nitrógeno, en el primer muestreo los resultados tienen un rango de diferencias mucho mayor que en los otros muestreos. En este primer muestreo los tratamientos 5 y 6 mostraron mayores niveles de nitrógeno, mientras que en el tratamiento 3 el conte-nido de nitrógeno fue más bajo. Los demás resultados están en el valor medio. Estas diferencias son menos marcadas en el segundo y tercer muestreo. El nitrógeno que contienen las plantas en las hojas se pue-de retirar o mover en determinados momentos del ciclo vegetativo, por ejemplo: para la formación de flores; esto explicaría por qué con el paso de los muestreos los contenidos de nitrógeno tienden a nivelarse. Si Azo-tobacter sp., actúa en estas plantas aportando nitrógeno, para el tercer muestreo no significa que no lo haga más. Una de las razones para este resultado es que el consumo y acumulación del nitrógeno, al igual que de los diferentes elementos, va a depender de la etapa fenológica de la planta, lo que se traduce, posiblemente, en el desvío del nitrógeno de las hojas a la formación de botón (Barcelo, et al., 1983); por eso no se ven diferencias entre los tratamientos.

Altura de las plantas en Pompón

De las cuatro mediciones de altura que se tomaron en pompón, sola-mente en la primera hay diferencias estadísticamente significativas. Estas se dan entre los tratamientos T3 y T6; el T6 muestra aquí el promedio más alto. Este resultado se vuelve a presentar en la última medida. En las dos medidas intermedias son T2 y T4 los que muestran los mayores promedios.

No hay un tratamiento que a lo largo del ciclo muestre un crecimiento mayor que los otros. Como se dijo anteriormente, T6 comienza y termina como el tratamiento de mejor desempeño. Este tratamiento no contiene fertilización nitrogenada, pero si todas las cepas de Azotobacter. Compa-rándolo con el T1, fertilización nitrogenada completa y ningún biofertili-zante, se puede afirmar que en lo relacionado con la altura, el T6 es más eficiente que el T1. Esta diferencia altura es de unos pocos centímetros, sin ser estadísticamente significativa.

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Altura de las plantas en Clavel

En clavel las seis medidas tuvieron diferencias significativas entre tratamientos. El T3 para las cuatro primeras medidas es el de mejor desempeño. Para el quinto muestreo T6 y para el sexto muestreo es T4, muy seguido por T3. Respecto a los más bajos, el T1 es el trata-miento que a través de los seis muestreos presenta siempre los valores más bajos. Este resultado pudo estar influenciado porque las dos pri-meras camas mostraron efecto de borde debido al método de la pre-paración mecánica del suelo, que no alcanza a homogenizar las áreas alrededor de los postes de la estructura del invernadero. Este efecto se reflejó en los T1R2 y T5R3 que mostraron un desarrollo más lento en las plantas pero al momento de la cosecha las plantas y sus botones eran ya normales.

Figura 1. Número de flores en pompón. Promedio por tratamiento en cosecha.

Peso fresco y peso seco en Pompón

El análisis de varianza de una vía muestra que hay diferencias signifi-cativas para pompón entre los siguientes tratamientos: T6 con T1, T4, T3, T5 y T2 con T4.

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Peso fresco y peso seco en Clavel

Para clavel el análisis de varianza establece diferencia entre los trata-mientos. En los dos hay diferencias significativas y en los dos pesos el de mayor valor es el de T5, encontrando que dicho tratamiento ni fue el más alto ni el que tuvo el mayor número de tallos. En plantas de maíz se re-portan como factores independientes la producción, el crecimiento y los pesos secos de las plantas inoculadas con Azotobacter sp. y fertilizantes N, lo que podría aplicarse al caso del clavel.

Datos obtenidos con la cosecha de pompón

Se evaluaron las siguientes variables: total de peso de racimos, núme-ro de tallos por ramo y número de flores; únicamente en el número de flores se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos 1 y 4, donde el tratamiento 1 obtuvo el mejor desempeño.

Figura 2. Flores de exportación, promedios por tratamiento.

Datos obtenidos con la cosecha de clavel

Flores de exportación, índice de flores por semana, peso por ramo de 25 unidades y flor nacional (Figura 2). En ninguno de los anteriores se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Los datos de co-secha no presentan diferencias significativas, sin embargo, es interesante ver que el mayor número de flores nacional y de exportación lo obtuvo el T6 (Figura 2). A este tratamiento se le aplicó el mínimo de la fertilización

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nitrogenada (30%) y todas las cepas. Todos los tratamientos donde se aplicó biofertilizante produjeron mayor número de flor de exportación que el control (T1). Estos resultados sugieren un efecto positivo de Azo-tobacter sp., en el cultivo del clavel.

CONCLUSIONES

En términos generales se puede concluir que la presente investiga-ción realizada directamente en los cultivos, dirigida y desarrollada con una metodología científica, se propone como una alternativa aplicada muy interesante para resolver preguntas concretas, ofreciendo solucio-nes prácticas a la floricultura. Con este modelo de trabajo se abren las puertas a investigaciones e interrogantes que exploren el uso de otros biofertilizantes, con el ánimo final de ofrecer al floricultor alternativas viables en un manejo racional y ecológico del cultivo.

Con respecto a los resultados obtenidos en bancos de enraizamiento se puede afirmar que siempre que el sustrato del banco esté formado por cascarilla de arroz y escorias cokizadas y no reciba ningún tipo de sustan-cia nutritiva, ni materia orgánica, no se aconseja aplicar el biofertilizante al comienzo de la siembra. De hacerlo se recomienda hacia el final del proceso de enraizamiento cuando las plántulas ya tienen las raicillas más desarrolladas y los niveles de riesgo han bajado al mínimo.

En cuanto a los ensayos en invernadero, los resultados demuestran tanto tanto en cultivo de clavel como de pompón que la aplicación de Azotobacter sp., tiene un efecto positivo sobre el crecimiento y produc-ción. Su aplicación puede realizarse en forma combinada con la fertili-zación nitrogenada sin ser excluyente o incompatible con ésta, lo que permite un cambio gradual y progresivo a esta alternativa de fertilización. Por lo anterior se puede concluir que:

• En clavel más que pompón, se observó un acortamiento de una sema-na en el ciclo. Este resultado es importante para los floricultores ya que conlleva, no solo al ahorro en los costos de los fertilizantes nitrogena-dos, sino todo el ahorro que implica una semana menos de las plantas en invernaderos.

• Cuando se usan biofertilizantes la calidad de la flor con un mínimo de fertilización nitrogenada en clavel y nada de fertilización nitrogenada en pompón. Por el contrario, en este tratamiento el clavel arrojó resul-tados muy positivos en la cosecha.

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• De acuerdo con los logros obtenidos en esta investigación y dadas las implicaciones económicas y ambientales que tiene la fertilización ni-trogenada en los cultivos, la sustitución progresiva por biofertilizantes se plantea como una alternativa actual muy promisoria.

• Reducciones en la fertilización nitrogenada sin detrimento significativo sobre la producción de flores es un resultado sobresaliente teniendo en cuenta que se trata de aplicaciones e investigaciones relativamente recientes para Colombia en estos dos tipos de cultivos.

• Los tratamientos T2 y T3 no representan un atractivo económico para el floricultor ya que tienen toda la fertilización nitrogenada, más los biofertilizantes con costos que se suman sin tener efectos sobre la producción de flores.

• La reducción de costos en T4, T5 es un resultado importante para el floricultor teniendo en cuenta la progresión de costos en cultivos in-tensivos.

• Según lo revisado en la literatura consultada a la fecha, no se conocen investigaciones similares para estos cultivos que permitan comparar los resultados obtenidos, no obstante, cabe mencionar que es impor-tante dar continuidad a éste tipo de investigaciones, incluyendo otros cultivos.

COMENTARIOS ADICIONALES

En el marco del plan de investigaciones definido por Asocolflores en 1997, se realizó este proyecto de investigación dirigido y presentado por la Fundación de Asesorías para el Sector Rural, FUNDASES, a cargo de la microbióloga e investigadora María Inés Matiz. El trabajo de campo se realizó en las instalaciones de producción de jardines de los Andes y Colibrí Flowers a quienes se les expresa reconocimiento. Este artículo es resumen del documento final que se puede consultar en el centro de documentación de Asocolflores.

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NEMATODOS ENTOMOPARÁSITOS - EXPERIENCIAS Y PERSPECTIVAS DE USO EN COLOMBIA

USING ENTOMOPATHOGENIC NEMATODES - OVERVIEW AND PERSPECTIVE IN COLOMBIA

JULIO C. PARADA1

1Asesor y Consultor Nematodos e [email protected]

RESUMEN

Especies introducidas y nativas de nematodos entomoparásitos en Colombia han demostrado eficiencia en control de insec-tos de importancia médica humana y económica agrícola en cultivos perennes, anuales y transitorios en diferentes regiones del país, convirtiéndose en una alternativa de control biológico válida y eficaz en el manejo integrado de insectos.

Palabras clave: Nematodos entomoparásitos, control biológico, especies nativas.

ABSTRACT

Entomopathogenic nematodes, native and commercial species, are an excellent alternative for insect pests control in perennials, annuals and transitory crops in Colombia.

Keywords: Entomopathogenic nematodes, native species.

INTRODUCCIÓN

Los nematodos entomoparásitos son una excelente alternativa como agentes de control de insectos dañinos comúnmente reportados en sue-lo, debido a sus condiciones de fácil producción, aplicabilidad y adap-tabilidad en campo, amplio rango y muerte relativamente rápida de hospedantes (48 horas) (Stock, 1998), seguridad para el ambiente y ver-tebrados, acción sinérgica con otros parásitos, patógenos (Woodring y Kaya,1988) y compatibilidad con agentes químicos (Crow, 2002), junto con la buena capacidad de búsqueda de organismos blanco, incluyendo aquellos de hábitat críptico (Woodring y Kaya, 1988; Parada, 2002).

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Tetradonematidae, Allantonematidae, Sphaeruliidae, Phaenopsitylen-chidae, Mermithidae, Heterorhabditidae y Steinernematidae, son algunas de las familias en que se agrupan los nematodos entomopatógenos que presentan asociaciones con insectos como foresis y parasitismo obligado o facultativo, causando patologías en los hospedantes como esterilización, reducción de la capacidad reproductiva, de vuelo, retraso en el desarrollo y disfunciones en el comportamiento, fisiología y morfología (Woodring y Kaya, 1988). Varias especies de heterorhabdítidos y esteinernemátidos son bioinsecticidas de producción comercial para el control de plagas de suelo en EEUU y Europa, destacándose Steinernema carpocapsae (Weisser, 1955); S. feltiae (Filipjev, 1934); S. riobravis (Cabanillas, Poinar y Raulston, 1994) y Heterorhabditis bacteriophora (Poinar,1976) como las de mejor acción en condiciones de campo.

En Colombia se han registrado experiencias en aislamientos e identifi-cación de especies nativas (Siabatto, 1980; Bustillo, et al., 1984; Navarro y Velez 1999; Parada, 2002), las cuales junto a cepas importadas, vie-nen siendo evaluadas experimentalmente en laboratorio y campo como potenciales controladores de especies de insectos de importancia epi-demiológica animal, humana y agrícola, en cultivos de palma (Mora y Calvache, 1999), café (Lopez, 2005), yuca (Melo et al, 2005), hortalizas y papa (Parada, 2004).

EXPERIENCIAS DE USO EN COLOMBIA

Especies introducidas

En Colombia se han evaluado productos comerciales de nematodos entomoparásitos con especies como Steinernema carpocapsae que ha sido explorada como potencial controlador de insectos como Cyrtome-nus bergi Froeschner (Hemiptera: Cydnidae) (Melo y Gaigl, 2004), sobre larvas y pupas de Oxydia trychiata (Lepidoptera: Geometridae), plaga del pino patula (Bustillo, 1976). También se ha utilizado en el control de algunas especies de chiza como Ancognatha scarabaeoides Burmeister (Coleoptera: Scarabaeidae), Anomala spp., y Phyllophaga spp., (Coleop-tera: Melolonthidae) en CIAT Palmira (Melo y Gaigl, 2004), en el depar-tamento de Antioquia (Londoño, 1999) y aplicaciones en campo para el control del barrenador de raíces Sagalassa valida Walker (Lepidop-tera: Glypterigidae) en Tumaco Nariño (Ortiz, 1993) y Strategus aloeus Burmeinster (Coleoptera: Scarabaeidae) en cultivos de palma de aceite (Mora y Calvache, 1999). De igual manera una cepa de Neoaplectana

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carpocapsae (Steinernema carpocapsae) (Rhabditida: Steinernemati-dae) se evalúo contra el cogollero del maíz Agrotis ipsilon (Hüfnagel) (Lepidoptera: Noctuidae) (Landazabal et al., 1973).

Dentro de proyectos de cooperación científica CIAT, Ministerio de De-sarrollo Agrícola de Alemania, se han evaluado en laboratorio cepas co-merciales de e-nema® de S. feltiae y H. bacteriophora, sobre C. bergi, Anomala spp., y Phylophaga spp. En el campo de la Entomología médica, se han realizado ensayos con especies introducidas como Romanomer-mis culicivorax (Nematoda: Mermithidae) ingrediente activo del Skeeter Doom® para el control integrado de vectores como Anopheles spp., Culex spp. y Aedes aegypti (Bustillo y Navarro, 1984; Valderrama, 1984) y se destaca el registro del nuevo género y nueva especie del nematodo ento-mopatógeno Anandranema phlebotophaga Poinar (Tylenchida: Allanto-nematidae) parásito de Lutzomyia sp. (Diptera: Psychodidae), vector de la leishmaniasis.

Especies nativas

Para Colombia se han registrado parasitismos naturales de nematodos sobre insectos como Zulia colombiana (Homoptera: Cercopidae) plaga del pasto braquiaria, con Caenorhabditis sp. (Rhabditida: Rhabditidae) (Arango, 1985) y del Mermithidae Hexamermis sp. sobre larvas de Spo-doptera spp. en cultivos de arroz en los llanos orientales (Siabatto, 1980; Bustillo, et al., 1984). Sin embargo los principales aislamientos corres-ponden a nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabdi-tidae, cuyas especies han mostrado ser potencialmente activas sobre en broca del cafeto Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolyti-dae) con Steinernema sp., (López y Briscoe, 1999) y sobre plagas de Solanum spp., como el gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax (Hustache) (Coleoptera: Curculionidae) (Rodríguez, 1986; Garzón y Aza, 1994) y la polilla guatemalteca Tecia solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae) (Parada et al., 1998; Sáenz y Luque, 1999; Parada, 2004) con Steinernema feltiae (Filipjev, 1934) (Rhabditida: Steinernematidae).

En la familia Heterorhabditidae se han identificado aislamientos de He-terorhabditis spp., (Parada, 2004; Lopez, 2005), los cuales han mostrado actividad sobre la chinche de la yuca Cyrtomenus bergi en el departa-mento del Valle (Barberena, 1996; Melo y Gaigl, 2004; Melo et al., 2005) y sobre especies de chiza A. scarabaeoides, Anomala spp., y Phylopha-ga spp., (Navarro y Vélez, 1999; Melo y Gaigl, 2004; Melo et al., 2005),

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Phylophaga obsoleta y Cyclocephala sp. (Coleoptera: Melolonthidae) (Londoño, 1999).

El potencial visto de las especies nativas registradas a la fecha en Co-lombia, hace necesario trabajar mas localmente sobre la identificación, distribución geográfica y especificidad de hábitat de nuevas especies, a fin de establecer su eficaz uso como posibles organismos bioindicadores y controladores biológicos de plagas en diferentes áreas y cultivos en el país (Parada, 2004) evitando así la introducción de especies exóticas que puedan eventualmente afectar la fauna benéfica local.

Aunque se viene trabajando en el desarrollo de tecnologías locales para el escalamiento masivo de los nematodos entomoparásitos en Colombia (López, 2004; Parada, 2004), aún no se garantiza acceso inmediato de estos organismos por parte de los productores, quienes entonces acu-den al ingreso ilegal de productos comerciales desde Europa o Estados Unidos, que resultan siendo poco eficientes, debido principalmente a las malas condiciones de transporte y desinformación para el manejo y uso del producto. Esta situación ha venido generando inconvenientes para el ingreso masivo de los nematodos entomoparásitos como alternativa de control biológico en programas de manejo integrado de insectos en Colombia. Por tanto se hace necesario trabajar para brindar las pautas y condiciones legales y administrativas por parte de las entidades corres-pondientes que permitan el ingreso legal de productos comerciales al país y que en última instancia permitan demostrar las bondades de las especies nativas.

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ENDOMICORRIZAS: ECOLOGÍA, PAPEL FUNCIONAL, APLICACIONES

ENDOMYCORRHIZAS: ECOLOGY, FUNCTION, APPLICATIONS

JIMENA SÁNCHEZ1, TIFFANY SOSA1, LUZ M. MELGAREJO1, CILIA FUENTES2


2Facultad de Agronomía. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

La simbiosis con hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) es de gran importancia para el desarrollo de las plan-tas, teniendo en cuenta que la raíz es el puente entre la planta y el suelo y que a su vez, el micelio del hongo es el puente entre la raíz y el suelo (Guerrero, 1996). Aunque los estudios de esta interacción se han enfocado tradicionalmente a los efectos be-néficos en la nutrición y desarrollo de las plantas permitiendo su aplicación como biofertilizantes, dichos hongos ofrecen ven-tajas adicionales tales como control biológico de fitopatógenos presentes en el suelo, biorremediación de suelos con metales pesados y/o con presencia de compuestos orgánicos conta-minantes, recuperación de suelos degradados, entre otras. A continuación se contemplan algunos aspectos generales de la ecología y funcionamiento de los hongos endomicorrícicos, téc-nicas implementadas recientemente para su cultivo, así como su uso en procesos de biorremediación.

Palabras clave: Endomicorrizas, biofertilizantes, biorremediación.

ABSTRACT

The symbiosis with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) is impor-tant for plant’s development, keeping in mind that the root is the bridge between the plant and the soil and AMF’s mycelium is the bridge between the root and the soil (Guerrero, 1996).

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Although the studies of this interaction have been focused tra-ditionally to the beneficent effects in the nutrition and deve-lopment of the plants allowing its application as biofertilizers, these fungi can offer additional advantages as biological con-trol agents of soil phytopatogens, biorremediation of soil with heavy metals and/or presence of organic pollutants, recovery of degraded soils, among others. Next, an overview on some general aspects of the ecology and function of AMF, techniques implemented recently for their cultivation, as well as their paper in phytorremediation processes are discussed.

Keywords: Endomycorrhizas, biofertilizers, biorremediation.

INTRODUCCIÓN

La palabra micorriza se origina del griego myco, que significa hongo y rhyza, que indica raíz. Etimológicamente se define como una simbio-sis mutualista entre algunos hongos del suelo y las raíces de las plan-tas (Sánchez de P., 1999). Se ha estimado que aproximadamente dos tercios del total de plantas terrestres están micorrizadas. Los registros fósiles más antiguos indican que dicha asociación tiene unos 400 mil-lones de años, tiempo similar al que se ha estimado para la evolución de las plantas terrestres, lo que ha llevado a considerar el papel fundamen-tal de esta interacción durante la colonización de la tierra por parte de las plantas superiores (Simon et al., 1993). Respecto a la especificidad de la relación, es importante resaltar que una sola planta puede formar micorrizas con varias especies de hongos, así como un solo hongo puede asociarse con diferentes especies de plantas, de modo que la compleji-dad de posibles combinaciones para la simbiosis es enorme (Allen et al., 2003). Se ha utilizado como criterio general el tipo de micorrización dado en las raíces de las plantas hospederas para establecer cinco tipos prin-cipales: ectomicorrizas, ectendomicorrizas, endomicorrizas orquidiodes, endomicorrizas ericoides y endomicorrizas arbusculares (Sánchez de P., 1999; Allen et al., 2003).

La clasificación taxonómica más reciente de HFMA establece que den-tro del Phylum Glomeromycota se encuentran los subórdenes Glomineae y Gigasporineae. Glomineae posee 4 familias con sus respectivos géne-ros: Archaeosporaceae (Archaeospora), Paraglomaceae (Paraglomus), Glomaceae (Glomus), Acaulosporaceae (Entrophospora y Acaulospora), en tanto que Gigasporineae contiene la familia Gigasporaceae con los

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géneros Gigaspora y Scutellospora (INVAM, 2005). Las características morfológicas más utilizadas para la clasificación de estos hongos son: Germinación de la espora, estructura de la pared celular, presencia y or-namentación de células auxiliares, presencia de esporocarpos, textura de la pared de la espora, principalmente (Werner, 1992). En la actualidad se emplean métodos adicionales a las descripciones morfológicas tradicio-nales tales como serología, técnicas basadas en DNA, determinación de isoenzimas y ácidos grasos (Koide y Mosse, 2004).

LAS MICORRIZAS ARBUSCULARES - ESTABLECIMIENTO DE LA SIMBIOSIS Y FISIOLOGÍA DE LA INTERACCIÓN CON LA PLANTA

El desarrollo de la micorrización depende de las interacciones entre los tres componentes del sistema: el hongo, la planta y las condicio-nes del medio que habitan, esto es, las condiciones del suelo (Brundrett et al., 1996). En términos generales, el proceso implica las siguientes etapas: precolonización, reconocimiento, penetración inicial del hongo, colonización intraradical, desarrollo del micelio externo y de estructuras reproductivas.

Por su carácter de simbiontes obligados, los HFMA sólo pueden ob-tener carbono a partir de la planta hospedera y a su vez, el aporte de dichos hongos está representado por la toma principalmente de fósforo desde el suelo translocándolo hacia los tejidos de la raíz (Sylvia et al., 1998). Al respecto, es interesante anotar que inicialmente la causa de los efectos positivos de HFMA sobre el crecimiento de las plantas no era co-nocida. Se pensó que implicaban procesos de toma de nitrógeno (1926) y solo hacia 1959 se sugirió que sus efectos podían estar relacionados con la toma de fósforo. Desde entonces se han realizado numerosos experimentos con un amplio rango de especies de plantas, en donde los investigadores han estudiado los efectos de la adición de P en varias cantidades y en formas de solubilidad diferencial para plantas micorriza-das y no micorrizadas (Koide y Mosse, 2004). Se sugiere que el principal mecanismo por el cual el HFMA mejora la toma de P es a través de una exploración más extensiva del suelo, más que por una propiedad intrín-seca de utilizar fuentes de P no disponibles a las plantas. Recientemente, se han reportado trabajos que sugieren que los HFMA pueden tener en-zimas fosfatasas útiles para tomar fosfatos que se encuentren en formas orgánicas en el suelo. Sin embargo, diferentes estudios han demostrado que la mayor colonización de la raíz por los HFMA y sus efectos sobre

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el desarrollo de la planta ocurre en suelos con baja disponibilidad de P. Entre las explicaciones a este fenómeno, se ha sugerido por ejemplo, que la mayor disponibilidad de P aumenta la concentración de azúcares en las células corticales, lo cual desfavorece la penetración y colonización de los HFMA (Sánchez de P., 1999).

Los factores ambientales y/o las condiciones del suelo inciden profun-damente en la formación y el funcionamiento de las micorrizas arbuscula-res. De hecho, algunos autores consideran que las múltiples interacciones ecológicas que ocurren en el suelo son responsables del comportamien-to de la micorriza y explican las diferencias observadas en la respuesta de las plantas a la inoculación en invernadero (condiciones controladas), en comparación con la inoculación en el campo (Guerrero, 1996). Es así que el desarrollo de la micorriza se puede ver afectado por el comporta-miento de variables ambientales de tipo abiótico como las propiedades físico - químicas del suelo y las variaciones climáticas, así como aquellas de tipo biótico como tipo de comunidad vegetal, condiciones fisiológicas de la planta hospedera, interacciones con otros organismos del suelo y prácticas antrópicas (deforestación, sistemas de cultivo, aplicación de agroquímicos, entre otros) (Werner, 1992; Guerrero, 1996; Sánchez de P., 1999). Con relación a los factores bióticos, vale la pena resaltar que es en la rizósfera donde suceden la mayor parte de las interacciones biológicas que afectan la micorriza. Las interacciones entre micorrizas y microorga-nismos del suelo son determinantes para los ciclos de nutrientes en un ecosistema, pero además afectan el balance entre procesos saprofíticos, patogénicos y simbióticos en el medio ambiente edáfico. El desarrollo de la micorriza resulta afectado por los otros microorganismos de la rizós-fera, sea que estos se comporten como antagonistas o como sinergistas (Guerrero, 1996).

METODOLOGÍAS UTILIZADAS EN LA INVESTIGACIÓN DE HFMA

Los métodos para facilitar la observación de la colonización radicular al interior de las raíces que involucran la limpieza del citoplasma de las raíces con KOH y la tinción de las paredes del hongo con azul de trypano fueron introducidos en 1970 y aún cuando han surgido otros métodos de coloración, el procedimiento básico de utilizar KOH para remover el cito-plasma del hospedero es común casi a todos (Koide y Mosse, 2004). Para la cuantificación de la colonización radicular se han estandarizado varias metodologías, tales como el método de determinación de raíz infectada en lámina por campos de infección (Allen y Allen, 1980). Uno de los prin-

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cipales impedimentos para la investigación en HFMA desde sus inicios ha sido la imposibilidad de separar estos hongos de su hospedero para cultivarlos aislados. Desde épocas tempranas (1924) se hicieron intentos fallidos por lograr cultivos independientes de HFMA, con frecuencia, los investigadores han intentado utilizar medios nutritivos estándar o medios de cultivos estándar implementados con algún “componente vital”. Sin embargo, aún en la actualidad no se ha obtenido un cultivo axénico per-manente de estos hongos. El mayor acercamiento se ha logrado en los denominados cultivos monoxénicos, que consisten en un cultivo in vitro de raíces de plantas transformadas asociadas a HFMA (Diop, 2003).

CULTIVO IN VITRO DE FRAGMENTOS DE RAÍZ COLONIZADOS POR HFMA

El cultivo in vitro de micorrizas asociadas a raíces fue desarrollado ini-cialmente por White y colaboradores en 1943. Dichos autores utilizaron fragmentos de raíces sobre medios minerales sintéticos suplementados con vitaminas y una fuente de carbohidrato. Sin embargo, el crecimien-to de raíces profusas, caracterizadas por la formación de numerosas ra-mificaciones de bajo nivel, ha sido obtenido con relativamente pocas especies de plantas. La formación de raíces de bajo orden es esencial para el incremento rápido en biomasa de raíz y el establecimiento de cultivos continuos. Se sabe que la transformación genética de plantas por la bacteria ubicua del suelo Agrobacterium rhizogenes Conn (Riker et al., 1930; Jones et al., 1997) aumenta la producción de pelos radiculares, ya que el DNA de esta bacteria puede transformar tejidos de plantas que están morfogenéticamente programados para desarrollarse como raíces. Sus balances hormonales modificados hacen que estos sean particular-mente vigorosos con el consecuente crecimiento profuso sobre medios artificiales.

Daucus carota L. (zanahoria) y Convolvulus sepium L. (enredadera) fueron las especies que inicialmente fueron transformadas con la bacte-ria (Tepfer y Tempé, 1981). Esta transformación se ha utilizado en varios estudios básicos y aplicados. Uno de los más importantes ha sido el de la simbiosis micorrícica. El primer cultivo de pelos radiculares colonizados por un HFMA fue investigado en 1987, donde se logró la colonización exi-tosa de pelos radiculares de C. sepium usando esporas de G. mosseae. Por su parte, la primera esporulación in vitro de HFMA fue obtenida en 1988 usando pelos radiculares de zanahoria colonizados por G. intrara-

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dices. El proceso de cultivo monoxénico se inicia a partir de cultivos en matera mantenidos en invernadero e implica: selección del inóculo de partida y su aislamiento, desinfección de los propágulos (esporas y frag-mentos de raíces colonizadas), incubación y su asociación con una raíz hospedera micótrofa en un medio de cultivo sintético (CESAMM, 2005). Dichas técnicas de cultivo in vitro constituyen una herramienta valiosa para el estudio de la simbiosis y de las interacciones con otros microor-ganismos, así como para la preservación de los HFMA (Diop, 2003).

ENCAPSULACIÓN DE LOS HFMA PRODUCIDOS IN VITRO

Técnicas de inmovilización de microorganismos han sido utilizadas porque ofrecen la posibilidad de diversificar los procesos de inoculación gracias a que mantienen la viabilidad de los microorganismos dentro de los soportes utilizados. El atrapamiento de HFMA fue logrado de manera exitosa por primera vez en 1982. En esa oportunidad se encapsuló una mezcla de esporas, raíces infectadas e hifas extramatricales de Glomus mosseae, para ensayos en campo. Desde entonces, se ha investigado el atrapamiento en perlas de alginato de calcio en condiciones de in-vernadero, con varias especies diferentes de HFMA, usando las formas intramatricales de estos hongos (como las vesículas). Strullu y Plenchette (1990) demostraron la habilidad de fragmentos de raíces infectados atra-pados para formar nuevas micorrizas, aún después de 1 mes de haber sido almacenados a 4 °C.

A pesar de la proliferación de sistemas de cultivo (en materos, hidro-pónicos, aeropónicos, e in vitro), la tecnología de encapsulación se ha limitado a inóculos producidos in vivo. Sin embargo, la técnica de cultivo in vitro de fragmentos de raíces colonizadas por HFMA, ofrece ventajas obvias sobre los sistemas tradicionales, permitiendo una producción im-portante de propágulos libres de contaminantes en cortos periodos de tiempo y en poco espacio. Adicionalmente, la capacidad de colonización de los propágulos producidos sobre el crecimiento de las plantas in vivo ha sido verificado varias veces (Declerck et al., 1996), obteniendo un inóculo de gran calidad y libre de patógenos.

PAPEL FUNCIONAL DE HFMA EN AGROECOSISTEMAS -BIOFERTILIZANTES

La presencia de los microorganismos en ecosistemas naturales y agroecosistemas es de gran importancia por el gran espectro de activi-

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dades que cumplen. Inicialmente, al determinar que en la mayoría de los suelos para uso agrícola ya se encontraban presentes los HFMA de manera natural, se le dio poco valor a una potencial inoculación. Sin em-bargo, hacia 1975 se hicieron las primeras demostraciones que la inocu-lación con HFMA podía ser benéfica en algunas circunstancias y aunque se consideró, no se hizo frecuente, debido a que resultaba más costosa que la aplicación de fertilizantes inorgánicos. No obstante, su potencial aplicación para la reforestación de áreas disturbada ha sido evaluada (Koide y Mosse, 2004). Se han efectuado múltiples estudios en el mundo evaluando la actividad biofertilizante de HFMA, comprobando los benefi-cios en la nutrición, crecimiento y sanidad de las plantas, así como en la calidad del suelo.

Desde estados tempranos de la investigación con estos hongos (1971 – 1972), los investigadores notaron que diferentes cepas de HFMA pro-ducían diferentes efectos sobre el crecimiento de las plantas. Por esto, la selección de las mejores cepas de estos hongos que han sido nota-blemente efectivas en cultivos particulares se ha desarrollado de manera activa. Sin embargo, la introducción de inóculos no nativos puede no ser tan efectiva, ya que una cepa que es mejor en un cultivo determinado puede no serlo en otro y una cepa mejor en unas condiciones ambienta-les puede no serlo en otras. Sin embargo, se han observado algunos ca-sos exitosos de establecimiento a corto plazo luego de la introducción de cepas foráneas, aunque no se conoce bien su efectividad a largo plazo. Debido a las anteriores limitaciones, la atención también se ha colocado en el manejo de las poblaciones nativas existentes en un suelo (Koide y Mosse, 2004).

HFMA EN CONTROL BIOLÓGICO

El control biológico de patógenos en plantas es comúnmente acepta-do como una práctica importante en agricultura sostenible porque esta basado en el manejo de un recurso natural. El estudio del posible papel de los HFMA en protección contra patógenos de plantas inició en 1970 y desde entonces se han generado muchas publicaciones al respecto, sin embargo, se sabe muy poco sobre los mecanismos involucrados (Hooker et al., 1994; Linderman, 1994). La reducción consistente de síntomas de enfermedad por HFMA ha sido descrita para fitopatógenos de los géneros Phytophthora, Gaeumannomyces, Fusarium, Chalara (Thiela-viopsis), Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Aphanomyces y para nematodos tales como Rotylenchus, Pratylenchus, Meloidogyne;

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esto no significa que la formación micorrícica pueda ser efectiva contra estos patógenos bajo todas las circunstancias. En efecto, para que los HFMA induzcan un incremento en la resistencia o un descenso en la sus-ceptibilidad, se requiere el preestablecimiento de los hongos y desarrollo extensivo de la simbiosis antes del ataque del patógeno (Azcón-Aguilar y Barea, 1996; Koide y Mosse, 2004). Adicionalmente, la potencial efec-tividad de un agente de control biológico depende de la virulencia y del inóculo del patógeno presente en el suelo.

Los HFMA han demostrado un papel en la reducción de los daños causados por fitopatógenos del suelo mediante el mejoramiento de la nutrición de la planta, compensación por el daño del patógeno y com-petencia por fotosintatos o colonización/infección de regiones en la raíz. Otros mecanismos que pueden estar involucrados son: cambios anató-micos y morfológicos inducidos por HFMA en el sistema de raíz, cam-bios en las poblaciones microbianas de la micorrizósfera y activación de los mecanismos de defensa de la planta. (Azcón-Aguilar y Barea, 1996). Respecto al mejoramiento de la nutrición de la planta hospedera, se ha establecido que un incremento en la toma de nutrientes es inducido por la simbiosis con HFMA dando como resultados plantas mas vigorosas (Hooker et al., 1994; Linderman, 1994).

Se ha sugerido que HFMA incrementan la tolerancia al ataque por el patógeno por compensación de la pérdida de biomasa en la raíz o de su función. Esto representa una contribución indirecta para biocontrol a través de la conservación de la función del sistema radicular, por el creci-miento de hifas extramatricales en el suelo e incremento en la superficie de absorción de las raíces y por el mantenimiento de la actividad de las células de la raíz a través de la formación de arbúsculos (Azcón-Aguilar y Barea, 1996). Adicionalmente, se ha establecido que la colonización por HFMA induce cambios marcados en la morfología de la raíz, así como en las actividades meristemáticas y nucleares de las células de la raíz (Atkin-son et al., 1994). Esto podría afectar la interacción con la rizósfera y par-ticularmente el desarrollo de la infección por el patógeno. También se ha determinado que la simbiosis con HFMA induce cambios en la fisiología del hospedero que pueden influir los patrones de exudación de la raíz y consecuentemente, causar alteraciones cualitativas y/o cuantitativas en la población microbiana en la rizósfera (Azcón-Aguilar y Barea, 1996).

Cambios en las poblaciones de microorganismos del suelo inducidos por la formación de HFMA pueden llevar a la estimulación de ciertos

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componentes de la microbiota, la cual a su vez podría ser antagonista de patógenos de raíz (Linderman, 1994). Igualmente, la habilidad profilác-tica de algunos HFMA podría ser explotada en asociación con otros mi-croorganismos rizosféricos conocidos por su actividad antagonista para patógenos de raíz y que son usados como agentes de control biológico. En términos generales, los HFMA pueden ser usados apropiadamente como agentes de control biológico, preferiblemente en asociación con otros microorganismos antagonistas de patógenos en el suelo.

HFMA EN FITORREMEDIACIÓN

Entre los microorganismos que afectan los procesos de la rizósfera, los HFMA inducen una serie de cambios en la fisiología de la planta, la disponibilidad de nutrientes y la composición microbiana que puede de-terminar el resultado de un proceso de fitorremediación. Más allá de la rizósfera, las hifas de las micorrizas actúan como las raíces de las raíces, pudiendo extender la rizósfera a través del suelo, creando una nueva interfase de interacciones suelo – planta: la hifósfera (Joner y Leyval, 2003).

En cuanto a la fitorremediación de metales pesados, la toma y la tole-rancia depende tanto de la planta como de factores del suelo incluyendo los microorganismos. La colonización con HFMA resulta en un incremen-to en el área superficial de la raíz para la adquisición de nutrientes. El mi-celio extraradical puede extenderse varios centímetros en el suelo para tomar grandes cantidades de nutrientes minerales, incluyendo a los me-tales pesados, hacia la raíz hospedera. La efectividad de la colonización por HFMA en términos de la adquisición de nutrientes difiere marcada-mente entre el genotipo de HFMA y la planta hospedera implicada (Khan et al., 2000). Las micorrizas también han sido reportadas en plantas cre-ciendo en sitios contaminados con metales pesados (Chen et al., 2001; Zhu et al., 2001; Rufyikiri et al., 2003), indicando que estos hongos han evolucionado con cierta tolerancia a éstos y que pueden jugar un papel importante en la fitorremediación de un ambiente.

Igualmente, se ha estudiado el papel de los HFMA en la fitorreme-diación de contaminantes orgánicos, resaltando que dentro del contex-to de la biodegradación se establece que: Los hongos formadores de micorrizas ericoides son degradadores potentes, los formadores de ec-tomicorrizas son moderadamente capaces, y los HFMA son simbiontes obligados con pequeña o ninguna capacidad para degradar materiales

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orgánicos (Nichols et al., 1997; Michelsen et al., 1998). Sin embargo, todos los grupos de micorrizas interactúan y modifican las comunidades microbianas a través de su micelio de hifas y de este modo, pueden afectar indirectamente todos los procesos de degradación microbiana. La rizodegradación exitosa de compuestos orgánicos ha sido demostrada para un amplio rango de compuestos o mezclas de compuestos, como los hidrocarburos alifáticos, gasolina y otros hidrocarburos derivados del petróleo, hidrocarburos aromáticos policíclicos (siglas del inglés PAHs), explosivos, plaguicidas y clorinados orgánicos (Hsu y Bartha, 1979; Jo-ner et al., 2001; Davis et al., 2002; Joner y Leyval, 2003a; Joner y Leyval, 2003b; Liu et al., 2004).

Los mecanismos involucrados en la degradación aumentada en la rizósfera no son bien conocidos. Posibles explicaciones incluyen efectos directos de enzimas derivadas de las raíces y efectos indirectos de una aireación aumentada debido al movimiento de las raíces a través del sustrato y el consumo de agua, la actividad microbiana aumentada y la modificación de la composición de la microflora debido al suministro de carbono proveniente de los exudados radiculares, efectos de precur-sores metabólicos exudados por las raíces (por ejemplo los fenólicos) que inducen actividad enzimática y disparan vías metabólicas que pue-den atacar el contaminante y cambios inespecíficos de pH, potencial osmótico, potencial redox, presiones parciales de O2/CO2, etc. (Curl et al., 1986). La actividad microbiana aumentada es probablemente un componente clave en la rizodegradación. Sin embargo, la modificación de condiciones en la rizósfera que afecten el crecimiento microbiano no conllevan a un incremento proporcional de la biomasa de todos sus organismos, sino más bien a un cambio en la composición de la comunidad, alterando la rizósfera con respecto a sus capacidades me-tabólicas (Duineveld et al.,1998). Dichos cambios en las poblaciones microbianas de un suelo contaminado que está recibiendo exudados radiculares puede derivar de incremento selectivo de la proporción de degradadores del contaminante, es decir, aumenta la cantidad de mi-croorganismos que pueden crecer con el contaminante como única fuente de carbono. Por su parte, la adición de nutrientes minerales puede favorecer específicamente los degradadores del contaminante, particularmente en suelos pobres de nutrientes donde el contaminante es degradable por el metabolismo microbiano directo y está presente en grandes cantidades, contribuyendo a aumentar las tasas C/N y C/P del suelo.

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En muchos casos la degradación no es mediada por metabolismo directo, sino más bien por cometabolismo. Sin embargo, la explota-ción de procesos cometabólicos puede ser también una trampa, puesto que la entrada de carbono degradable puede en algunos casos reducir la mineralización del contaminante orgánico, debido al hecho que el organismo degradador prefiere el sustrato más fácilmentemente de-gradable, en vez del contaminante (Addelhafid et al., 2000). Adicio-nalmente, la coexistencia ubicua de bacterias y hongos en el suelo y el conocimiento que existe sobre su cooperación catabólica sugiere que las interacciones físicas entre estos organismos pueden ser importantes para la degradación de compuestos como los hidrocarburos policícli-cos aromáticos (siglas del inglés PAHs). Recientemente, la formación de biopelículas de bacterias alrededor de las hifas de HFMA ha sido demostrada y esto permite plantear la hipótesis que las hifas del hongo pueden actuar como vectores que movilizan las bacterias conforme van creciendo, facilitando el desplazamiento de las bacterias por el suelo (Johnsena et al., 2005).

DISCUSIÓN

Los HFMA llevan a cabo importantes actividades en los sistemas suelo – planta y junto con otros microorganismos rizosféricos, contribuyen a la estabilidad y productividad sostenida de agroecosistemas. Su principal uso ha sido como biofertilizantes, aún cuando se han presentado algu-nas limitaciones relacionadas con su producción masiva, las cuales se han venido superando, mediante la implementación de cultivos in vitro; no obstante, se requiere continuar con investigaciones en la multiplica-ción y formulación del inóculo de HFMA, estudios sobre la diversidad y dinámica de la población de la microbiota en la rizósfera/micorrizósfera, sobre su papel en la fitoestabilización /biorremediación de suelos conta-minados con metales pesados, en programas de manejo para el control de diferentes fitopatógenos en agricultura sostenible y en la degradación de compuestos orgánicos diferentes a los PAHs.

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INTERACCIONES ENTRE HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS

ARBUSCULARES Y Trichoderma sp.

INTERACTIONS BETWEEN ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI AND Trichoderma sp.

TIFFANY SOSA1, JIMENA SÁNCHEZ1


[email protected]

RESUMEN

Teniendo en cuenta la importancia que ha cobrado en la ac-tualidad la utilización de productos biológicos (controladores biológicos y biofertilizantes) como complementos de las acti-vidades agrícolas, resulta fundamental ampliar el conocimiento que se tiene hasta el momento de los efectos de la inoculación con micorrizas arbusculares haciendo énfasis en la relación de estos con otros microorganismos del suelo y de la rizósfera, en especial con aquellos que son utilizados comercialmente. Múlti-ples trabajos se han realizado con el objetivo de determinar las posibles interacciones entre hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) y agentes de control biológico del género Trichoderma, así como el efecto de dichas interacciones sobre el crecimiento de diferentes plantas. Una revisión concisa de las investigaciones más relevantes en este campo se presenta a continuación.

Palabras clave: Hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA), Trichoderma sp., rizósfera, interacción.

ABSTRACT

Taking into account the significance that the use of biological products (biological control agents and biofertilizers) has been taken recently as complements in agricultural activities, is im-portant spreading awareness about inoculation with arbuscular vesicular fungi (AMF), pointing the relationship among it and other soil and rhizosphere’s microorganisms, particularly if the

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former are used commercially. Several works has been done to determine possible interactions AMF - Trichoderma sp., as much as the effect of these interactions on plants’ growth. A concise mini review on the most important research in this field is shown in the following manuscript.

Keywords: Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF), Trichoderma sp., rizo-sphere, interaction.

INTRODUCCIÓN

Los estudios realizados en nuestro país sobre los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) han sido enfocados al conocimiento de la diversidad de dichos hongos en diferentes ecosistemas naturales y agroecosistemas. La aproximación a los efectos del fenómeno de la mi-corrización sobre el crecimiento y el desarrollo de las plantas hospederas ha sido el principal enfoque que se le ha dado a la mayoría de trabajos realizados y desde sus inicios, el estudio de HFMA ha dado especial im-portancia al potencial de estos microorganismos como fertilizantes en diferentes tipos de suelos, ecosistemas y plantas hospederas. De esta forma se han implementado productos basados en hongos formadores de micorrizas que aprovechan la diversidad y ubicuidad de estos organis-mos. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que la efectivi-dad de la simbiosis y por tanto la de estos productos, depende en cierta medida de las condiciones particulares del suelo y ecosistema donde se establece. Es importante tener en cuenta que las micorrizas constituyen una asociación multifuncional con las plantas, cuyos beneficios van más allá de los aspectos nutricionales. Los hongos formadores de micorrizas arbusculares son considerados como un recurso biológico multipropósito cuyo manejo, además de los efectos sobre la productividad vegetal, gen-era beneficios ambientales al mejorar las condiciones físico – químicas y biológicas del suelo (Guerrero et al., 1996).

Los beneficios desde el punto de vista biológico se derivan de su in-teracción con los diversos grupos de macro y microorganismos de la rizósfera. Las interacciones entre micorrizas y microorganismos del sue-lo son determinantes para los ciclos de nutrientes en un ecosistema, interactuando con bacterias fijadoras de nitrógeno y microorganismos solubilizadores de fosfato (Azcón-Aguilar y Barea, 1996b; Kim et al., 1998; Hodge, 2000). Se han desarrollado estudios de las interacciones con microorganismos implicados en el control biológico de patógenos

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del suelo, demostrando que existen diferentes tipos de interacción con HFMA. Algunos estudios sugieren que determinadas especies empleadas en control biológico pueden ser compatibles con las micorrizas y en con-secuencia pueden ser aplicadas conjuntamente en el mismo inóculo, con la finalidad de mejorar el crecimiento vegetal en términos de rendimien-to y sanidad. Así por ejemplo, no se han encontrado efectos negativos de Gliocladium virens sobre HFMA, a pesar del notable efecto deletéreo que este ejerce sobre hongos fitopatógenos (Paulitz y Linderman, 1991). La existencia de interacciones semejantes es una muestra más de la com-plejidad de los HFMA, que además de haberse adaptado a una simbiosis completa con las plantas superiores, parecen interactuar de forma per-manente y muchas veces sinergista con la microflora del suelo. Las impli-caciones evolutivas de tales interacciones y las adaptaciones especiales que están involucradas, son todo un universo dispuesto a ser estudiado y aprovechado de manera sostenible.

INTERACCIONES ENTRE HFMA Y LOS DEMÁS MICROORGANISMOS DE LA RIZÓSFERA

La formación de micorrizas induce cambios en la composición mineral y en la fisiología de las plantas y consecuentemente, en los exudados radicales de las mismas. Esta alteración de la exudación radical provoca a su vez cambios cualitativos y cuantitativos en la composición microbiana de la rizósfera que ya han sido demostrados en trabajos concretos don-de se ha visto que las poblaciones de determinados grupos de bacterias resultan afectadas por la micorrización. También se ha visto efecto de aumento de la biomasa microbiana del suelo en plantas tratadas con inóculos conjuntos de micorrizas y bacterias como Enterobacter aglome-rans (Kim et al., 1998).

La interacción entre los hongos formadores de micorrizas y los mi-croorganismos del suelo ha sido estudiada en diversos grupos. Tal es el caso de aquellos que están implicados en el ciclaje de nutrientes como los fijadores de nitrógeno y los solubilizadores de fosfato. La interacción con microorganismos fijadores de nitrógeno ha sido estudiada con bac-terias como Rhizobium sp. demostrándose una alta dependencia para la adecuada formación de nódulos en las leguminosas de una micorriza-ción apropiada (Azcón-Aguilar y Barea 1996b). Por su parte, se ha visto que los microorganismos solubilizadores de fosfato hacen disponible el fósforo, que es captado por las hifas de hongos micorrizógenos debido a

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su capacidad para explorar diferentes microhábitats del suelo (Kim et al., 1998). Por otro lado, también se han desarrollado estudios de las inte-racciones con microorganismos implicados en el control biológico de pa-tógenos del suelo, que han demostrado diferentes formas de interacción con los HFMA. Tal es el caso de algunas bacterias como Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Bacillus sp. y Azotobacter sp., que tambièn tienen la capacidad de promover el crecimiento vegetal (Whipps, 2001).

Así mismo, se ha considerado la posible relación entre los microorgan-ismos fitopatógenos y los HFMA. Teniendo en cuenta que las micorrizas pueden alterar el equilibrio de las poblaciones microbianas del suelo, es de suponer que su presencia tenga efectos sobre las poblaciones de los fitopatógenos, ya que comparten con ellos el mismo sustrato. Se ha demostrado que en ciertos casos, la micorrización induce una menor susceptibilidad de las raíces, o una mayor tolerancia a ciertos patógenos. La resistencia de la planta al ataque de los patógenos se relaciona prin-cipalmente con una mejor nutrición, que la hace fisiológicamente más resistente al ataque de los patógenos, aunque no se puede desestimar el papel de una protección física directa de las hifas del HFMA sobre los tejidos radicales. Se ha observado una reducción consistente de los síntomas de la enfermedad en hongos fitopatógenos de los géneros Phy-tophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, entre otros. Es importante resaltar que la protección contra estos patógenos es efectiva, siempre y cuando la simbiosis entre la planta y el HFMA esté bien desarrollada al momento del ataque del patógeno (Azcón-Aguilar y Barea, 1996a). Adicionalmente es importante resaltar la evidencia ar-rojada por algunos estudios, que indica que las propiedades profilácticas de los HFMA pueden ser explotadas en asociación con otros microorgan-ismos antagonistas de la rizósfera y se ha demostrado que éstos pueden mejorar el desarrollo del micosimbionte y facilitar la formación de la mi-corriza. Estos efectos han sido evidenciados utilizando cepas de contro-ladores biológicos conocidos, como el hongo Trichoderma aureoviride (Calvet et al. 1993).

Trichoderma sp.

Género de hongos del suelo que se encuentran comúnmente en la capa de humus y que tienen la capacidad de degradar sustancias tan diversas como la celulosa o los pesticidas; tal vez su propiedad más estudiada es la de ser un género de micoparásitos, capaces de matar a sus hospe-deros antes de invadir sus tejidos, o poco tiempo después de hacerlo.

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(Papavizas, 1985). Son microorganismos que pueden vivir activamente como saprófitos, pero parasitan a otros hongos cuando la oportunidad se presenta. Dado que no están especializados para el modo de vida par-asítico, son virulentos y es por ello que conducen a la muerte temprana de su hospedero. Esta cualidad ha sido aplicada a nivel industrial y en la actualidad se reconoce el gran potencial como controlador biológico de varias especies del género. La interacción entre cepas de Trichoderma y sus potenciales hospederos se da por contacto externo directo, de modo que sus hifas crecen enrollándose en torno a las células del hospedero. La muerte de este último se da por una serie de sustancias produci-das por Trichoderma como las enzimas hidrolíticas β –1,3-glucanasa y la quitinasa, responsables de la degradación de la pared celular, algunos metabolitos volátiles como el etileno y la acetona y varios antibióticos difundibles (Moore, 1996; Harman et al., 2004).

No obstante, en la actualidad se consideran otros mecanismos de con-trol biológico utilizados por este hongo. Adicional a su habilidad de ata-car o inhibir el crecimiento de los fitopatógenos directamente, recientes descubrimientos indican que también puede inducir resistencia sistémica y localizada contra una variedad de patógenos de plantas. Es más, se ha visto que ciertas cepas tienen influencia substancial sobre el crecimiento y desarrollo de algunas plantas tanto en sistemas axénicos, como en campo. De hecho, las cepas más funcionales han mostrado una propie-dad que se conoce como “competencia en la rizósfera”, que denota su habilidad de colonizar y crecer en asociación con las raíces de las plantas (Harman et al., 2004).

Trichoderma harzianum ha sido considerablemente estudiado debido a que se trata de una especie de amplia distribución a nivel mundial y a que ha presentado importantes y positivos resultados como controlador biológico de diversos grupos de hongos patógenos originados en el sue-lo (Papavizas, 1985). En estudios de sus propiedades como antagonista, se ha observado que sus hifas crecen enrollándose alrededor de las cé-lulas hospederas, aunque también puede invadirlas. Recientemente se han establecido propiedades de algunas cepas de T. harzianum como promotor del desarrollo de las raíces y crecimiento de las plantas. Así por ejemplo, tanto en la investigación académica, como en la práctica comer-cial, se ha demostrado que la cepa T – 22 incrementa el desarrollo de las raíces en maíz y plantas ornamentales como las poinsetias, aunque se estima que este efecto no se restringe solo a estos tipos de plantas y que

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el crecimiento de estas puede ser estimulado también por la presencia de otros microorganismos benéficos colonizadores de las raíces. De he-cho, el sinergismo entre los hongos micorrícicos y la cepa T-22 ya ha sido evidenciado (Harman et al., 2004).

INTERACCIÓN ENTRE HFMA Y Trichoderma sp.

Existen algunos acercamientos al estudio de esta interacción en par-ticular realizados en diversas partes del mundo y con diferentes modelos, que combinan inóculos micorrícicos con cepas de distintas especies y cepas de Trichoderma, incluyendo en ocasiones algunos fitopatógenos. Tal es el caso de los ensayos realizados por Calvet et al. (1993) para evaluar los efectos de la inoculación conjunta del HFMA Glomus mos-seae, Trichoderma aureoviride y el fitopatógeno Pythium ultimum sobre el crecimiento de plantas de Tagetes erecta. Por lo general, los estudios de la interacción HFMA – Trichoderma evalúan el efecto de cada inóculo por separado, así como del inóculo conjunto sobre el crecimiento de las plantas hospederas, y los posibles efectos de Trichoderma sobre la mi-corrización y/o la viabilidad del inóculo del HFMA. En algunos estudios se ha evaluado también el efecto de la presencia del HFMA sobre las poblaciones de Trichoderma.

Los resultados obtenidos por diversos investigadores indican en primer lugar, que el comportamiento del sistema HFMA – Trichoderma – planta varía de acuerdo a las condiciones particulares de experimentación, sien-do de gran importancia la especie de micorriza y la cepa de Trichoderma empleadas. Tal es el caso de los ensayos realizados con cinco cepas de T. pseudokoningii, que se combinaron con los HFMA Glomus mosseae y Gigaspora rosea, donde se observó inhibición de la germinación de las esporas micorrícicas por parte de algunas de las cepas del antagonis-ta, así como efectos diferenciales de acuerdo a la especie de micorriza empleada sobre la acumulación de biomasa en las plantas hospederas infectadas con ambos inóculos (Martínez et al., 2004). La siguiente con-clusión general a la que se ha llegado a través de estos estudios, es que en la mayoría de los casos, la aplicación del inóculo conjunto de HFMA y Trichoderma sp. aumenta el crecimiento de la planta hospedera y el porcentaje de infección radicular por parte del HFMA con respeto a plan-tas inoculadas solamente con el hongo micorrícico; lo que significa que la interacción entre dichos microorganismos es de tipo sinergístico. Este resultado se ha observado en estudios con T. harzianum, T. aureoviride y T. pseudokoningii (Calvet, 1993; Fracchia, 1998).

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Sin embargo, también es importante mencionar que algunos estudios han arrojado resultados contrastantes a este respecto, en donde la in-oculación con ambos microorganismos no muestra un efecto claro sobre el crecimiento de la planta hospedera o el porcentaje de colonización radical (para el caso de la soya), reportándose incluso efectos inhibitorios por parte de algunas cepas de T. pseudokoningii (Martínez et al., 2004). Aparte del tipo de organismos, el momento de realizar la inoculación con el antagonista también ha demostrado ser un factor determinante. Se han observado efectos negativos sobre el crecimiento de plantas de maíz al realizar la inoculación con Trichoderma koningii antes o al mismo tiempo de inocular con Glomus mosseae (Mcallister et al, 1994).

Respecto a la influencia de Trichoderma sp. sobre la viabilidad y ca-pacidad de germinación de las esporas de HFMA, los resultados obteni-dos pueden considerarse como una consecuencia del efecto que ejerce Trichoderma sobre la fase presimbiótica de HFMA (periodo comprendido entre la germinación de las esporas de HFMA y la llegada e invasión efectiva del micelio a los tejidos de la raíz). Este efecto ha sido estudiado por varios autores en ensayos de germinación de esporas de HFMA re-alizados in vitro (Mcallister et al., 1994; Fracchia et al., 1998), donde se ha establecido que diferentes especies de Trichoderma pueden afectar el porcentaje de germinación de las esporas de HFMA. De hecho, se han determinado reducciones en el porcentaje de germinación de las espo-ras por efectos de antagonismo de Trichoderma que produce sustancias solubles en el medio y compuestos volátiles que afectan directamente estas estructuras (Mcallister et al., 1994a; Martínez et al., 2004).

Por su parte, al estudiar el efecto de T. harzianum sobre el proceso de micorrización, algunos investigadores que han realizado un acercamiento a la interacción en sistemas de suelo “libre de raíces” diseñados con el ánimo de minimizar el efecto de la presencia de los tejidos radicales de la planta hospedera, haciendo énfasis en la interacción entre el micelio externo de Glomus intraradices y las hifas de T. harzianum, encontraron que la densidad de hifas externas de G. intraradices se redujo en pres-encia de T. harzianum, aunque no así la biomasa de hifas viables, lo que sugiere que T. harzianum explota solo el micelio muerto del HFMA. Por su parte, se observó que la presencia de micelio externo de G. intra-radices suprimió el desarrollo de la población de T. harzianum, derivado posiblemente, de una competencia por nutrientes (Green et al., 1999). El estudio del efecto del hongo formador de micorrizas sobre las pobla-

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ciones de Trichoderma sp., también ha arrojado resultados variables. En los sistemas más típicos (planta – antagonista – HFMA) no se han en-contrado cambios en las poblaciones de T. pseudokoningii en términos de unidades formadoras de colonia por gramo de suelo (Martínez et al., 2004), mientras que disminuciones en la población de T. koningii y T. harzianum en presencia de G. mosseae sí han sido reportadas (Mcallister et al., 1994; Fracchia et al., 1998).

La variedad de posibles resultados al implementar un sistema que per-mita aproximarse al conocimiento de la interacción entre las micorrizas y Trichoderma sp., debida a la influencia de las condiciones particulares de cada área de estudio, justifica la obtención de nuevos resultados que complementen el panorama obtenido hasta el momento. En un trabajo realizado recientemente (Sosa y Sánchez, 2005) se observó una influen-cia discreta de la interacción sobre el crecimiento de las plantas estudia-das, lo que sugiere la posibilidad de una competencia importante entre los hongos implicados.

DISCUSIÓN

Se puede afirmar que en general, los resultados de las investigaciones realizadas en torno a la interacción entre diferentes cepas de Trichoderma sp. y HFMA difieren ampliamente, aún en casos en donde se utilizan las mismas especies del hongo biocontrolador, concluyendo que Trichode-rma sp. puede tener efectos antagonistas, neutros o estimulatorios sobre los HFMA (Mcallister et al., 1994; Fracchia et al., 1998; Godeas et al., 1999; Green et al., 1999; Martínez et al., 2004). La revisión comparativa entre los diferentes resultados reportados en literatura y los obtenidos en ensayos realizados con el fin de estudiar esta interacción, permite con-cluir que las respuestas de la planta, los HFMA y Trichoderma sp. cuando se encuentran en interacción, pueden obedecer a diferencias en las con-diciones de realización de los estudios como: origen y tipo de cepas de microorganismos empleadas, condiciones ambientales y climáticas del lugar de experimentación, entre otros.

Por tanto, si los resultados obtenidos en los estudios existentes hasta el momento se relacionan con el potencial y efectividad del inóculo de HFMA empleado, queda abierta la posibilidad de complementar la in-formación obtenida realizando otros ensayos de compatibilidad HFMA – Trichoderma sp., sobre todo si se pretende orientar este tipo de traba-jos hacia el potencial uso de esta interacción en un producto biológico

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formulado para ser aplicado como complemento en actividades agríco-las. Finalmente, cabe resaltar que cada nuevo resultado obtenido, en cada condición particular, constituye un aporte a la construcción actual de conocimiento sobre ambos microorganismos y el sistema que con-forman con la planta hospedera, contribuyendo a la comprensión de la relación existente, la cual puede arrojar diferentes respuestas al verse influenciada en mayor o menor grado por diversos factores presentes en el ecosistema de la rizósfera.

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CONTROL BIOLÓGICO DE INSECTOS PLAGA: MITO ACADÉMICO O REALIDAD AGRÍCOLA

BIOLOGICAL CONTROL OF PEST INSECTS: ACADEMIC MYTH OR AGRICULTURAL REALITY

Daniel Uribe1

1Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Desde la segunda guerra mundial la agricultura ha sustentado su desarrollo en la utilización de agentes pesticidas de síntesis química. Desafortunadamente estos desarrollos han estado li-gados a la generación de una serie de efectos negativos a nivel medioambiental, agronómico y de salud pública. Tales efectos han creado la necesidad de desarrollar estrategias agrícolas que remplacen o complementen la acción de los agentes de sínte-sis química. Dentro de estas estrategias, el control biológico de plagas ha tomado un papel preponderante ya que estas estra-tegias se perfilan como las alternativas mas adecuadas para el manejo de fenómenos de resistencia de insectos y para dismi-nuir la presión de dichos agentes sobre el ambiente así como su presencia en los productos agrícolas comerciales de exporta-ción. A pesar de la pertinencia tanto técnica como socio-econó-mica para el desarrollo de la industria de bioinsumos asociados al control biológico, el mercado mundial de biopesticidas no supera el 2% del mercado global de pesticidas. El objetivo del presente ensayo es discutir algunos elementos asociados a las limitaciones de los productos de control biológico para lograr un mayor desarrollo comercial. En ese contexto se hará énfasis en cinco frentes principales desde el punto de vista tecnológico como son: 1) comprensión del patosistema asociado al control biológico de insectos; 2) producción y formulación de agentes de control biológico; 3) entendimiento de la fisiología micro-biana como estrategia de mejoramiento de las formulaciones comerciales; 4) estudio de la genética de los agentes de control y 5) desarrollo de plantas transgénicas resistentes a insectos.

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Palabras clave: Control biológico, hongos entomopatógenos, Bacillus thuringiensis, pato-sistema.

ABSTRACT

Since the Second World War the development of the agricul-tural sector has been supported by the utilization of chemical pesticides. Unfortunately those developments have been re-lated to the generation of a series of negative effects on the environment, agriculture and public health. Such effects have created the necessity to develop agricultural strategies to repla-ce or to complement the pesticide action of the chemical pes-ticides. Within these strategies, the biological control has been taken a preponderant role due to their potential to manage insect resistance to chemical agents, to decrease the pressure of those agents on the environment and its presence on inter-national trade products from the agricultural sector. Despite of the technological developments and the relevance of the bio-logical control products into the agricultural sector, the world market of biopesticides does not represent 2% of the total glo-bal pesticides trade in the world. The aim of the present essay is to discuss some elements related with the limitations of the biological control products to achieve a higher commercial de-velopment. In this context emphasis will be made in five main technological issues: 1) understanding of the patho-system as-sociated with the biological control of insects; 2) production and formulation of biological control agents; 3) understanding of the microbial physiology as strategy to enhance the com-mercial formulations; 4) study of the genetics of the biological control agents and 5) development of transgenic plants resis-tant to insects.

Keywords: Biological control, entomopatogenic fungi, Bacillus thurin-giensis, patho-system.

INTRODUCCIÓN

El control biológico de plagas es una práctica agrícola que está co-brando cada vez más importancia dentro de los sistemas productivos a nivel mundial. La razón para esto reside en que debido a la globaliza-ción de los mercados estos son cada vez más exigentes en la generación

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de etiquetas de calidad, que certifiquen la implementación de sistemas productivos ambiental y socialmente sostenibles. Tales sistemas de cer-tificación están sustentados en una serie de estudios generados desde los años 70s. Estos estudios han demostrado los efectos adversos de una gran variedad de productos de síntesis química a nivel toxicológico, salud pública, fenómenos de resistencia y efectos ambientales. Por otra parte están las presiones políticas de los países desarrollados para esta-blecer sistemas de producción socialmente justos. La implementación de los sellos de calidad ha llevado a la exclusión del mercado de una gran cantidad de productos comerciales de síntesis química. Tal procedi-miento deja un espacio para la implementación y desarrollo de nuevas estrategias de manejo integrado de plagas (MIP). Estas estrategias están soportadas muchas de ellas en productos de control biológico (formula-dos a base de hongos, bacterias, virus y nematodos), los cuales son di-señados bien sea para remplazar (agricultura orgánica) o complementar la utilización de agentes de origen químico, que han sido prohibidos o están siendo empleados bajo ciertas restricciones en el mercado (Pickett et al., 1995).

El establecimiento de las reglas de mercadeo sustentadas en sellos de calidad o producción “verde”, tiene obviamente un efecto en el mercado mundial. Este efecto es evidente ya que todos los países que deseen implementar una economía de exportación, están obligados a cumplir con los niveles mínimos residuales de pesticidas químicos. Esto si no se quieren ver sometidos al veto internacional para la comercialización de sus productos agrícolas. Como consecuencia de la implementación de estas políticas de producción, ha habido un incremento en el registro de nuevos productos comerciales de control biológico en el mercado a nivel mundial (Butt et al., 2001). Sin embargo, a pesar que el conocimiento generado a nivel bio-tecnológico ha permitido el desarrollo de mejores productos biológicos y que las necesidades agronómicas y las presiones internacionales están promoviendo el desarrollo de estrategias ambiental y socialmente más amigables mientras que las exigencias del mercado están favoreciendo indirectamente el desarrollo de la industria de control biológico, la comercialización actual de estos productos no supera el 2% del total del mercado de pesticidas. La razón para este hecho reside bási-camente en que la mayoría de agentes de control biológico (ACB) produ-cen resultados inconsistentes en campo, además de desarrollar procesos infecciosos lentos en comparación con los agentes de síntesis química (St Leger y Screen 2001; Butt et al., 2001).

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DIRECCIONANDO EL DESARROLLO DE LOS AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO DE INSECTOS

El implemento de estrategias para el desarrollo del uso de ACB en el sector agrícola, debe contemplar la aplicación de esfuerzos desde el punto de vista técnico, agronómico, socio-económico y político. Ningu-na de estas áreas debe ser descuidada ya que todas ejercen una fun-ción particular en el desarrollo del mercado de cualquier producto en el sector agrícola, especialmente aquellos relacionados con la seguridad alimentaria de un país. Teniendo en cuenta la temática de este libro, a continuación me centraré en las principales áreas de investigación que a mi manera de ver se deben impulsar desde el punto de vista técnico y agronómico para lograr desarrollar el mercado de los ACB.

1. Comprensión del pato-sistema asociado al control biológico de insectos

Con el objeto de lograr una mayor eficacia de los productos a base de ACB en campo, se han venido desarrollando timidamente estudios agronómicos con una visión más ecológica. Esta visión busca entender el pato-sistema en el contexto de control biológico de plagas, definiendo como un pato-sistema la interacción hospedero - patógeno - ambiente (Fargues, 2003). La comprensión de la dinámica de esta interacción, se espera que conduzca a un conocimiento holístico de la relación que ocu-rre a nivel de campo, de tal forma que se logre manipular algunas varia-bles de los elementos del pato-sistema y así incrementar la efectividad en campo de los productos de control biológico.

Un ejemplo ilustrativo de las interacciones a nivel de pato-sistema esta dado por los trabajos descritos por Inyang et al. (1999 a y b) en el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae. En estos trabajos fue demos-trado que la planta hospedera Brassica napus puede interferir con el efecto de M. anisopliae sobre el insecto blanco Phaedon cochleariae. Esta interacción se lleva a cabo al diluir el inoculo del hongo por un atrapamiento de este en la capa cérica epicuticular de la planta o por la presencia de ciertos exudados o compuestos alelo-químicos que afec-tan las esporas o principio activo de interés. Efectos similares han sido descritos en formulaciones comerciales de la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis, donde se ha encontrado que los taninos presentes en árboles de cedros inhiben la acción biopesticida de este agente de control biológico (ACB) (Appel, H.M. y J.C. Schultz, 1994). Por otra parte

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es sabido que algunas plantas al ser ingeridas por insectos plaga pueden incrementar la susceptibilidad de estos a la infección fúngica (Butt et al., 2001b). Estos ejemplos ponen en evidencia que la comprensión de cada pato-sistema particular es importante al momento de diseñar una estra-tegia de control biológico.

2. Producción y formulación de agentes de control biológico de insectos

Otro frente de investigación muy importante ha sido el estableci-miento de estrategias de producción y formulación adecuadas. Tales estrategias han sido diseñadas primordialmente para la obtención de la cantidad suficiente de principio activo, con el objeto de reproducir los efectos de patogenicidad obtenidos a nivel de laboratorio (Feng et al., 1994; Wraigth et al., 2001). Hoy día se han logrado establecer sis-temas de producción del orden de 1013 conidias.kg-1 de sustrato sólido para Beauveria bassiana (Bradley et al., 1992) y 1012 para Metarhizium anisopliae, o 1011 ufc.mL-1 de Bacillus thuringiensis, que satisfacen las necesidades de campo en forma relativamente eficiente (Dorta y Ar-cas, 1998; Jenkins et al., 1998). Sin embargo, en no pocas ocasiones, el énfasis en la investigación para el desarrollo de estos sistemas de pro-ducción ha derivado en que se sacrifique la calidad de los formulados obtenidos en nombre de la cantidad del mismo. Esto bajo la filosofía que la inundación de propágulos en el campo debe ser suficiente para llevar a cabo su función.

En el afán de satisfacer las necesidades de producción a nivel comer-cial, se han dejado a un lado características relevantes de los productos, como mantenimiento de la vida útil de estos bajo condiciones de alma-cenamiento. En general, con excepción de los productos comerciales a base de B. thuringiensis, los formulados de ACB de insectos, no mantie-nen un alto nivel de virulencia por periodos superiores a los seis meses de anaquel, inclusive en el marco de una cadena de frío. Además del al-macenamiento es importante considerar el desarrollo de formulaciones que sean compatibles con el empleo de mezclas de diferentes agentes de control biológico y/o químico, de tal forma que se amplíe el rango de acción ecológico y agronómico de los productos comerciales diseñados para el control biológico de insectos (Sáenz-de-Cabezón et al., 2003). Por último, dadas las particularidades de los principios activos asociados a los ACB, sus exigencias ambientales para el desarrollo de la enferme-

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dad, además de su estrecha relación entre dosis y el desarrollo de la misma, es importante desarrollar sistemas de aplicación del principio activo en campo, que permitan asegurar que este alcanza su blanco en las concentraciones necesarias para el desarrollo de la enfermedad. En este contexto algunos avances se han realizado en el desarrollo de com-puestos químicos o agentes visuales que atraen a los insectos a controlar permitiendo la auto-inoculacion masiva de estos (Pell et al., 1993; Mul-rooney y Elmore, 2000). Sin embargo, faltan estudios que identifiquen incluso el efecto de los sistemas convencionales de aplicación sobre las formulaciones de origen biológico en campo.

3. Fisiología como estrategia de mejoramiento de las formulaciones

Un tercer frente de investigación muy importante, especialmente den-tro del contexto de los hongos entomopatógenos, consiste en el estudio y manipulación de la fisiología microbiana. Algunos de estos estudios han sido diseñados para que se puedan acumular reservas endógenas útiles, como por ejemplo polihidroxi alcoholes, los cuales se acumulan en célu-las fúngicas, dándoles la capacidad de soportar actividades metabólicas incluso en presencia de baja actividad de agua (aw). Esta actividad xero-tolerante en hongos entomopatógenos es un factor reconocido como critico para el desarrollo de la actividad biopesticida, ya que usualmente procesos como germinación y la virulencia en general se ven afectados debido a una baja disponibilidad de agua en el medio. Así mismo, fac-tores como la edad del cultivo, temperatura y pH es sabido que afectan los contenidos de poliholes y trealosa de las esporas de hongos ento-mopatógenos (Hallsworth y Magan 1996), solutos que tienen un papel importante en ajuste osmótico y han sido asociados con resistencia a ambientes extremos, germinación acelerada, incremento de la virulencia y de la vida de almacenamiento de los propagulos (Hallsworth y Magan 1996), factores todos estos de vital importancia para el desarrollo de productos de control biológico.

4. Entendiendo la genética de los agentes de control biológico

El cuarto frente de investigación muy importante para los agentes de control biológico se ha dado en términos de un conocimiento mas deta-llado de la genética de estos organismos. El ACB de insectos que mas ca-mino a recorrido en este sentido es B. thuringiensis (B.t), agente de tipo bacteriano que inició su producción y comercialización a escala industrial en Francia a partir de 1956 y hacia 1961 en Estados Unidos. A partir de

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esta fecha mucha ha sido la investigación asociada a este microorga-nismo, lo que ha conducido al conocimiento detallado del mecanismo de acción de las proteínas asociadas al cristal (delta endotoxina), prin-cipal agente toxico de B.t. Este conocimiento ha permitido el desarrollo de diferentes productos recombinantes que han derivado en proteínas híbridas que poseen un rango de acción biopesticida ampliado. Así mis-mo, se han creado cepas potencialmente mas activas al convertirlas en microorganismos hiperproductores de una toxina particular. Una mani-pulación en este sentido ha sido la creación de mutaciones puntuales en diferentes dominios de la delta endotoxina, como en el caso de la pro-teína Cry4Ba de B. thuringiensis var israelensis, en la que se realizó una mutación en el tercer pliegue del dominio II, lográndose un incremento en actividad 700 veces mayor contra los mosquitos Culex quinquefascia-tus y 285 veces mayor contra C. pipiens (Abdullah, et al., 2003). Algunas de estas modificaciones han logrado ser comercializadas, tal es el caso de RavenTM, un producto comercial basado en una cepa que posee genes cry3 con actividad contra coleópteros y genes cry1 con actividad contra lepidópteros, lo cuál fue logrado luego de emplear técnicas de trasconju-gación. Esta mezcla de genes cry permite el control de un amplio rango de insectos presentes en cultivos de papa, tomate y berenjena, todos pertenecientes a la familia solanaceae (Deacon, 2005).

En el caso de los hongos entomopatógenos en un periodo relativamen-te reciente se han venido implementando técnicas moleculares como el microarreglo, la hibridización diferencial, mutagénesis aleatoria y dirigida entre otras, diseñadas para identificar genes específicos asociados con factores de virulencia de dichos agentes. Tales estudios han permitido identificar una serie de genes relacionados con factores de especificidad de las cepas, enzimas relacionadas con penetración del hospedero, pro-teínas que inactivan las defensas del mismo o toxinas requeridas para el desarrollo de los síntomas de la enfermedad, que poseen un potencial para ser empleados en el mejoramiento de la efectividad de los agentes de control (St Leger y Screen, 2001). En este contexto St Leger et al. en 1996 desarrollaron una cepa transgénica de M. anisopliae sobre-produc-tora de una proteasa tóxica que terminó en un micoinsecticida mejorado. Enmarcados dentro de la línea de investigación de manejo integrado de Hypothenemus hampei el grupo de investigación en hongos entomo-patógenos de Cenicafe ha venido realizando aproximaciones similares donde se han transformado cepas de B. bassiana con proteasas tipo subtilisinas (pr1A) y esterazas (ste1) aislados de M. anisopliae (Góngora,

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2005). Estos trabajos han logrado incrementar la actividad biopesticida contra H. hampei en un 20% logrando inclusive tiempos letales (LT50) más cortos (Góngora, 2005).

5. Desarrollo de plantas transgénicas resistentes a insectos

Finalmente, otra línea de investigación que ha permitido desarrollos tecnológicos que han derivado en la generación de productos comercia-les muy importantes para la agroindustria es la creación de plantas trans-génicas. Diversas variedades especialmente de maíz y algodón han sido transformadas con genes usualmente codificantes de proteínas Cry que confieren resistencia a insectos plaga específicos de estos cultivos. Por ejemplo, en el año de 2004 el mercado global de plantas transgénicas ascendió a 3,8 billones de dólares con 81 millones de hectáreas sembra-das, de las cuales 22,5 millones poseían genes cry solos o en mezcla con genes de resistencia a herbicidas (James, 2004).

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ii. Fermentación de microorganismos

261

PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES PARA UNA AGRICULTURA

SOSTENIBLE

PRODUCTION OF BIOFERTILIZERS AND BIOCONTROL AGENTS FOR SUSTAINABLE AGRICULTURE

NUBIA MORENO1

1Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería Instituto de Biotecnología

Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá[email protected]

RESUMEN

El desarrollo de un producto comercial de origen biológico para ser empleado como insumo agrícola se inició con la bús-queda y selección de microorganismos que tuvieran actividad fijadora de nitrógeno, solubilizadora de fosfatos y/o de acción controladora de fitopatógenos, en zonas cultivadas tradicio-nalmente con arroz (Tolima y los Llanos orientales, Colom-bia). El trabajo coordinado entre el sector agrícola, productivo y científico permitió el desarrollo de cuatro productos que hoy cuentan con registro comercial del ICA, que son una alternati-va rentable para el agricultor disminuyendo el uso de produc-tos químicos y mejorando la producción.

Palabras clave: Insumos biológicos, biofertilizantes, Fosfosol, Trifesol.

ABSTRACT

The development of a biological product to be used as agricultural additive was initiated with the search and selection of microorga-nisms with either nitrogen fixing activity, phosphate solubilizer ac-tivity and/or controlling activity against plant pathogens in zones cultivated traditionally with rice (Tolima and Llanos Orientales, Co-lombia). Coordinated works between the agricultural, productive and scientific sectors allowed the development of four products accounting with commercial registry given by ICA, which repre-sent a profitable alternative for the agriculturist, diminishing the chemical agents use and improving their yields in production.

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Key Words: Biological products, biofertilizer, Fosfosol, Trifesol.

INTRODUCCIÓN

El manejo actual de los sistemas de producción agrícola en Colombia provoca un deterioro de las propiedades biológicas, físicas y químicas del recurso natural suelo. En las dos últimas décadas el consumo de fertili-zantes en nuestro país pasó de 80 a 280 kilogramos de fertilizante por hectárea de tierra arable y este tipo de fertilización química conduce a la salinización de los suelos de cultivos, lo cual esta en detrimento de la calidad del mismo (Zapata y Roy, 2004) y genera problemas de contami-nación del agua y en muchos casos de alimentos con agro-tóxicos, con el consecuente deterioro ambiental y con efectos sobre la salud humana.

Por otra parte, la microbiota edáfica resulta afectada por el uso excesi-vo de compuestos químicos que se refleja en el descenso de las pobla-ciones naturales. Los microorganismos del suelo, en especial bacterias y hongos, juegan un papel importante en el ciclaje de nutrientes. La apli-cación mediante incorporación (inoculación) de poblaciones apropiadas eficientes y con capacidad rizosférica competitiva, en especial ciertos grupos funcionales (solubilizadores de fosfatos, fijadores de nitrógeno), ponen a disposición de las plantas nutrientes esenciales, incidiendo así en la fertilidad del suelo y la productividad.

BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES

El desarrollo de tecnologías limpias con producción de biopreparados microbianos, (biofertilizantes y/o fitoestimuladores) es una alternativa para la sustitución parcial o total de fertilizantes minerales con la conse-cuente disminución de costos y aumento en la producción de alimentos limpios, trayendo beneficios al destinatario del producto y a los consu-midores, sin alterar la seguridad ambiental, garantizando un equilibrio ecológico dentro del ámbito de la agricultura sostenible. Así mismo, el Manejo Ecológico de Plagas Agrícolas, conlleva una drástica disminución o la eliminación total del uso de agroquímicos. Los Controladores Bio-lógicos y principalmente los Bioplaguicidas de origen microbiano están ganando terreno a escala mundial (Higa, 1995), pero su uso extensivo depende de la disponibilidad de cantidades suficientes de productos de excelente calidad y de su correcto manejo.

Los microorganismos son importantes en las transformaciones bio-químicas que tienen lugar en el suelo y juegan un papel activo en su

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fertilidad, en ciclos biogeoquímicos y de nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo, etc.) requeridos para el crecimiento de las plantas. Por ejemplo, muchos microorganismos son responsables de la descomposición de la materia orgánica y por consiguiente de la mineralización y reciclaje de nutrientes. Otros pueden aumentar la cantidad de nutrientes, como los fijadores biológicos de nitrógeno, los cuales transforman el nitrógeno gaseoso (N2) presente en la atmósfera en compuestos nitrogenados solubles que las raíces pueden absorber (Dutto et al., 2000). También la disponibilidad de un nutriente mineral como el fósforo puede in-crementarse mediante la acción de microorganismos solubilizadores de fosfatos inorgánicos y el producto de su acción (fosfatos solubles) puede ser utilizado directamente por las plantas o translocados a és-tas mediante las micorrizas, o con otros hongos con probada actividad solubilizadora pero cuyo mecanismo de acción no está bien determi-nado.

La tendencia de la agricultura mundial es buscar la sostenibilidad de los cultivos mejorando su rentabilidad y cuidando el medio ambiente, las nuevas tecnologías en agricultura sostenible brindan alternativas de origen biológico las cuales son más económicas y permiten recuperar el suelo. Dentro de este contexto la ingeniería química y de manera espe-cifica los Bioprocesos cuentan con las herramientas que nos permiten obtener bienes que contribuyen a esta solución (Moreno, 2004).

Figura 1. Penicillium janthinellum, hongo aislado solubilizador de fosfato, empleado en la producción de Fosfosol.

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PRODUCCIÓN DE BIOINSUMOS

El objetivo del proyecto es aislar del suelo cepas nativas de bacterias fijadoras de nitrógeno, hongos solubilizadores de fosfato y biocontro-ladores de enfermedades producidas por hongos patógenos del suelo; seleccionando de estas cepas las más activas para posteriormente pro-ducir un formulado que pueda ser aplicado en la agricultura, de acuer-do a unos protocolos establecidos para el desarrollo de campo de cada producto con el fin de ser aplicado en los cultivos según sus necesidades nutricionales y sus problemas fungosos y así poder hacer un aporte a la agricultura nacional, tan afectada por el gran consumo de productos quí-micos. El uso de esta tecnología puede reducir los costos de producción y disminuir el impacto negativo sobre el medio ambiente.

Para el desarrollo de este tipo de tecnología se requiere del concurso de los diferentes GREMIOS AGRICOLAS que identifican las necesidades requeridas para una mayor competitividad de cada uno de los cultivos, de las UNIVERSIDADES Y CENTROS DE INVESTIGACIÓN que desarrollen las tecnologías apropiadas para dar las soluciones a los distintos requeri-mientos, LA EMPRESA PRIVADA que desarrolle los proyectos productivos tendientes a solucionar los requerimientos de los gremios con las formu-laciones apropiadas dadas por los centros de investigación, haciendo las inversiones en equipos, maquinaria y en marketing.

En el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colom-bia, IBUN, se han obtenido los productos TRIFESOL®, FOSFOSOL®, DIMA-ZOS® Y DIMARGON® que son el fruto de la investigación y desarrollo de un grupo interdisciplinario conformado por profesionales del laboratorio de Microbiología del suelo del departamento de Biología, el laboratorio de Química Agrícola del departamento de Química, ambos de la Facultad de Ciencias y el laboratorio de Fermentaciones del IBUN, en conjunto con la empresa BIOCULTIVOS S. A.

La planta piloto fue diseñada, puesta en operación y actualmente per-mite una producción semicomercial. Sus equipos principales son los bio-reactores de 1000 y 100 litros, y sus formulaciones otorgan características que disminuyen costos e incrementan la productividad de los cultivos. Esta planta piloto, ubicada en el IBUN, cuenta con el registro de produc-tor otorgado por el ICA y los respectivos registros de venta de este ente regulador para los cuatro productos.

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Figura 2. Reactor de 1000 litros de la planta piloto del IBUN.

Todos los ensayos de validación en campo, bajo protocolos apro-bados por el ICA, fueron realizados por agrónomos del Departamen-to Técnico de Biocultivos S.A. y asistidos por el Departamento Técnico de FEDEARROZ. Estos productos se están aplicando en cultivos de arroz en más de 3000 hectáreas en los llanos Orientales (Villavicencio, Yopal, Acacias) y Tolima (Armero, Saldaña y Venadillo); en cultivos de algodón en el Tolima en mas de 700 hectáreas, en la Costa Atlántica (Arauquita) en unas 1500 hectáreas y actualmente se están desarrollando ensayos de validación en caña de azúcar con el ingenio Rio Paila en el Valle del Cauca. Adicionalmente, en trabajo conjunto con FEDEARROZ y el aval del ICA, se lleva a cabo la validación de la producción de semilla certificada de arroz inoculada con TRIFESOL®.

TRIFESOL® COMO CONTROLADOR BIOLÓGICO DE RHIZOCTONIA SOLANI EN CULTIVOS DE ARROZ

El manejo integrado de enfermedades ofrece unos buenos resultados y un bajo impacto ecológico sin alterar las condiciones naturales del am-biente. La posibilidad de controlar enfermedades en las plantas con mi-

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croorganismos antagonistas es una alternativa para el manejo integrado de las enfermedades.

TRIFESOL® Trichoderma viride, ejerce inhibición del crecimiento mi-celial sobre Rhizoctonia solani, compitiendo por espacio al invadir su sustrato de crecimiento y las raíces. Por su acción celulolitica, TRIFESOL® ayuda a degradar la celulosa y ligninas de los materiales orgánicos del suelo eliminando hospederos de enfermedades, evita el consumo de nitrógeno en la descomposición de los residuos de cosecha aumentando la fertilidad del suelo y además incrementa la rentabilidad del cultivo por la reducción de los costos, debido a la disminución en la aplicación de funguicidas químicos e incremento de la producción.

Figura 3. Productos Trifesol y Fosfosol.

FOSFOSOL® Biofertilizante solubilizador de fosfatos

El fósforo es esencial para el crecimiento de las plantas, su utilización en el suelo esta restringida por la formación de compuestos insolubles y por su adsorción en las partículas del suelo, especialmente en suelos ácidos donde la presencia de hierro y aluminio hace que se precipi-ten junto con el fósforo en forma de fosfatos insolubles que impiden la disponibilidad de fósforo natural. Estas acciones rápidas de fijación traen como resultado una baja eficiencia de la fertilización fosfórica, que

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puede oscilar entre un 10 y 25%, manifestada en la disminución de la disponibilidad de este nutrimento con presencia de una gran proporción de fósforo inorgánico. Muchos microorganismos del suelo, incluyendo bacterias, hongos y actinomycetes, son capaces de solubilizar los com-puestos de fósforo insoluble y así incrementar las cantidades de este en solución.

FOSFOSOL® Penicillium janthinellum, libera el fósforo que está fijado por las arcillas del suelo, mejora la eficiencia del fertilizante fosfórico aplicado y se puede emplear en cualquier tipo de suelo, proporcionando un mejor desarrollo inicial y mayor competencia con las malezas, mayor formación de raíces (lo cual permite un buen anclaje y menor caída del arroz) y mejor toma de nutrientes, menor pérdida por ataque de fitopa-tógenos del suelo por competencia de espacio, ahorro del 30 al 50% del fertilizante fosfórico recomendado en las normas de manejo del cultivo y mejor calidad de la producción del cultivo (granos de mayor tamaño y peso en el cultivo de arroz). En la Tabla 1 se observa el efecto de la apli-cación del Fosfosol en la producción de arroz en cuatro municipios del Tolima, donde el ensayo se realizó aplicando el producto sobre semilla en una dosis de 1Kg de producto por hectárea.

Figura 4. A) Se observa como Trichoderma viride aplicado a semilla de arroz invade el espacio disponible y no permite que los otros microorganismos fitopatógenos presen-tes en la semilla se multipliquen. B) El desarrollo radicular alcanzado por la planta en la que se emplean los productos aplicados a semilla es mayor (supera al testigo en un 20% en volumen), lo que le disminuye la posibilidad de volcamiento y mejora la toma de nutrientes.

A B

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Figura 5. Observaciones de campo. Las espigas son de mayor tamaño y número de espigas por panícula, se obtienen más granos llenos y menor numero de granos vanos.

Tabla 1. Efecto de la aplicación del solubilizador de fosfato en la producción de arroz en el departamento de Tolima, Colombia (Torres, 2002).

Municipio Finca LoteRendimiento Kg/Ha

Fosfosol TestigoArmero El Puente Arauca 9750 7062Lerida Piedrapintada Mateguadua 8656 8137La Sierra Balmoral Guante 9375 8938Venadillo La Pilar Cinco 7147 5893

DIMARGON® y DIMAZOS® Bacterias fijadoras de nitrógeno

El nitrógeno disponible para las plantas es el que se encuentra en for-ma soluble, esto se logra a través de la actividad microbiológica, siendo mayor a un pH cercano a la neutralidad en lo que respecta a la nitrifica-ción y fijación del nitrógeno. DIMARGON® Azotobacter chroococcum (re-comendado para algodón, hortalizas, frutales) y DIMAZOS® Azotobacter chroococcum y Azospirillum amazonense (arroz, pastos, cereales) pre-sentan una opción en la nutrición vegetal. Estos productos contienen bacterias fijadoras de nitrógeno de forma asociativa, las cuales son al-

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tamente eficientes en la transformación del nitrógeno atmosférico en amonio, además de ser bacterias promotoras del crecimiento vegetal al producir fitohormonas tales como citoquininas, giberelinas, ácido indola-cético, entre otros. Con su empleo en los cultivos se logra buen vigor en la germinación y plántulas más desarrolladas, mayor formación de raíces (mejor toma de nutrientes y mejor anclaje) y mejor calidad en la produc-ción del cultivo, así como ahorro entre el 5 y 15 % del fertilizante nitroge-nado recomendado en las normas de manejo del cultivo en el caso del DIMARGON® y entre el 20 y 30 % en el caso del DIMAZOS®. También se han evidenciado incrementos del rendimiento entre un 5 y 10 % en el caso de DIMARGON® y entre el 15 y 20 % para DIMAZOS®.

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DETERMINACIÓN DEL VALOR FERTILIZANTE DE BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFATO

ASOCIADAS A CULTIVOS DE ARROZ

BIOFERTILIZER POTENTIAL OF PHOSPHATE SOLUBILIZING BACTERIA ASSOCIATED WITH RICE CROPS

NELSON VALERO1

1Universidad Popular del Cesar. Programa de Microbiologí[email protected]

RESUMEN

Se presenta una metodología empleada para la obtención de bacterias solubilizadoras de fosfatos con potencial para la ela-boración de biofertilizantes. Se aislaron bacterias fosfato-solu-bilizadoras nativas asociadas a cultivos de arroz (Oryza sativa L). Se evaluó la actividad solubilizadora de fosfatos in vitro, se determinó la capacidad para producir ácido indolacético, el efecto promotor del crecimiento vegetal sobre plantas de arroz y el valor fertilizante a través de balances de fósforo a nivel de invernadero. Los aislamientos bacterianos más promisorios pre-sentaron efectos positivos que ocurren por la combinación de varias características; aumentan el estatus nutricional del suelo y estimulan el crecimiento vegetal a través de la producción de sustancias promotoras del crecimiento. Adicionalmente, algu-nos asilamientos evaluados disminuyeron la fijación de fósforo en el suelo, actuando como fertilizantes de liberación lenta y acción sostenida.

Palabras clave: Bacterias solubilizadoras de fosfatos, arroz, Oryza sativa, biofertilizante.

ABSTRACT

Native phosphate solubilizing-bacteria were isolated from com-mercial rice crops (Oryza sativa L.). The specific activity of each isolate was evaluated under in vitro conditions; a greenhouse assay was designed to evaluate the plant growth promoting effect and the fertilizing capacity using a phosphorus balance. In

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addition, the ability to produce indole 3- acetic acid was deter-minated. Some selected isolates exhibit a features’ combination that offer a high potential to produce biofertilizers, increasing the soil nutritional content and improving the plant capacity to assimilate phosphorus and nitrogen. In addition, the phosphate solubilizing bacteria diminished the phosphorus fixation in soil, acting like slow-release fertilizers with a long-term effect.

Keywords: Bhosphate solubilizing bacteria, rice, Oryza sativa, biofertil-izer.

INTRODUCCIÓN

Se presentan los resultados de una investigación que estuvo orientada a la determinación de algunos atributos de bacterias solubilizadoras de fosfatos, aisladas a partir de cultivos industrializados de arroz, evaluando el potencial de estos microorganismos del suelo como biofertilizadores y promotores del crecimiento vegetal, con el fin de obtener microorganis-mos promisorios para desarrollar la producción de biofertilizantes a partir de cepas seleccionados a nivel de laboratorio, invernadero y campo.

Para la experimentación se siguió el criterio que microorganismos pro-venientes de suelos sometidos a cultivo intensivo tradicional pueden ser competitivos para aplicaciones en suelos sometidos a situaciones seme-jantes, puesto que posiblemente ya están adaptados a estas condiciones “adversas” donde otros organismos con alta efectividad en laboratorio e invernadero, pero aislados de ecosistemas más conservados, encontrarán limitantes para su actividad, por la presencia de residuos de plaguicidas, la fertilización química y la alteración de las propiedades naturales del suelo, entre otros factores. Por tanto, el hecho de determinar la potencia-lidad de bacterias cultivables en laboratorio, provenientes de suelos de cultivos industrializados, ofrece la posibilidad de reintroducir estos micro-organismos como biofertilizantes, con mayor probabilidad de éxito.


Obtención de los aislamientos

Para el aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfatos inorgánicos a parir de muestras de rizósfera de arroz, se utilizó el medio según Sun-dara, Rao y Sinha (SRS) siguiendo el procedimiento desarrollado por Pra-mer y Schmidt (1964), realizando diluciones y siembra en placa además

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de siembra de partículas de suelo y segmentos de raíces, directamente en medio SRS sólido según Domsch y Gams (1967, Citado por Gualdrón et al., 1997). Se seleccionaron las colonias bacterianas que crecieron aci-dificando el medio de cultivo y formando un halo transparente alrededor, indicando actividad solubilizadora de fosfato.

Valoración de la actividad solubilizadora de fosfatos

Se realizó preliminarmente una valoración cualitativa de la eficiencia relativa de solubilización de los aislamientos en medio SRS sólido, em-pleando el método propuesto por Sundara Rao y Sinha (1963). Se se-leccionaron los aislamientos que presentaron la mayor eficiencia y se realizó una determinación cuantitativa de solubilización de fosfatos en medio líquido; para ello se determinó el contenido final de fósforo so-luble presente en un filtrado de medio SRS líquido inoculado con el microorganismo de interés, determinado mediante el método del mo-libdovanadato, utilizando la prueba analítica spectroquant® fosforo (vm) Merck “phosphate test”. Finalmente se evalúo el comportamiento de la actividad solubilizadora de fosfatos en el tiempo en medio SRS líquido y se seleccionaron los mejores aislamientos.

Valoración del efecto promotor del crecimiento vegetal

Se diseñó un ensayo de invernadero para evaluar el efecto promo-tor del crecimiento sobre plantas de arroz, tras la aplicación de inóculos de cultivos bacterianos, evaluando la estimulación de la germinación, el efecto sobre la longitud de raíces y biomasa de las plantas y el efecto fertilizante, mediante análisis de contenido de nitrógeno y fósforo en el sistema suelo - planta. Para ello el ensayo fue realizado en condiciones controladas para el cultivo, sembrando semillas en un suelo proveniente de una finca arrocera con contenido medio a bajo de fósforo soluble y fertilizado químicamente con los nutrientes requeridos para un buen cre-cimiento del arroz, excepto fósforo. Se siguió un diseño experimental de bloques completos aleatorizados, teniendo un control sin inocular y un control con fertilización química fosforada. Para cada variable medida se realizaron análisis de varianza y comparaciones múltiples por medio de la prueba de Dunnet. Se determinó el contenido inicial y final de fósforo soluble en suelo y el fósforo total asimilado en la biomasa, después de la mineralización completa con ácido sulfúrico concentrado en presencia de cobre.

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Producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal

Inicialmente se determinó la producción de auxinas como el ácido indol acético (AIA). Se partió del supuesto que las células bacterianas sintetizan la sustancia y la liberan al medio, donde es absorbida y apro-vechada por las plantas. De acuerdo a lo anterior, se planteó la obtención de extractos a partir de los cultivos bacterianos, para determinar la ca-pacidad para producir AIA por el método colorimétrico de Salkowsky de acuerdo al procedimientos descrito por Balota et al. (1997).


Inicialmente se obtuvieron 13 morfotipos diferentes con buena expre-sión de la actividad solubilizadora de fosfatos en medio SRS sólido, per-tenecientes a los géneros Klebsiella y Pseudomonas. Se seleccionaron cuatro aislamientos que presentaron mayores halos de solubilización y de actividad en medio líquido, los cuales además presentaron una activi-dad de solubilización sostenida en cultivo líquido en un tiempo evalua-do de 15 días. Estos aislamientos fueron denominados BSF1 (Klebsiella oxytoca), BSF7 (Klebsiella oxytoca), BSF8 (Pseudomonas aeruginosa) y BSF12 (Pseudomonas sp.).

Los aislamientos BSF7, BSF8 y BSF10 estimularon significativamente la velocidad y el porcentaje de germinación de las semillas (Figura 1). Todos los aislamientos de BSF ensayados mostraron un efecto positivo sobre la biomasa y la longitud de raíces y longitud del follaje, con respuestas su-periores al tratamiento control y al tratamiento con fertilización química. Sin embargo, el aislamiento BSF12 presentó un efecto significativamente mayor que el de los demás aislamientos y el tratamiento con fertilización química, con un valor alfa de 0,05, según la prueba de Dunnet, sobre los parámetros de longitud de raíces, longitud y área del follaje y biomasa foliar.

En la Tabla 1 se presentan los datos de fósforo soluble en suelo an-tes y después del ensayo de invernadero y el fósforo asimilado por las plantas en cada tratamiento. Al final del experimento, las cantidades de fósforo soluble en el suelo fueron menores en todos los tratamientos con respecto a la cantidad inicial, siendo esta disminución mucho menor en el tratamiento control. En los tres tratamientos donde se aplicó al suelo bacterias solubilizadoras de fosfatos se presentó mayor asimilación de fósforo que en el tratamiento con fertilización química, con incrementos

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de 63, 73 y 128 % para los tratamientos BSF 7, BSF 8, y BSF 12 respec-tivamente frente al control, mientras que el tratamiento con fertilizante químico presentó un incremento del 39% en la asimilación de fósforo.

Sin tener en cuenta las pérdidas de fósforo por lixiviación, que se asu-men despreciables en este caso, se puede considerar el siguiente balan-ce de fósforo en el suelo: P soluble final = P soluble inicial - ( P asimilado + P fijado). Donde el P fijado corresponde al fósforo ligado al suelo como fósforo en materia orgánica, fosfatos de calcio, fosfatos de aluminio, fos-fatos de hierro y fósforo ligado a partículas de arcillas. Entonces, P fijado = P soluble inicial - (P soluble final + P asimilado).

Figura 1. Efecto de bacterias solubilizadoras de fosfato sobre la germinación de semillas de trigo.

Como se observa en la Tabla 1, la pérdida mayor por fijación se obtuvo en el tratamiento con fertilización química en el cuál se agregó fosfato soluble. La menor fijación ocurrió en el tratamiento control, por tanto se comprobó la estimulación de la fijación por los componentes del sue-lo (posiblemente formando fosfatos de calcio insoluble) al agregar fer-tilizantes. Los tratamientos con BSF presentaron menor fijación que el tratamiento con fertilización química; en particular el aislamiento BSF 12 que redujo en un 45% la fijación de fósforo, considerando que en el tratamiento con fertilización química ocurrió un 100% de la fijación posi-

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ble (Figura 2). Así, este efecto de las bacterias solubilizadoras de fosfato puede ser asociado con el de un fertilizante de liberación lenta.

Tabla 1. Balance de fósforo tras 40 días de la inoculación de bacterias solubilizadoras de fosfatos (BSF) en suelo cultivado con plantas de arroz.

Tratamiento Contenido de P soluble en suelo P asimilado en biomasa vegetal P fijado

Nitrógeno en la biomasa

P inicial P final % P foliarCantidad

(mg)*%

incremento(mg) % mg

BSF 7 50 21,2 0,301 2,04 63 30,84 4.11 27.91BSF 8 50 16,7 0,297 2,17 73 35,47 3.95 28.85BSF 12 50 32,2 0,296 2,86 128 20,66 3.94 41.65

Fert. química 64,6 28,8 0,232 1,74 39 37,54 3.74 20.13Control 50 47,3 0,272 1,25 --- 3,45 3.15 19.48

* El valor corresponde a la cantidad de fósforo promedio asimilado por 10 plantas en cada tratamiento.

Figura 2. Efecto de la actividad de bacterias solubilizadoras de fosfato sobre proceso de fijación de fósforo en el suelo.

Aún cuando en los tres tratamientos con BSF se determinó una menor cantidad de fósforo soluble al final del experimento, las plantas corres-

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pondientes a los tratamientos con BSF presentaron una mayor asimi-lación de fósforo en la biomasa, e incluso una mayor asimilación de nitrógeno. Esto indica una un efecto sobresaliente en la capacidad de la planta para asimilar nitrógeno y fósforo soluble y se puede relacionar cla-ramente con los resultados de longitud radical y biomasa foliar obtenidos para estos tratamientos.

La acción de estas bacterias es análoga a la aplicación de un fertilizan-te convencional, es decir, a medida que se aplican formas de fosfatos solubles a un suelo con alto potencial fijador de fósforo, se incrementa el proceso de fijación del mismo, lo cual se evidenció al no presentarse fijación de fósforo en el tratamiento control, al cual no fue aplicado ferti-lizante químico ni bacterias. Pero la solubilización sostenida y constante de fosfatos por parte de las bacterias hace más eficiente la asimilación por las raíces, hecho que también se evidencia por el comportamiento del tratamiento control donde se presentó al final mayor contenido de fósforo soluble en suelo pero menor asimilación, lo cual se ve reflejado en una menor biomasa. A largo plazo la aplicación de bacterias solubi-lizadoras de fosfato, también disminuye la actividad fijadora de fósforo que se presenta generalmente en el suelo al aplicar la fertilización. Esto se ve especialmente con el aislamiento BSF 12 que redujo la fijación, favoreció el crecimiento vegetal y la asimilación de fósforo y nitrógeno. Para comprobar lo anterior sería necesario realizar estudios detallados de la dinámica de las formas de fósforo en el suelo, al aplicarle estos inoculantes bacterianos.

En general todos los aislamientos evaluados preliminarmente mos-traron la capacidad de producir AIA a las 72 horas. El asilamiento BSF7 presentó la mayor capacidad (18,39 ppm). La capacidad para producir AIA por microorganismos de interés biofertilizante es considerada como un parámetro de calidad (Almonacid et al., 2000) puesto que esta carac-terística esta relacionada con aumentos en la longitud de raíces, gene-ración de raíces secundarias y pelos radicales que le confiere a la planta mayor superficie de búsqueda y absorción de nutrientes.

Varios aislamientos estudiados presentaron características sobresalien-tes en cuanto a actividad específica a nivel de laboratorio, capacidad para promover el crecimiento vegetal a nivel de invernadero, incrementar el contenido de nitrógeno y fósforo asimilable por las plantas y capacidad para producir y liberar ácido indolacético, sustancia que está relacionada con la estimulación de procesos favorables como la elongación radical,

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proliferación de raíces secundarias y pelos radicales. Los aislamientos que presentaron estas características sobresalientes pueden ser promi-sorios para utilizarlos como base de productos biofertilizantes. Sin em-bargo, los resultados de ensayos en invernadero señalan únicamente las tendencias de su efecto bajo ciertas condiciones controladas, efecto que es susceptible de modificarse en condiciones reales de campo, donde el microorganismo aplicado como biofertilizante entra a interactuar con otras poblaciones bacterianas presentes en el suelo, cuya dinámica es fluctuante e influenciada por factores ambientales y el desarrollo mismo del cultivo dependiendo de las necesidades particulares en cada estado fenológico de la planta.

Por su parte, el fósforo estimula el desarrollo radical, favorece el ahija-miento, contribuye a la precocidad y uniformidad de la floración y madu-ración. El arroz necesita encontrar fósforo disponible en las primeras fases de su desarrollo, por ello es conveniente aportar fósforo como abonado de fondo. Las cantidades de fósforo generalmente aplicadas van de 50 a 80 kg de P2O5/ha. La posibilidad de incorporar algunas bacterias solubi-lizadoras de fosfatos estudiadas en este trabajo junto con la fertilización puede contribuir a la disponibilidad adecuada de fósforo en el momento en que la planta lo necesita, dado que la actividad solubilizadora de las bacterias se mantiene sostenida en el tiempo y luego de su aplicación se disminuye la cantidad de fósforo que tiende a fijarse tras una aplicación de fertilizante químico. Esto ofrece la posibilidad de disminuir la cantidad de fósforo aplicado al cultivo, además de hacerlo más disponible para la planta y favorecer su absorción al estimular el desarrollo radical, lo cual se ve reflejado en la cantidad de fósforo asimilado en la biomasa; además el fósforo solubilizado por las bacterias se comportó como un fertilizante de liberación lenta, aconsejado en suelos “Fijadores” de fosfa-tos. Para comprobar la actividad de estos aislamientos sobre otras formas de fosfato fijado, como fosfatos de hierro y de aluminio, es necesario desarrollar trabajos que determinen las formas de fósforo presentes en diferentes tipos de suelos y la transformación de estas sustancias luego de la inoculación con bacterias solubilizadoras de fosfatos, así como la actividad y dinámica de enzimas fosfatasas.

CONCLUSIONES

Las pruebas y criterios aplicados para la evaluación de la potencialidad de microorganismos solubilizadores de fosfatos, permitieron la selección de aislamientos con alto valor fertilizante, comprobado a nivel de inver-

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nadero, con posibilidades de ser aplicados en campo, los cuales, con-tribuyen a mejorar la asimilación de fósforo y nitrógeno por las plantas, además de poseer una alta eficiencia solubilizadora de fosfatos y la capa-cidad de disminuir la fijación del fósforo soluble en el suelo.

Para estudios posteriores se ve la necesidad de realizar balances de fósforo en condiciones de campo, junto con estudios de la dinámica de las formas de fósforo en diferentes tipos de suelos, al ser inoculados con solubilizadores de fosfatos, con el fin de entender mejor los mecanismos y relaciones que se pueden presentar allí y evaluar el impacto real de la actividad biofertilizante de los microorganismos que potencialmente se puedan utilizar como inoculantes biológicos.

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iii. Biorremediación /biodegradación

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ENVIRONMENTAL GENOMIC: BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF UNCULTURED MICROORGANISMS

GENÓMICA AMBIENTAL: POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE MICROORGANISMOS NO

CULTIVABLES

ZIV ARBELI11 Departamento de Agronomía. Facultad de Agronomía.

Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá[email protected]

ABSTRACT

It is estimated that 90 - 99.9 % of microorganisms can’t be cul-ture by standard methods. These microorganisms possess high portion of the genome on earth and are expected to offer valua-ble opportunities for biotechnology. This genome (the metage-nome) could be accessed by improving cultivation methods or by direct cloning of environmental DNA. The following review would discuss these two options.

Keywords: Biotechnology; environmental genomic; metagenome; un-cultured bacteria.

RESUMEN

Se estima que del 90 a 99.9% de los microorganismos no pue-den cultivarse con métodos convencionales. Estos microorga-nismos poseen gran porción del genoma presente en la Tierra y se considera que este genoma presenta grandes oportunidades de aplicación en biotecnología. Para aprovechar este genoma hay que mejorar los métodos de cultivo o clonarlo directamente del ambiente. En esta revisión se discutirán las dos opciones.

Palabras clave: Biotecnología; genómica ambiental; metagenoma; bac-terias no cultivables.

INTRODUCTION

A gram of soil might contain 10,000 species of prokaryotes carrying approximately 2*1012 prokaryotic genes. Yet 90-99.9% of these microor-

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ganisms cannot be cultured by standard methods (Torsvik et al., 1998). This phenomena, which was termed as “the great plate count anomaly” (Staley and Konopka, 1985) is well known since 1932 from a simple observation: only 0.1-10% of the bacteria observed by microscope can be cultured in Petri dish. As a result, what we knew about the micro-bial world was merely the tip of the iceberg, and the biotechnological potential of 90-99% of this enormous genetic reservoir was out of our reach. Hence, culture-independent methods (methods which cultiva-tion of microorganisms is not necessary) were essential to bypass this handicap.

The modern revolution in microbiology started by the introduction of molecular systematic into microbiology. Comparative analysis of the se-quences of the small-subunit ribosomal RNAs (16S rRNA and 18S rRNA) suggested that it is adequate for microbial classification, and enabled for the first time to draw evolutionary tree of prokaryotes (Woese and Fox, 1977; Woese, 1987). The consequence of molecular systematic, however, was far behind. In the mid 1980s Norman Pace and colleagues started the edge of molecular microbial ecology. Pace et al. (1985) extracted DNA directly from environmental sample. 16S rDNA was then amplified by PCR, cloned and sequenced in order to identify the bacteria presented in the sample. This new approach bypassed the need to cultivate a mi-croorganism in order to characterize the microbial community, and new molecular methods have soon developed (Head et al., 1998; Dabert et al., 2002). These methods enable to monitor a microbial community, a specific genus, a specific functional gene, or gene expression (mRNA) in the natural environment (e.g. soil, bioreactor) of culturable and un-cultur-able bacteria.

These new studies have revolutionized our knowledge about microbial diversity (Hugenholtz et al., 1998). The number of recognized bacterial phyla has increased from the original estimate of 11 in 1987 (Woese, 1987) to 39, 26 of which have one or more cultivated representatives, and 13 of which are known only from environmental sequences (Lead-better, 2003). ¿What do the silence majority of un-cultured bacteria do for living? ¿What is their biotechnological potential? Contemporary research has only begun to address these questions (Rondon et al., 2000; Venter et al., 2004), but many more challenges still lie on the road ahead (De-Long, 2004).

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BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL OF UNCULTURED MICROORGANISMS

97% of the prokaryotes deposited in the Australian culture collection are all member of four bacterial phyla (out of 39) also kwon as the “Big Four”: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes (Hu-genholtz, 2002). Approximately 65% of published microbiological re-search from 1991 to 1997 was dedicated to only eight bacterial genera, all belong to three phyla (out of the big four), and are relatively simple to grow on agar plates (Galvez et al., 1998). This means that we know very little about the rest of the phyla. Nevertheless, it is quite safe to predict that other bacteria, not yet studied, possess genes with commercial val-ue. For example: genes which codify the production of anti tumors, anti bacterial, anti-viral, anti-fungi, anti-insects, could be used in medicine as new drugs, in agriculture for plant protection, and in the food industries as new preservatives; genes, which codify the production of steroids, ca-rotenoids, and solvents, could be used in many types of industries; genes, which codify the production of substance which promote plants growth (of uncultured plant growth promoting bacteria) could be used in agri-culture; and genes, which codify the production biodegradation enzyme could be use for bioremediation. These are only few examples. More examples could be found in the literature (e.g. Cowan et al., 2005) or in our imagination. However, before letting our imagination fly, we must look for ways to learn about the biotechnological potential of uncultured bacteria, and methods to use this potential.

CULTURING “UNCULTURABLE” BACTERIA

The knowledge about the phylogenetic of uncultured bacteria and about the ubiquity in nature of some of these new phyla has encouraged the effort to cultivate at least one representative from these phyla (Lead-better, 2003). Indeed, recent works have demonstrated that isolation and cultivation of these bacteria is possible, sometimes by using very simple methods (e.g. Connon and Giovannoni, 2002; Janssen et al., 2002; Ste-venson et al., 2004). Molecular tools could also help to monitor enrich-ment of uncultured bacteria, and thus indicating that we are in the right direction (e.g. Stevenson et al., 2004).

Traditional cultivation methods usually include medium with extreme-ly high level of nutrients. For example, typical nutrient agar contains (g/L) 1 meat extract; 2 yeast extract, 5 peptone. In nature rarely bacteria

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are exposed to such conditions and as a consequence, the majority of bacteria are not adapted to such conditions. When expose to high con-centration of nutrients (e.g., when inoculated on nutrient agar) few bac-teria, which not necessarily represent the majority of bacteria grow fast and are soon visible as colonies. At this stage, we stop the incubation, do what we do (total counts, isolation of bacteria, etc.), and sterilize it. We actually sterilize many bacteria, which could have grown if given enough time (some time 3 months are needed: Janssen et al., 2002). If we would, however, incubate nutrient agar for 3 months, fast growing bacteria (or fungi) will cover the slow growing bacteria or exclude their growth by competition. A very simple solution, which was applied with great success, is a very low nutrient agar. For example, Janssen et al., 2002 have used 350 times diluted nutrient agar. Other way to imitate better the condition in nature also proved successful: for example, it is very common to work in completely aerobic condition or anaerobic conditions but some bacteria are microaerophilic; that is, they grow at a very low concentration of oxygen, while high oxygen concentration is toxic. This fact should not be surprising since low oxygen concentra-tion is the normal condition in many habitats including soils. Similarly, using different substrate (e.g. Chin et al., 1999), electron donors (e.g. Schink et al., 2002), electron acceptors (Lovley et al., 1996), energy source (e.g. Glaeser and Overmann, 1999); growth factors (DeWeerd et al., 1990), trace element (Fujishiro et al., 2004), signaling molecules (Stevenson et al., 2004), or using “natural medium” such as sterilized sea water (Kaeberlein et al., 2002) are likely to yield new bacteria. To do so, we need to observe (what exist in nature), calculate ΔG (to know if a given substrate can support growth) and again, use our imagination (to come up with new hypothesis about microbial growth condition and metabolic requirements). It is quite safe to predict that all ecologi-cal niches on earth, which can theoretically support life, are occupied by microorganisms.

Another approach is to physically isolate single cell, which is then cultivated to yield a pure culture. These methods include sample dilu-tion (dilution to extinction) (Aakra et al., 1999; Connon and Giovanno-ni, 2002), micromanipulators and optical tweezers (Frohlich and Konig, 2000), density-gradient centrifugation (Putzer et al., 1991), cell-sorting using flow cytometry, encapsulating single cell in gel micro-droplets (Zengler et al., 2002) or killing contaminants bacteria (Parashar et al., 2004).

285


CLONING THE METAGENOME

Advances in sequencing technology and cloning vectors has also en-tered to the field of environmental microbiology. While first works of envi-ronmental cloning focused on specific genes (typically 16S rDNA), which were amplified by PCR before cloning, it is now possible to clone directly the entire genome of microbial community. This new approached has been termed ‘environmental genomics’, ‘microbial population genom-ics’, ‘ecogenomics’ and ‘metagenomics’ (DeLong, 2004). It is expected to have a huge contribution to our knowledge about microbial diversity, evolution, and ecology. From the practical point of view, environmental genomic has enabled us to explore a gigantic new genome (probably the most diverse on earth) for new biological products (DeLong, 2004; Handelsman, 2005; Tyson and Banfield, 2005).

Cloning metagenome is relatively straightforward. DNA is extracted di-rectly from environmental sample, cloned into appropriate vector and transformed in to bacterial host (Handelsman et al., 2002). One of the objectives is to capture high molecular weight DNA. Thus, a gentle DNA extraction method that minimizes shearing of DNA should be applied (Rondon et al., 2000); and a large insert cloning vector such as cosmid, fosmid and bacterial artificial chromosome (BAC) is usually used. Cur-rently, BAC is the better choice since it can contain higher molecular DNA (till 200 kb) and the genes it harbors can be expressed in Escherichia coli at a relatively high percentage (Rondon et al., 1999). The advantage of large insert libraries is that they provide contiguous sections of DNA from a single organism. If this sequence contains a phylogenetic marker, a significant number of functional genes can be assigned to that organism. In addition, large insert might contain a full operon, which can be thus expressed and execute a complete biological function.

Although cloning the metagenome is relatively simple, it is estimated that 1 million of clones each containing 50 kb is needed to cover the entire genome (without repetition) from one gram of soil (Handelsman, 2004), and even more challenging is to investigate such enormous library (Handelsman, 2005). For example, Rondon et al., have constructed two clones library of 28224 clones, which contained around 1100 Mbp of DNA and about one million genes but managed to partially investigate only 213 clones (0.75%) in their first publication (Rondon et al., 2000) and might be kept occupied with these clones for few years.

286


EXPLORING THE METAGENOME

The big task is the study of the metagenome clone library. Methods to do so can be roughly divided to three categories: 1 screening of spe-cific genes (by PCR or hybridization); 2 sequencing and bioinformatics; and 3 functional analyses by gene expression in the host cell. In the first method, libraries are screened in order to find a specific gene such as 16S rDNA (to identify the bacterial source of the clone) or a functional gene. Screening could be done by hybridization with a specific probe or PCR amplification with a specific primer. The limitation of this approach is the need of preliminary knowledge about the gene of target in order to design the probes or primers. This is a big disadvantage, if we are prima-rily interested in discovering new genes of uncultured microorganisms. However, for looking for a specific gene family, or for partial genome from a specific species, this might be the method of choice (e.g. Stein et al., 1996). Moreover, with new hybridization facilities, the Microarray, this type of screening is much more efficient.

The most comprehensive method is sequencing the whole library. The sequences can be then characterized using bioinformatics tools, and the function of genes can be identified. Again, identification of genes is pos-sible only if their sequence is similar to a previously studied gene, and completely new gene would not be identified. The most impressive work thus far is of Venter et al. (2004) who have applied “whole-genome shot-gun sequencing” to microbial populations collected from the Sargasso Sea near Bermuda. A total of 1.045 billion base pairs of non-redundant sequence was generated, annotated, and analyzed to elucidate the gene content, diversity, and relative abundance of the organisms within these environmental samples. Their data are estimated to derive from at least 1800 genomic species, including 148 previously unknown bacterial phylo-types, and over 1.2 million previously unknown genes. Another interesting work is of Tyson et al. (2004) who constructed the all genome of uncul-tured bacteria by sequencing 76.2 bp of DNA from bacterial biofilm of acid mine drainage. This was possible due to the very low diversity in the biofilm caused by the extreme condition in the mine (pH 0.83, 42 ºC).

The functional analysis approach is the best method to look for entirely new class of genes, which carry out a specific function. In this method the transformed bacteria, which contain part of the metagenome, is screened for a new activity. Bacteria, which exhibit the desired activity, are selected for further analysis in order to identify the desired gene (Rondon et al.,

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2000). As stated above, since there is no need for a preliminary knowl-edge about the gene, it is possible to discover new genes with complete-ly novel sequence. The drawback is that many enzymes would not be synthesized or assembled correctly in the host cell and as a consequence would not be discovered. This problem might be solved by a new meth-od for screening the metagenome designated “substrate-induced gene expression screening” or SIGEX (Uchiyama et al., 2005). In this method the cloning vector contain a reporter gene, such as gfp (green fluorescent protein), upstream to the metagenome DNA. Uchiyama et al. (2005) have looked for benzoate degradation genes. To do so they expose their library to this substrate. If the metagenome DNA contained benzoate degra-dation gene, which are up regulated by the presence of benzoate, it is expected that benzoate degradation gene would be expressed together with the reporter gene and the colony would fluorescence. The fluores-cent colony can be picked for further studies. This method is considered as a brake through in metagenome analysis but is limited to inducible enzymes (Handelsman, 2005).

CONCLUSION

To my knowledge, up to now there is no example of commercial suc-cess of metagenome products, but its potential has already been demon-strated by many works (Cowan et al., 2005). Biotechnological companies such as Diversa Corporation (www.diversa.com) possess numerous librar-ies derived from global biotopes and numerous cloned enzymes in from different classes (Cowan et al., 2005). New development in the field would probably accelerate advances in this field, and Environmental Pro-teomics is already here (Ram et al., 2005). That the silent 99% of the prokaryote have grand biotechnological potential is un-questionable, and it seems that a commercial success is just a matter of time.

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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DEHALOGENANTE DE UN LODO ANAEROBIO

EVALUATION OF THE DEHALOGENATING CAPACITY OF AN ANAEROBIC MUD

JUAN. D. VALDERRAMA1, MARÍA. C. DÍAZ-BÁEZ 1

1 Sección de Ingeniería Ambiental. Facultad de Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

Se adaptó un lodo granular proveniente de un reactor UASB que trataba aguas residuales de una industria cervecera. El lodo fue inoculado a un reactor tipo UASB a nivel de laboratorio, el cual fue alimentado con 2,4,6-triclorofenol (TCP) disuelto en un agua residual sintética (ARS). Se evaluó la capacidad deha-logenante del lodo y se determinó la máxima concentración de 2,4,6-TCP que puede ser alimentado sin que se altere el com-portamiento, la cual fue de 80 mg/L. Concentraciones superio-res, generaron desestabilización y acidificación del reactor hasta un valor de pH de 5.2. Sin embargo, el lavado del lodo y la neutralización de los ácidos grasos volátiles permitió reactivar el reactor y la dehalogenación estable hasta una concentración de 75 mg/L de 2,4,6-TCP sin que se presentara alteraciones en la eficiencia de remoción del reactor. Una comparación de las características del lodo antes y después de los ensayos de de-halogenación, mostró que la metodología seguida permitió una aclimatación del lodo sin que se alteraran las características ni el proceso de granulación.

Palabras clave: Bacterias dehalogenantes, compuestos orgánicos haloge-nados, 2,4,6-Triclorofenol, 2,4-Diclorofenol, 2-Clorofenol, 4-Clorofenol.

ABSTRACT

In this study a granular mud from a UASB reactor used in the treatment of waste water from beer industry was adapted. The mud was inoculated in a UASB reactor at laboratory scale, which was fed with 2, 4, 6-trichlorophenol (TCP) dissolved in synthetic

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residual water. The dehalogenating capacity of the mud was evaluated and the highest concentration of 2, 4, 6–TCP that can receive the system without alteration was 80mg/L. Higher va-lues caused destabilization and acidification until pH 5.2. Howe-ver, washing the mud and neutralizing of the volatile fats acids allow reactivation of the reactor and dehalogenation stable until concentration of 75 mg/L of 2, 4, 6-TCP without lost of removal efficiency. A comparison of the characteristics of the mud before and after assays showed that the methodolgy applied, allows a conditioning of mud without changes neither in its properties nor in the granulation process.

Keywords: Dehalogenating bacteria, halogenated Organic Compounds, 2, 4, 6-Trichlorophenol, 2, 4-Dichlorophenol, 2-Chlorophenol, 4-Chloro-phenol.

INTRODUCCIÓN

Uno de los problemas asociados con el tratamiento biológico de aguas residuales industriales, es la presencia de sustancias orgánicas e inor-gánicas persistentes con alto potencial tóxico. Dentro de ellas, los com-puestos orgánicos halogenados son considerados uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes debido al amplio uso de ellos como pesticidas, retardantes de llama, preservantes de madera, solventes y refrigerantes (Fetzner y Lingens, 1994). Aunque para el trata-miento de efluentes con este tipo de contaminantes se han utilizado di-ferentes procesos fisicoquimicos y biológicos, la selección de alternativas aerobias y anaerobias, dependerá del tipo de contaminante dado que compuestos orgánicos halogenados con un gran número de sustituyen-tes halogenos, solo pueden ser degradados por organismos anaerobios mediante un proceso conocido como dehalogenación reductiva (Arme-nante et al., 1999; Ronen y Abeliovich, 2000).

La degradación y detoxificación de estos compuestos requieren la se-lección de microorganismos especiales capaces de llevar estos procesos en reactores o sistemas de bioremediación, por lo que algunas de las investigaciones en este campo se han orientado a evaluar y optimizar los procesos de aclimatación de estas complejas comunidades microbianas (Montgomery, 1994). Una de las dificultades en el tratamiento anaerobio de estos compuestos son las bajas tasas de degradación así como los potenciales efectos tóxicos que ellos puedan ejercer sobre la comunidad,

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una solución es favorecer el crecimiento de la población dehalogenante en un medio con bajas concentraciones del contaminante, lo cual per-mitiría una rápida respuesta a concentraciones crecientes así como el crecimiento y proliferación de ellas (Tartakovsky et al., 1999).

Estudios realizados en otros países han mostrado que dentro del gran número de compuestos orgánicos halogenados, el 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP) puede ser rápidamente transformado en 2,4-diclorofenol (2,4-DCP) el cual a su vez se degrada formando una mezcla de 2-clo-rofenol (2-CP) y 4-clorofenol (4-CP), aunque hay una vía preferencial hacia el 4-clorofenol (Kennes, 1996). Dada la relativa facilidad para de-gradar este compuesto, así como la necesidad de desarrollar una me-todología para la adaptación de consorcios microbianos que pudieran llevar a cabo la dehalogenación, el presente trabajo se orientó a evaluar el proceso de aclimatación de un lodo anaerobio en un reactor UASB a escala de laboratorio. Igualmente, estudiar el proceso de dehalogena-ción del 2,4,6-TCP como un modelo de la degradación de estos com-puestos halogenados.

METODOLOGÍA

Inóculo y montaje experimental

Para la realización de este trabajo se utilizó un lodo granular prove-niente de un reactor UASB que trataba las aguas residuales de una in-dustria cervecera. Las características físicas iniciales del lodo fueron 86.12 g/L de SST, 75.187 g/L de SSV, un tamaño promedio de gránulo de 1.2 mm y un Índice Volumétrico de Lodos (IVL) de 4.41 mL/g. La inoculación se llevó a cabo colocando 500 mL de lodo sedimentado dentro de un reactor UASB de 2.7 L. Para la puesta en marcha y la operación del reac-tor se trabajo con ARS (Díaz-Báez, 1987), manteniendo una temperatura de 35±2 ºC mediante un circuito de calentamiento externo. El 2,4,6-TCP se disolvió en un agua residual sintética en concentraciones que variaron entre 5 y 80 mg/L.

Paralelo con la puesta en marcha del reactor, se montaron ensayos de dehalogenación en tandas utilizando viales de 30 mL. Los ensayos se rea-lizaron por triplicado siguiendo los procedimientos recomendados por Arbeli y Ronen (2003). Cada vial se llenó hasta un tercio de su capacidad con la mezcla de medio mineral, lodo con una concentración de 2.7 g SST/L y 2.4 g SSV/L, y 2,4,6-TCP a una concentración de 50 mg/L.

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Métodos analíticos

La producción de metano en el reactor se determinó midiendo el vo-lumen de líquido desplazado en el gasómetro, y la concentración de los gases en el biogas se determinó utilizando un Cromatógrafo de Gases Marca Varian Modelo 3600, con detector de conductividad térmica y una columna de silica gel 40/60 en acero inoxidable, y helio como gas de arrastre. La concentración de ácidos grasos volátiles (AGV) se determinó mediante el método colorimétrico recomendado por la HMSO (1979). El seguimiento del pH se llevó a cabo utilizando un potenciómetro Mar-ca Lab-Line, y la alcalinidad se determinó por titulación (APHA 2004). La medición de DQO se realizó mediante el método de reflujo abierto 5220B (APHA 2004) y para la determinación de la concentración de SST y SSV se siguieron los métodos gravimétricos 2540B y 2540E recomen-dados por la APHA (2004). Se estableció la velocidad de sedimentación, el IVLy el tamaño promedio del gránulo de los lodos siguiendo los proce-dimientos descritos por Díaz-Báez et al. (2002).

Para la cuantificación del 2,4,6-TCP y los subproductos de dehalogena-ción se utilizó un cromatógrafo líquido de alta eficiencia Marca Waters, Modelo 510, acoplado a un detector UV (Waters 486), a una longitud de onda de 290 nm, y un cartucho C-18 Merck LiChroCART 250-4 a una temperatura de 30 ˚C. La fase móvil consistió en una mezcla de de ácido acético al 1% en metanol y acetato de amonio (1.34 g/L) en metanol con 1 % de ácido acético en una proporción 75/25. El tiempo de corrida fue de 10 minutos.

Figura 1. Localización de los puntos de muestreo en el sistema de tratamiento

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Evaluación de la actividad dehalogenante

Terminado el arranque y estabilización del reactor a un tiempo de re-tención hidráulico de 24 h, se inició la alimentación del agua residual más 5 mg/L de 2,4,6-TCP. Como no se observó ninguna alteración en el desempeño del reactor en términos de los parámetros de control, se ini-ció el aumento escalonado del TCP. En la Figura 1 se presenta el esque-ma del sistema donde se señala la ubicación de cada uno de los puntos de muestreo.

En la Figura 2 se presenta el balance de masa realizado para el 2,4,6-TCP y los productos de dehalogenación en base molar para facilitar la comparación. Como puede observarse, la concentración del 2,4,6-TCP teóricamente inyectada al tanque de alimentación difiere de la concen-tración medida a la entrada del reactor, lo cual significó que durante los primeros 10 días solo ingresó el 50 % de la concentración teórica. Esta diferencia pudo ser el resultado de la volatilización del compuesto en el momento de la inyección, ó la adsorción de este a las mangueras de alimentación. Por esta razón, se incrementó la concentración inicial para lograr un aumento escalonado de 10, 20, 40, 60, 80 (mg TCP/L).

Figura 2. Balance de masa de 2,4,6-TCP y sus productos de dehalogenación.

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Los resultados tanto en los experimentos por tandas, como durante el aumento escalonado del TCP, mostraron que en el efluente del reactor solo pudieron ser detectadas concentraciones de 2,4-DCP, 4-CP, 2-CP. Aunque en el análisis cromatográfico se detectó la presencia de fenol, este no pudo ser cuantificado por interferencias con los componentes del ARS. Por esta razón, las perdidas calculadas a partir del balance de masa no se pueden atribuir completamente a la adsorción del 2,4,6-TCP al reactor ó al lodo, sino que parte del compuesto pudo ser degradado a fenol ó aun mineralizarse.

Como se observa en la Figura 2, la presencia de 2,4-DCP en el efluente del reactor solo se detectó durante los primeros días después de incre-mentar la concentración del TCP de 20 a 40 y de 60 a 80 mg/L. A pesar que durante los primeros días de haber realizado el incremento de TCP de 60 a 80 mg/L se detectaron concentraciones de 2-CP y 4-CP es evi-dente que el sistema se satura, por lo que se empieza a registrar la pre-sencia de 2,4,6-TCP en el efluente, así como la inhibición completa de la producción de gas y la acidificación del reactor, mostrando la capacidad de este compuesto para inhibir la actividad metanogénica.

Con el fin de establecer si la inhibición del lodo era irreversible se pro-cedió a hacer un lavado del lodo y la neutralización de los AGV produci-dos. Con este mismo lodo, se re-arrancó el reactor y se inició un nuevo proceso de aclimatación escalonada, incrementando la concentración de 2,4,6-TCP de la siguiente manera: 10, 25, 40, 55, 60, 70 (mg TCP/L) y evitando llegar a 80 mg TCP/L, concentración a la cual se presentó la inhibición de la actividad metanógenica. En la Figura 3 se presentan los resultados del balance de masa para este segundo ensayo de aclimata-ción. Al igual que en el primer experimento, la presencia del 2,4-DCP en el efluente del reactor se presenta durante los incrementos de TCP espe-cialmente a las concentraciones más altas. Este hecho observado durante los dos procesos, estaría señalando que la ausencia de este compuesto en el efluente sería un indicativo del buen desempeño del consorcio dehalogenante y que su presencia estaría indicando la saturación del sistema, por lo cual si no es controlado, se iniciará un descenso en el pH y de la alcalinidad (día 162) que podría llevar a la alteración completa del sistema. Este fenómeno, sugiere que existe una relación entre la presen-cia del 2,4-DCP en el efluente y la estabilidad y el grado de adaptación de la población en el reactor.

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Figura 3. Balance de masa de 2,4,6-TCP y sus productos de dehalogenación.

Figura 4. Desempeño del reactor durante la dehalogenación.

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Al comparar el comportamiento del reactor durante los dos ensayos, se puede observar que incrementos menores en la concentración de 2,4,6-TCP favorecen el mantenimiento de la estabilidad del reactor, y así evitar la acidificación. La producción de gas y la eficiencia de remoción de DQO soluble permanecen estables, siempre y cuando no se sobrepase la concentración a la cual se satura el sistema (80 mg TCP/L), valor lige-ramente superior a la concentración media inhibitoria (CI50) reportada para este compuesto (García-Chavez y Díaz-Báez, 2004). Sin embargo, es necesario tener en cuenta que durante la segunda aclimatación a una concentración de 2,4,6-TCP de 55 mg/L (Figura 4) se inicia el descenso de alcalinidad, pH y la eficiencia de remoción de DQO soluble (79 %). Medidas de control, como la adición de bicarbonato para suministrar al-calinidad para neutralizar los AGV producidos (día 167) pueden tomarse, lo cual aunque genera un súbito aumento de pH y alcalinidad (día 167), es efectivo para mantener el sistema estable.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente estudio, permitieron hacer las siguientes conclusiones:

• A concentraciones inferiores a 80 mg 2,4,6-TCP/L, puede operarse un reactor UASB sin que se altere la remoción de DQO soluble (90 %) con un lodo anaerobio previamente aclimatado.

• La operación estable de un reactor con un lodo aclimatado a la pre-sencia de 2,4,6-TCP permite un adecuado proceso de granulación, lo cual pudo ser comprobado con el aumento del tamaño de los gránu-los, así como de su velocidad de sedimentación.

• La posible relación observada entre la presencia de 2,4-DCP en el efluente del reactor y la estabilidad de este, podría ser considerado como un indicador de saturación del sistema.

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ESTRATEGIAS DE BIORREMEDIACIÓN EN AMBIENTES ACUÁTICOS Y TERRESTRES

BIORREMEDIATION STRATEGIES IN AQUATIC AND TERRESTRIAL ENVIRONMENTS

FABIO ROLDAN1

1Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA). Pontificia Universidad [email protected]

RESUMEN

El incremento en la presencia de compuestos orgánicos en el medio ambiente, generados por su producción, uso y disposi-ción final, hace necesario considerar la biorremediación como una alternativa en la recuperación de estos ambientes conta-minados. Muchas tecnologías físicas y químicas convenciona-les son costosas y no eliminan el problema sino que pueden transferirlo a otros ambientes. La biorremediación utiliza el me-tabolismo microbiano para convertir estos contaminantes orgá-nicos en compuestos menos tóxicos y lograr su mineralización completa. Existen diferentes tecnologías de biorremediación in situ y ex situ, donde es importante identificar y suministrar los parámetros limitantes de la biodegradación.

Palabras clave: Biorremediación in situ y ex situ, microorganismos.

ABSTRACT

The increment of organic compounds in the environment cau-sed by their production, use and final disposition make neces-sary to consider bioremediations as an alternative to recovery those contaminated environments. Conventional technologies are expensive and there are not able to completely eliminate the problem but in addition they transfer the problem to other environments. During the bioremediation the microorganisms use these contaminants in their metabolisms as electron donors or as terminal electron acceptors making them less toxic and achieving their completely mineralization. There are different in situ and ex situ bioremediation technologies, where is impor-

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tant to identify and supply the limiting parameters to achieve higher biodegradation rates.

Keywords: Bioremediation in situ and ex situ, microorganisms.

INTRODUCCIÓN

El incremento de la presencia de compuestos orgánicos en diferentes ambientes acuáticos (p.e, ríos, mares, aguas subterráneas) y terrestres (zona vadosa) ha ocasionado un deterioro es estos ecosistemas. Estos compuestos orgánicos pueden ser de origen natural, como el caso de los hidrocarburos (HCs) de petróleo o de origen humano como los solventes halogenados (p.e., percloroetileno, PCE). Los problemas asociados con estos sitios contaminados están tomando mayor relevancia en nuestro país. Grandes áreas contaminadas son el resultado de actividades indus-triales en el pasado y muchas de ellas actualmente están relacionadas con la producción, uso y disposición final de los compuestos orgánicos y sus residuos.

En la actualidad se reconoce el efecto de estos compuestos sobre la sa-lud humana, cadenas tróficas y en los diferentes ecosistemas. Es por esta razón que en los últimos años se han generado nuevas estrategias e incre-mentado los esfuerzos para la remediación de estos sitios contaminados.

Los problemas asociados con la contaminación pueden ser reducidos por tecnologías convencionales que remueven, alteran o aíslan los con-taminantes. Algunas de estas tecnologías convencionales pueden se ex situ, como la incineración, remoción del suelo contaminado o el bombeo de las aguas contaminadas, o pueden ser in situ, como el recubrimien-to o inmovilización física de los contaminantes en el sitio contaminado (EPA, 1995). Todas las tecnologías tienen sus limitaciones y desventajas es así como las tecnologías convencionales generalmente incrementan los riesgos durante la transferencia de los contaminantes a otros ambien-tes especialmente durante la manipulación, transporte y tratamiento. Es-tas tecnologías son costosas y en la mayoría de casos no destruyen los contaminantes pero lo transfieren de un ambiente a otro. De igual forma las técnicas in situ no siempre solucionan el problema y es necesario un monitoreo por largos periodos de tiempo (Litchfield, 2005).

Una mejor aproximación para el tratamiento de estos sitios contami-nados es la biorremediación, proceso en el cual se emplea el metabolis-mo microbiano para la degradación completa del contaminante orgánico

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hasta dióxido de carbono, metano y agua (mineralización), o para la pro-ducción de subproductos inocuos y biomasa. Durante este proceso los microorganismos obtienen la energía necesaria para su metabolismo y crecimiento por el movimiento de electrones de los donadores de elec-trones (DEs) a los aceptores terminales de electrones (ATEs) (Roldan, 2002). Muchos de los compuestos orgánicos contaminantes pueden ser utilizados por los microorganismos como DEs (p.e., HCs) o ATEs (p.e., PCE) (Figura 1).

La biorremediación es una alternativa in situ o ex situ, mucho más eco-nómica, de mayor facilidad de implementación, tecnológicamente más simple y de mayor aceptación por la opinión pública. Sin embargo, la biorremediación es una opción que debe ser evaluada cuidadosamente por el rango de compuestos que pueden ser degradados, largos periodos de tiempo y las condiciones específicas en cada sitio contaminado.

Figura 1. El uso de compuestos orgánicos como donadores de electrones (benceno) y acep-tores terminales de electrones (PCE) durante la biodegradación.

FACTORES QUE AFECTAN LA BIORREMEDIACIÓN

El grado de biodegradación y la tasa a la cual esta ocurra dependerán de las condiciones ambientales del sitio contaminado (hidrogeoquímica),

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el tipo y numero de microorganismos presentes y la estructura química de los contaminantes que serán degradados. La biorremediación puede ser afectada por otros factores como la temperatura, pH, disponibilidad de nutrientes, solubilidad y biodisponibilidad de los compuestos orgáni-cos, interacciones abióticas, presencia de DEs y ATEs, y composición de la comunidad microbiana (Tablas 1 y 2).

Tabla 1. Condiciones ambientales que afectan la degradación.

Parámetro Condiciones requeridas para la actividad microbiana

Humedad 25 - 28% capacidad de campopH 5.5 - 8.0Concentración de O2 10 - 40%Nutrientes (C:N:P) 100:10:1Temperatura (oC) 15 - 45Metales pesados < 2,000 ppmTipo de suelo Bajo en arcillas

(Modificada de Vidali, 2001).

Tabla 2. Diferentes relaciones de N:P:K y estudio donde han sido utilizadas.

Relación C:N:P Tipo de nutriente Referencia

100:2:0.4 NH4H2PO4 Gentry et al., 1993

100:10:2 NH4NO3- K2HPO4FIC (NPK)

Song y Bartha, 1990; Margesin y Schinner, 1997a; Margesin et al., 2000

100:10:1 NH4NO3-KH2PO4

Flathman, et al, 1995; Calabrese, et al, 1993; Margesin y Schinner, 1997b; Ávila, 1999.

FIC = fertilizante inorgánico compuesto.(Tomada de Eweis et al., 1998).

ESTRATEGIAS DE BIORREMEDIACIÓN

Biorremediación in situ: El tratamiento de remediación de suelos o aguas contaminadas es realizada en el sitio y es una opción bastante uti-lizada porque no hay que excavar ni transportar la matriz contaminada, lo cual genera un bajo impacto en otros ambientes. Generalmente, los factores limitantes para una biodegradación eficiente son la baja dispo-

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nibilidad de ATE y nutrientes y en algunas ocasiones la baja población de microorganismos degradadores nativos (Venosa y Zhu, 2003).

El tratamiento mas utilizado durante la biorremediación es la bioesti-mulación, donde se identifican y suministran los factores limitantes (p.e., nutrientes, ATE) logrando un balance de masas y aumentando las tasas de degradación. El bioventeo es utilizado para suministrar oxigeno como ATE y nutrientes en el suelo contaminado (zona vadosa). La bioaspersión (biosparging) es utilizada en aguas superficiales y subterráneas conta-minadas para suministrar DEs, ATEs (p.e., oxigeno, nitrato) y nutrientes directamente en la matriz contaminada.

Generalmente, casi todos los ambientes poseen microorganismos na-tivos con capacidad para degradar los compuestos orgánicos contami-nantes (Vidali, 2001), los cuales pueden ser cultivados en el laboratorio y posteriormente reintroducidos. La bioaumentación con microorganis-mos nativos o externos se emplea para lograr tasas de biorremediación mayores. Los microorganismos externos (modificados genéticamente o no) difícilmente pueden establecerse y mantenerse en ambientes conta-minados, sin embargo, es una estrategia que esta siendo ampliamente estudiada logrando algunos resultados interesantes en campo.

Biorremediación ex situ: Estas técnicas involucran la remoción y transporte de la matriz contaminada. El objetivo principal de la biorreme-diación ex situ es controlar las condiciones ambientales y aumentar las tasas de degradación.

La biolabranza (landfarming) utiliza los microorganismos degradado-res nativos del suelo donde se coloca un capa de matriz contamina-da (~15 cm) la cual es mezclada con el suelo y periódicamente arada para incorporar oxigeno como ATE. Durante el desarrollo de esta técnica hay que prestar especial atención a la concentración de nutrientes, pH y humedad del suelo (Cleves y Sandoval, 2001). Con el tiempo, se logra establecer una población de degradadores con una alta capacidad de-gradadora.

Adicionalmente, se puede trabajar el compostaje, con tratamiento a altas temperaturas, y las biopilas, en las cuales se logran controlar las perdidas físicas por lixiviación y volatilización. Las biopilas son una ver-sión refinada de la biolabranza donde los microorganismos aerobios y anaerobios pueden degradar los compuestos orgánicos.

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La enumeración y monitoreo de las bacterias degradadoras en am-bientes contaminados puede ser un proceso muy largo (p.e., 28 d utili-zando NMP para degradadores) y la mayoría de las veces los recuentos son sesgados por la incapacidad de cultivar todos los microorganismos presentes en el sitio (Atlas y Bartha, 1993; Roldan, 2002). Recientemente, se están realizando estudios moleculares para identificar las poblaciones nativas de bacterias no cultivables así como el estudio de las comuni-dades microbianas involucradas en la biodegradación de compuestos orgánicos.

La combinación de estudios clásicos con los estudios moleculares per-mite una interpretación mucho mas completa de los procesos microbia-nos en la biorremediación activa y el seguimiento de microorganismos degradadores externos que han sido adicionados durante los procesos de bioaumentación (Widada et al., 2002).

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iv. Caracterización molecular microbiana

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ESTUDIOS EN MICROBIOLOGÍA DE SUELOS AMAZÓNICOS COLOMBIANOS RELACIONADOS CON

LA FERTILIDAD DEL SUELO

STUDIES ON SOIL MICROBIAL COMMUNITIES RELATED TO SOIL FERTILITY FROM COLOMBIAN AMAZON

GLADYS CARDONA1, CLARA PEÑA2

1Instituto SINCHI. Grupo de Recursos Genéticos y Biotecnología. Bogotá.

[email protected] SINCHI. Grupo de Recursos Genéticos y Biotecnología.

Leticia. [email protected]

RESUMEN

Los suelos de la Amazonia colombiana se caracterizan por su alta acidez y baja fertilidad, presentando una saturación eleva-da de aluminio que limita la fijación de elementos importantes para la nutrición vegetal como fósforo y nitrógeno. El aprove-chamiento de la fase orgánica y el reciclaje de nutrientes me-diados por los microorganismos, son factores que determinan la fertilidad del suelo. El grupo de Recursos Genéticos y Biotec-nología del Instituto SINCHI en sus sedes de Leticia y Bogotá, ha venido desarrollando proyectos de investigación, orientados a identificar el potencial microbiológico de los suelos amazónicos por medio de metodologías convencionales y moleculares, con el fin de seleccionar microorganismos nativos que sirvan como insumos para el desarrollo de biofertilizantes, que apoyen al desarrollo sostenible de la región.

Palabras clave: Amazonia, suelos, microbiota edáfica, recuperación, téc-nicas moleculares.

ABSTRACT

The colombian Amazon soils are characterized by low pH and fertility, its high aluminum saturation limits the fixes of impor-tant elements for plant nutrition like phosphorous and nitrogen. The profit of the organic substrate and the nutrient recycling

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by microorganisms are factors that determinate the soil fertil-ity. The research group Biotechnology and Genetic Recourses of the Institute SINCHI from Bogotá and Leticia, had been de-velopment studies directed to identify the useful of microbio-logical potential from Amazon soils through conventional and molecular methods, the aim of these studies is identify the na-tive microorganisms that would be use like biofertilizers, which improve the regional sustainable development.

Keywords: Amazon soil, soil microorganisms, restoration, molecular techniques.

INTRODUCCIÓN

La formación de la Amazonia colombiana se caracterizó por extremos y prolongados procesos formativos y de evolución que han generado una alta diversidad de recursos de flora y fauna y la formación de suelos muy evolucionados con horizontes minerales muy pobres, con alta acidez sa-turación, elevada de aluminio que se traduce en una baja fertilidad (ver Peña–Venegas, 2004). Los microorganismos son fundamentales para el funcionamiento de un ecosistema, debido a que determinan el ciclaje de nutrientes, la descomposición de la materia orgánica y el flujo de energía (Crecchio et al., 2004). La fertilidad del suelo en la región es mantenida y dinamizada por un gran número de comunidades microbianas capaces de reciclar y aprovechar la materia orgánica, transformándola en nutrien-tes disponibles para las plantas, siendo en últimas quienes determinan la fertilidad del suelo (Peña–Venegas, 2004). El fósforo es el elemento limitante en el suelo para el desarrollo vegetal, seguido del nitrógeno. La mayoría de los cultivos y el mismo bosque dependen de un ciclaje efectivo que provea concentraciones mínimas de estos nutrientes para su desarrollo.

Los microorganismos aprovechan diferentes elementos como el car-bón, nitrógeno atmosférico, fósforo, azufre, entre otros (Santruckova’ et al., 2004). Estos son capaces de degradar numerosos contaminantes am-bientales sin producir metabolitos tóxicos intermediarios (Debarati et al., 2005). También forman asociaciones simbióticas a través de las cuales disminuye el estrés abiótico, producen exopolisácaridos que mejoran la estructura y porosidad del suelo, lo que facilita una mejor penetración de las raíces y ofrecen protección contra patógenos (Selosse et al., 2004). De allí la importancia de conocer y entender el papel que cada comuni-

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dad de microorganismos juega y como esta se relaciona con el manteni-miento o restauración de la fertilidad del suelo.

Es así como desde el año 2000, el grupo de investigaciones en “Recur-sos Genéticos y Biotecnología” del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas–Sinchi, a través del proyecto “Mantenimiento de la Fertilidad del Suelo y Generación de Tecnologías para la Recuperación de Áreas Degradadas en la Amazonia colombiana”, ha adelantado investigaciones enfocados a conocer mejor el componente microbiológico de los suelos. Los estudios se han enfocado a dos tipos de comunidades:

1. Microorganismos que establecen relaciones directas con las plantas y que por esta vía mejoran la fertilidad del suelo, afectando positiva-mente el desarrollo y permanencia de las plantas en el medio como lo son los hongos formadores de micorriza arbuscular y las bacterias fijadoras simbióticas de nitrógeno.

2. Microorganismos que no se asocian directamente con las plantas pero que tienen un papel importante en los ciclos biogeoquímicos del sue-lo, incidiendo directamente en su fertilidad, como lo son bacterias y hongos solubilizadores de fosfatos y actinomicetos.

Hongos formadores de Micorrizas Arbusculares (MA)

Los hongos MA, pertenecen al Phylum Glomeromycota, el cual com-prende 5 familias reconocidas: Glomaceae (con un solo género Glomus), Acaulosporaceae (con Acaulospora y Entrophospora), y Gigasporaceae (con Gigaspora y Scutellospora). Recientemente se describieron Archa-eosporaceae y Paraglomaceae. Actualmente se conocen cerca de 150 especies de MA. Con los avances en las técnicas moleculares se han reclasificado de acuerdo a la similaridad de las secuencias de ADN ribo-somal, elucidando su filogenia (Redecker, 2000).

La simbiosis con micorrizas arbusculares juega un papel crítico en la nutrición de las plantas, su actividad se basa en la capacidad que el mi-celio externo del hongo tiene para el suelo alrededor de las raíces en busca de nutrientes y en especial el fósforo (Calvente et al., 2004). Esta simbiosis también aumenta la resistencia o tolerancia a patógenos, al es-trés por desecación o toxicidad por metales pesados. La simbiosis ocurre en el 90% de las plantas vasculares, algunas de ellas son dependientes por lo que constituyen una parte importante de los ecosistemas natu-rales (Daniell et al., 2001), siendo usadas en procesos de restauración

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de ecosistemas disturbados (Tao y Zhiwei, 2005). En el suelo, juegan un papel importante en la formación de agregados estables, construyendo una estructura de macroporos, que permite la penetración de agua y aire, previniendo la erosión (Oehl et al., 2003).

Desde el año 1996, la ficha BPIN, ha desarrollado proyectos para identificar hongos micorrizales en suelos bajo coberturas como bos-ques, pastos, chagras, agroforestales, asociados a especies maderables (Peña–Venegas, 1999; 2001), frutales amazónicas, leguminosas nativas e introducidas (Arcos, 2002) y a géneros de importancia para la región como Capsicum spp (Cardona, 2000), Hevea spp (Peña–Venegas, 2000), Theobroma spp (Ochoa, 1997), etc.

Actualmente se cuenta con información sistematizada de aproximada-mente 400 registros que incluye la localización geográfica de la muestra, características fisicoquímicas de los suelos, planta huésped asociada, co-lonización radicular, número de esporas en suelo, número de morfoti-pos y representatividad de cada morfotipo en la muestra expresado en porcentaje. A la fecha, se han identificado 31 morfotipos de MA, de los cuales se tiene la plena caracterización hasta especie de 18 de ellos. Da-das las dificultades en la determinación taxonómica de estos hongos se ha comenzado la estandarización de técnicas moleculares para su iden-tificación por medio del análisis de los polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) de las regiones internas no transcritas (ITS) de los genes ribosomales (rRNA) (Redecker, 2000).

Bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno

La fijación de nitrógeno puede considerarse como una de las activida-des microbianas más importantes, debido a que hace posible el reciclaje de nitrógeno sobre la tierra y contribuye a la homeostásis del nitrógeno en la biosfera (Campell, 1987). La fijación biológica puede darse de dos formas, por asociaciones simbióticas específicas entre plantas y bacterias o por asociaciones con poblaciones bacterianas de vida libre (Schlesin-ger, 1997). En ecosistemas que dependen estrictamente del reciclaje de materia orgánica en descomposición, como es el caso de los suelos de la Amazonia, la fijación biológica de nitrógeno podría tener un valor más significativo.

La fijación biológica de nitrógeno más estudiada ocurre a través de la simbiosis leguminosa-rizobio, siendo las bacterias Rhizobium, Bradyrhi-

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zobium, Sinorhizobium y Azorhizobium, los fijadores simbióticos asocia-dos a leguminosas más importantes (Sylvia et al., 1998). Perret et al. (2000) reportaron una alta presencia de bacterias fijadoras simbiontes y sus hospederos en zonas tropicales, sugiriendo una alta frecuencia en zonas tropicales.

El Instituto Sinchi ha venido evaluando la simbiosis en leguminosas nativas y foráneas desde el año 1996 en coberturas naturales (bosques primarios) y modificadas (chagras y potreros). Durante el año 2001 se llevó acabo una colecta de leguminosas nativas en el municipio de Leti-cia, Amazonas donde el 59.5% de las especies colectadas no presenta-ron nódulos de fijación de nitrógeno (Peña-Venegas y Arias, sometido). Los resultados mostraron que esta simbiosis es muy sensible a factores abióticos que disminuyen la posibilidad de aparición, requiriendo un cui-dadoso manejo del suelo para mantener o aumentar la capacidad fijado-ra de la cobertura vegetal.

El género Inga mostró ser el grupo de leguminosas con mayor capa-cidad de fijar nitrógeno en este tipo de suelos, aumentando si también ocurre la simbiosis con hongos micorrícicos.

Bacterias y hongos solubilizadores de fosfatos

En suelos ácidos, la mayor parte del fósforo no está disponible para las plantas, este se encuentra quelado en forma de fosfatos de hierro y aluminio (ver Useche, 2003). La forma en que dicho fósforo puede ser aprovechado por las plantas se realiza por medio del proceso de solubili-zación que realizan bacterias, hongos y actinomycetes fosfato solubiliza-dores (ver Useche, 2003).

Los microorganismos producen ácidos orgánicos e inorgánicos que in-teractúan con los fosfatos generando compuestos solubles (ver Useche, 2003). Los mecanismos por los cuales los microorganismos llevan a cabo la solubilización son: producción de ácidos orgánicos e inorgánicos, pro-ducción de quelantes como 2-cetogluconato, citrato, lactato y oxalato, reducción del hierro en el fosfato férrico a fosfato ferroso, producción de sulfuro de hidrógeno y por actividad enzimática de fosfatasas (Alexander, 1977; en Useche, 2003).

Vera (1999), realizó aislamientos de hongos solubilizadores de fosfatos, en el departamento de Guaviare, reportando a Trichoderma sp., Asper-gillus aculeautus, Aspergillus sp., Paecilomyces sp. y Gongronella butreli

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como organismos solubilizadores de fosfato de calcio. Cabrera (2000) reportó los hongos Penicillium, Aspergillus, Scytalidium y Paecilomyces con actividad a la degradación de fosfatos en ultisoles y oxisoles del sur del Trapecio Amazónico. Dentro de los géneros bacterianos con mayor capacidad de solubilización se encontraron Pseudomonas, Xanthomo-nas, Enterobacter y Chromobacterium, siendo Enterobacter agglome-rans, Chromobacterium sp., Xanthomonas macrophilia y Pseudomonas gladioli reportes nuevos de especies solubilizadoras de fosfatos. Entre los hongos solubilizadores de fosfato se encontraron Penicillium sp., Paeci-lomyces sp., Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Scopulariopsis sp., Moniliella sp., Mortierella sp. y un ascomycete sin identificar. Una estima-ción in vitro mostró que el 5.5 % de las bacterias y el 3.2 % de los hon-gos presentes en estos suelos tienen capacidad solubilizadora (Useche, 2003).

Las investigaciones deben ahora apuntar a demostrar los efectos sig-nificativos en el fósforo asimilado por las plantas a partir de la solubiliza-ción microbiológica de fosfatos y la existencia de una relación sinérgica con micorrizas arbusculares.

Actinomycetes

Estas bacterias caracterizadas por sus altos contenidos de G+C en su ADN, pueden encontrarse en un amplio rango de hábitats, siendo par-ticularmente abundantes en el suelo. Producen varios compuestos bio-activos estructuralmente diversos de importancia farmacéutica y agrícola (Monciardini et al., 2002).

Los actinomycetes juegan un papel crucial en la sostenibilidad a largo plazo de los sistemas naturales y agrícolas, debido al papel que cumplen en la descomposición de la materia orgánica, fijación de nitrógeno (Fran-kia sp.), degradación de agroquímicos y el control biológico de plagas de plantas y animales. Algunos son saprofitos estrictos, otros forman asocia-ciones parasíticas o simbióticas con plantas o animales. En conjunto con ciertos hongos juegan un papel importante en la degradación de com-puestos recalcitrantes como lignina, siendo la capacidad para producir antibióticos, enzimas y productos bioactivos, una de sus características más importantes (Ver Cardona, 2004).

A la fecha se han realizado dos trabajos sobre la abundancia y diversi-dad de esta comunidad en suelos bajo diferentes coberturas vegetales,

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uno en una área de colonización del municipio de San José de Guaviare (Cardona, en prensa) y en comunidades y resguardos ubicados en el sur del trapecio Amazónico colombiano, siendo este uno de los pocos grupos de microorganismos estudiado por medio del uso de técnicas molecula-res (Análisis de Restricción de los Amplificados del rRNA 16S–ARDRA) en el sur de la Amazonía Colombiana (Cardona, 2004).

Los resultados tanto por técnicas de recuperación en placas de agar como por técnicas moleculares mostraron una mayor diversidad de esta comunidad en suelos bajo cobertura de bosque. Los géneros de acti-nomycetes con mayor frecuencia de aparición fueron: Streptomyces, No-cardia, Pseudonocardia, Microbispora, Sacharomonospora, Agromyces, Nocardiopsis y un morfotipo perteneciente al grupo de los Actinomyces nocardioformes no identificado (Cardona, 2004, 2005). De éstos géne-ros, Streptomyces fue el más dominante e importante dentro de la co-munidad. Igualmente se encontró que el ADN del suelo representa la comunidad total de actinomicetos, y no únicamente la subfracción capaz de crecer en placa de cultivo. La importancia ecológica y biotecnológica de los actinomycetes, permiten proponer a esta comunidad como un indicador biológico de procesos de alteración del paisaje y un modelo adecuado para la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos (Cardona, 2004).

Uso de técnicas moleculares para el estudio de la diversidad microbiana en suelos de la amazonía colombiana

Numerosos estudios han comprobado que la mayoría de las bacterias en muestras ambientales no pueden ser aisladas o cultivadas usando solamente técnicas tradicionales de cultivo; solo una pequeña fracción de la biomasa microbiana puede ser cultivada de esta forma bajo con-diciones usuales de laboratorio (Roose-Amsaleg et al., 2001). Técnicas moleculares basadas en la caracterización de los ácidos nucleicos extraí-dos de suelo ofrecen un gran potencial para investigar las comunidades bacterianas no cultivables del suelo. Dentro de éstas aproximaciones, la amplificación por PCR de las regiones conservadas y variables de los ge-nes 16S rRNA pueden proporcionar una vista global de grupos distante taxonómicamente o de ramas profundas dentro de grupos eco-fisiológi-camente seleccionados. El ADN amplificado puede clonarse en vectores, secuenciarse y analizarse por su semejanza a otras secuencias conocidas en las bases de datos de dominio publico (Crecchio et al., 2004). La recu-

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peración, clonación y expresión del ADN ambiental sin cultivo previo es una aproximación, que permite explotar el potencial biocatálitico de las comunidades microbianas presentes en muestras ambientales (Esther et al., 2003). El grupo de Recursos Genéticos y Biotecnología del Instituto Sinchi, ha estandarizado y aplicado técnicas independientes de cultivo como ARDRA y clonación molecular de genes 16S rRNA, para estimar la diversidad de poblaciones de actinomycetes y bacterias en suelos bajo coberturas vegetales de bosque, pastizal y rastrojo en la Amazonia sur de Colombia. El uso de éstas técnicas ha permitido estimar en forma mas precisa la diversidad de los diferentes grupos, cuantificar la presencia de microorganismos a diferentes profundidades del suelo, relacionándolas con procesos de degradación y apoyar técnicas tradicionales para la de-terminación de especies difíciles de taxar. El uso de estas herramientas debe ahora apuntar a la identificación de secuencias y genes de interés que puedan ser aplicados en diferentes campos de la ciencia, dando va-lor agregado a la biodiversidad de la Amazonia colombiana.

DISCUSIÓN

Con este tipo de investigaciones, el instituto Sinchi busca implemen-tar el uso de técnicas moleculares de punta para apoyar el estudio de la diversidad microbiana que se ha venido realizando por metodologí-as convencionales en suelos de la amazonía colombiana, con el fin de aportar al conocimiento de la biodiversidad del país, así como su posible aplicación en cadenas productivas que garanticen el uso sostenible de los recursos naturales y mejoren la calidad de vida de los pobladores de la región.

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YUCOMICS: APLICACIONES PARA LA RESISTENCIA A LA BACTERIOSIS VASCULAR

YUCOMICS: APPLICATIONS TO THE RESISTANCE TO CASSAVA BACTERIAL BLIGHT

CAMILO LÓPEZ1

1Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

[email protected]

RESUMEN

La yuca (Manihot esculenta) representa la cuarta fuente más importante de calorías después del arroz, el maíz y el trigo y es la fuente de carbohidratos de más de 500 millones de per-sonas. Una de las principales limitaciones de este cultivo es la bacteriosis vascular de la yuca, enfermedad endémica en Áfri-ca y América Latina, ocasionada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Una colección de ESTs (Ex-pressed Sequence Tag) fue desarrollada a partir de diferentes variedades de yuca resistente y sensible a la bacteriosis vascular y con diferente contenido de almidón. Un total de 11954 se-cuencias fueron generadas, las cuales fueron ensambladas en un set unigen de 5700 secuencias únicas. Esta información fue utilizada para construir el primer microarreglo de yuca, el cual fue empleado para estudiar la expresión de estos genes como respuesta a la infección por Xam. Un total de 199 genes fueron diferencialmente expresados, 126 inducidos y 73 reprimidos. Dentro de estos genes se encontraron genes implicados en procesos como el estrés oxidativo, la degradación proteica y el refuerzo de la pared celular.

Palabras clave: Yuca, resistencia, bacteriosis vascular, EST, microarreglos.

ABSTRACT

Cassava (Manihot esculenta), a starchy root crop, is the fourth resource of calories after rice, corp and wheat. Cassava is an important source of carbohydrates for over 500 million people. Cassava Bacterial Blight (CBB) is an important disease, endemic

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in Latin America and Africa. CBB is caused by the bacterium Xan-thomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). An EST (Expressed Sequence Tag) collection was developed from different cassava cultivars, resistant and susceptible to CBB and with different starch content. A total of 11954 sequences were generated and assembled in a unigene set of 5700 unique sequences. This infor-mation was used to construct the first cassava microarray, which was employed to study the gene expression profile in response to Xam infection. A total of 199 genes were differentially expressed (126 induced and 73 repressed). This expression profiling indi-cated that, in response to inoculation with Xam, cassava induces dozens of genes, including principally those involved in oxidative burst, protein degradation and cell wall reinforcement.

Keywords: Cassava, resistance, cassava bacterial blight, EST, microarray.

INTRODUCCIÓN

La yuca es uno de los cultivos más importantes en las regiones tropi-cales, subtropicales y sub-Saharianas del mundo; es cultivada en más de 90 países y constituye la base de la alimentación de más de 600 millones de personas. La yuca es producida en más de 16 millones de hectáreas y su producción alcanza los 170 millones de toneladas (FAO/FIDA 2000).

Las principales enfermedades que afectan la yuca y disminuyen su pro-ducción son las enfermedades virales y bacterianas, las cuales pueden incluso amenazar la seguridad alimenticia en varios casos. La enferme-dad del mosaico de la yuca (CMD, del inglés Cassava Mosaic Dissease) es causada por un complejo de geminivirus, el cual esta solo presente en África. La bacteriosis vascular de la yuca o añublo bacteriano (CBB, del inglés Cassava Bacterial Blight) es una enfermedad endémica importante en Latinoamérica y África. La bacteriosis vascular es causada por la bac-teria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam), un patógeno foliar y vascular (Verdier et al., 2004). Las pérdidas causadas por la bacteriosis pueden alcanzar incluso el 80 o 100 % de la cosecha si las condiciones del medio son favorables para su desarrollo y si no se adoptan practicas agronómicas y fitosanitarias adecuadas para su control (Verdier et al., 2004). A pesar de que existen variedades resistentes, estas no poseen buenas cualidades culinarias y por esta razón no han sido adoptadas por los productores. La alternativa es poder desarrollar variedades resistentes que posean propiedades culinarias adecuadas para su comercialización.

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El desarrollo de variedades resistentes mediante estrategias de mejo-ramiento convencional ha permitido elevar los niveles de resistencia en ciertos casos (Jorge, 2000), sin embargo las características propias de la yuca, tales como su largo ciclo reproductivo, su naturaleza tetraploide y su alta heterocigocidad han dificultado la obtención de mejores resultados. El empleo de las herramientas de biotecnología (p.e. transformación) constituye una herramienta valiosa con el objetivo de generar variedades mejoradas de una manera eficaz y rápida. Sin embargo, para esto se re-quiere un entendimiento de los mecanismos de resistencia de la yuca a la bacteriosis y la clonación de genes de resistencia. En los últimos años se han realizado varios avances en este sentido. Actualmente existe un mapa genético de yuca (Fregene et al., 1997) el cual ha permitido la iden-tificación y ubicación de varios QTLs (del inglés Quantitative Trait Loci) asociados a la resistencia (Jorge et al., 2000; 2001). Varios genes de re-sistencia candidatos o RGCs (del inglés Resistance Gene Candidats) han sido identificados y constituyen una herramienta importante en los pro-gramas de mejoramiento (p.e. en la selección asistida por marcadores y como punto de partida para la clonación de genes (López et al., 2003).

El desarrollo reciente de la genómica (secuenciación de genomas en-teros, desarrollo de colecciones de ESTs) ha permitido grandes avances en el entendimiento de los mecanismos moleculares de diferentes espe-cies. Estos trabajos han permitido la construcción de microarreglos de ADN, los cuales han sido extensamente utilizados para estudiar el nivel de expresión de cientos o miles de genes (incluso del genoma entero) de manera simultánea como respuesta a una condición o de un estadio de desarrollo particular.

En este trabajo se presentan los recientes desarrollos realizados en el área de genómica de yuca, con un énfasis particular en la resistencia a la bacteriosis vascular. Se describe el desarrollo de la colección de ESTs y como esta información ha sido utilizada para construir el primer microar-reglo de yuca, el cual fue empleado para evaluar la expresión simultanea de más de 5000 genes en respuesta a la infección por Xam.

DESARROLLO DE UNA COLECCIÓN DE ESTS

Los ESTs son fragmentos cortos de ADN generados a partir de la se-cuenciación de uno o ambos extremos de los clones de una librería de ADNc (ADN complementario). Los ESTs representan fragmentos de un gen expresado en ciertas condiciones (Rudd, 2003).

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Para el desarrollo de la colección de ESTs, se generaron un total 12 librerías de ADNc. Cuatro de estas librerías se obtuvieron por procedi-mientos estándar. Las restantes ocho librerías fueron sustractivas. La sustracción se realizó por dos métodos diferentes (DSC -Differential Sub-traction Chain- y SSH -Supresión Subtractive Hybridization-) utilizando ADNc obtenido a partir de material inoculado y material no inoculado. Las librerías fueron obtenidas a partir de cinco variedades de yuca, las cuales presentan fenotipos particulares de interés. Dos de ellas muestran un fenotipo contrastante en cuanto a su capacidad de almacenamiento de almidón y las tres restantes presentan una respuesta diferencial a la bacteriosis vascular, variando desde altamente resistente hasta sensible (Tabla 1). Un total de 11954 secuencias de alta calidad fueron generadas y varios análisis bioinformáticos se desarrollaron.

El total de 11954 ESTs generados fueron ensamblados en un set uni-gen de 5700 secuencias únicas, comprendiendo un total de 1875 contigs (secuencias sobrelapantes, -9218 ESTs-) y 3825 singletones (López et al., 2004). Para realizar la anotación de los ESTs presentes en el set unigen se empleó el esquema del consorcio Gene Ontology (The Gene Onto-logy Consortium, 2000). Siguiendo este criterio fue posible asignar una categoría funcional, sobre la base de la similitud que presentaron estas secuencias con otras proteínas presentes en la base de datos, a 37 % de los ESTs del set unigen. Dentro de las funciones moleculares, las catego-rías mas representadas fueron la de unión a ácidos nucleicos (10 %) y la de las actividades hidrolasa y transferasa (9 y 6 % respectivamente). En la categoría de metabolismo se agruparon 977 secuencias y en la de crecimiento/mantenimiento celular 406 ESTs.

Para identificar genes específicos de yuca, el set unigen fue compara-do con la base de datos de ESTs de varias especies vegetales (Arabidop-sis, soya, tomate, papa y Medicago) utilizando TBLASTX. El porcentaje de secuencias de yuca que no mostraron similitud con otros ESTs varió entre 21 y 27 % según la especie de comparación. En total, 16 % de las secuencies de yuca no presentaron similitud con ninguno de los productos proteicos predichos de las otras especies vegetales y pue-den representar potenciales genes específicos de yuca. Sin embargo es necesario tener en cuenta que algunos de ellos pueden representar regiones no traducidas (UTR) o ser muy cortas para tener dominios que detecten similitud significativa con las proteínas presentes en las bases de datos.

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Tabla 1. Características de las librerías utilizadas para la generación de la colección de ESTs en yuca.

Variedad Fenotipo/Condición Órgano Designación No. de secuencias

CM523-7 Alto contenido de almidón Raíces CM 3608MPer183 Bajo contenido de almidón Raíces Mper 3391MCol1522 Sensible/Inoculada Tallos MCol-48h 1721

Sensible/Sustraída Tallos mc_ssh 258MBra685 Resistente/No inoculada Tallos mbra 1560

Resistente/No sustraída Tallos mb_nosub 258Resistente/Sustraída Hojas mb_dsc 438

SG107-35 Resistente/No sustraída Tallos sg_nosub 128Resistente/Sustraída Tallos sg_ssh 210Resistente/Sustraída Tallos sg_dsc 382

MBra685 Resistente/AFLP Tallos aflp 241

Para tratar de identificar genes que pueden estar potencialmente im-plicados en la respuesta de defensa a la bacteriosis, se seleccionaron aquellos ESTs presentes únicamente en las librerías de ADNc inoculadas con Xam. Un total de 1613 secuencias fueron obtenidas. En general se presentaron pequeñas diferencias entre los genes presentes en las dife-rentes variedades de yuca (resistentes –MBra685, SG107-35- vs. sensibles –MCol1522-). Algunos de los ESTs en este grupo mostraron similitud con genes previamente implicados en la respuesta de defensa tales como genes de resistencia, factores de transcripción de tipo WRKY, quitinasas, peroxidasas y kinasas entre otros. Un mayor porcentaje de secuencias (56%) que en el análisis global no mostró similitud con las proteínas pre-sentes en las bases de datos. Las secuencias presentes únicamente en las librerías de ADNc inoculadas representan genes que potencialmente juegan un rol importante en la resistencia a la bacteriosis. Sin embargo, estudios de expresión mas detallados como RT-PCR o análisis de micro-arreglos (ver mas adelante) permitirán comprobar su rol en la defensa (López et al., 2004).

DESARROLLO DEL PRIMER MICROARREGLO DE YUCA

El desarrollo de una colección de ESTs constituye un gran recurso para el estudio de expresión global de genes. En particular, ESTs que son im-presos sobre láminas de vidrio (microarreglos) han sido empleados para examinar la respuesta de cientos o miles de genes de manera simultánea.

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En plantas, los microarreglos de ADNc han sido usados para estudiar las respuestas frente al estrés abiótico (Thimm et al., 2001) y han mostrado ser de gran utilidad para revelar nuevos mecanismos en el estudio de interacciones plantas-microorganismos (Ramonell y Somerville, 2002). Nosotros aprovechamos la información generada a partir de la colección de ESTs de yuca para construir el primer microarreglo de yuca. Este mi-croarreglo fue utilizado para estudiar los cambios en la expresión de los genes identificados a diferentes tiempos en el caso de una interacción incompatible (resistencia) entre el cultivar MBra685 y la cepa de Xam CIO151.

Para la construcción del microarreglo, insertos amplificados por PCR de cada uno de los 5700 clones representativos del set unigen fueron im-presos en láminas de vidrio. Adicionalmente, un grupo de genes controles de tomate, papa y de humanos fueron impresos para evaluar la calidad de las hibridaciones. Para monitorear los cambios de expresión en los genes de yuca durante el ataque del patógeno, muestras de ARN prove-nientes de tallos a cinco tiempos diferentes después de la inoculación fueron extraídos y el ADNc correspondiente fue sintetizado utilizando Cy3 (muestras inoculadas) o Cy5 (muestras no inoculadas). Los tiempos post-inoculación empleados fueron 12, 24 y 48 horas post-inoculación (hpi) y 7 y 15 días post-inoculación (dpi). Con el objetivo de aumentar la calidad y la consistencia en los datos de microarreglos nosotros usamos tres replicas biológicas (ARNm extraídos en tres fechas diferentes del año) y para cada una de ellas realizamos 3 replicas técnicas (3 hibrida-ciones diferentes, en una de las cuales se invirtió el marcaje, Cy3 para muestras no inoculadas y Cy5 para muestras inoculadas).

Utilizando el programa SAM (Significance Analyses of Microarrays) (Tusher et al., 2001) para identificar genes expresados diferencialmente, nosotros encontramos 199 genes cuya expresión varió significativamente entre plantas inoculadas con el patógeno y plantas sanas. De estos 199 genes 123 mostraron una inducción y 73 de ellos fueron reprimidos. Varios genes fueron expresados diferencialmente durante el curso de la infección. La proporción de genes diferencialmente expresados es baja y constante durante las primeras 48 hpi pero incrementa considerable-mente a 7 dpi antes de disminuir a los 15 dpi. De los 199 genes expresa-dos diferencialmente, 155 mostraron similitud con proteínas conocidas. Algunas de estos codifican para proteínas que previamente han sido re-portadas como importantes en los mecanismos de defensa vegetal contra

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patógenos. Dentro de las que se encuentran proteínas implicadas en el refuerzo de la pared celular, asociados con el estrés oxidativo (peroxida-sas, peroxidasas catiónicas y Glutation-S-transferasa), con la degradación proteica (proteasas, ubiquitina), factores de trascripción de respuesta al etileno, entre otros. Dentro de los genes que se encontraron reprimidos, se encontraron básicamente genes que codifican para proteínas involu-cradas en la fotosíntesis (proteína de unión a la clorofila a/b) (López et al., 2005).

Para confirmar la validez de los resultados obtenidos por microarre-glos, un grupo de genes diferencialmente expresados fueron estudiados mediante RT-PCR en tiempo real. El patrón de expresión (inducción o represión) fue conservado para todos los genes usando los dos métodos, aunque el nivel de expresión fue siempre mayor mediante RT-PCR.

EL CASO DE LA INTERACCIÓN COMPATIBLE (ENFERMEDAD)

Ocho de los genes que mostraron ser expresados diferencialmente por microarreglos en el caso de la reacción incompatible fueron estudiados por RT-PCR en el caso de una reacción compatible (enfermedad). Para esto se utilizó el cultivar MCol1522 el cual es sensible a la cepa de Xam CIO151. La mayoría de ellos (6) fueron igualmente inducidos pero a un tiempo mas tardío, en la mayoría de los casos solo 15 dpi. Los dos restan-tes mostraron una inducción similar tanto en el cultivar resistente como en el sensible pero solo a 7 dpi.

DISCUSIÓN

Uno de los desafíos más importantes dentro de los programas de me-joramiento vegetal es la identificación de los genes de la planta impli-cados en la resistencia o en la vía de señalización, los cuales conducen a la activación de la respuesta de defensa frente a la infección con un patógeno determinado.

A pesar de la importancia de la yuca como cultivo de “seguridad” ali-mentaria, son pocos los esfuerzos que se han hecho con miras a entender mejor su biología, a aumentar su producción y en particular, son escasos los esfuerzos que se han llevado a cabo para entender los mecanismos moleculares que se establecen como respuesta a la infección por Xam.

Los recientes avances en el campo de la genómica y bioinformática molecular han permitido generar de una manera rápida y eficaz cono-

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cimientos valiosos que se pueden traducir, en un corto tiempo, en la generación de variedades con características mejoradas.

Nosotros aprovechamos el desarrollo de las últimas tecnologías de genómica estructural y funcional con miras a obtener una mejor repre-sentación de la organización del genoma de la yuca y obtener así un conocimiento mas profundo de los genes y procesos implicados en la respuesta de defensa de la yuca a la bacteriosis vascular. Estos avances en el conocimiento harán posible establecer comparaciones con los meca-nismos de resistencia en otros cultivos y contra otro tipo de patógenos.

El objetivo último de este tipo de trabajo es la identificación de ge-nes de resistencia que podrán ser introducidos en variedades sensibles mediante transformación. Esto permitirá proveer al productor de nuevas variedades resistentes, lo que en últimas se traducirá en una mayor pro-ducción de yuca y una mejor entrada de ingresos al pequeño productor.

PERSPECTIVAS

Aquellos genes que por sus similitudes con proteínas previamente identificadas con un rol en la resistencia y que han mostrado ser dife-rencialmente expresados como respuesta a la infección por Xam, serán seleccionados para ser ubicados en el mapa de ligamiento de yuca y es-tablecer una posible co-localización con QTLs de resistencia a la bacterio-sis vascular. Estos genes podrán ser validados funcionalmente mediante la estrategia de silenciamiento génico. Esta estrategia ha mostrado ser eficaz en la validación funcional a gran escala en varias especies vege-tales (Lu et al., 2003). Recientemente este método ha sido adaptado en yuca en el laboratorio de Claude Fauquet (ILTAB, St Louis, Missouri) (Fofana et al., 2004), lo cual permitirá una validación de varios genes de manera rápida y simultanea. Al mismo tiempo estos genes constituyen una fuente importante de nuevos marcadores moleculares que pueden ser empleados en los programas de mejoramiento asistido por marcado-res y constituyen además el punto de partida para el clonaje de genes.

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v. Comunicación Celular

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QUORUM SENSING: EL LENGUAJE DE LAS BACTERIAS

QUORUM SENSING: THE TALKING OF BACTERIA

CATALINA ARÉVALO1

1Departamento de Química. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

[email protected]

RESUMEN

Las bacterias producen señales químicas que les permiten co-municarse entre si y regular la expresión genética en respuesta a cambios en la densidad de población del medio. A este fe-nómeno se le conoce con el nombre de quorum-sensing (QS). Los circuitos de QS se han encontrado tanto en bacterias Gram-negativas como Gram-positivas y se conocen diferentes tipos de moléculas autoinductoras. Este tipo de regulación permite la coordinación de diversas actividades fisiológicas como expre-sión de factores de virulencia, competencia, formación de bio-film, producción de antibióticos, motilidad y esporulación entre otros. Las bacterias Gram- usan homoserinlactonas y las Gram+ usan oligopéptidos como autoinductores para comunicarse. Se ha observado que la comunicación bacteriana no solo funciona dentro de la misma especie, también existen moléculas señal comunes entre especies diferentes y recientemente se encontró un nuevo autoinductor que parece ser “la molécula de comuni-cación universal”. Los estudios realizados sobre QS han revela-do la posibilidad que tiene las bacterias para comunicarse y así intercambiar información con la que coordinan actividades para vivir en comunidad. La posibilidad de comunicarse era conside-rada una característica de organismos superiores ahora las bac-terias se estudian con un lente diferente y se pueden encontrar consorcios estratificados que se acercan a la “multicelularidad”.

Palabras clave: Autoinductores, homoserinlactonas, comunicación celu-lar, quorum-sensing, virulencia.

ABSTRACT

Bacteria produce chemical signal molecules for communication; the ability to communicate with one another allows bacteria to

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coordinate the gene expression in response to fluctuations in cell-population density. This phenomenon is known as Quorum sensing (QS). QS circuits are used by Gram-positive and Gram-negative bacteria and different autoinducers are discovered. Coordination of diverse physiological activities is regulated by QS circuits for instance virulence, biofilm formation, antibiotic production, motility, and sporulation among others. Gram- bac-teria use homoserine lactones, and Gram+ bacteria use oligo-peptides as autoinducers to communicate. It has been seen that cell-cell communication occurs both within and between bacte-rial species. It is also known that there are common signals for different bacterial species and recently a new autoinducer was discovered which seems to be “the worldwide communication molecule”. The studies about QS unravelled the communication of bacteria and the possibility they have to share information for coordinating the community live activities. Communication was thought to be restricted to higher organisms, nowadays it is recognised that bacteria exist as stratified consortia few steps separated from multicellularity.

Keywords: Autoinducer, homoserine lactone, cell-cell communication, quorum-sensing, virulence.

INTRODUCCIÓN

Los primeros hallazgos que llevaron a descubrir el fenómeno de quo-rum-sensing (QS) se hicieron en 1970 en bacterias luminiscentes (Nealson y Hastings, 1970) cuando se comenzó a estudiar el sistema de produc-ción de luz de Vibrio fischeri. K. Nealson y W. Hastings observaron que la emisión de luz en cultivos de Vibrio fischeri (antiguamente conocido como Photobacterium fischeri) solamente ocurría en la mitad de la fase logarítmica de la curva de crecimiento bacteriano. En los cultivos de la fase logarítmica temprana la luciferasa estaba inactiva. Una vez se había alcanzado una densidad óptica suficiente (aprox. 1010 células/mL) el cul-tivo emitía luz sin intervención externa, esto les permitió concluir que una sustancia secretada al medio por las bacterias, se acumulaba a me-dida que la población bacteriana aumentaba y activaba a la enzima. Las bacterias acondicionaban el medio de tal manera que un cultivo fresco de bacterias inoculado en el medio modificado emitía luz en la fase loga-rítmica temprana (Nealson y Hastings, 1970, Nealson y Hastings, 1979). Desde esa época se encontró que la emisión de luz estaba determinada

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por la población bacteriana en respuesta a una sustancia auto inductora (A. I) que se acumulaba en el medio, actuando como señal para la acti-vación del operón estructural de la luciferasa, el operón luxICDABE, esta enzima es una de las encargadas de la producción de luz en bacterias luminiscentes (Kaplan y Greenberg, 1985; Fuqua et al., 1994).

Hasta 1985 el fenómeno fue conocido con el nombre de autoinducción debido a que los A.I se difundían libremente a través de la membrana de las bacterias y activaban la expresión de ciertos genes. Fuqua et al. (1994) bautizaron este fenómeno con el nombre de “Quorum-Sensing” porque el autoinductor se acumulaba y solamente se difundía al interior de la bacteria cuando la densidad óptica del cultivo era elevada, es decir, había quórum para que los genes fueran activados.

Hasta hace poco se consideraba este fenómeno una característica pe-culiar de algunas bacterias Gram-negativas (Gram-) que tenían la posi-bilidad de usar señales para comunicarse, en la actualidad se sabe que una gran variedad de microorganismos utilizan compuestos químicos lla-mados moléculas señal para comunicarse entre ellos y que pueden co-ordinar la expresión de ciertos fenotipos de acuerdo con la densidad de población del cultivo en el que se encuentren. El QS está generalizado en muchas especies bacterianas, se conocen tres sistemas canónicos de QS: uno para bacterias Gram-, otro para bacterias Gram-positivas (Gram+) y uno que es una combinación de los dos anteriores (De Kievit y Iglewski, 2000; Whitehead et al., 2001).

Es una realidad que las bacterias, haciendo un censo de la densidad de población, deciden si una característica fenotípica debe ser expresada o no, esto hace que tengan cierto poder sobre el medio ambiente afectán-dolo de una manera favorable o desfavorable. Por un lado, está el con-sorcio que les permite colonizar y establecer infecciones en los diferentes tejidos de los huéspedes y por otro lado, está la protección de ciertos cultivos asociada con la comunicación bacteriana. Las bacterias tienen la capacidad de comunicarse entre la misma especie y entre diferentes especies empleando compuestos químicos específicos y variados que les permiten regular la expresión genética de una forma global y construir consorcios de vida comunitaria estratificada.

SISTEMAS DE QUORUM SENSING EN BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

En muchas bacterias QS regula una gran variedad de fenotipos por ejemplo bioluminiscencia en V. fischeri y V. harveyi (Nealson y Hastings

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1979), transferencia de plásmidos inductores de tumores (plasmidos Ti) en Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al., 1993), producción de an-tibióticos (carbapenem) en Erwinia carotovora (McGowan et al., 1995), motilidad (swarming) de Serratia liquefaciens (Eberl et al., 1996), forma-ción de biofilm y factores de virulencia en Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cenocepacia (de Kievit y Iglewski, 2000, Huber et al., 2001, Arévalo-Ferro et al., 2003). Se ha demostrado que muchas bacterias no expresan factores de virulencia hasta que la densidad de población es suficientemente elevada para poder derrotar a las defensas del huésped y establecer la infección (Greenberg, 2003).

Sistema de luminiscencia LuxI-LuxR en Vibrio fischeri

El circuito de Vibrio fischeri tiene los tres componentes típicos de un sistema QS de bacterias Gram-. 1) La proteína LuxR, es un regulador transcripcional que se une al ADN (en el promotor conocido como “lux box”, una secuencia palindrómica de ADN de 20 pb) y activa la expresión del operón lux. LuxR se une a la molécula señal generando un multíme-ro que expone un motivo típico helix-turn-helix (HTH) de unión al ADN (Figura 1.A). 2) Lux I, es la enzima encargada de sintetizar una acilhomo-serinlactona (AHL) que en el caso de los Gram– es la molécula típica de la señalización. Los sustratos de esta enzima son la proteína acarreadora de grupo acilo (Acilo-ACP) y la S-adenosilmetionina (SAM). LuxI cataliza la formación de un puente entre el grupo amino de SAM y la cadena acilo del Acilo-ACP y la posterior lactonización para formar la AHL (Figura 1.B). 3) El último componente es la molécula señal, en el caso de los Gram- es una AHL, en el caso específico del V. fischeri es la 3-(oxohexanoil) homo-serinlactona (3-oxo-C6-HSL). Las AHL que actúan como moléculas señal se diferencian en la longitud de la cadena acilo que acarrea la Acilo-ACP esta diferencia les da la exclusividad dentro de una especie bacteriana o las hace una señal común entre varias especies (Eberhard et al., 1981; Fuqua et al., 1994).

El regulón que se encarga de la emisión de luz en V. fischeri está com-puesto por el operón luxICDABE y el gen luxR; los genes accesorios del operón están relacionados con la producción de luz. luxI codifica para la sintetasa de AHL (LuxI), luxA y luxB son las subunidades alfa y beta de la luciferasa y los genes luxCDE codifican enzimas relacionadas con la síntesis de sustratos para la luciferasa (p.e. la reductasa de ácidos grasos que interviene en la síntesis de aldehídos).

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El operón lux tiene una expresión basal que permite la síntesis de 3-oxo-C6-HSL, esta molécula se difunde libremente a través de la mem-brana bacteriana y se acumula en el medio de cultivo. A medida que la densidad de población aumenta, la concentración de HSL en el medio se equilibra con la concentración en el interior de la bacteria (aprox. 10 nM). En este momento la molécula señal se une al factor de trascripción LuxR. Esta interacción ocurre en la parte N-terminal de la proteína cau-sando un cambio conformacional que deja libre al motivo HTH de LuxR permitiendo su unión al promotor (lux box). De esta forma LuxR activa la trascripción del operón luxICDABE generando una autorregulación po-sitiva de luxI (retroalimentación positiva) (Engebrecht y Silverman, 1984; Kaplan y Greenberg, 1985).

Figura 1. A. Diagrama esquemático de Lux R. 1. Región autorreguladora que es necesaria para la activación basal del gen lux R. 2. Segmento de unión a la molécula señal. 3. Segmen-to que facilita la multimerización requerida para la unión al ADN. 4. Motivo de unión al ADN helix-turn-helix (HTH). 5. Segmento C Terminal necesario para la activación transcripcio-nal. B. Esquema de la síntesis de AHLs a partir de SAM y la proteína acarreadora del grupo acilo: I. puente con el grupo amino, II. Lactonización.

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V. fischeri vive en una asociación simbiótica con diferentes huéspedes eucariotes en el fondo del mar, p.e. el molusco Euprymna scolopes, que han desarrollado un órgano especializado para atrapar a estas bacterias luminiscentes, “un órgano iluminado” donde V. fischeri puede alcanzar la densidad óptica suficiente para acumular AHLs sin que se difundan en el agua del mar. Este órgano parece ser el único nicho natural donde V. fischeri pude alcanzar su máxima emisión de luz, de esta forma el mo-lusco provee a la bacteria de un hábitat protegido y rico en nutrientes y aprovecha esta relación simbiótica utilizando la luz que produce el mi-croorganismo para evadir predadores y atraer a su pareja (Engerbrecht et al., 1983).

Sistemas de virulencia LasI-LasR y RhlI- RhlR en Pseudomonas aeruginosa

Esta bacteria es un patógeno oportunista que infecta una gran varie-dad de huéspedes (animales y plantas). Se han descubierto dos sistemas de QS que tienen los mismos componentes del sistema canónico LuxI-LuxR y regulan la expresión de la mayoría de factores de virulencia en P. aeruginosa. El primer sistema es el circuito las. Está regulado por el factor de transcripción LasR y la enzima LasI que sintetiza la molécula de señal N-3-oxo-dodecanoil-homoserinlactona (3-oxo-C12-HSL). El segun-do sistema es el circuito rhl formado por el factor de trascripción RhlR y la enzima RhlI que sintetiza la N-butanoil-homoserinlactona (C4-HSL). Los dos sistemas no operan de forma independiente, están arreglados en una jerarquía en la que el circuito las regula positivamente la expresión de rhlR y rhlI quedando en la cima de la cascada de señalización (Figura 2.A) (Pesci et al., 1997; de Kievit y Iglewski, 2000).

La activación de estos sistemas ocurre de la misma forma descrita an-teriormente para V. fischeri. Las AHLs se unen a sus respectivos factores de activación transcripcional que activan directamente la expresión de los genes regulados por un promotor “lux box”. Se ha visto que muchos de los genes que codifican un fenotipo determinado expresado cuan-do la población bacteriana es considerable (en cultivos con densidades ópticas altas), es decir, coordinados por QS, no están bajo la regulación directa de un promotor lux box, no responden a la activación directa que hacen el LasR o el RhlR, así mismo se tienen evidencias de modificacio-nes postranscripcionales reguladas por QS. Un ejemplo de este tipo de regulación es la proteína “Cap”, la subunidad de FliD del flagelo; mientras

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esta proteína funciona como sombrero del flagelo parece tener un tipo de conformación, pero cuando las bacterias se adhieren a mucina, en diferentes tejidos, FliD presenta una conformación diferente. Este cambio de conformación no ocurre en mutantes de los genes que gobiernan los circuitos de QS en P.aeruginosa. Debido a esto se propuso que el cambio de conformación se debía a una digestión enzimática controlada por una proteína que actúa, de alguna manera, en respuesta a la densidad de po-blación. Otra evidencia de modificaciones postranscripcionales reguladas por QS la dieron estudios en paralelo de proteómica y transcriptómica que completaron la información existente sobre posibles fenotipos co-ordinados por este fenómeno (Arévalo-Ferro et al., 2003; Hentzer et al., 2003a; Schuster et al., 2003; Wagner et al., 2003).

Entre los fenotipos regulados por QS en P. aeruginosa se encuentran la expresión de factores de virulencia como la elastasa (LasB), quitinasa (ChiC), algunas proteasas como la endoproteasa PrpL, factores involu-crados en el uso y adquisición de hierro como la proteína HaspP y el receptor de ferripioverdina FpvA (de Kievit y Iglewski, 2000; de Kievit et al., 2002; Arévalo-Ferro et al., 2003; Hentzer et al., 2003a; Arévalo-Ferro et al., 2004).

Se han encontrado reguladores adicionales que forman parte integral de los circuitos de QS de P. aeruginosa, entre ellos se encuentran RsaL, QscR, GacA, Vfr, MvaT and RpoS (Figura 2.A). El gen rsaL codifica un re-presor (RsaL) de algunos genes de virulencia, si este gen se encuentra sobreexpresado los niveles de expresión de LasB disminuyen (de Kievit et al., 1999). Otro represor del sistema es la proteína QscR (quorum-sen-sing control represor) que interfiere con la expresión de lasI, mutantes en qscR sintetizan AHL antes que la cepa silvestre resultando en una trans-cripción prematura de genes regulados por QS (Chugani et al., 2001).

Se han reportado también activadores de los sistemas, como el activa-dor global de genes de virulencia GacA que forma parte del sistema de dos componentes GacA/GacS y parece tener influencia en la expresión de los dos circuitos (Reimann et al., 1997). Uno de los reguladores adiciona-les más estudiado es el regulador de factores de virulencia Vrf. Es una pro-teína receptora de AMP-cíclico (cyclic AMP receptor protein, CRP) que se une a una secuencia consenso de unión a CRP (CRP-binding consensus sequence, CCS) activando la expresión de lasR (Albus et al., 1997). Estos y otros reguladores externos de los dos circuitos de QS en P. aeruginosa generan una compleja red de coordinación de la expresión genética.

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En la actualidad la evidencia del control que tienen los sistemas de QS en la expresión de muchos fenotipos de P. aeruginosa es muy am-plia, entre ellos se encuentran principalmente la formación de biofilm y la expresión de factores de virulencia. La importancia de los sistemas de comunicación celular en la patogenicidad de P. aeruginosa han sido estudiados en varios modelos animales, en todos los casos las mutantes defectuosas en los sistemas de QS (mutantes en los genes lasI, lasR o la mutante doble lasI-lasR) fueron menos virulentas que la cepa nativa (Tang et al., 1996; Tan et al., 1999; Wu et al., 2001).

SISTEMAS DE QUORUM SENSING EN BACTERIAS GRAM–POSITIVAS

Las bacterias Gram+ regulan también muchos procesos en respuesta a la densidad de población. El sistema para censar el quórum en este tipo de bacterias es diferente al sistema de las bacterias Gram-, en vez de usar AHL como moléculas señal, las bacterias Gram+ usan oligopéptidos con un tamaño entre 5 y 17 aminoácidos (autoinducing peptides, AIPs) como auto inductores de los sistemas de QS. Los AIPs son secretados por proteínas transportadoras ABC (ATP-binding cassette, ABC transporters) porque la membrana no es permeable a estos péptidos. Para la detec-ción de los AIPs, una vez se han acumulado en el medio, estas bacterias usan sistemas de transducción de señal de dos componentes, en los que la señalización se hace a través de cascadas de fosforilación y desfosfo-rilación de proteínas quinasas. Esta cascada termina en la activación de una proteína reguladora (que se fosforila o se desfosforila para activar-se). La proteína reguladora se une a un promotor en el ADN y promueve la expresión de un factor de la trascripción. Los factores de trascripción regulan la expresión de los genes blanco y tienen, en algunas bacterias, una regulación coordinada con la cascada de fosforilación inicial, es decir están activos o inactivos según su estado de fosforilación (Mark et al., 2002). El locus que codifica para péptido señal, se traduce como una proteína precursora que es procesada de diferentes formas para producir el AIP. El clivaje de esa proteína precursora no ocurre de la misma forma en todas las bacterias Gram+, esta especificidad hace que los AIPs sean exclusivos de ciertas especies baterianas o sean comunes entre varias (lo mismo ocurre con la cadena acilo en las AHLs). Se han identificado dife-rentes tipos de AIPs, los más especiales son los péptidos cíclicos con un enlace tioester característicos de Staphylococcus aureus (para revisión: Sturme et al., 2002).

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Una vez el péptido es transportado al exterior de la bacteria y se acu-mula hasta alcanzar el nivel mínimo para la estimulación, una proteína quinasa, (el primero de los componentes del sistema de transducción de señal de dos componentes) detecta el AIP y autofosforila su residuo típi-co de histidina (histidine sensor kinase protein, HSKP), el grupo fosforilo es transferido de una quinasa a otra hasta una proteína reguladora que, finalmente, activa un factor de trascripción promoviendo la expresión de los genes blanco.

Se han encontrado muchos sistemas de QS en bacterias Gram+. Por ejemplo, la posibilidad de adquirir ADN externo (competencia) en Strep-tococcus pneumopniae está regulada por el sistema ComD-ComE (Lee y Morrison, 1999), factores de virulencia en Staphylococcus aureus están regulados por el sistema Agrc-AgrA (Novick, 1999) y la competencia y esporulación de Bacillus subtillis está coordinada por el sistema ComP-ComA (Hoch, 1995). Con el descubrimiento de moléculas de señal que le permitían a bacterias Gram+ comunicarse, se abrió el panorama de la regulación de la expresión genética por QS y ahora se considera un fenó-meno global que permite la coordinación de actividades en consorcios bacterianos para tener una vida en comunidad.

Sistema de competencia ComD-ComE en Streptococcus pneumoniae

El proceso con el que S. pneumoniae y B. subtilis se vuelven “compe-tentes”, es decir se habilitan para recibir ADN foráneo, está controlado por un sistema de QS; por esta razón el desarrollo del estado de com-petencia ocurre sólo en la fase exponencial de crecimiento bacteriano. En el caso del S. pneumoniae el sistema de QS está formado por la proteína ComD, la quinasa que recibe la señal del péptido acumulado en el exterior, y la proteína reguladora ComE que es la encargada de promover la expresión del factor de trascripción ComX (Lee y Morrison, 1999).

El CSP (competence stimulating peptide) es el AIP necesario para el desarrollo de competencia en S. pneumoniae. Es un péptido de 17 ami-noácidos que se produce a partir de un péptido precursor de 41 ami-noácidos llamado ComC. ComAB es la proteína transportadora ABC que secreta el péptido modificado al exterior de la bacteria. A medida que la densidad óptica aumenta CSP se va acumulando en el medio y cuando ha alcanzado una concentración elevada, suficiente para estimular la cascada de señalización, la proteína ComD autofosforila el residuo de

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histidina y comienza la transducción del grupo fosfato. Al final de la cas-cada de señalización, el grupo fosfato es trasferido a la proteína regula-dora ComE. Cuando esta proteína está fosforilada activa la trascripción del gen comX (Figura 2.B). ComX es un factor sigma necesario para la expresión de genes involucrados en el desarrollo de competencia. Entre estos genes se encuentran cilA, cilB, cilC, cilD, cilE, que comparten una secuencia conceso promotora “cin-box” a la que se une ComX (Lee y Morrison, 1999).

SISTEMA HIBRIDO DE QUORUM SENSING EN Vibrio harveyi

El sistema de QS de V. harveyi comparte características de los sistemas clásicos de bacterias Gram+ y Gram-, las moléculas señal son AHLs como es el caso de bacterias Gram-, sin embargo, para percibir la señal utili-za un sistema de transducción de señal de dos componentes (Bassler, 1999). Además de esta particularidad, una de las moléculas señal de V. harveyi es un diester de furanosil borato (Boron), esta molécula no tiene la estructura de una AHL pero también se sintetiza a partir de la SAM, se difunde libremente a través de la membrana celular pero la señal es detectada por una HSKP y se transfiere al interior de la célula por medio de una cascada de fosforilación. Actualmente se sabe que esta molécula señal y el gen involucrado en su producción, se encuentran en una gran variedad de bacterias Gram+ y Gram-. Varios estudios demuestran que esta molécula puede ser detectada por un amplio rango de bacterias, esto la convierte en una molécula de comunicación universal (Federle y Bassler, 2003).

La emisión de luz de V. harveyi está controlada por dos sistemas de QS, que funcionan en paralelo regulando la expresión del operón estructural de la luciferasa, luxCDABE. Cada sistema está compuesto por un sensor que es, como en el caso de las Gram+, una HSKP. Cada sensor detecta uno de los dos autoinductores (AI1 y AI2), AI1 es una AHL, la 3-(hidroxibutanoil)-homoserinlactona (3-hidroxi-C4-HSL) que es detectada por LuxN. La síntesis de AI1 en V. harveyi no depende de una proteína como LuxI en V. fischeri, en este caso la síntesis la hace la proteína LuxLM que no comparte ninguna similaridad con LuxI. El AI2, es un diester de furanosil borato, sintetizado por la enzima LuxS, y detectado por el sensor LuxQ. Estas moléculas se difunden libremente y se acumulan en el medio cuando la densidad óptica del cultivo es considerable.

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Figura 2. Diagrama esquemático de los circuitos de QS de A. P. aeruginosa. (lasI-lasR), B. V. harveyi (sistema de QS hibrido), C. S. pneumoniae (comD-comE). Las cajas negras representan los “lux box” o “cinbox” respectivos.

En el caso de V. harveyi cuando la densidad óptica del cultivo es baja y no hay suficientes autoinductores, las proteínas LuxN y LuxQ actúan como quinasas y se autofosforilan generando una cascada de fosforilación. Si la densidad óptica es elevada y los autoinductores se han acumulado en el medio los sensores LuxN y LuxQ actúan como fosfatasas y generan una cascada de desfosforilación (actuando de manera opuesta a las HSKP de los Gram+). Las dos cascadas de señalización (la generada por LuxN y la generada por LuxQ) se unen en una proteína integradora LuxU que trasfiere la señal a la proteína reguladora LuxO (Figura 2.C). LuxO regula

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negativamente la expresión del operón luxCDABE. Si los autoinductores están presentes LuxO se mantendrá desfosforilada permitiendo que el operón se exprese y la bacteria emita luz. Cuando los autoinductores no han alcanzado la concentración necesaria para estimular a los sensores, la cascada de fosforilación mantendrá fosforilada a la proteína LuxO y el operón estará regulado negativamente.

QUORUM-SENSING BACTERIANO: MÁS QUE UNA VIDA SOLITARIA, UNA AGITADA VIDA SOCIAL

Hasta hace poco las bacterias se consideraban organismos individuales que no eran capaces de coordinar actividades. Estos atributos se creían exclusivos de organismos superiores. En la actualidad se reconoce que las bacterias se pueden comunicar dentro de su misma especie usando cierto tipo de lenguaje y también entre especies usando otro tipo de “expresiones idiomáticas”, de esta forma identifican si están “en familia”, con bacterias de la misma especie, o si hay otras especies presentes en el medio. Comunicándose pueden coordinar y organizar actividades como la formación de biofilm o la producción de factores de virulencia para colonizar ciertos tejidos. La comunicación entre células permite que las bacterias se comporten como un grupo y a ese grupo se le ha descrito como una “unidad multicelular”. (Greenberg, 2003b; Shapiro, 1998). La conclusión actual es clara, las bacterias usan señales químicas que les permiten comunicarse intercambiando información con otras bacterias en el medio, con esa información pueden detectar si hay una población considerable que les permita desarrollar una actividad determinada, así el QS juega un papel muy importante en la regulación de la expresión genética bacteriana. Muchas de las actividades que realizan cuando en-cuentran que hay “quórum” están relacionadas con patogenicidad, se ha visto que las bacterias no expresan factores de virulencia si no existe una población considerable que les permita derrotar las defensas del hués-ped. Las mutantes en los sistemas de QS son mucho menos virulentas que las cepas nativas, no expresan factores de virulencia y las mutantes en sistemas que reprimen en QS (es decir cepas que expresan factores de virulencia antes que exista el quórum indicado) son detectadas por el organismo antes de que puedan establecer la infección.

El impacto del QS en el desarrollo de biofilm y en la patogenicidad bacteriana hace que estos sistemas sean un blanco muy atractivo para el desarrollo de nuevos terapéuticos, los llamados medicamentos “anti-

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patogénicos”. Muchos inhibidores del QS han sido utilizados con eficacia en el control de infecciones bacterianas en animales (Hentzer y Givskov, 2003; Smith y Iglewski, 2003).

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vi. Otras aplicaciones

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BIOPROSPECCIÓN, AVANCES Y PERSPECTIVAS

BIOPROSPECTING, ADVANCES AND PERSPECTIVES

DOLLY MONTOYA 1

1Grupo de Bioprocesos y Bioprospección. Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá

[email protected]

RESUMEN

La naturaleza de las especies, el reconocimiento de la importan-cia de la diversidad biológica y el uso sostenible de los recursos naturales ha tomado mucha relevancia para la supervivencia de la humanidad. Todo esto unido a la revolución biotecnológica actual convoca a la comunidad científica en general a contribuir en la exploración de los recursos biológicos con el ánimo de convertirlos en fuente de desarrollo para la sociedad. Se pre-senta la conceptualización de algunos términos empleados en el proceso de bioprospección, la situación colombiana de este y algunos casos exitosos de procesos de exploración de la bio-diversidad microbiana de nuestro país.

Palabras clave: Bioprospección, biodiversidad, bioprocesos, taxonomía.

ABSTRACT

The nature of the species, recognition the importance of the bio-logical diversity and the sustainable use of the natural resour-ces have taken much relevance for the humanity survival. This, added to the present biotechnological revolution summons the scientific community in general to contribute in the exploration of the biological resources with the principal aim to turn them in a source of development for the society. This review presents the conceptualización of some terms used during the bioprospecting process, the colombian status regarding to it, as well as some suc-cessful cases of microbial exploration processes in our country.

Keywords: Bioprospecting, biodiversity, bioprocess, taxonomy.

CONCEPTUALIZACIÓN

De acuerdo al Convenio sobre Diversidad Biológica, la Biotecnología se define como “toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos

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y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos” (Montoya, 2004). En dicho contexto, la Biodiversidad correspondería al repertorio natural ofrecido por un ecosistema delimitado en el cual pueden ser encontrados dichos sistemas biológicos, y resulta particularmente alta en países que paradó-jicamente poseen muy bajos niveles de PIB per capita. Una alta biodi-versidad está asociada a una gran disponibilidad de recursos genéticos, y son estos últimos los elementos vitales de la bioprospección cuando el objetivo final es la obtención de un producto original de alta rentabilidad (Artusso, 2002). Se entiende también por bioprospección la “búsqueda sistemática de usos sostenibles y con fines comerciales, de los elementos genéticos y bioquímicos de la biodiversidad”; bajo esta definición, las actividades de bioprospección constituyen un elemento esencial en cual-quier estrategia de conservación de la biodiversidad nacional, puesto que permiten la generación de conocimiento acerca del valor del uso actual o potencial de sus recursos. La relación de los conceptos biotecnología, biodiversidad, recursos genéticos y bioprospección puede ser vista como un ciclo que parte de las posibilidades abiertas por una región con alta biodiversidad para llegar a la generación de un producto biotecnológico por medio de un proceso de bioprospección guiado por principios co-merciales, epidemiológicos, etnobotánicos, etc. (Figura 1).

Figura 1. Ciclo de obtención de productos biotecnológicos a partir de la biodiversidad de un ecosistema.

BIOPROSPECCIÓN EN PAÍSES EN DESARROLLO: EL CASO DE LATINOAMÉRICA

La bioprospección ha sido malentendida en muchas ocasiones como una excusa para la adjudicación de recursos a países en desarrollo por parte de países que poseen una alta capacidad económica y territorios muy reducidos o alejados del trópico, en donde se encuentra la mayor

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diversidad de especies en el planeta (Barret y Lybert, 2000). Sin embargo, también ha sido relacionada con el hurto de propiedad intelectual sobre los recursos genéticos de un país por parte de los países que han patro-cinado económicamente la investigación de dichos recursos. Para evitar este tipo de inequidades en la investigación biotecnológica paritaria se llevó a cabo en 1992 la Convención sobre Diversidad Biológica (CBD) en Rio de Janeiro, y aunque en la mayoría de los países latinoamericanos aun no se ha reglamentado su aplicación, se han establecido algunos convenios independientes de conservación de biodiversidad y explota-ción de recursos genéticos con fines farmacéuticos, como el constituido por el gobierno de Costa Rica y Merck & Co. con respecto a los Parques Naturales de dicho país.

Un modelo completo de bioprospección llevado a la realidad requiere de la cooperación de países en desarrollo que poseen alta biodiversidad y países desarrollados que poseen la tecnología y los recursos económi-cos necesarios para impulsar la investigación de recursos genéticos. Para establecer una cooperación internacional equitativa, el Convenio sobre Diversidad Biológica propone reglamentar la propiedad nacional sobre los recursos genéticos de cada territorio, la propiedad intelectual asig-nada a los grupos de investigación de cada país sobre el conocimiento tradicional de su población autóctona y la distribución de los beneficios económicos producto de la investigación entre los países patrocinadores y los países fuente de nuevos productos biotecnológicos.

En una de las Conferencias de las Partes celebrada en 1997 como re-sultado de la CBD de 1992 se estableció la figura de ICBG (International Cooperative Biodiversity Group) y se crearon siete grupos internacionales para el fomento de la bioprospección y la conservación de la biodiversi-dad. Cada uno de estos grupos se compone de una o varias instituciones académicas norteamericanas, centros de investigación patrocinados por el gobierno de los países en desarrollo beneficiarios, reservas natura-les de dichos países que actúan como nichos de bioprospección y una transnacional farmacéutica que financia parcialmente el proyecto y se compromete a desarrollar productos comerciales a partir de los recursos genéticos identificados como promisorios. Los ICGB tienen como propó-sito no solo el descubrimiento de nuevos fármacos y microorganismos que resuelvan problemas sanitarios y comerciales a escala mundial, sino también el fomento del desarrollo sostenible en la región fuente del re-curso genético investigado a partir de la explotación racional del mismo.

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Parte de los recursos económicos obtenidos por la comercialización de los productos generados a partir de la labor de bioprospección desarro-llada debe garantizar la conservación permanente de la biodiversidad en los países en desarrollo.

La finalización súbita del acuerdo que dio origen al grupo de ICBG ‘Drug discovery and biodiversity among the Maya of Mexico’ fue un duro golpe contra las bases sobre las cuales se establecieron este tipo de acuerdos, pues puso en tela de juicio la credibilidad científica de los gru-pos de investigación representantes de los países en desarrollo y generó a su vez resentimientos en los países apoyados por el gobierno de Esta-dos Unidos, algunos de los cuales consideraron que dicho gobierno esta-ba interesado en obtener derechos legales sobre sus recursos genéticos para investigar fármacos que responderían únicamente a los intereses de la salud pública norteamericana. Los debates generados demuestran que la bioprospección va mucho más allá del esquema teórico en el cual se investiga un recurso genético promisorio en un nicho de biodiversidad y se llega hasta un producto biotecnológico que resuelve un problema industrial o sanitario; en la práctica, la bioprospección es un acuerdo de investigación bilateral o multilateral cuyos beneficios económicos deben conducir a un equilibrio duradero entre los países con altos recursos tec-nológicos y aquellos con una gran biodiversidad.

La bioprospección debe ser abordada tanto desde el punto de vista técnico como conceptual al momento de diseñar un plan de acción para un grupo de investigación. Por ejemplo, un largo proceso de bioprospec-ción puede verse menoscabado debido a la falta de protección legal para los recursos naturales investigados y para el conocimiento generado. El apoyo a grupos de investigación de países en desarrollo ricos en biodi-versidad por parte de países de gran trayectoria científica y las regalías para el país dueño de los recursos naturales por el aprovechamiento in-dustrial de estos últimos constituyen quizás la mejor alternativa, sin dejar de lado otras opciones como la negociación entre países, convenios con grupos de investigación internacionales, ajustes a la legislación vigente sobre propiedad intelectual y la inversión por parte del estado poseedor de la biodiversidad.

La bioprospección debe apoyarse idealmente en una política nacional que proteja las diferentes formas de conocimiento e innovación genera-das a partir de la biodiversidad del país, estableciendo unos requisitos básicos para el acceso a recursos genéticos por parte de los grupos de

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investigación nacionales y foráneos. El estado, la academia y la empresa privada darán importancia a las actividades de bioprospección en la me-dida en que la biodiversidad sea reconocida como una fuente de desa-rrollo para el país, y entonces pueden establecerse alianzas estratégicas en el marco legal nacional e internacional vigente. Por ejemplo, puede plantearse el libre acceso a las especies que integran la biodiversidad nacional a cambio del compromiso de usar dichas muestras en investi-gaciones científicas de bioprospección. El beneficio para los grupos de in-vestigación está tanto en el acceso a dichas muestras biológicas como en la provisión de recursos para la investigación y regalías sobre los produc-tos comerciales generados durante la investigación. Como en la mayoría de los casos no se espera que la totalidad de los recursos sean proporcio-nados por el Estado, surgen los convenios academia-empresa en los cua-les la empresa financia una investigación y se encarga del escalamiento y la producción industrial de los productos generados. Los convenios tripa-ritarios de bioprospección permiten preservar y aprovechar los recursos genéticos de un país rico en biodiversidad, impulsan la transferencia de tecnología y la capacitación de nuevos investigadores para los centros de investigación y a la industria nacionales (Sittenfield, 1996).

OPORTUNIDADES ACTUALES DE BIOPROSPECCIÓN A ESCALA INTERNACIONAL

Recientemente un grupo de investigación chileno ha propuesto la creación de una red de bioprospección de nichos marítimos que inclu-ya a países latinoamericanos con importantes territorios costeros, como es el caso de Brasil, Argentina, Colombia, Cuba y México, todos ellos con un potencial investigativo reconocido. En estos nichos se presenta la oportunidad de encontrar una gran cantidad de nuevos microorganis-mos con interés biotecnológico, como es el caso de biocatalizadores y biorremediadores con propiedades anticongelantes encontrados a gran-des profundidades, en donde imperan las presiones elevadas y las bajas temperaturas. Por otra parte, los hidrotermales tropicales se caracterizan por alojar microorganismos productores de compuestos estables a tem-peraturas extremas entre los que se cuentan biocatalizadores solubles, exopolisacáridos, y biopolímeros abriendo paso al nuevo campo de la biohidrometalurgia (Bull et al., 2000). En la actualidad, el estado de la bioprospección bacteriana ha llegado a un punto tal, que diariamente se describen especies nuevas productoras de compuestos de alto valor agregado lo cual requiere de un soporte taxonómico fuerte que permita

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emplear cepas de especies nuevas como referencia de nuevos proyectos de investigación (Stackerbrand y Swings, 2005). En cuanto a la biodiver-sidad terrestre, la utilización de huevos de mosca y sanguijuelas para la recuperación de heridas ha atraído el interés de médicos e investigadores hacia la biocirugía, constituyendo el hallazgo de los compuestos respon-sables de la acción cicatrizante otro modelo válido en bioprospección. Aun más, la bioprospección animal y vegetal puede comenzar a basarse en conocimientos tradicionales pertenecientes al folclor de las poblacio-nes que habitan nichos biodiversos, siguiendo el modelo establecido por las transnacionales farmacéuticas desde hace varias décadas.

BIOPROSPECCIÓN APLICADA EN COLOMBIA

Diversos grupos de investigación provenientes de instituciones aca-démicas en su gran mayoría han establecido convenios con entidades privadas y estatales para la investigación y explotación racional de los recursos naturales de Colombia. En el curso de dos talleres nacionales se han consignado las investigaciones de dichos grupos, y las publica-ciones de Melgarejo et al. (2002) exponen los campos con potencial de investigación en Bioprospección de Organismos Marinos, Biopros-pección Animal, Bioprospección Microbiológica, Bioprospección Vegetal y Bioprospección Ecológica en el país. Los modelos generales de bio-prospección propuestos para cada área a partir de modelos específicos utilizados por instituciones como ECOPETROL–ICP, UniValle, CORPOICA, CENICAFÉ, LST, Pizano S.A., el SINCHI, la CEE y el IBUN tienen en común puntos focales que incluyen el planteamiento de ideas de bioprocesos, la revisión bibliográfica del estado del arte, la caracterización a gran es-cala de la biodiversidad disponible, el tamizaje de especies promisorias, la obtención de productos en laboratorio y el escalamiento a proceso industrial con el apoyo de empresas privadas, el trámite de patentes de los productos biotecnológicos y su comercialización, y finalmente la re-cuperación y conservación de los ambientes naturales como actividades paralelas a su aprovechamiento.

GRUPO DE BIOPROCESOS Y BIOPROSPECCIÓN DEL IBUN

La bioprospección en Colombia es una oportunidad prioritaria para los grupos de investigación, y por ello el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) ha dedicado gran parte de sus recursos humanos a este propósito. Partiendo de la definición de bioprospección como “la búsqueda sistemática y el desarrollo retroali-

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mentado de nuevas fuentes de compuestos químicos, genes, micro- y macroorganismos, y otros productos valiosos a partir de la naturaleza”, cuyo objetivo fundamental es “el uso sostenible del recurso biológico a través de la biotecnología y su conservación, y el desarrollo científico y socioeconómico del país de donde proviene el recurso” (Sittenfeld, 1996), en el IBUN se han encontrado y se siguen buscando especies nativas para el fortalecimiento de líneas de investigación en Cultivo y Pro-ducción de Caucho, Producción de solventes por Clostridios, Producción de Biofertilizantes y Producción de Biopolímeros.

Bioprospección microbiológica

La búsqueda de microorganismos nativos en el Grupo de Bioprocesos y Bioprospección del IBUN abarca las líneas de solventes, biofertilizantes y biopolímeros. La línea de investigación en Clostridios Solventogénicos ha aportado al grupo de Bioprocesos y Bioprospección la mayoría de técnicas moleculares de las cuales dispone actualmente, a la vez que ha abierto el camino para el crecimiento de las líneas de investigación que surgieron posteriormente. Esta línea inició sus investigaciones estan-darizando las condiciones de aislamiento y cultivo de microorganismos anaerobios mediante el uso de cepas de referencia (Clostridium ace-tobutylicum ATCC 824 en la mayor parte de los casos). A mediados de la década de 1990 se obtuvieron 155 muestras de suelos de diferentes cultivos agrícolas a través del territorio colombiano, incluyendo cultivos de calabaza, café, maíz, arroz, aguacate, banano, limón, mango, tomate, cebolla, lechuga, repollo, zanahoria, algodón, caña de azúcar, arveja, frí-jol, soya, crisantemo, pasto, papa y humus. De estas muestras se aislaron 178 cepas del género Clostridium, y se encontraron trece cepas que de-mostraron ser capaces de producir una concentración total de solventes de interés comercial (acetona, butanol y etanol) mayor a la producida por las cepas de referencia C. acetobutylicum ATCC 824, C. acetobutylicum DSM 792 y C. beijerinckii NCIMB 8052 bajo condiciones de fermentación preestablecidas. La capacidad de estas cepas promisorias para utilizar como sustrato diferentes tipos de polisacáridos fue evaluada igualmente, obteniéndose resultados alentadores con los sustratos celulósicos y he-micelulósicos CMC, Xilano, Arabinano, Pectina, Avicel y Celobiosa (Mon-toya et al.,1999).

Inicialmente, la cepa IBUN 22A fue sometida a transformación con un plásmido metilado que expresa una endoglucanasa, y se encontró que el plásmido era estable por más de 100 generaciones, mientras que su

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actividad β-glucanasa se incrementó notablemente. Una de las metas del grupo es el establecimiento de un bioproceso consolidado de produc-ción de solventes partiendo de sustratos celulósicos contenidos en los efluentes de industrias vegetales, como es el caso de la melaza de caña y el POME (efluente del proceso de extracción de aceite de palma africana con alto contenido de polisacáridos) (Montoya, 2003).

Considerando que Clostridium es uno de los pocos géneros bacteria-nos reconocidos por producir 1,3-propanodiol (iniciador de cadena en la síntesis de polímeros usados como fibras textiles) a partir de glicerol, se evaluó la capacidad de las trece cepas promisorias para producir 1,3-PD, y se encontró que cinco de ellas poseen una productividad volumétrica mayor a la de las cepas de referencia C. acetobutylicum ATCC 824, C. kainantoi DSM 523 y C. beijerinckii NCIMB 8052. Con miras al estableci-miento de un bioproceso consolidado a partir de un sustrato de bajo cos-to se realizó la fermentación utilizando como sustrato el glicerol residual del proceso productivo de biodiesel, obteniéndose resultados exitosos (Cárdenas et al, 2004).

Las trece cepas promisorias han sido estudiadas en cuanto a taxono-mía por medio de una serie de ensayos bioquímicos y moleculares que han sido estandarizados en el laboratorio de Microbiología del IBUN y puestos a disposición para estudios posteriores en otros grupos. Los en-sayos moleculares implementados incluyen AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism), perfiles plasmídicos, secuenciación total o parcial del gen 16S rRNA, PFGE (electroforesis en gel de campo pulsado), hibri-dación ADN-ADN y perfiles de macrorrestricción. Un análisis multivariado reciente que reúne los resultados de dichos ensayos concluyó que diez de las trece cepas promisorias pueden formar una nueva especie dentro del género Clostridium (Suárez et al, 2004).

A partir del genoma de la cepa IBUN 22A se construyó una librería con el objetivo de buscar genes involucrados en los procesos mencionados, ya que esta cepa se ubica entre las cinco con mayor capacidad de pro-ducción de 1,3-PD y es a la vez una de las más versátiles degradadoras de polisacáridos. Los clones de mayor tamaño (mayores a 500 bp) fue-ron secuenciados en México y Brasil, y sus secuencias fueron analizadas con el uso de herramientas bioinformáticas. Se encontró de esta manera una secuencia interrumpida idéntica al gen dhaB1 de C. butyricum que codifica para la enzima glicerol deshidratasa, encargada del primer paso en la conversión de glicerol a 1,3-PD. Se ha propuesto la caracterización

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del operón 1,3-PD de una de las cepas promisorias de Clostridium sp. en próximos estudios.

Los criterios desarrollados durante el proceso de bioprospección ex-puesto hasta el momento fueron utilizados para la búsqueda de una nueva colección de clostridios a partir de suelos colombianos no ana-lizados anteriormente, teniendo como principal objetivo el hallazgo de cepas productoras de endoglucanasas y exoglucanasas que puedan ser utilizadas en la producción de solventes a partir de sustratos celulósicos, bien sea que tal proceso sea escalado para la creación de una industria rentable o que se utilice como modelo pedagógico y de investigación para la apropiación de nueva tecnología por parte del Instituto de Bio-tecnología. Con este último paso se demostró uno de los puntos más importantes para reportar la existencia de una nueva cepa, esto es, la posibilidad de aislar nuevamente la misma cepa a partir de muestras del hábitat en donde se espera encontrarla. Con el proceso de biopros-pección descrito se ha conseguido encontrar cepas promisorias de Clos-tridium sp. con potencial para constituir una nueva especie y así mismo establecer las bases para la generación de procesos rentables de produc-ción de reactivos y solventes basados en ellas.

Uno de los procesos exitosos fue la búsqueda de agentes promoto-res del crecimiento vegetal. Para ello, se realizaron muestreos de suelo y plantas de arroz en zonas arroceras de Colombia (Saldaña, Espinal y Villa Nueva) con el fin de seleccionar microorganismos potencialmente biofertilizadores y promotores de crecimiento vegetal y evaluar la activi-dad de fijación biológica de Nitrógeno (Diazótrofos) y la actividad solu-bilizadora de Fósforo. A los microorganismos aislados se les realizaron métodos de identificación y evaluación de sus propiedades. De estos se obtuvieron 37 bacterias fijadoras de Nitrógeno y 13 solubilizadoras de Fosfato. De los microorganismos diazótrofos se encontró predominio de bacterias Gram (-) y bacilos de formas pleomórficas. El género Klebsiella fue el más representativo obtenido a partir de suelos de Villa Nueva y el género Azotobacter a partir de suelos de Tolima. También se identifica-ron otros microorganismos de los géneros Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas y Azospirillum. En cuanto a los microorganismos so-lubilizadores de fósforo predominaron bacilos Gram (-), filamentosos, característicos del género Klebsiella. Al realizar el análisis de suelos se encontró que son de carecer ácido, lo que puede inhibir el desarrollo de poblaciones de diazótrofos como algunas especies de Azotobacter, sin

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embargo algunas especies de Azospirillum, Klebsiella y Pseudomonas se adaptan a este tipo de suelos. Esto ha llevado al desarrollo de producción de inoculantes por fermentación y a evaluar el efecto fitoestimulante y biofertilizante mediante la realización de bioensayos y análisis a nivel de campo.

El grupo de biopolímeros, comenzó con el desarrollo y la estandari-zación de la producción por fermentación y la obtención y purificación de polihidroxialcanoatos (PHAs), con cepas de referencia: Pseudomonas putida y Ralstonia eutropha. Al tener apropiación sobre esta tecnología, se dio paso a la búsqueda de microorganismos nativos con capacidad de acumular este tipo de polímeros, cuyas propiedades físicas y materiales de biocompatibilidad y principalmente biodegradabilidad, los hace inte-resantes candidatos para reemplazar a los plásticos convencionales. Pero en el IBUN, se busca a corto plazo producir una membrana soporte para crecimiento celular con miras al reemplazo de tejidos dentales, en esto se está trabajando con los investigadores del laboratorio de Biomiméti-cos. Con el propósito de tener un cepario con bacterias acumuladoras de PHAs, se exploraron suelos cultivados con caña de azúcar y la rizósfera de sus plantas, de los departamentos de Cundinamarca, Valle del Cau-ca, Nariño y Santander. En este tipo de hábitats, los microorganismos compiten por la supervivencia, y desarrollan interesantes estrategias, como almacenar carbono y energía en forma de gránulos intracelulares de PHAs. De 440 aislamientos, 108 conforman actualmente el cepario, se seleccionaron, porque mostraron una acumulación de polímero por tinción con Sudan negro B, precipitación con hipoclorito de sodio y por su velocidad de crecimiento bajo unas mismas condiciones y medio de cultivo. De este cepario, 44 aislados se caracterizaron bioquímicamente por el sistema de identificación BBL CRYSTAL®, y se tamizaron por la pro-ducción y productividad del polímero a nivel de matraz, seleccionándose 6 cepas que fueron identificadas preliminarmente por caracterización del gen ribosomal 16S, y se tiene evaluada la producción y productividad del polímero a nivel de fermentador. Se han empleado diferentes fuen-tes de carbono, de acuerdo a la naturaleza de la cepa, con el propósito de disminuir el costo de la producción a mayor escala. También se ha caracterizado preliminarmente el polímero por temperatura de fusión y cromatografía de gases. Dos de estas seis cepas acumulan mayor can-tidad de polímero que la cepa de referencia (R. eutropha), y producen PHB (polihidroxibutirato) con propiedades más deseables que el de la cepa patrón. Con el objetivo de identificar las cepas productoras a nivel

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de género y especie se ha trabajado en su caracterización molecular, y así poder establecer las condiciones de medio que requeriría, además se está investigando sobre el gen de la enzima clave (PHA sintasa) en la síntesis de este polímero, de cuya clase también depende el sustrato y el tipo de polímero que se produciría. Actualmente se apunta a incrementar la competitividad del IBUN en este campo mediante el desarrollo de una estrategia de fermentación con un sustrato económico y una cepa nativa con las condiciones de crecimiento ideales para una alta acumulación de un polímero novedoso.

BIOPROSPECCIÓN VEGETAL

Brevemente, la bioprospección en plantas se desarrolla en la línea de investigación de Cultivo y Producción de Caucho, el propósito es buscar diferentes clones con características de resistencia al mal suramericano de la hoja, calidad y productividad. La selección de estos clones se hace por genética mendeliana. En el IBUN se ha partido de varios clones co-merciales, y actualmente se están evaluando para seleccionar los mejo-res, considerando el agroecosistema donde se deban cultivar para que se expresen las características requeridas. Los pasos a seguir en este campo son: constituir un jardín clonal, escoger el material vegetal a probar en un campo de observación, y seleccionar clones para una plantación co-mercial. En el grupo se está trabajando en la producción del caucho, la caracterización molecular de los clones y la caracterización del hongo causante del mal suramericano de la hoja. Un factor a tener en cuenta es que el periodo de desarrollo de un nuevo clon es mínimo de 10 años, factor determinante en el diseño de cualquier modelo de bioprospección vegetal, y esto trae implicaciones sobre la producción de caucho que jus-tifican el aprovechamiento de los clones ya desarrollados.

CONCLUSIONES Y COMENTARIOS

Es verdad que Colombia es un país biodiverso y tenemos nichos aún no explorados, cuyos microorganismos nos pueden sorprender en el la-boratorio. Pero la experiencia en bioprospección en el IBUN, deja ver claramente una necesidad: fortalecer el mantenimiento y conservación de los ceparios, que en últimas son nuestro recurso de trabajo y a la vez pueden constituir un servicio para otros centros de investigación. Es per-tinente aprovechar el tema de la bioprospección para generar expectati-vas reales en Colombia, preguntándose: ¿Qué especies, genes, productos químicos y otros productos valiosos a partir de la naturaleza, se requieren

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para procurar soluciones a los problemas en nuestra sociedad? Buscar el espacio para enriquecer la visión de los investigadores del IBUN, no solo es benéfico para los mismos sino también para el desarrollo del país y para el Instituto en su proyección.

En general, algo que comparten todas las estrategias de bioprospec-ción expuestas es la búsqueda de cepas nativas que presenten un flujo de conversión de sustrato eficiente en diferentes hábitats de la diver-sidad colombiana y el posterior desarrollo de un proceso fermentativo estandarizado utilizando sustratos del menor costo posible, así como el mejoramiento genético de las cepas promisorias aisladas que constitu-yen los ceparios del IBUN. En el futuro se busca diseñar una estrategia de bioprospección basada en los conocimientos que se han adquirido con experiencias anteriores, y se ha considerado que un punto de partida acertado sería el planteamiento de un diseño estadístico para la búsque-da de nichos en la biodiversidad colombiana.

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BIOPROSPECCIÓN DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS OBTENIDAS DE ORGANISMOS MARINOS

BIOACTIVE SUBSTANCES FROM MARINE ORGANISMS

CARMENZA DUQUE1

1Departamento de Química. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

[email protected]

RESUMEN

En el presente trabajo se describe el inmenso potencial que nos ofrecen los organismos marinos como fuente de compuestos químicos que pueden ser usados en la industria farmacéutica como medicamentos; en la agricultura como pesticidas, herbici-das, fungicidas; en la industria de alimentos como importantes suplementos nutracéuticos; en química fina, particularmente en biología molecular como reactivos especiales; en la industria cosmética como parte de cremas para la piel, etc. Adicionalmen-te, se presenta en forma resumida, algunos de los importantes avances en investigación obtenidos en el campo de la química de los productos naturales marinos en Colombia, por nuestro grupo de investigación, durante los últimos 17 años. En la parte final, se hacen algunas recomendaciones importantes, particu-larmente el uso de métodos biotecnológicos para el cultivo de simbiontes que se encarguen de la producción de la biomasa necesaria para el desarrollo de productos comerciales.

Palabras clave: Drogas y cosméticos de origen marino, drogas de origen marino, bioproductos marinos, fármacos de origen marino, bioactivos, productos naturales marinos en Colombia.

ABSTRACT

Marine organisms have proven to be a very rich source of many unique metabolites which could be used in the pharmaceutical industry as drugs, in the agriculture field as pesticides, herbicides and fungicides, in the food industry as important nutraceutics, in fine chemistry as reagents particularly in molecular biology, and in the cosmetic industry as additives in cosmetic skin care

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products to prevent irritation caused by exposure to the sun, etc. Additionally, the present work presents a short summary of the results obtained in the field of marine natural products chemistry by our research group in Colombia, during the last 17 years. It also tries to discuss the future potential of biotechno-logy to the development and sustainable use of marine-derived compounds with industrial application.

Keywords: Drugs and cosmetics from the sea, marine based drugs, marine bioproducts, marine pharmaceuticals, bioactives, marine natural products in Colombia.

INTRODUCCIÓN

El mar posee una diversidad asombrosa tanto biológica como química. En cuanto a la primera puede decirse que los océanos contienen cerca de 300.000 especies descritas hasta el momento, cifra que según los cálculos de los más moderados solo representa un pequeño porcentaje del total de las especies existentes, así que aún hay muchísimas especies esperando ser descubiertas y descritas. Entre los 34 phyla que existen para seres vivientes, 17 son terrestres, mientras que 32 viven en el mar (aunque hay algunos phyla que viven tanto en la tierra como en el mar) (Kijjoa y Sawangwong, 2004). Debido a su larga historia evolutiva algu-nas de estas especies marinas, p. e. las esponjas (fueron los primeros organismos que se desarrollaron en la tierra hace 700-800 millones de años) poseen una gran diversidad molecular si se les compara con sus contrapartes terrestres, y muchas de estas sustancias poseen estructura novedosa y presentan algún tipo de actividad biológica. (Faulkner, 2002 y las referencias allí citadas).

La gran mayoría de compuestos novedosos hasta ahora descubier-tos (algo mas de 15.000) (Figura 1) han sido aislados de microorganis-mos (bacterias, cianobacterias, hongos) y fitoplancton, algas, esponjas, celenterados, briozoos, moluscos, tunicados (ascidias) y equinodermos (Faulkner, 2002 y las referencias allí citadas; Blunt et al., 2003; Blunt et al., 2004), y representan un potencial inmenso en el desarrollo de agen-tes farmacéuticos, agroquímicos, suplementos nutricionales, cosméticos, enzimas y productos en química fina, etc. Cada una de estas clases de bio-productos representa un potencial de multi-billones de dólares en el mercado mundial (BioScience, 1996).

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Figura 1. Compuestos con estructura novedosa aislados de organismos marinos desde el año 1965 hasta el final del año 2003.

Sin embargo, es importante mencionar que aunque las investigacio-nes en la química de productos naturales marinos son aún muy jóvenes (podría decirse que éstas empezaron en forma en 1970), ya hay algunos productos derivados de fuentes marinas que están en el mercado, p. e. algunas drogas antivirales como Ara A, comercializada por Glaxo Smith Kline, y AraC comercializada por Pharmacia; drogas anticáncer como AraC y YondelisTM, producida por Pharmamar y comercializada por Johnson y Johnson; aditivos (pseudopterosinas) en cremas cosméticas comerciali-zadas por Estée Lauder; suplementos nutritivos (FormulaidTM); reactivos en Biología Molecular, etc. (Pomponi, 1999; Kijjoa y Sawangwong, 2004; Newman y Cragg, 2004). Vale la pena mencionar que existen también numerosas patentes particularmente en los países desarrollados, prote-giendo la propiedad y el futuro de muchos compuestos marinos y que están a la espera del momento y oportunidad adecuados para su explo-tación. Las dedicadas al sector salud revisten particular importancia, por los beneficios que el desarrollo de nuevos medicamentos puede traer a la especie humana (Shu, 1998), especialmente en tratamientos anti-cancerígenos, antivirales, antimicrobianos, antiinflamatorios, analgésicos, contra el Alzheimer, etc.

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En contraste, en Colombia el estudio de nuestros organismos marinos para el aislamiento e identificación de sustancias bioactivas o aprovecha-bles industrialmente, está aún en su infancia, a pesar de los esfuerzos que algunos pocos investigadores hemos venido haciendo. El grupo de investigación “Estudio y aprovechamiento de productos naturales mari-nos y frutas de Colombia” de la Universidad Nacional de Colombia, ha te-nido la ventaja de ser el pionero en estudios químicos de la biodiversidad marina colombiana destacándose en el estudio de aquellos organismos que no han sido estudiados en otras partes del mundo, pero que han probado ser organismos fuente de compuestos novedosos y de interés farmacéutico e industrial en general (Duque et al., 2003).

En el presente trabajo se presentarán en forma resumida algunos de los resultados de las investigaciones que se han llevado a cabo en Co-lombia, cómo se han hecho, hasta dónde hemos llegado, y sobre todo se analizarán las perspectivas a corto y mediano plazo de este importante campo de investigación y desarrollo.

BÚSQUEDA DE COMPUESTOS BIOACTIVOS EN COLOMBIA

La búsqueda sistemática de compuestos bioactivos en organismos ma-rinos del Caribe Colombiano se ha realizado principalmente en esponjas, estrellas, ofiuros y corales blandos recolectados en su gran mayoría en el área de Santa Marta y en el Parque Nacional Natural Tayrona, y en gorgónidos recolectados en las Islas de San Andrés y Providencia. Se han estudiado cerca de 100 organismos en cuanto a su actividad biológica y en muchos de ellos se ha realizado el aislamiento e identificación de los compuestos bioactivos así como también de los demás compuestos presentes. El esquema de trabajo comprende varias etapas, las cuales pueden agruparse como sigue.

• Recolección e identificación taxonómica de las especies de organis-mos marinos a estudiar.

• Preparación de extractos con solvente orgánico a partir de las muestras biológicas que contengan la mayor parte de los metabolitos presentes en el organismo sometido a estudio, o fraccionamiento del extracto crudo total en subfracciones de menor complejidad y de acuerdo a la polaridad de los compuestos presentes.

• Evaluación biológica (antimicrobiana, citotóxica, tóxica, antitumoral, antiinflamatoria) preliminar de los extractos obtenidos.

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• Separación de los metabolitos presentes por métodos cromatográficos y determinación de su estructura por métodos espectroscópicos.

• Evaluación biológica (antimicrobiana, citotóxica, tóxica, antitumoral, antiinflamatoria) de los compuestos aislados.

• Síntesis y modificación estructural de algunos compuestos selectos con el fin de potenciar su actividad biológica.

• Estudio del potencial de aplicación de los compuestos puros con acti-vidad biológica.

Preparación de extractos y ensayos de bioactividad

Una vez recolectado el animal, éste es cortado y sometido a extracción en frío con solventes de diferente polaridad por ejemplo agua, metanol, acetona y cloroformo, o con mezclas de solventes. Luego de evaporar el solvente, los extractos obtenidos son sometidos a ensayos de actividad biológica (Duque et al., 2003), por ejemplo, antimicrobianos contra bac-terias Gram +, Gram - y hongos; citotoxicidad usando huevos fertilizados de erizo de mar y líneas de células tumorales P-388 (linfoma de ratón), A-549 (cáncer de pulmón humano) y HT-29 (cáncer de colon humano); toxicidad o letalidad contra Artemia salina o contra pólipos de coral man-tenidos en acuario; antitumorales usando discos de zanahoria y de papa y toxicidad contra peces. Los extractos que presentan valores significati-vos de actividad son luego sometidos a extensos procedimientos de se-paración para aislar el o los compuestos bioactivos presentes para luego identificarlos por las técnicas modernas usadas en Química de Productos Naturales. Una vez aislados, estos compuestos activos son sometidos de nuevo a los ensayos de bioactividad mencionados.

Aislamiento e identificación de compuestos bioactivos

Los extractos orgánicos que hayan presentado actividad biológica sig-nificativa son sometidos a procesos de fraccionamiento por métodos cromatográficos (CCCMC, CC, CCD preparativa, CLAE, CGAR, CGAR-EM, CL-EM) con el objeto de obtener compuestos puros o fracciones en-riquecidas que permitan la identificación estructural de las sustancias allí presentes. Luego, los compuestos así aislados, son identificados por métodos cromatográficos (CGAR, CLAE), métodos espectroscópicos (UV, IR, EM de impacto electrónico y de ionización suave, RMN mono- y bi-dimensional, CL-EM, CGAR-EM) y métodos de transformación química (oxidaciones, reducciones, formación de derivados, etc). Como la gran

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mayoría de las veces los compuestos aislados contienen uno o mas cen-tros quirales, se hace necesario emplear también métodos químicos y físicos, para la determinación de la estereoquímica relativa y absoluta de los compuestos aislados.

Figura 2. Algunos compuestos bioactivos con estructura novedosa aislados de organismos marinos recolectados en el Caribe colombiano.

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Como resultado de estas investigaciones se han logrado aislar e identificar cerca de 600 compuestos químicos, 60 de ellos nuevos en la naturaleza y muchos de ellos con importante actividad biológica. La Figura 2 muestra algunos ejemplos de los compuestos bioactivos aisla-dos: (+)-curcufenol 1, antimicrobiano y citotóxico, aislado de la espon-ja marina Didiscus oxeata; los sesquiterpenos nitrogenados clorhidrato de axinissamina 2, (4R*,5R*,7S*,10R*)-4-isocianatoeudesm-11-eno 3 y (4R*,5R*,7S*,10R*)-formamidoeudesm-11-eno 4, citotóxicos contra lí-neas celulares cancerosas, obtenidos de la esponja Axinyssa ambrosia; 3’-O-sulfato del 24-O-(α-arabionofuranosil)-5-α-colestan-3β-6α-8,15α-24-pentol 5 con actividad hemolítica, aislado de la estrella de mar Oreas-ter reticulatus; el furanosesterterpeno (7E,12E,18R,20Z)-variabilina 6, aislado de la esponja marina Ircinia felix; el 5α,8α-epidioxiesterol ambro-sinosterol 7, citotóxico contra células cancerosas, aislado también de A. ambrosia; el compuesto (5Z)-trieicosenamida 8, citotóxico contra células tumorales cancerosas, obtenido de la esponja Aulospongus samariensis; las pseudopterosinas P-V 9-15 compuestos antiinflamatorios aislados del gorgónido Pseudopterogorgia elisabethae. Los resultados de los estu-dios anteriores indican claramente la factibilidad de considerar la bio-diversidad en fauna y flora marina colombiana como fuente de riqueza inexplotada. Hacia el futuro, Colombia debe poner especial énfasis en el desarrollo de las aplicaciones tecnológicas que de estos estudios se derivan.

Conversión de los compuestos nuevos con actividad biológica en productos de importancia comercial

La conversión de muchos de estos metabolitos en productos de impor-tancia comercial requiere cantidades muy grandes de biomasa, la cual en la mayoría de los casos no puede ser provista sustentablemente por las poblaciones naturales. Tampoco la síntesis química, ni la química com-binatoria han demostrado ser alternativas suficientes, baratas o fáciles para la producción de muchos de los compuestos de origen marino, que se quieren comercializar. Sin embargo, en la mayoría de los casos estos organismos marinos fuente de las sustancias bioactivas que nos gusta-ría obtener en cantidades suficientes para suplir la demanda necesaria durante el desarrollo del producto comercial y luego la demanda misma del mercado, es muy escasa, bien porque el organismo es de tamaño muy pequeño, bien porque crece a velocidades muy lentas, bien porque las densidades poblacionales son pobres (lo hemos experimentado con

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algunos de nuestros compuestos, p. e. al intentar obtener cantidades sig-nificativas de pseudopterosinas a partir de P. elisabethae del archipiélago de San Andrés y Providencia, hemos encontrado que sus poblaciones naturales son muy poco densas (Puyana et al., 2005) y no resistirían una colecta sustentable del organismo), bien porque se encuentra en zonas de muy difícil acceso, etc, factores éstos que hacen necesario el desarro-llo de métodos de producción artificial del organismo fuente. Así, se han ideado cultivos del organismo utilizando maricultura, acuacultura en el mar, o en ambientes controlados de acuarios, y cultivos celulares o de agregados celulares, para la producción de cantidades significativas de biomasa (Belarbi et al., 2003; Pomponi, 1999).

Recientemente, con el descubrimiento de que en algunos casos las sustancias bioactivas son producidas por el simbionte asociado (bacte-rias, arqueas, cianobacerias, dinoflagelados y microalgas) al macroor-ganismo de donde fueron aisladas inicialmente estas sustancias se ha recurrido al cultivo de estos simbiontes, tarea que es sin duda alguna de menor complejidad que el cultivo del macroorganismo fuente (Newman y Cragg, 2004; Mydlarz et al., 2003). Adicionalmente, estos últimos mé-todos proveen condiciones para la producción biotecnológica en gran escala. Así, que resulta claro cómo las investigaciones del presente y del futuro, deberán estar enfocadas hacia el desarrollo de estrategias para la producción de biomasa a partir de la cual pueda recuperarse el metabo-lito activo.

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DETECCIÓN DE AGENTES ETIOLÓGICOS DE ENFERMEDADES CORALINAS MEDIANTE EL ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN BACTERIANA DE LA CAPA DE

MUCOPOLISACÁRIDOS

DETECTION OF ETIOLOGICAL AGENTS OF CORAL DISEASES BY USING THE BACTERIAL COMPOSITION OF THE

MUCOPOLYSSACHARIDAE LAYER

DIEGO GIL-AGUDELO1

1Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras (INVEMAR). Santa Marta. Magdalena. Colombia

[email protected]

RESUMEN

Los corales escleractineos son la base de uno de los más impor-tantes ecosistemas marinos, los arrecifes de coral. Por más de 250 millones de años este grupo de organismos ha soportado cambios ambientales que han reducido sus poblaciones, hasta su casi extinción. Actualmente, los arrecifes coralinos parecen estar experimentando nuevamente una de estas reducciones en sus poblaciones. Varios han sido los factores que han sido se-ñalados como responsables de estos cambios, uno de ellos las enfermedades coralinas. El estudio de las comunidades micro-bianas asociadas a las capas de mucopolisacáridos de corales ha permitido la identificación de varias de estas afecciones en corales. Nuestras investigaciones han mostrado el posible papel de Vibrio charchariae (sinominia de V. harveyi) en el desarrollo de la enfermedad de lunares oscuros; esta misma bacteria es también el mas probable causante de la enfermedad de Banda blanca. Estas investigaciones además han permitido encontrar características de estas comunidades microbianas interesantes desde el punto de vista biotecnológico, tales como su potencial como fuente de antibióticos.

Palabras clave: Enfermedades coralinas, capa de mucopolisacáridos, co-munidades microbianas, caracterización metabólica.

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ABSTRACT

Scleractinian corals are the main component of one of the most important marine ecosystems, coral reefs. For more than 250 mil-lion years, scleractinians have stood environmental changes that have reduced their populations to almost their extinction in several occasions. Nowadays, coral reefs seem to be experiencing these reductions in populations once again. Different factors have been pointed out as responsible of these changes, being one of them coral diseases. The study of microbial communities living in association with mucopolyssacharidae layers of corals, have allowed the identification of several of these coral diseases. Our investigation has shown the possible role of Vibrio carchariae (synonym of V. harveyi) on the development of dark spots dis-ease; this same bacterial species has also been found as the most probable causal agent of white band disease. Our research on the microbial communities of corals has also shown interest-ing characteristics of these communities from the biotechnology point of view, such as their potential as source of antibiotics.

Keywords: Coral diseases, mucopolysaccharidae layer, microbial com-munities, methabolic fingerprinting.

INTRODUCCIÓN

Es reconocido que durante el Triásico (aproximadamente 250 millones de años antes del presente) el grupo de los corales escleractineos (com-ponentes principales de los arrecifes coralinos) aparece por primera vez como un grupo biológico distintivo. Durante este tiempo han exhibido períodos de gran diversidad (i.e. Jurásico) y otros de casi extinción (i.e. final del Cretáceo) (Veron, 1995).

Actualmente los arrecifes coralinos son uno de los ecosistemas mari-nos más importantes, a pesar de ocupar menos del 1 % del ambiente marino (Birkely, 1997). A pesar de su escasa distribución, estos ecosiste-mas albergan una gran diversidad de especies y general una alta produc-tividad (Dubinsky, 1990; Birkely, 1997; Malakoff, 1997). Es así como los arrecifes coralinos se han convertido en un importante ecosistema para el hombre, debido a sus aportes a la economía mundial en recursos y servicios, siendo para muchos países la principal fuente de ingresos (Bir-kely, 1997; Malakoff, 1997).

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Los arrecifes coralinos son ecosistemas muy estables que se encuen-tran cerca de su clímax ecológico, lo cual los hace muy susceptibles a perturbaciones externas y frágiles ante la acción de tensores externos (Chávez e Hidalgo, 1988; Grigg y Dollar, 1990; Birkely, 1997). Uno de estos tensores que parece estar tomando mayor relevancia durante los últimos años es la aparición de enfermedades coralinas, que al parecer se han vuelto cada vez más comunes en los arrecifes de todo el mundo y han puesto en peligro a estos delicados ecosistemas (Rosenberg y Loya, 2004).

La primera enfermedad de corales registrada fue la Enfermedad de la Banda Negra, encontrada en los arrecifes de Belice a principios de los años 70. Durante estos mas de 30 años, se han descrito más de 20 dis-tintas afecciones coralinas, de las cuales solamente se han cumplido los postulados de Koch para cuatro de ellas (Aspergilosis, Enfermedad de la Plaga Blanca tipo II, Serriatosis de Acroporas y Blanqueamiento Bacteri-ano) (Sutherly et al., 2004). En un último caso (Enfermedad de la Banda Negra) se conoce que es producto de un consorcio microbiano en el cual intervienen bacterias, cianobacterias y hongos (Rützler y Santavy, 1983; Richardson, 1998); sin embargo, en los últimos años se han encontrado nuevas características de este consorcio que ponen en duda la identidad del/los organismos patógenos (Frías- López et al., 2003).

La capa de mucopolisacáridos de los corales es un producto caracterís-tico de estos organismos que crea un ambiente rico en nutrientes tales como proteínas, polisacáridos, monosacáridos, lípidos y aminoácidos en los cuales las bacterias pueden proliferar (Ducklow y Mitchell, 1979 a y b; Wild et al., 2004a). De hecho, el número de bacterias que viven en esta capa es cercano a dos órdenes de magnitud superior y varios órdenes de magnitud más activos que en las aguas circundantes (Ritchie y Smith, 1995a). Estas comunidades bacterianas parecen ser específicas para cada especie de coral (Ritchie y Smith, 1995b; 2004, Rowher et al., 2002).

El papel de esta microbiota habitando esta capa de mucopolisacáridos, es ampliamente desconocida, a pesar que se sabe que es importante en la cadena alimenticia de los mares. El mucus coralino puede transportar energía y nutrientes del arrecife a la laguna arrecifal por medio del “mi-crobial loop”, siendo una significativa fuente de energía para las comu-nidades heterotróficas (Wild et al., 2004 a y b). Es también posible que estas comunidades bacterianas sean consumidas por los mismos corales, jugando así un papel nutricional para los pólipos coralinos proveyendo

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nutrientes (tales como nitrógeno) que los corales asimilan (Ferrier-Pages et al., 1998). Finalmente, la microbiota “normal” de estos corales podría servir de protección mediante la producción de compuestos antimicro-bianos y ocupando nichos que de otra forma podrían ser ocupados por patógenos (Rohwer et al., 2002). Se ha observado que esta microbiota “normal” sufre cambios durante fenómenos de blanqueamiento (Ritchie y Smith, 1995b; Ritchie et al., 1994; Jindal et al., 1996) y enfermedades (Ritchie y Smith, 1995a). El efecto de estos cambios en el coral es aún desconocido.

Una manera de estudiar enfermedades de corales es precisamente a través del estudio de estas comunidades microbianas y sus cambios. Utilizando esta aproximación, se ha logrado determinar la identidad de la mayoría de las enfermedades coralinas de las cuales se conoce el or-ganismo patógeno. El presente trabajo muestra algunos de los adelantos en la identificación de patógenos y etiología de enfermedades coralinas realizados en los últimos años por nuestro grupo de trabajo, al igual que adelantos en la ecología de algunas de estas enfermedades mediante el uso de diferentes técnicas microbiológicas y moleculares.

ENFERMEDAD DE LOS LUNARES OSCUROS

Esta enfermedad fue observada y caracterizada por primera vez en las costas colombianas (Solano et al., 1993; Díaz et al., 1995; Gil-Agude-lo y Garzón-Ferreira, 2001). Se ha calculado que la incidencia de esta enfermedad en corales del Caribe es de aproximadamente 1.2% (Weil, 2004). Esto la hace una de las tres enfermedades más prevalentes en el Caribe, superada solamente por la Enfermedad de Banda Negra y la Aspergillosis. Su incidencia parece incrementarse con el aumento tem-peratura del agua (Gil-Agudelo y Garzón-Ferreira, 2001).

Se ha tratado de identificar el agente causal de esta enfermedad usando métodos de caracterización microbiana basados en perfiles metabólicos. Para tal fin se utilizó una modificación al método de placas GN de Bio-log®, el cual realiza una “huella” metabólica basándose en la utilización por parte de la cepa bacteriana de 95 diferentes fuentes de carbón (www.biolog.com). Para aplicar este método, fue necesario tomar muestras de la capa de mucopolisacáridos de corales sanos y enfermos utilizando jerin-gas estériles. El mucus fue cultivado en Agar Glicerol Agua de Mar (Smith y Hayasaka, 1982), un medio de cultivo no selectivo. Todas las colonias bacterianas que exhibieran morfologías diferentes fueron aisladas y con-

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servadas en cultivos axénicos. Cada una de estas cepas fue diluida en agua estéril con una salinidad de 32 y llevadas a una absorbancia entre 0.154 y 0.196 a una longitud de onda de 600 nm. Luego, cada una de las 96 micro cápsulas de la placa de Biolog® se incubaron por 72 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 25 oC) y se leyeron en un espectrofotómetro automático. Cada uno de los perfiles obtenidos fue almacenado en una base de datos y comparado en bacterias tratadas de similar manera y entre sí.

De esta forma se han encontrado diferencias entre las comunidades bacterianas que viven en asocio con corales sanos y aquellos afectados por la enfermedad (Figura 1). Así, tras el análisis de mas 180 cepas bac-terianas, se identificó como posible agente causal de la enfermedad una cepa metabolicamente parecida a Vibrio carchariae (Tabla 1), las cuales se encontraron exclusivamente en colonias afectadas por la enfermedad. A pesar de estos avances, los postulados de Koch no han sido cumplidos en su totalidad, por lo cual no se ha podido aún establecer la identidad del patógeno responsable (Gil-Agudelo et al., 2004).

Figura 1. Diferencias en la composición microbiana de corales sanos y afectados por la en-fermedad de los lunares oscuros y muestras de la columna del agua.

382


ENFERMEDAD DE LA BANDA BLANCA TIPO II

La Enfermedad de la Banda Blanca ha sido sin duda alguna la enferme-dad coralina más agresiva y que más daño ha causado a los arrecifes del Caribe. Esta enfermedad ha sido encontrada responsable de las mortan-dades masivas de corales Acropóridos registradas en los años 80’s y que diezmó las poblaciones de estos corales en toda la región, matando hasta un 99% de Acropora palmata y Acropora cervicornis en algunos lugares. Al parecer, este fenómeno no tiene antecedentes en los últimos 4000 años y ha cambiado la zonación arrecifal de la región (Aronson y Precht, 2001).

Esta enfermedad fue registrada por primera vez en los arrecifes de St. Croix (Islas Vírgenes de EEUU) en 1977 (Gladfelter, 1982). A mediados de los 90’s Ritchie y Smith (1995 y 1998) encontraron una variación de dicha enfermedad a la cual llamaron Enfermedad de la Banda Blanca tipo II. Al parecer, esta enfermedad solo atacaba corales de la especie A. cervicornis; sin embargo, aún no se tiene claro si se trata simplemente de una varia-ción en los signos de la enfermedad, o es un padecimiento diferente.

Tabla 1. Análisis de las bacterias cultivables asociadas a corales sanos y afectados por la Enfermedad de Lunares Oscuros. Modificado de Gil-Agudelo et al. (2004).

GRUPO # Géneros/Especies Coral Enfermo Coral Sano Asociadas Número Porcentaje Número Porcentaje

I Enterobacter 11 11.83% 8 9.64%II Salmonella/Serraita 8 8.60% 6 7.23%III Klebsiella/Cedecea 4 4.30% 7 8.43%IV Delega 6 6.45% 3 3.61%V V. natriegens/Kluyvena 5 5.38% 5 6.02%VI Serratia/V. metschnikovii 5 5.38% 5 6.02%VII V. carchariae 7 7.53% 0 0.00%VIII K. planticola 10 10.75% 3 3.61%IX V. metschnikovii/carchariae 9 9.68% 11 13.25%X Yersinia 8 8.60% 8 9.64%XI Aeromonas 1 1.08% 2 2.41%XII V. pelagius/splendidus 3 3.23% 7 8.43%XIII V. harveyii/anguillarum 4 4.30% 1 1.20%XIV Kingella/Brucella 2 2.15% 5 6.02%XV Xanthomonas 3 3.23% 5 6.02%XVI Alteromonas 6 6.45% 6 7.23%XVII Agrobacterium/Rhizobium 1 1.08% 1 1.20%

93 83

383


Utilizando métodos de caracterización metabólica de microorganismos (similares a los utilizados en la Enfermedad de los Lunares Oscuros), Rit-chie y Smith (1995 y 1998) encontraron como más probable sospechoso de producir esta enfermedad a una cepa metabolicamente parecida a V. carchariae, sin embargo en sus estudios no llegaron a inocular corales sanos con este posible patógeno, por lo cual no se cumplieron los pos-tulados de Koch.

Debido a los indicios del papel de bacterias del género Vibrio en ésta enfermedad, nuestros estudios se centraron en el aislamiento de bacte-rias de este género y su prueba en corales sanos. Para esto, se aislaron 61 cepas bacterianas en agar TCBS provenientes de 5 corales con signos de la enfermedad. Posteriormente, estas cepas fueron aisladas y cultivadas en Agar Glicerol Agua de Mar (Smith y Hayasaka, 1982) para luego ser inoculadas en corales sanos. Las pruebas fueron realizadas en La Par-guera, Puerto Rico y para las inoculaciones se utilizaron pedazos de gasa estéril de 3x3 cm en los cuales se colocaron las bacterias. Fueron llevadas a campo en bolsas estériles e inoculadas en el coral asegurándolas con bandas plásticas.

Al cabo de solo tres días de inoculado, algunos de los corales comen-zaron a mostrar signos de la enfermedad. La identificación molecular de las cepas bacterianas que mostraron desarrollo de signos de la enferme-dad se encuentran en proceso. Sin embargo, en experimentos piloto rea-lizados, se encontró que una cepa bacteriana 99 % similar (basados en 1000 pares de bases) a Vibrio harveyi reprodujo los signos de la Enfer-medad de Banda Blanca tipo II. V. carchariae y V. harveyi son sinonimias, así que se tienen evidencias metabólicas y moleculares del papel de esta bacteria en esta enfermedad. Para completar los postulados de Koch, hace falta identificar esta bacteria en los corales inoculados, proceso que se encuentra en desarrollo. Esta es la primera ocasión en que se pueden reproducir los signos de esta enfermedad.

ASPERGILOSIS

Esta enfermedad afecta corales blandos de las especies Gorgonia ven-talina y Gorgonia flabellum en el Caribe. En algunos lugares, ha matado más del 90 % de estos corales, como es el caso del área de Santa Marta, Colombia (Garzón-Ferreira y Zea, 1992).

Smith et al. (1996) cumplieron con los postulados de Koch encon-trando al hongo Aspergillus sydowii como responsable de la enferme-

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dad (Nagelkerken et. al., 1997). Este es un hongo terrestre, poco común en ambientes marinos, que puede germinar pero no esporular en estos ambientes. Por estas características, se supone que el hongo viene de fuentes terrestres, siendo la fuente más probable las masas y polvo pro-venientes del África y acarreadas por el viento, las cuales contienen espo-ras de esta especie (Shinn et al., 2000; Weir-Brush et al., 2004).

En nuestros estudios utilizamos métodos de identificación de perfiles metabólicos de las comunidades por medio del sistema Biolog Ecopla-tes® (www.biolog.com), el cual utiliza juegos de 31 fuentes de carbono por triplicado para identificar el poder metabólico de la comunidad cora-lina. Para este estudio se extrajeron muestras de la capa de mucopolisa-cáridos de tejidos sanos y enfermos de colonias de G. ventalina afectadas por Aspergillosis con la ayuda de jeringas estériles. De la misma forma se tomaron muestras de colonias sanas.

Figura 2. Formación de tres grupos bacterianos distintivos luego del análisis metabólico de comunidades de Gorgonia ventalina. D = comunidades bacterianas del tejido enfermo de corales enfermos; h = comunidades bacterianas del tejido sano de corales enfermos; H = comunidades bacterianas de corales sanos.

Los resultados de este estudio permitieron establecer diferencias en la composición microbiana de corales sanos y enfermos. Más aún, se han encontrado diferencias en las partes sanas y enfermas del mismo coral

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(Figura 2). Esto mostraría que la enfermedad avanza y posiblemente se establece debido a cambios en la composición microbiana de la capa externa de mucopolisacáridos del coral (Gil-Agudelo et al., en prensa). Siendo así, las bacterias que viven en asociación con este octocoral ser-virían como barrera de defensa contra la acción de enfermedades, ya que en general, los corales producen pocas sustancias que les sirvan como agentes antimicrobianos que puedan servir como defensas ante organismos patógenos (Kelman, 2004). Sin embargo, Kim et al. (2000) mostraron la producción de sustancias que inhibían el crecimiento de A. sydowii en corales atacados por la enfermedad.

Pero no se conoce aún si estos metabolitos secundarios son produ-cidos por los corales o por las bacterias asociadas. Similares casos han sucedido en esponjas, encontrándose en algunos casos que estos me-tabolitos eran producidos por bacterias asociadas y no por las esponjas (Kelman, 2004).

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece a las diferentes entidades que han apoyado las pre-sentes investigaciones, en especial COLCIENCIAS/Fulbright (081-2000), Tyler Trustees Fund., National Science Foundation (OCE-0326269), Natio-nal Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA-CRES-0648-0384), el fondo para investigaciones claves del Banco Mundial GEF y la funda-ción Khaled Bin Sultan Living Oceans.

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ESTUDIOS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN ESPONJAS MARINAS (PORIFERA) DEL CARIBE

COLOMBIANO

STUDIES OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF COLOMBIAN CARIBBEAN MARINE SPONGES (PORIFERA)

JENNYFER MORA1,2, JIMENA SANCHEZ2, FEDERICO NEWMARK1

1Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras (INVEMAR). Santa Marta, Magdalena. Colombia.


[email protected]

RESUMEN

Entre los bioensayos típicos para detectar bioactividad de sus-tancias obtenidas de fuentes naturales, se encuentra el ensayo de actividad antimicrobiana frente a cepas bacterianas y fúngi-cas de importancia clínica en humanos. A partir de esta prueba se ha detectado que 43 esponjas marinas del Caribe colom-biano poseen compuestos capaces de inhibir el crecimiento in vitro de bacterias y hongos. A continuación se presenta una bre-ve descripción de las especies de esponjas y microorganismos evaluados. Estos estudios constituyen las bases en los procesos de bioprospección marina en Colombia.

Palabras clave: Porifera, antimicrobiano, compuestos químicos, biopros-pección marina, Caribe colombiano.

ABSTRACT

The antimicrobial activity against both bacterial and fungi strains of clinical importance in humans is one of the typical bioassays used to identify bioactivity of chemical compounds from natural sources. This bioassay has permitted to found that 43 marine sponges of the Colombian Caribbean have compounds capable to inhibit the growth in vitro of bacteria and fungi. A review of the sponges and microorganisms screened is presented in this work. These studies constitute the foundations for the proces-ses of marine bioprospecting in Colombia.

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Keywords: Porifera, antimicrobial, chemical compounds, marine bio-prospecting, Colombian Caribbean.

INTRODUCCIÓN

En Colombia la búsqueda de compuestos marinos con propiedades biológicas se realiza desde hace 20 años aproximadamente. Aún hoy, a pesar de las experiencias que han conducido al avance del tema, nos falta conocer e inventariar un alto porcentaje de la biodiversidad marina a nivel genético y bioquímico. Esta realidad sólo hace evidente la dimen-sión de las perspectivas en bioprospección de sustancias activas en Co-lombia y las alternativas de desarrollo biotecnológico y económico que se pueden generar en nuestro país.

Las bases de un proceso de bioprospección en productos naturales se construyen a partir de la caracterización de la biodiversidad, identi-ficación de los compuestos y de los organismos promisorios (Duque, 2002). Los primeros estudios con este enfoque se realizaron con es-ponjas marinas. Este grupo primitivo de invertebrados marinos, mor-fológicamente simples pero complejos y diversos en su organización bioquímica, ha sido la mayor fuente, en número y diversidad, de pro-ductos naturales marinos (Pawlik, 1993). Dicha diversidad se atribuye a las características biológicas y ecológicas del grupo. Las esponjas son un componente importante en los ecosistemas de arrecife de coral y se caracterizan por ser organismos filtradores sésiles. Algunas especies poseen contenidos nutricionales altos y por lo tanto, son organismos vulnerables a la depredación (Pawlik, 1997; Puyana, 2001); el hábito bentónico las hace susceptibles a la epibiosis (colonización superficial) (Sullivan et al., 1983; Henrikson y Pawlik, 1995) y su forma de obtener alimento (filtración), a infecciones por microorganismos que circulan en su sistema de canales y cavidades (Nigrelli et al., 1967). Precisa-mente, el éxito frente a la amenaza que representa una concentración excesiva de microorganismos en el tejido de la esponja, llevó a varios científicos en el año 1959, al descubrimiento de sustancias antibióticas en estos organismos. Aunque la presencia de sustancias orgánicas bac-tericidas y bacteriostáticas se confirmó hasta el año 1980 (revisión en Bergquist y Bedford, 1978). Se sospecha que las sustancias antibióticas presentes en las esponjas son las responsables de la rápida destrucción de especies adventicias y quizá expliquen la abundancia y especificidad de bacterias marinas asociadas a estas (Fieseler et al., 2004). Además, estos compuestos presentan distintos tipos de actividad biológica con-

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tra enzimas y receptores, ideales para la investigación farmacológica y clínica (Mayer y Hamman, 2000 y citados allí; Proksch et al., 2002).

EL PARQUE NACIONAL NATURAL TAYRONA Y LA BAHÍA DE SANTA MARTA: FUENTES DE MATERIAL BIOLÓGICO

La mayoría de las esponjas marinas han sido recolectadas en diferentes localidades y profundidades de la Bahía de Santa Marta y de las bahías y ensenadas del Parque Nacional Natural Tayrona (PNNT), una sola especie ha sido colectada en la Bahía de Cartagena (referencias en Tabla 1).

En el sector de la Bahía de Santa Marta y el PNNT, las estribaciones de la Sierra Nevada de Santa Marta irrumpen directamente dentro del mar, formando bahías arenosas relativamente profundas, flanqueadas por acantilados rocosos (Zea, 1994). Los lados y puntas rocosas forman acantilados de roca litoral (metamórfica), en los cuales se desarrollan for-maciones coralinas que van desde los 5-10 m hasta los 20-25 m de pro-fundidad, luego de las cuales existen fondos arenosos planos o inclinados (Garzón-Ferreira y Cano, 1991). La existencia de un litoral rocoso abrupto y profundo y la mayor incidencia de la descarga continental (aporte de materia orgánica en suspensión) conlleva a que los organismos filtrado-res como esponjas se vean favorecidos sobre los corales resultando en una gran variedad de especies y abundancia de individuos (Zea, 1987 y 1994), además muchas especies de esponjas que en otras áreas viven en aguas profundas, aquí se encuentran a profundidades regulares de buceo (Hooper et al., 1999).

MUESTRAS QUÍMICAS Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE SU BIOACTIVIDAD

La mayoría de bioensayos para determinar si un organismo posee algún tipo de actividad biológica se realizan inicialmente con extractos orgánicos crudos (EOC), este proceso se conoce como ‘screening’ o tami-zaje de bioactividad e incluye varios tipos de pruebas como citotoxicidad, antimitosicidad, antiepibióticas, antidepredación y antimicrobiana, entre las más usadas.

Los EOC se obtienen incluyendo trozos del tejido limpio del organis-mo, en una cantidad suficiente de algún solvente orgánico puro (meta-nol, etanol, acetona, diclorometano, cloroformo, entre otros) o en una mezcla de estos, usualmente durante 24 horas en agitación, trascurri-

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do este tiempo la solución obtenida es filtrada y concentrada. De esta misma forma, es posible obtener extractos acuosos, usando sólo agua durante el proceso. En etapas avanzadas de la evaluación todo tipo de extracto puede ser fraccionado, usando solventes orgánicos de diferente polaridad.

Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana usadas para estos ta-mizajes han seguido los métodos tradicionales usados en microbiología clínica, como la técnica de difusión en agar o prueba de susceptibilidad de Kirby-Bauer (usando como fuente sensidiscos y/o pozos con la mues-tra química de interés) y la técnica de dilución en caldo. Es importante incorporar replicas en el diseño del ensayo, así como también, controles negativos y positivos; los primeros permiten detectar si los solventes en los cuales se disuelve el extracto o sustancia purificada tienen efecto sobre el crecimiento de los microorganismos, mientras que los segun-dos permiten estimar el nivel de actividad de la sustancia o mezcla de interés, respecto a antibióticos comerciales. En la Tabla 2 se presentan las especies bacterianas y fúngicas que han sido utilizadas en los bioensayos realizados con esponjas del Caribe colombiano.

ANÁLISIS DE DATOS

La mayoría de las valoraciones se basan en los diámetros del halo de inhibición generados por el extracto o sustancia purificada, estos permi-ten estimar el nivel de actividad respecto a los antibióticos comerciales. De acuerdo a su valor, algunos autores como Monks et al. (2002) han propuesto las siguientes categorías para identificar los niveles de activi-dad:(-) sin actividad, (+) actividad débil (7-11 mm), (++) moderada (11-16 mm), (+++) fuerte (>16 mm). Cuando se realizan pruebas usando la técnica de dilución en caldo se mide el nivel de actividad por métodos convencionales (turbidez respecto al patrón de McFarland o por espec-trofotometría).

ESPONJAS MARINAS: POSIBLES FUENTES DE NUEVAS SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

Entre los nuevos agentes antimicrobianos purificados se registran la va-riabilina (de Ircinia felix) de amplio espectro antimicrobiano, el compues-to + (-) Curcufenol (de Didiscus oxeata), activo frente a bacterias Gram+, Gram-, C. albicans y S. cerevisiae (Duque et al., 2003) y dos epidioxieste-roles bactericidas aislados de Dragmaxia undata (Santafé, 2002).

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Tabla 1. Esponjas marinas del Caribe colombiano evaluadas para determinar propiedades antimicrobianas.

Especie Muestra Química No. de cepas susceptibles ReferenciaGram+ Gram - Hongos

Acarnus innominatus EOC 2 0 0 de Silvestri et

al., 1994Agelas clathrodes EOC y EAc 1 1 0 Zea et al., 1986

Agelas conifera EOC y EAc 3 2 0 Zea et al., 1986

Anthosignella varians EOC 1 0 0 de Silvestri et

al., 1994Aplysina cauliformis EOC 1 1 0 Zea et al. 1986

Aplysina fulva EOC 4 5 NETorres y Zambrano, 1995

Aplysina lacunosa EOC 2 2 0 de Silvestri et

al., 1994

Aplysina insularis EOC 3 5 0

Torres y Zambrano, 1995

Biemna cribaria EOC 0 0 0 Mora, 2004

Cinachyrella kuekenthali EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometidoCribrochalina infundibulum EOC 0 0 0 Mora, 2004

Desmapsamma anchorata EOC 0 0 0

de Silvestri et al., 1994; Mora et al.,sometido

Didiscus oxeata (+)-curcufenol 8 3 2Zea et al., 1986; Duque et al., 1988

Discodermia dissoluta EOC 2 1 0 de Silvestri et

al., 1994Dragmaxia undata Epidioxiesteroles 3 1 0 de Silvestri et

al., 1994Ectyoplasia ferox EOC 1 1 0 Zea et al., 1986

Halichondria sp. EOC 2 0 1 Mora et al., sometido

Iotrochota birotulata EOC y EAc 1 1 0 Zea et al., 1986

394


Iotrochota inminuta EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometido

Ircinia campana Furanosesterterpenos 5 7 5

Zea et al., 1986; Ramírez y Velásquez, 1989; Martínez, 1996

Ircinia campana EOC y EAc 2 0 NE Martínez, 1996

Ircinia felix mezcla de volátiles 3 1 0 Bonilla, 1997

Ircinia felix isotiocianato de metilo 1 1 0 Bonilla, 1997

Ircinia felix variabilina 1 0 NE Gamboa y Pinzón, 1997

Ircinia felix tiobismetano 2 0 0 Bonilla, 1997

Ircinia felix furanosesterterpenos 6 7 0


Ircinia strobila furanosesterterpenos 6 7 0


Monanchora arbuscula EOC 0 0 1 de Silvestri et

al. 1994Myrmekioderma gyroderma EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometidoMyrmekioderma rea EOC 0 0 0 Mora, 2004

Myrmekioderna styx EOC 0 0 1 de Silvestri et

al., 1994Neofibularia nolitangere EOC 2 3 0 Zea et al., 1986

Oceanapia peltata EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometidoOceanapia bartschi EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometido

Petromica ciocalyptoides*. EOC y EAc 3 5 1

Muñoz y Sarmiento, 1993;

Plakinastrella onkodes* EOC 3 3 1

Díaz y Cárdenas, 1993; de Silvestri et al., 1994

395


Polymastia tenax EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometidoPseudoceratina crassa EOC y EAc 1 1 0 Zea et al., 1986

Raspailia sp. EOC 1 0 1 De Silvestri et al.,1994

Scopalina ruetzleri EOC 0 0 0 De Silvestri et

al.,1994Smenospongia aurea EOC y EAc 3 2 1 Zea et al., 1986

Smenospongia echina EOC 1 2 0 de Silvestri et

al., 1994Spirastrella coccinea EOC 0 0 0 Mora et al.,

sometidoTopsentia ophiraphidites EOC 2 2 1 de Silvestri et

al., 1994

Ulosa ruetzleri EOC 3 3 NE Linares y Novoa, 1995

Verongula rigida EOC y EAc 3 1 0 Zea et al., 1986

Xestospongia muta EOC y EAc 3 3 1 Zea et al., 1986

Xestospongia proxima* EOC y EAc 4 5 1

Gordillo y Santamaría, 1993; Mora, 2004

*En estas especies se han realizado pruebas con fracciones de extractos. ECO: Extractos Orgá-nicos Crudos (diferentes solventes). EAc: Extracto Acuoso. NE: No Ensayado.

Desde el año 1986 se inició una serie de trabajos de tipo exploratorio en la costa Caribe colombiana para identificar las especies que exhiben este tipo de actividad. En años posteriores (1994 a 2003) fueron evalua-das más especies (Tabla 1).

Para dar continuación a este proceso de exploración, en el año 2003 el Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras “José Benito Vives de Andréis”-INVEMAR, propuso una nueva exploración en la que incluyó 15 esponjas del Caribe colombiano. De estas se obtuvo el extracto metanol-diclorometano y se evaluó la actividad contra un aislamiento clínico de Candida albicans y contra cepas de las bacterias Gram+ Staphylococcus aureus y Streptococcus faecalis y de las bacterias Gram- Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa. Entre los resultados más rele-vantes se encontró que los extractos de las esponjas Halichondria sp., Petromica cyocaliptoides y Xestospongia proxima exhibieron actividad

396


contra las cepas Gram+ y el hongo, mientras que la esponja Dragmaci-don reticulata sólo mostró actividad contra este último. Además, se pudo determinar que con excepción a P. ciocalyptoides frente a la levadura, siempre fue mayor la inhibición de los extractos concentrados (500 mg/mL) respecto a los extractos a la concentración natural en el tejido de la esponja. Incluso, el extracto concentrado de X. proxima igualó el poder de inhibición de la Cefoperazona (cefalosporina de tercera generación) para la cepa S. faecalis y fue superior para la cepa S. aureus, así como para C. albicans, en donde superó el poder de inhibición de la Nistatina (Mora et al. sometido).

Es de resaltar que los extractos de estas cuatro esponjas inhiben el crecimiento de C. albicans, enfatizando la fuerte actividad de X. proxima para las cepas Gram+. P. ciocalyptoides generó los mayores halos de inhi-bición a la concentración natural, mientras que X. proxima lo hizo con el extracto a la mayor concentración.

DISCUSIÓN

Las frecuencias de susceptibilidad entre cepas Gram+ y Gram- muestran cierta tendencia que es coincidente con la hipótesis que sugiere que bacterias Gram+ son más sensibles que las Gram- a extractos obtenidos de esponjas marinas, dicha hipótesis se fundamenta en la proporción de los aislamientos de bacterias marinas (66-98 % corresponden a cepas Gram-) (Bergquist y Bedfort, 1978; Green et al., 1985). Esto ha sido ob-servado en extractos de esponjas provenientes de otras áreas tropicales y del Caribe (Bergquist y Bedfort, 1978; Muricy et al., 1993; McCaffrey y Endean, 1985; Xue et al., 2004).

No obstante, tal hipótesis ha sido rebatida en otros estudios, en donde las bacterias Gram- mostraron mayor o igual susceptibilidad (Nigrelli et al., 1967; Amade et al., 1982), incluso en el caso de las esponjas del Cari-be colombiano es evidente que algunas especies son activas contra más especies Gram- que Gram+ (p.e. Petromica cyocaliptoides, Xestospongia proxima, Tabla 1). Dichas diferencias son muy sutiles y si bien, puede ser posible que se presente en las esponjas tropicales y particularmente en las especies del Caribe una mayor incidencia del control microbiano frente a las bacterias Gram positivas, aún falta conocer la bioactividad de muchas especies, para definir un patrón geográfico de actividad an-timicrobiana. Es importante anotar que en este sentido incluso pueden presentarse diferencias en la actividad frente a diferentes especies bacte-

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rianas y fúngicas que dependen de la naturaleza química de la muestra evaluada, presentándose variaciones en muestras de una misma especie, como es el caso de Ircinia felix.

Tabla 2. Bacterias Gram+, Gram- y hongos empleados para la evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos, fracciones y compuestos purificados obtenidos de esponjas ma-rinas.

Gram+ Gram - Hongos

Streptococcus sp. Escherichia coli Candida tropicalesStreptococcus faecalis Serratia marcescens Candida albicans

Streptococcus pyogenes Klebsiella pneumoniae Saccharomyces cereviseae

Staphylococcus aureus Pseudomonas sp. Aspergillus tamariStaphylococcus epidermis P. aeruginosa Aspergillus nigerBacillus subtilis Salmonella typhi Aspergillus sp.Micrococcus luteus Salmonella sp.Bacillus cereus Proteus mirabilisBacillus anthracis Enterobacter aerogenes

Shigella sp.

Un resultado importante es la actividad de más del 50 % de las mues-tras químicas de las esponjas (27/48) sobre S. aureus y S. pyogenes (da-tos no mostrados), considerando que las cepas de S. aureus poseen gran facilidad para mutar e incorporar genes de resistencia frente a los antibió-ticos tradicionales (Walker, 2000). Aunque en menor proporción, incluir diferentes especies de hongos en las pruebas de bioactividad constituye sin duda un avance en la búsqueda de nuevos agentes antimicóticos, ya que para el tratamiento de infecciones causadas por estos, existen limi-tantes respecto al número de antimicóticos (Walter, 2000). A nivel local resulta ser significativa la fuerte actividad de los extractos de X. proxima y del + (-) curcufenol sobre el control de C. albicans; por cuanto los va-lores de los halos de inhibición registrados sugieren que el compuesto activo posiblemente tenga una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) relativamente baja (Duque, 1988; Mora et al., sometido)

Aunque estos resultados no pueden ser extrapolados al ambiente ma-rino para respaldar hipótesis ecológicas y evolutivas y es cuestionable la información obtenida usando microorganismos marinos en ensayos in vitro (Bergquist y Bedfort, 1978; Green et al., 1985); las pruebas realiza-

398


das respaldan la búsqueda de sustancias que puedan inhibir el estable-cimiento de bacterias en las esponjas. Por esto, se propone como tema de futuras investigaciones determinar si la actividad antibiótica detectada para estas muestras químicas tiene una función ecológica en las espon-jas, como también en algunos casos, sería importante determinar si los compuestos activos son realmente producidos por la esponjas, ya que podrían ser producto del metabolismo de simbiontes bacterianos (Ke-lecom, 2002). En los casos en los cuales se pueda hallar un compuesto con propiedades antibióticas a partir de una bacteria, las posibilidades de desarrollar un proceso biotecnológico serán mayores, siempre y cuando se pueda cultivar el microorganismo y/o mediante técnicas moleculares desarrollar la estrategia para obtener el compuesto de interés.

Finalmente, aunque aún en los tipos de muestras químicas analizadas prevalezcan los extractos orgánicos crudos, este tipo de exploraciones generan información valiosa para la planeación de los procesos en bio-prospección de organismos marinos; así como también dan pautas para plantear temas de investigación en ecología química de las especies in-volucradas, en este caso esponjas marinas y microorganismos marinos.

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SIMBIOSIS Y ASOCIACIONES EN EL MEDIO MARINO: LA IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL CON APLICACIONES FARMACÉUTICAS

SYMBIOSIS AND ASSOCIATIONS IN THE MARINE ENVIRONMENT: THE ROLE OF MICROORGANISMS IN THE PRODUCTION OF NATURAL COMPOUNDS WITH

PHARMACEUTICAL APPLICATIONS

MÓNICA PUYANA1

1Dirección de Investigaciones. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano

[email protected], [email protected]

RESUMEN

Los invertebrados marinos son una fuente prolífica de compues-tos con actividad biológica significativa, muchos de los cuales tienen estructuras novedosas y grupos funcionales únicos que los diferencian de aquellos producidos por organismos terres-tres. Se cree que muchos de los productos naturales marinos que tienen potencial aplicación en la industria farmacéutica y cosmética son producidos por los simbiontes que albergan in-vertebrados marinos como esponjas, ascidias u octocorales. Los avances en técnicas químicas, moleculares y microscópicas han ayudado a lograr resolver el dilema sobre el verdadero origen de los compuestos aislados de invertebrados marinos y en este capítulo se incluyen algunos ejemplos relevantes.

Palabras clave: Productos naturales marinos, simbiosis, microorganis-mos, cianobacterias, zooxantelas, invertebrados marinos.

ABSTRACT

Marine invertebrates are a prolific source of compounds with significant biological activity, many of which have novel structu-res and unique functional groups different from those isolated from terrestrial sources. It is believed that many of the mari-ne natural products with potential pharmaceutical or cosme-

404


tic applications are produced by symbionts hosted in marine invertebrates such as sponges, ascidians or octocorals. Recent advances in chemical, molecular and microscopic techniques have been very useful in solving the issue on the real origin of compounds isolated from marine invertebrates. In this chapter some relevant examples will be discussed.

Keywords: Marine natural products, symbiosis, microorganisms, cyano-bacteria, zooxanthellae, marine invertebrates.

INTRODUCCIÓN

Los estudios de bioprospección tienen un fuerte componente de in-vestigación básica la cual es fundamental para determinar los potenciales usos y aplicaciones de los productos derivados del medio natural. Como primera medida, es necesario realizar recolecciones exhaustivas de or-ganismos, con todas las implicaciones económicas, ambientales y legales que estas actividades conllevan, para después realizar los procesos de extracción y fraccionamiento, seguidos de bioensayos para la determi-nación de la actividad biológica, proceso conocido como screening o tamizaje. A partir de los resultados de los screenings y de los análisis de-tallados de las muestras recolectadas, se puede optimizar el aislamiento e identificación de compuestos con actividad biológica promisoria, cono-cimiento que puede generar programas importantes de descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos (Capon, 2001). El desarrollo de este tipo de programas suele estar a cargo de empresas farmacéuticas multinacio-nales dados los costos, infraestructura requerida y la formación de alto nivel del personal que ha de estar involucrado en estos procesos. Sin embargo, somos los países en vías de desarrollo los que contamos con la “materia prima”, es decir, los recursos biológicos, en su gran mayoría inexplorados aún, con un enorme potencial de usos y aplicaciones que son en última instancia el objeto mismo de la bioprospección.

La bioprospección ha basado sus esfuerzos en la búsqueda y potencial aplicación de sustancias con actividad biológica provenientes del me-dio natural, especialmente a partir de plantas terrestres y en menor gra-do animales y microorganismos. Sin embargo, a medida que se ha ido avanzando en las técnicas de análisis y se han podido evaluar recursos biológicos provenientes de diversas partes del mundo, los químicos de productos naturales han empezado a enfrentar una drástica reducción en las posibilidades de encontrar compuestos novedosos con actividad bio-

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lógica interesante, promisoria y superior a los productos farmacéuticos ya desarrollados disponibles en el mercado. Por esta razón a mediados del siglo XX, los esfuerzos bioprospectivos en ambientes terrestres se con-centraron en la búsqueda y producción de sustancias bioactivas a partir de microorganismos aislados de fuentes diversas, especialmente el sue-lo. Los compuestos descubiertos se constituyeron en el fundamento de la industria farmacéutica moderna pues al optimizar las condiciones de fermentación a gran escala se redujeron los costos asociados a la produc-ción de compuestos y se pudo garantizar su disponibilidad continua, sin tener que depender de costosas y complicadas síntesis químicas o de las impredecibles y dispendiosas recolecciones en el medio natural. Dada la repentina disponibilidad de productos derivados de microorganismos, muchos de estos empezaron ser ampliamente utilizados en la industria farmacéutica y en la agricultura. Los ejemplos más relevantes incluyen las penicilinas como agentes antibacterianos, las nistatinas como agentes antifúngicos y las avermectinas como agentes antiparasitarios (resumido en Capon, 2001).

Hace 30 años aproximadamente se empezó a contemplar el mar como una fuente de organismos con un potencial químico interesante por di-versos motivos. El primero es que en el mar están representados todos los phyla animales conocidos con excepción de uno que es exclusivamente terrestre. Así de 33 phyla animales, 32 de ellos están representados en el mar, de los cuales 21 son exclusivamente marinos mientras que solo 12 phyla animales están representados en el medio terrestre incluyendo los ambientes dulceacuícolas (May, 1994). De otra parte, los procesos de bio-síntesis de los organismos marinos han producido una mayor diversidad de compuestos, con estructuras complejas y novedosas sin contraparte terrestre, que incorporan en muchos casos elementos “raros”, como los halógenos, no encontrados en los productos naturales terrestres (Faulk-ner, 2000). Esta diversidad de compuestos sintetizados por organismos marinos obedece a la necesidad que tienen éstos de defenderse de de-predadores, competidores, epibiontes o patógenos, ya que la mayoría de ellos -por lo menos en el caso de los invertebrados- son sésiles y carecen de defensas físicas. Un cálculo muy crudo indica que desde 1977 a 2000 se aislaron por lo menos 10000 productos naturales marinos a partir de microorganismos (bacterias, cianobacterias, dinoflagelados, hongos), algas e invertebrados marinos (principalmente esponjas, cnidarios, mo-luscos opistobranquios, briozoos y ascidias) (Faulkner, 2000; Faulkner, 2002 y referencias anteriores en la serie). Muchos de estos compuestos

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revisten especial interés ya sea por su estructura novedosa o su actividad biológica significativa en pruebas preliminares in vitro. Sin embargo, no todos los compuestos que muestran una actividad promisoria en bio-ensayos se constituyen en candidatos ideales para su desarrollo como productos farmacéuticos. Muchos compuestos bioactivos, como es el caso de aquellos aislados de dinoflagelados, equinodermos y peces son simplemente demasiado tóxicos para su uso medicinal (Faulkner, 2000). En la actualidad hay 12 compuestos o derivados de compuestos marinos que se encuentran en pruebas clínicas avanzadas en los EEUU y Europa (Fusetani, 2000). Sin embargo, dado el carácter de secreto industrial de las investigaciones realizadas por la industria farmacéutica es posible que existan otros compuestos de origen marino en pruebas preclínicas y en desarrollo (Fenical ,1997).

El mayor obstáculo que ha impedido el desarrollo de productos far-macéuticos a partir de organismos marinos ha sido la dificultad en obte-ner suficientes cantidades de material para la realización de las pruebas farmacológicas preclínicas y clínicas. En la gran mayoría de los casos, después de mucho esfuerzo, tiempo y dedicación solo se obtienen canti-dades del orden de miligramos de compuestos promisorios, por lo tanto, a pesar del potencial que algunos compuestos pueden representar, los investigadores prefieren publicar los resultados de las investigaciones en revistas científicas y avanzar así en otras investigaciones. Esto probable-mente representa una gran pérdida de potenciales candidatos para su desarrollo como medicamentos, ya que ninguna empresa le va a apos-tar a desarrollar un medicamento que no esté protegido por patentes (Shimizu, 2000). Los compuestos que se dan a conocer por medio de publicaciones no pueden ser patentados a no ser que se les encuentre un uso novedoso y no relacionado con aquellos resultados descritos en las publicaciones lo cual casi nunca sucede.

El desarrollo de un producto farmacéutico de origen natural depende-rá en gran medida de la disponibilidad de la “materia prima” que pueda ser obtenida del medio natural. Recientemente existe una gran preocu-pación respecto a las implicaciones ambientales de la recolección de toneladas de material biológico en zonas sensibles como arrecifes de coral para obtener cantidades minúsculas de un compuesto de interés. Aunque en el medio terrestre la agricultura es una solución viable, en el medio marino las condiciones ambientales son mucho mas complejas y aunque ha habido algunos casos exitosos de acuacultivos con fines de

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obtención de productos naturales, los avances no han ocurrido tan rápi-do como se requiere (Mendola, 2000).

LOS MICROORGANISMOS MARINOS

Se consideran como microorganismos exclusivamente marinos, aque-llos que requieren agua de mar, específicamente sodio, para su crecimien-to. En el caso de los hongos, se definen como hongos marinos aquellos que pueden esporular exclusivamente en hábitats marinos (resumido en Jensen y Fenical, 2000). Estas definiciones se complican cuando se recolectan muestras en ambientes estuarinos ya que una gran cantidad de microorganismos puede sobrevivir y desarrollarse en el medio marino aunque su origen sea terrestre. A pesar de lo anterior, se puede esperar una producción de compuestos novedosos a partir de organismos no exclusivamente marinos dado que las adaptaciones para crecer y desa-rrollarse en el océano son muy diferentes de aquellas requeridas para sobrevivir en ambientes terrestres (Jensen y Fenical, 2000).

Resulta muy difícil determinar si las diferencias en el metabolismo de los microorganismos son adaptaciones a un ambiente en particular, a interacciones entre organismos o si son influenciadas genéticamente. Dado que el 99 % de los microorganismos que existen en la naturale-za no pueden ser cultivados (Fuhrman y Campbell, 1998), solamente el reciente advenimiento de las técnicas moleculares ha permitido com-prender mucho mejor la diversidad microbiana en la naturaleza, su meta-bolismo y su papel ecológico (DeLong, 2001; Moon-Van der Staay et al., 2001; Mincer et al., 2002). Los procesos de especiación en microorganis-mos pueden ser muy rápidos y depender en gran medida de gradientes ecológicos, necesidades metabólicas específicas y las preferencias por determinados microhábitats.

ASOCIACIONES Y RELACIONES SIMBIÓTICAS DE MICROORGANISMOS E INVERTEBRADOS MARINOS

Las asociaciones entre microorganismos e invertebrados son comunes en diversos ambientes marinos donde el espectro de las asociaciones es muy amplio. La mayor parte de ellas tiene un carácter metabólico donde ambos organismos derivan mutuo beneficio de la asociación. El hospedero provee un sustrato donde el microorganismo encuentra refu-gio y aprovecha los productos del metabolismo, mientras que el micro-organismo genera productos aprovechables o es importante en algunos

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procesos fisiológicos del hospedero. Este tipo de simbiosis son las más comunes y se conocen como mutualismo. De otra parte, podemos en-contrar relaciones en donde el microorganismo deriva nutrientes de su hospedero (parasitismo) y culminar con interacciones con patógenos en las cuales las funciones vitales del hospedero se ven disminuidas hasta la muerte (Peters, 1988). Dado que el grado de dependencia e intimidad de las asociaciones es difícil de determinar es muy frecuente que el tér-mino simbiosis se use en un contexto amplio para definir simplemente la asociación de dos organismos de especies diferentes.

El establecimiento de simbiosis entre microorganismos e invertebra-dos ha permitido que estos últimos adquieran nuevas capacidades meta-bólicas en muchos ambientes marinos desde arrecifes de coral hasta las chimeneas submarinas (Fisher, 1990; Santavy, 1995; Wilkinson, 1987b). Las asociaciones simbióticas pueden proveer energía o compuestos para la supervivencia del hospedero, proteger al hospedero de patógenos u organismos oportunistas, proteger al hospedero de los efectos nocivos de la radiación ultravioleta o sintetizar compuestos que sirvan al hospe-dero como defensas químicas para su protección (Puyana, 2001).

Dentro de los invertebrados que se constituyen como hospederos hay gradientes marcados de luz y oxígeno entre sus tejidos así como disponi-bilidad de diversos compuestos químicos, por lo cual dentro de los hos-pederos constituyen microambientes con condiciones variables según la ubicación de los microorganismos dentro de estos. La particularidad de estos microhábitats puede haber favorecido la especiación de muchos grupos microbianos.

Se considera que los microorganismos simbióticos son responsables de producir un buen número de compuestos bioactivos aislados a partir de organismos marinos particularmente los invertebrados. La principal razón para adjudicar un origen microbiano a un compuesto en particular puede ser la semejanza estructural, parcial o casi total, entre el com-puesto aislado y otros compuestos de origen microbiano. Un caso que llama particularmente la atención son los péptidos no ribosomales o los complejos policétidos aislados de esponjas, ascidias y briozoos, análogos de los cuales solamente se han aislado a partir de microorganismos (re-sumido en Piel et al., 2004). Otros factores que pueden sugerir el origen microbiano de algunos compuestos es el aislamiento en cantidades muy bajas o muy variables de determinados compuestos y el aislamiento del mismo compuesto a partir de organismos muy diversos no relacionados

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filogenéticamente (Bernan, 2001). Algunos aspectos que pueden cons-tituirse como indicios que hay una asociación consistente entre el inver-tebrado y el microorganismo son que la abundancia del microorganismo en cuestión, se correlaciona con la cantidad del producto aislado y que el microorganismo se encuentra en las mismas porciones o tejidos de la misma especie de hospedero, en varios ejemplares recolectados en localidades diversas o por lo menos distantes. La prueba fehaciente de que existe una asociación consistiría poder cultivar el microorganismo y demostrar la producción del compuesto de interés en condiciones de cultivo, sin embargo, en el caso de las simbiosis mutualistas resulta muy difícil, por no decir que imposible cultivar los simbiontes. Es el mutuo beneficio y la consistencia de la relación que separa los microorganis-mos simbióticos de aquellos simplemente asociados con su hospedero (Faulkner et al., 2000).

SIMBIOSIS EN ESPONJAS

Las esponjas son hasta el momento el grupo animal del cual se han aislado el mayor número de compuestos bioactivos novedosos, con una diversidad estructural y funcional única representando una fuente pro-misoria de nuevos productos farmacéuticos (Faulkner, 2000 y referen-cias anteriores allí citadas). La alta diversidad química de las esponjas es parcialmente responsable de la baja depredación que sufren éstas en su medio natural (Pawlik et al., 1995; Pawlik, 1997). Las esponjas albergan densas y diversas comunidades microbianas que tienen una gran influen-cia en su distribución (Wilkinson, 1987a), metabolismo y translocación y reciclaje de nutrientes (Wilkinson, 1980; Reiswig, 1981; Corredor et al., 1988; Rützler, 1990; Arillo et al., 1993; Díaz, 1996). Se han detectado bacterias de vida libre en la matriz orgánica o mesohilo de las esponjas (Vacelet, 1975; Wilkinson, 1978; Santavy y Colwell, 1990; Bewley et al., 1996; Diaz, 1997). Dado que el medio marino es pobre en nutrientes, la matriz orgánica de las esponjas se constituye como un medio nutritivo que favorece el desarrollo de poblaciones bacterianas (Bergquist y Be-dford, 1978). En algunas esponjas, las bacterias pueden constituir hasta el 40% de su volumen total (Vacelet, 1975) y los tipos de bacterias que se encuentran asociados a las esponjas son diferentes a aquellos que se encuentran en el medio ambiente circundante (Wilkinson et al., 1981; Fieseler et al., 2004). Las esponjas también albergan cianobacterias (Wil-kinson, 1980, 1987b; Arillo et al., 1993; Rützler, 1990; Rützler y Muzik, 1993; Díaz, 1996; Unson y Faulkner 1993; Unson et al., 1994), Archaea

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(Preston et al., 1996), dinoflagelados (Rosell y Uriz, 1992; Hill; 1996) y hongos (Richter, 1985; Numata et al., 1997; Höller et al., 2000; Brauers et al., 2001). Recientemente, el desarrollo de técnicas moleculares ha per-mitido reconocer la gran diversidad de bacterias heterótrofas (Friedrich et al., 1999; López et al., 1999; Hentschel et al., 2001) y cianobacterias (Diaz, 1996; Diaz, 1997) asociadas a esponjas. Las esponjas revisten un especial interés desde la bioprospección por su capacidad de producir compuestos interesantes, la diversidad microbiana asociada a éstas y por ende su potencial en aplicaciones biotecnológicas (Hentschel et al., 2003).

A pesar de que se ha atribuido un origen microbiano a una gran can-tidad de compuestos derivados de esponjas, solo en muy pocos casos esto se ha podido comprobar (Faulkner et al., 1999). Las esponjas del género Dysidea se encuentran en arrecifes tropicales y producen una alta diversidad de compuestos que incluyen terpenos, esteroles, compuestos derivados del nitrógeno, aminoácidos clorados y éteres difenílicos bro-mados (Venkateswarlu et al. 1998). La esponja D. herbacea, de amplia distribución en el Indopacífico, presenta dos quimiotipos muy caracte-rísticos. A partir de uno de ellos han aislado sesquiterpenos y derivados de aminoácidos clorados. El otro quimiotipo produce únicamente éte-res difenílicos bromados (Unson & Faulkner 1993; Unson et al., 1994). En ambos quimiotipos se encuentran poblaciones abundantes de cia-nobacterias que se han identificado en ambos casos como Oscillatoria spongeliae. Unson y Faulkner (1993) aislaron a partir de ejemplares de Oscillatoria spongeliae de la Gran Barrera de coral Australiana, los ses-quiterpenos spirodysina (1), herbadysiolido (2) y el derivado clorado de aminoacidos 13-demetilisodysidenina (3) (Figura 1). Las células de las esponjas y de sus cianobacterias asociadas fueron separadas mediante gradientes Ficoll de densidad y usando citometría de flujo acoplada a fluorescencia. Así de las células que contenían pigmentos fotosintéticos (es decir las cianobacterias) fueron separadas de todas las células restan-tes. El compuesto 3 se encontró asociado a las fracciones que contenían las cianobacterias mientras aquellas fracciones no fluorescentes que con-tenían las células de esponjas y otro tipo de microorganismos, contenían predominantemente los sesquiterpenos 1 y 2. Al examinar un ejemplar de Oscillatoria spongeliae proveniente de las islas Palau, los mismos autores solo aislaron el éter polifenílico bromado 4 en cantidades de hasta 12% del peso seco de la esponja. Usando los mismos métodos de separación celular descritos anteriormente, los autores encontraron

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que este compuesto estaba asociado a las fracciones que contenían la cianobacteria. El compuesto es producido en tal cantidad que cristaliza y se concentra justo bajo la superficie de la esponja donde posiblemente cumple funciones de defensa (Unson et al., 1994). Otras muestras de O. spongeliae recolectadas en la región del Indopacífico han confirmado los resultados anteriores pero también han encontrado una mayor diversi-dad de compuestos clorados asociados a la cianobacteria, lo cual sugiere que estas cianobacterias tienen una diversidad química y posiblemente genética que no es obvia usando técnicas morfométricas tradicionales (Flowers et al., 1998; Faulkner et al., 2000).

SIMBIOSIS Y COMPUESTOS DE APLICACIÓN FARMACÉUTICA EN ASCIDIAS

Aunque a simple vista podrían ser confundidas con esponjas para el ojo no entrenado, las ascidias son cordados porque entre otras caracte-rísticas, sus larvas tienen una pequeña notocorda que se reabsorbe al fijarse y sufrir la metamorfosis. Las ascidias arrecifales, especialmente aquellas de la familia Didemnidae tienen asociaciones estrechas y obli-gatorias con la prochlorophyta Prochloron didemni (Lewin, 1977) (Kühl y Larkum, 2002). P. didemni es considerada por algunos como una cia-nobacteria “aberrante” (Lewin, 2002) dado que contiene clorofila a y b pero carece de las ficobilinas que caracterizan a las cianobacterias. Por esta razón otros investigadores prefieren ubicarla dentro de una división aparte, la división Prochlorophyta. Adicionalmente las ascidias también tienen asociaciones simbióticas con otras prochlorophytas y cianobacte-rias (resumido en Kühl y Larkum, 2002).

Las células de Prochloron recubren la cloaca de las ascidias solitarias o están inmersas en pliegues de la túnica en las formas coloniales. Estos microorganismos forman sobre la túnica una densa biopelícula, con una alta cantidad de mucus. La túnica provee un ambiente protegido con una gran superficie disponible para la colonización de las células de Prochlo-ron y las ascidias modifican su forma y crecen hacia la luz para maximizar un acceso de ésta a sus simbiontes. Se ha comprobado que hay un apor-te significativo de los productos de la fotosíntesis de Prochloron hacia su hospedero, que cumple parcial o totalmente con la demanda de carbono por parte de éste, además de reciclaje de nitrógeno entre hospedero y huésped y fijación de este elemento por parte de Prochloron (resumido en Kühl y Larkum, 2002).

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Figura 1. Compuestos aislados de la esponja Dydisea herbacea (1, 2) y de su cianobacte-ria simbiótica Oscillatoria spongeliae (3, 4). La ecteinascidina 743, compuesto con ac-tividad tumoral fue aislado originalmente de la ascidia caribeña Ecteinascidia turbinata, se constituye hoy en día en un poderoso agente antitumoral comercializado bajo el nombre de YONDELIS® (trabectedin).

Las ascidias han sido una fuente prolífica de compuestos bioactivos, principalmente péptidos con actividad citotóxica (Davidson, 1993; Ma-tsumoto et al., 2003) aunque recientemente se ha reportado actividad antimicrobiana, antiviral y antiparasitaria de compuestos derivados de ascidias tropicales y de zonas templadas (Kang et al., 1996; Mitchell et al., 2000; Blunt et al., 2003, 2004). A lo largo de los años se ha sugeri-do que los ciclopéptidos producidos por ascidias son sintetizados por Prochloron spp., pero los estudios en los cuales las células del hospe-dero y los simbiontes han sido separadas para analizar e identificar la fuente de estos compuestos no han arrojado resultados concluyentes. De igual forma a pesar de que las células de Prochloron pueden aislarse del hospedero, éstas no han podido cultivarse con éxito (Schmidt et al., 2005).

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Figura 2. Compuestos con actividad citotóxica aislados de ascidias: la didemnina B fue origi-nalmente aislada de la ascidia caribeña Trididemnum solidum (6) pero dada su toxicidad no pasó la fase II de pruebas clínicas. La dehidrodidemnina B (7), fue aislada originalmente de la ascidia mediterránea Aplidium albicans y actualmente se encuentra en pruebas clínicas avanzadas para el tratamiento de cánceres hematológicos y tumores sólidos bajo el nombre comercial de APLIDIN®. Las patellamidas A y C (8 y 9) son ciclopéptidos con actividad citotóxica moderada aislados de la ascidia del Indopacífico Lissoclinum pate-lla. Las pseudopterosinas A-D (10-13) son diterpenos glicosidados aislados del gorgonáceo caribeño Pseudopterogorgia elisabethae que tienen una excelente actividad antiinfla-matoria y son ampliamente usados para el tratamiento de afecciones y deterioro de la piel.

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Hoy en día hay dos compuestos provenientes de ascidias que ya están listos para salir al mercado para el tratamiento de tumores de diversa naturaleza al haber superado exitosamente las pruebas clínicas o bien se encuentran en fases avanzadas de éstas. El primer caso es la ecteinasci-dina 743 (5) (Figura 1) originalmente aislada en cantidades muy peque-ñas de la ascidia caribeña Ecteinascidia turbinata (Rinehart et al., 1990; Wright et al., 1990). Este compuesto que fue desarrollado por la empresa española PharmaMar y Johnson & Johnson, será comercializado con el nombre YONDELIS® (trabectedin). Actualmente se produce por síntesis y sirve para tratar formas avanzadas de cáncer de ovario. El compuesto didemnina B (6) (Figura 2) originalmente aislado de la ascidia caribeña Trididemnum solidum, presenta actividad antiviral e inmunospupresora de importancia siendo también un agente efectivo para el tratamiento de leucemias y melanomas. El compuesto llego hasta la fase II de pruebas clínicas pero dada su toxicidad tuvo que ser retirado (Faulkner, 2000). Un análogo de este compuesto, la dehidrodidemnina B (7) (Figura 2), ori-ginalmente aislado de la ascidia del Mediterráneo Aplidium albicans, se puede obtener por oxidación de la didemnina B o por síntesis total. Este agente es efectivo contra la leucemia linfoblástica y el mieloma múltiple, y se encuentra en la fase II de pruebas clínicas contra tumores sólidos de próstata y vejiga. El compuesto se conoce bajo el nombre comercial de Aplidin® y también esta siendo desarrollado por la empresa PharmaMar.

Lissoclinum patella es una ascidia colonial ampliamente distribuida en el Indo Pacífico. Esta especie es una fuente prolífica de ciclopéptidos entre los cuales se destacan las patellamidas A (8) y C (9) (Figura 2), las cuales presentan actividad citotóxica selectiva y moderada. Adicional-mente, algunas patellamidas parecen revertir la resistencia de algunos tumores a los tratamientos convencionales (resumido en Schmidt et al., 2005).

A pesar de que las células de Prochloron no son cultivables, en un estudio reciente, Schmidt et al. (2005) lograron aislar e identificar los genes responsables de la biosíntesis de las patellamidas y confirmaron su función mediante la expresión de toda la ruta biosintética primaria en Escherichia coli. Los genes fueron aislados de células de Prochloron y corresponden a genes que sintetizan péptidos mediante la vía ribosomal. Este trabajo se constituye en uno de los muy pocos ejemplos que existen en los cuales se adscribe la expresión de productos naturales marinos a genes de los simbiontes obligados.

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SIMBIOSIS EN EL GORGONÁCEO Pseudopterogorgia elisabethae Y PRODUCCIÓN DE PSEUDOPTEROSINAS

Los gorgonáceos (Octocorallia; Gorgonacea), son algunos de los in-vertebrados mas prolíficos y conspicuos de las comunidades marinas en la región Caribe, el Atlántico Occidental tropical y el Indopacífico. Los pólipos de octocorales se nutren de plancton y partículas que captu-ran con sus tentáculos. Sin embargo, un buen porcentaje de la nutrición también proviene del transporte activo de nutrientes disueltos a través de la epidermis y de la producción fotosintética de zooxantelas (dinofla-gelados) que viven en una obligada asociación con el pólipo. Estudios utraestructurales, moleculares e histológicos han permitido determinar que las zooxantelas asociadas a corales y octorales son muy diversas y hasta el momento se han descrito por lo menos 24 especies de zooxan-telas 10 de las cuales pertenecientes al género Symbiodinium (resumido en Santos et al., 2003).

El gorgonáceo Pseudopterogorgia elisabethae es una especie que ha-bita a profundidad moderada en varias localidades del Caribe incluyendo el archipiélago de San Andrés y Providencia. Esta especie reviste un espe-cial interés dado que produce una gran cantidad de diterpenos con acti-vidad antiinflamatoria, citotóxica y antituberculosa (resumido en Puyana et al., 2004). Las pseudopterosinas son los compuestos provenientes de P. elisabethae que han recibido mayor atención dado que poseen exce-lente actividad antiinflamatoria y analgésica y por lo tanto vienen siendo incorporadas en productos cosméticos de prestigiosas marcas internacio-nales y representan un gran potencial en el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la artritis y afecciones en la piel como el eccema y las dermatitis. El mecanismo de acción de estos compuestos es novedoso y diferente al de otros compuestos y fármacos no esteroidales (Look et al., 1986a, b; Roussis et al., 1990). Las pseudopterosinas parecen actuar a diferentes niveles del proceso inflamatorio y ahí radica su eficacia como agentes antiinflamatorios. De una parte, las pseudopterosinas parecen mediar su efecto antiinflamatorio al inhibir la secreción de eicosanoides a partir de células inflamatorias, en una forma dependiente de la dosis y la concentración (Mayer et al., 1998). Otras pseudopterosinas inhiben la síntesis de leucotrienos lo cual parece sugerir que puede actuar como antagonista de lipooxigenasas o enzimas involucradas en los primeros pasos de la cascada del ácido araquidónico (Roussis et al., 1990) y tam-bién se ha podido determinar que algunas pseudopterosinas inhiben

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el proceso de degranulación de granulocitos neutrófilos humanos impi-diendo la liberación de enzimas degradativas y sus consecuencias, como reacción al proceso de inflamación (Fenical, 1997).

La primera serie de pseudopterosinas (pseudopterosinas A-D) (10-13) (Figura 2) fue aislada y caracterizada por Look et al. (1986a, b) a partir de una muestra de P. elisabethae recolectada en las islas Bahamas. Ensayos preliminares revelaron que estos animales contenían grandes cantidades de metabolitos desconocidos de naturaleza lípida-polar que resultaron tener marcada actividad inhibitoria en pruebas de citotoxicidad y antimi-crobianas. Las pseudopterosinas son diterpenos glicosidados, cuyo azúcar es la D-xilosa, mientras que las pseudopterosinas B-D son isómeros en los cuales la única variación es la posición de los acetatos (Fenical, 1987). Posteriormente, se han aislado otra pseudopterosinas en Bahamas, Ber-muda (Roussis et al., 1990), los cayos de la Florida (Thorton y Kerr, 2002) y las islas de San Andrés y Providencia (Duque et al., 2004; Duque et al. en prep.). Dado que la fuente de estos compuestos para la industria son los extractos orgánicos de octocorales recolectados del medio natural, existe un gran interés en determinar las causas de la variabilidad química de las pseudopterosinas la cual es muy alta entre individuos y localidades (Mydlarz et al., 2003; Puyana et al., 2004).

Thorton y Kerr (2002) determinaron algunos mecanismos que influ-yen en la inducción a la producción de pseudopterosinas en Pseudop-terogorgia elisabethae en la isla Gran Bahama (Bahamas). Los autores encontraron que la depredación por el gastrópodo Cyphoma gibbossum y especialmente el descenso en los niveles de radiación UV tuvieron una incidencia significativa en el incremento del contenido de pseudoptero-sinas in situ.

P. elisabethae se asocia específicamente con un linaje único de Sym-biodinium sp. tipo B que ha sido denominado Symbiodinium sp. B184 (Santos, 2003). Esta asociación es bien particular porque las plánulas de P. elisabethae caen directamente de las colonias madre al sustrato y una vez éstas se asientan y sufren metamorfosis seleccionan exclusivamente estas zooxantelas del medio ambiente circundante (resumido en Santos et al., 2003).

Un estudio reciente indica que las pseudopterosinas A-D (10-13) (Fi-gura 2) son producidas por los Symbiodinium asociados a P. elisabethae. Esto se determinó purificando los simbiontes intracelulares mediante

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gradientes Ficoll de densidad y analizando el contenido de los cuatro compuestos de interés en las fracciones enriquecidas en las células de simbiontes. Se encontró que mientras en las colonias de P. elisabethae las pseudopterosinas totales equivalen a 5 % del extracto crudo, en las células purificadas de Symbiodinium estos compuestos constituyen 11 % del extracto algal. Los autores encontraron una correlación positiva entre el número de células de simbiontes y contenido de pseudopterosinas por unidad de volumen de la colonia. De igual manera, también se ais-ló a partir de las células de Symbodinium un intermediario biosintético importante en la síntesis de pseudopterosinas. La biosíntesis de estos compuestos se confirmó incubando células purificadas de Symbiodinium en presencia de NaH14CO3. Después de un lapso de 48 h se confirmó una incorporación significativa de 14C en las pseudopterosinas sintetizadas (Mydlarz et al., 2003).

DISCUSIÓN

Las características del medio marino han influido para que numero-sos microorganismos establezcan asociaciones simbióticas con plantas y animales marinos incrementando aún más la complejidad de las inte-racciones ecológicas en el océano. Día a día el avance de técnicas mo-leculares, químicas y microscópicas entre otras, nos permite ahondar en las complejas relaciones que existen entre invertebrados marinos y sus simbiontes. Este conocimiento es fundamental porque solo así se podrá algún día llegar a optimizar la producción de compuestos bioactivos pro-ducidos por microorganismos en el laboratorio y así eliminar los proble-mas inherentes a la recolección de enormes cantidades de biomasa y a la variabilidad química entre diferentes muestras, entre otros. Estudios recientes demuestran que es posible expresar los genes biosintéticos de microorganismos que producen de compuestos de interés. La mi-crobiología marina es de carácter netamente interdisciplinario y resulta fundamental en el estudio de los productos naturales marinos siendo un campo con enorme potencial en el cual todo está por hacerse y que seguramente dará en el futuro resultados muy alentadores y aplicables a la industria farmacéutica e industrias relacionadas.

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BIOACTIVIDAD DE EXTRACTOS CRUDOS DE ESPONJAS MARINAS Y PERSPECTIVAS DE LA LÍNEA DE BIOPROSPECCIÓN MARINA DEL INVEMAR

BIOACTIVIDAD OF MARINE SPONGE EXTRACTS CRUDE AND PERSPECTIVE OF THE MARINE LINE OF BIOPROSPECTION OF

INVEMAR

MARISOL SANTOS-ACEVEDO1, FEDERICO NEWMARK1, SVEN ZEA2

1Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras (INVEMAR). Santa Marta. Magdalena. Colombia.

[email protected], [email protected] de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.

2Centro de Estudios en Ciencias del Mar (CECIMAR) (UNC)[email protected]

RESUMEN

En este estudio se presentan cuatro posibles nuevas fuentes de sustancias antimicrobianas a partir de las esponjas marinas, 12 extractos han resultado ser fuertemente activos en la prueba citotóxica-antimitótica, ocho con actividad antiepibiotica selec-tiva, 10 fueron tóxicas contra corales y cinco disuasoras de la alimentación de un pez generalista. El trabajo se realizó con los extractos metanol-diclorometano obtenidos de 15 especies de esponjas marinas colectadas entre 2003 y 2004, en la región de Santa Marta (Colombia) e incluye el estudio de la actividad an-tibacteriana, antifúngica, citotóxica, antimitótica, antiepibiotica y de disuasión de la alimentación.

Palabras clave: Bioprospección, esponjas marinas, extractos crudos, bioactividad.

ABSTRACT

Four new possible sources of antimicrobial substances from marine sponges were revealed in this study. Twelve extracts tur-ned out to be strongly active in the cytotoxic-antimitotic test, eight with selective antifouling activity, ten were toxic against corals and five dissuade feeding from generalist fish. The stu-

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dy was based on methanol-dichloromethane extracts from 15 marine sponge species collected between 2003 and 2004 at Santa Marta – Colombia. The study also included antibacterial, antifungal, cytotoxic-antimitotic, antifouling and feeding dissua-sion activity.

Keywords: Bioprospection, marine sponges, crude extracts, bioactivity.

INTRODUCCIÓN

Se cree que la biodiversidad a nivel genético y bioquímico en el mar sea mayor que en los continentes (Márquez, 1996), de allí que en nuestro país, especialmente dotado con dos océanos, se encuentre una gran al-ternativa de desarrollo biotecnológico y económico. Sin embargo, para encaminarse en la ruta de tal desarrollo es necesario ampliar el cono-cimiento de las especies y su potencial de uso (Mora, 2004).

Los organismos marinos son fuente de novedosas estructuras quími-cas y así mismo de nuevos productos naturales, que pueden ser usados por la industria farmacéutica, como aditivos en alimentos, suplementos alimenticios, materiales ortopédicos, materiales adhesivos, cosméticos, etc. (Duque, 1998). No obstante, de todos los invertebrados marinos las esponjas han mostrado el mayor número y diversidad de produc-tos naturales marinos (Pawlik, 1993) y además, una tercera parte de los productos naturales hasta ahora descritos provienen de estas (Santafe, 2002).

En Colombia son varios los estudios que se han realizado sobre el tema. Sin embargo, queda un gran porcentaje de organismos marinos colombianos sin estudiar, es por esto que a través de los bioensayos que se realizaron en el proyecto, se busca responder a la necesidad de aumentar la capacidad de investigación básica en el país.

MÉTODOS

El ensayo antimicrobiano respalda la búsqueda de sustancias de impor-tancia contra microorganismos patógenos humanos más aún cuándo se ha identificado multiresistencia a diferentes antibióticos por cepas bacte-rianas, cuyo tratamiento requiere de sustancias novedosas para formular terapias antimicrobianas efectivas. Este bioensayo consistió básicamente en evaluar el poder de inhibición de crecimiento que poseen los extrac-tos, sobre microorganismos patógenos humanos. Se realizó utilizando el

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método de difusión en agar con aplicación de antibióticos (en este caso de extracto) por medio de discos de papel (Hewitt y Vincent, 1989). El diámetro del halo de inhibición se toma como medida de la bioactividad, en referencia a unos antibióticos comerciales (controles positivos) y a los discos sin extractos (controles negativos). Se usaron cultivos de las bac-terias Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis (Gram positivas), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (Gram negativas) y el hongo Candida albicans.

El ensayo de citotoxicidad y antimitosicidad es una aproximación en la búsqueda de sustancias con potencial anticancerígeno y antitumoral, por su efecto sobre la división celular. Desde el punto de vista ecológico, también respalda de manera indirecta la búsqueda de sustancias que inhiben la epibiosis, previniendo potencialmente la división celular de las larvas recién asentadas en la superficie de una esponja (Zea et al., 1986; Dueñas, 2000). Para este ensayo se usaron huevos de erizos de mar Lytechinus variegatus. Al iniciar el ensayo se verificó la viabilidad de los huevos, posteriormente se fertilizó con esperma, se trataron durante 90 minutos con los extractos, se fijaron con formalina y se contó en varios campos al azar del número de embriones fertilizados sin división. Se usaron como control positivo colchicina y negativo huevos sin extracto y sin solvente y huevos con solo solvente (Dueñas, 2000).

Para el ensayo de antiepibiosis se utilizó el método ecológicamente más relevante, efectivo y reproducible; que permite desacoplar la ac-ción química de las sustancias presentes en la piel de una esponja, o exudadas, de la textura física de su superficie, que también puede tener un efecto antiepibiótico (Henrikson y Pawlik, 1995). Consiste en ubicar en el campo estructuras que sostengan un medio gelatinoso de agar compacto (Phytagel), previamente mezclado con los extractos crudos de la esponja, durante 28 días. El asentamiento de invertebrados y algas se registra en el laboratorio y las diferencias se estiman a partir de la cober-tura y abundancia de los organismos (Henrikson y Pawlik, 1995).

Para el ensayo de disuasión de la alimentación se aplicó el método de Chanas et al. (1996), modificado por Chavez, 2003, en el cual se mez-cló un volumen conocido de extracto con comida a base de manto de calamar secado y liofilizado, con harina de trigo para dar consistencia y así formar tiras de alimento (pellets) que fueron ofrecidos a grupos de peces (Stegastes partitus) previamente aclimatados y acostumbrados al alimento. Para este ensayo se prepararon también pellets sin extracto

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que funcionan como control. Esta prueba tiene un significado ecológico importante, por cuanto revela si la esponja tiene sustancias capaces de disuadir a un depredador generalista, con independencia de lo que éste haya aprendido en su vida libre respecto de la forma, el color y el olor de la esponja (Chanas et al., 1996).

El ensayo de toxicidad en coral tiene implicaciones ecológicas impor-tantes en la competencia por espacio en el arrecife, a nivel de defensa contra posibles depredadores e inhibición de epibiosis, entre otros (Aerts y Soest, 1999; en Dueñas, 2000). Para su realización se dispuso de co-lonias de Madracis mirabilis en un acuario, donde previamente se han aclimatado. Antes de agregar los extractos, se realizó un conteo de los pólipos sanos en un área de 1 cm2 en cada una de las réplicas, tanto de controles como de tratamientos. Después de agregar los extractos a los tratamientos, se contó cada 10 minutos durante dos horas, el número de pólipos contraídos (Dueñas, 2000). Al cabo de las dos horas, los corales fueron trasladados a acuarios con agua limpia y a las 24 horas se realizó otro conteo de pólipos contraídos.


Se evaluaron 15 esponjas marinas para tratar de dilucidar su potencial bioactivo (Tabla 1).

En el ensayo antimicrobiano, Halichondria sp., Petromica cyocalyptoides y Xestospongia proxima inhibieron el crecimiento de las bacterias Gram positivas y del hongo; mientras que Dragmacidon reticulata solamente presentó actividad antifúngica. Las esponjas Myrmekioderma gyroderma, Myrmekioderma rea, Biemna cribaria, Cinachyrella kuekenthali, Iotro-chota imminuta, Oceanapia peltata, Polymastia tenax, Desmapsamma anchorata, Spirastrella coccinea, Cribrochalina infundibulum, Oceana-pia bartschi no presentaron actividad antibacteriana ni antifúngica en el presente estudio.

En el ensayo citotóxico-antimitótico, S. coccinea, M. rea, I. imminuta, Halichondria sp., P. ciocalyptoides, C. kuekenthali, B. cribaria, X. proxima, O. peltata, O. bartschi, P. tenax y D. reticulata mostraron una alta activi-dad citotóxica-antimitótica (Inhibición mayor al 95%), siendo el efecto más frecuente la inhibición del clivaje celular desde el primer estadio celular.

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Tabla 1. Tabla resumen de los resultados de los ensayos sobre bioactividad.MHNMC: Museo de Historia Natural Marina de Colombia.Positiva: hay efecto para la actividad ensayada. Negativa: no hay efecto para la actividad ensayada.

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Los extractos orgánicos crudos de las esponjas marinas responden di-ferencialmente a la posibilidad del asentamiento de diversos epibiontes, pueden favorecerlo, disminuirlo o simplemente puede no afectarlo. Ocho tienen actividad antiepibiotica contra diversos organismos: C. vasculum, B. cribaria, S. coccinea, O. peltata, D. reticulata, M. gyroderma, I. immi-nuta y X. proxima.

Unicamente D. reticulata, P. cyocaliptoides, X. proxima, M. gyroderma y B. cribaria, fueron disuasoras positivas de la alimentación del pez arreci-fal generalista S. partitus. A pesar de que los demás extractos no tuvieron una respuesta antidepredatoria positiva, es probable que esta sí se de en otras especies de depredadores potenciales, ya que muchos compuestos bioactivos son diferencialmente efectivos hacia los depredadores (Van Alstyne y Paul, 1988; Pennings et al., 1994).

De las 15 especies de esponjas marinas estudiadas cinco, M. rea, X. proxima, D. anchorata, D. reticulata e I. imminuta fueron medianamente tóxicas, es decir, causaron la contracción permanente de aproximada-mente la mitad de los pólipos de coral y cinco, C. kuekenthali, P. ciocalyp-toides, Halichondria sp., O. peltata y S. coccinea son altamente tóxicas para los corales, ya que les causaron la muerte, o de la mayoría de sus pólipos.

Con estos ensayos se obtuvo información relevante sobre la bioacti-vidad de los extractos crudos aislados de algunas esponjas marinas del Caribe colombiano, base del progreso en futuras investigaciones quími-cas, biológicas y clínicas (o farmacológicas) que contribuirán al desarrollo biotecnológico en Colombia. De acuerdo al Plan Nacional de Bioprospec-ción en organismos marinos, el conocimiento que aquí se genere permiti-rá avanzar a la investigación aplicada y así cumplir con los requerimientos mundiales en el tema de bioprospección (Melgarejo et al., 2002).

CONCLUSIONES

En este estudio se presentan cuatro posibles nuevas fuentes de sus-tancias antimicrobianas a partir de las esponjas marinas Halichondria sp., X. proxima y P. ciocalyptoides colectadas en el Caribe colombiano y el primer reporte de actividad antimicrobiana sobre cepas de S. aureus, St. faecalis y C. albicans de los extractos orgánicos crudos (metanol:di-clorometano) obtenidos de Halichondria sp., D. reticulata, X. proxima y P. ciocalyptoides. La especie más interesante es X. proxima, por presentar los niveles más altos de actividad en los microorganismos evaluados.

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Desde la perspectiva que representa para la salud humana la actividad citotóxica-antimitótica de los extractos de las esponjas marinas del Cari-be colombiano, se generan expectativas respecto al descubrimiento de nuevas fuentes alternativas para la obtención de sustancias con potencial anticancerígeno; por esto se recomienda pasar a la fase de pruebas de bioactividad sobre líneas de células tumorales. Como resultado de este proyecto se encontró que el 80% de estos extractos han resultado ser fuertemente activos respecto a esta actividad y el 13% moderadamente.

X. proxima presentó resultados positivos para las siete pruebas repor-tadas en la tabla 1, con lo cual es una excelente candidata para continuar con el proceso bioprospectivo.

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