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Cortesía de Dra. A. M. P.

Demostración de los postulados de Koch usando cítricos

FUNDAMENTOS: Relación entre los microorganismos y las enfermedades. Antes del siglo XIX el pensamiento mayoritario sobre la causa de las enfermedades era que existía un desequilibrio entre 4 humores corporales (sangre, flema, bilis amarilla y bilis negra). Durante el siglo XIX se empezó a cuestionar esta idea y surgieron los primeros indicios de que las enfermedades podrían estar debidas a seres microscópicos. Uno de los científicos clave en este tema fue el médico alemán Robert Koch (1843-1910) ya que realizó la primera demostración experimental sobre el papel de las bacterias como causantes de enfermedades (en su caso en la enfermedad del carbunco o anthrax). Los criterios que siguió Koch para demostrar la relación entre la bacteria Bacillus anthracis y la enfermedad del carbunco se conocen como los postulados de Koch y se suelen resumir de la siguiente forma:

1. El agente sospechoso de ser causante de la enfermedad debe estar presente en todos

los individuos u hospedadores enfermos y no encontrarse en los individuos sanos.

2. Es necesario aislar y desarrollar en cultivo puro al microorganismo sospechoso.

3. Al inocular el microorganismo aislado en cultivo puro a un individuo u hospedador

sano, éste desarrollará la enfermedad.

4. El microorganismo debe poder aislarse de nuevo a partir del individuo u hospedador

infectado experimentalmente. (Este último postulado fue añadido a los anteriores pero

es obra del microbiólogo Erwin Smith).

MATERIAL: Naranjas con moho/hongo sobre la piel (color blanquecino/verdoso), naranjas sanas, bisturí o similiar esterilizable, asa de siembra, medio de cultivo general para hongos (PDA, potato dextrose agar), placas Petri de plástico, mechero Bunsen, recipientes metálicos, papel de aluminio, arena, agua destilada. El tiempo de preparación depende del crecimiento de los hongos. La incubación duraría una semana, por tres veces que sería necesario realizarla serían tres semanas. El tiempo que estarían los alumnos realizando manipulativamente la actividad sería de unas 2 o 3 sesiones de 50 minutos. La dificultad de esta experiencia es media, ya que se requiere un mínimo de precaución para evitar contaminaciones no deseadas. El coste de material no es muy elevado. El medio de cultivo sería lo más costoso y no superaría los 30 dólares, comprando suficiente cantidad para que se pudiese realizar el experimento en parejas.

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MONTAJE: 1. Se toma una naranja con hongo (Penicillium digitatum, ver figura 1) y, utilizando un bisturí estéril o un asa de siembra previamente esterilizada a la llama, se toma un poco del hongo y se deposita en una placa con el medio de cultivo PDA solidificado. El tiempo de cultivo es de alrededor de 1 semana a temperatura ambiente (20-25 ºC).

Figura 1: Naranja infectada con P. digitatum. Se pasa el hongo a una placa de cultivo y se incuba hasta que invada la placa (aprox. 1 semana).

2. Se cogen dos naranjas no infectadas y se les lava la piel con un poco de agua con detergente y luego se le pasa una dilución de legía al 10% para eliminar los posibles contaminantes. Luego se retira una porción de la piel de cada naranja de alrededor de 1 cm2. En este hueco se coloca (ver figura 2): - En una naranja (CONTROL) un pedazo de agar estéril (de una placa no utilizada en el aislamiento del hongo). - En la otra naranja se coloca un pedazo de agar que contiene el hongo aislado previamente en el paso 1. Se dejan incubar en recipientes esterilizados, cerrados con papel de aluminio que contienen arena humedecida con agua destilada para mantener las condiciones de humedad apropiadas. Se dejan incubar a temperatura ambiente, 1 semana.

Figura 2: Proceso de infección de naranja sana. A) Se realiza un control negativo colocando agar estéril a una naranja. B) Se infecta otra naranja utilizando el hongo previamente aislado.

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3. Pasado el tiempo de incubación se estudia el estado de las naranjas. La naranja control no debería estar contaminada, en cambio la otra naranja estará infectada por Penicillium. 4. Por último se repetirá el paso 1 utilizando como muestra la naranja que hemos infectado experimentalmente en el paso 2. EXPLICACIÓN: Esta actividad trata de acercar un experimento histórico a los alumnos, de manera segura y factible (por coste y sencillez). Koch utilizó ratones para estudiar la infección para demostrar que la bacteria Bacillus anthracis era la causante del carbunco. En este caso se sustituyen los ratones por naranjas y el microorganismo patógeno es el hongo Penicillium digitatum. El primer postulado es la constatación de que las naranjas con película de moho blanquecino-verdoso en la piel están infectadas por P. digitatum. En el primer paso (2º postulado de Koch), trasladamos tanto las células vegetativas como las esporas del hongo a una placa apropiada para su crecimiento. Así tendremos un cultivo único de ese hongo aislado de una naranja infectada. Para comprobar que este hongo produce la infección (3º postulado), ponemos en contacto el hongo aislado en placa con una naranja sana (y con la piel limpia de contaminantes) observando que se desarrolla el mismo tipo de moho/hongo sobre la piel de naranja. Para realizar la última comprobación (4º postulado) aislamos el moho patógeno de la naranja que hemos infectado nosotros en otra placa de agar. Una vez incubada dicha placa se puede comparar el aspecto de esta con la placa inicial de donde obtuvimos el patógeno. ESTIMACIONES: En la práctica científica sería necesario tener varias réplicas del experimento y estimar estadísticamente si la infección se ha producido por azar o porque lo hemos provocado nosotros. Pero la finalidad de esta actividad es meramente intuitiva y para la visualización del proceso, así que no haría falta. APLICACIONES: La demostración de Koch supuso un antes y un después en la historia de la ciencia y un gran impacto en la sociedad, ya que se demostró que existían seres microscópicos que eran causantes de las enfermedades y por lo tanto se podían combatir siguiendo medidas de asepsia, que en algunos casos eran muy sencillas como lavarse las manos o hervir el material (alimentario, quirúrgico etc.). Esto mejoró notablemente la calidad vida y supervivencia de las personas. PREGUNTAS: ¿Por qué tenemos que esterilizar el asa de siembra y manipular las placas cerca de la llama?, ¿por qué añadimos arena húmeda al recipiente donde se incuban las naranjas infectadas?, ¿porqué es necesario tener muestras de control negativo en un experimento, por qué se estropean todas las naranjas de un cesto y dejamos una infectada con el hongo entre ellas? Incl uir

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REFERENCIAS: 1. http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00219266.2010.9656221. (Artículo de investigación) 2. Prescott, Harley & Klein (2004). Microbiología. McGraw-Hill interamericana. (Libro de consulta) 3. http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/odonto/GuiaMicrobiologiaOdontologia.pdf