Marianella QuezadaClara Pritsch

Jornada Técnica en Biotecnología ForestalINIA Tacuarembó 2012

¿Por qué hacer estudios genómicos en mirtáceas nativas en Uruguay?Dos ejemplos.

Genómica

¿Cuáles son las diferencias y semejanzas en el ADN entre individuos de diferentes especies, poblaciones, tipos de plantas?

¿Cómo está organizado físicamente (estructura) el genoma de una especie?

¿Cuáles regiones en el ADN contienen los genes responsables de la expresión de una característica agronómica productiva en particular como : sabor de fruta, largo de ciclo etc?

Algunas preguntas que estudia la Genómica

La genómica de las mirtáceas está en gran desarrollo

¿Cuáles son los individuos portadores de información genética mas favorable?

Se enfoca al estudio de la información codificada en el ADN de un individuo

Distribución de la familia Myrtaceae

Adaptado de Heywood 1996

Organización de las mirtáceas en tribus

Mirtáceas nativas (33)

Mirtáceas exóticas

E. g

rand

is

E. g

lobu

lus

Ara

záPi

tang

aG

uaya

bo

Grattapaglia, 2012

La importancia económica de esta familia ha incentivado la realización de estudios genómicos pero con nivel de desarrollo variable.

Importancia económica

Producción de fruta fresca

Especies

AceitesFuente madera o fibra

Psidium guava Pimenta dioica

Melaleuca alternifoliaEucalyptus grandis

Como todo proceso generador de conocimiento los énfasis en los estudios genómicos se balancean entre:

Eucalyptus género pilar en la exploración del genoma:

Desarrollo del primer mapa de ligamiento para una especie leñosa. Actualmente mapas altamente saturados

Publicación del primer genoma de referencia completamente anotado (E. grandis, BRASUZ1) (2012)

Identificación de genes asociados a caracteres de interés: crecimiento y propiedades de la madera, resistencias a estrés biótico y abiótico

EXPLORACION VS. EXPLOTACION

Estudios genómicos

Conocimiento Herramientas

Genómica estructural

Tamaño del genoma

Número de genes

Variantes alélicas

Familia de secuencias repetidas

Organización de la información genética

Localización de genes y QTLs asociados a caracteres de interés (formación de madera, estrés biótico y abiótico, propagación vegetativa)

Mapas genéticos

Mapas físicos

Mapas funcionales

Bibliotecas genómicas

Microarreglos (DArT, SFPs)

Borrador del genoma ensamblado de E. grandis

Genómica funcional

Catalogo y perfil de expresión de genes vinculados a: estrés por frío, formación de madera, resistencia a enfermedades, metabolismo secundario

Identificación de genes candidatos

Base de datos de EST

Validación de la función propuesta del gen candidato:

Exploración de la información genómica en Eucalyptus

Manejo de poblaciones

Diversidad genética, prueba de paternidad, estimación de heterocigosis, identificación de clones

Selección asistida por marcadores

Con dificultades de implementación en familias poco relacionadas

Selección genómica

Resultados preliminares prometedores

Tecnología transgénica

Tolerancia a helada

Explotación de la información genómica en Eucalyptus

Grattapaglia, 2004

Ejemplo: explotación de la información genómica

Situación de los estudios genómicos en otras mirtáceas

Adaptado de Grattapaglia 2012

Cam

pom

anes

ia ad

aman

tium

Con

teni

do 1

C d

e A

DN

(pg)

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

Euca

lyptu

s gra

ndis

Euca

lyptu

s gra

ndis

Euca

lyptu

s glob

ulus

Euca

lyptu

s glob

ulus

Euca

lyptu

s uro

phyll

a

Euca

lyptu

s uro

phyll

a

E. c

amald

ulens

is

Cory

mbia

citri

odor

a

Euge

bnia

uniflo

ra

Myr

ciaria

glaz

iovian

a

Acca

sello

wian

a

Acca

ra e

legan

s

Calyp

trant

hes b

rasil

iensis

Gom

idesia

affin

s

Pim

enta

idoic

a

Psidi

um g

uajav

a

Psidi

um g

uajav

a

P . a

cuta

ngulu

m

P.

cattle

ianum

Guayabo del país (Acca sellowiana)

E. grandis

E. globulus

Guayabo brasilero (Psidium guajava)

Eucalypteae Myrteae

Arazá(Psidium cattleianum)

Tamaño del genoma en mirtáceas

Guayabo del país (Acca sellowiana)

Buena producción de fruta

Fruto con propiedades nutracéuticasVitamina C, Iodo

Rico en bioactivos con propiedades biomédicas (Bontempo et al., 2007)

Integrante de la comunidad de especies que comparte microorganismos beneficiosos y patógenos con Eucalyptus

• anti-oxidante

• antimicrobiana

• anti-cancerígena

• anti-inflamatoria

• inmunoestimulante

Cultivares

Sistemas de producción

Sistemas de propagación

Manejo de post-cosecha

Marketing

Integración al sistema productivo

DESARROLLO TECNOLÓGICO

• Prospección e Instalación de materiales en la EFFAS para evaluación de caracteres agronómicos

Liberación de cultivares adaptados a nuestras condiciones locales

• Selección de genotipos destacados por calidad de fruta (tamaño, sabor, productividad)

• Especie prioritaria en el Programa de Selección de Frutas Nativas (FA-UdelaR, INIA, Dirección Forestal-MGAP)

• Realización de cruzamientos dirigidos entre padres seleccionados, con el fin de identificar genotipos recombinantessuperiores

…en Uruguay

Diferentes estrategias de análisis genómico como apoyo al mejoramiento genético

Algunas características de A. sellowiana que facilitan los análisis genéticos

• Se cuenta con material , de buen adaptación, genéticamente elite diverso

• Diploide

• Numero cromosómico conocido 2n = 22

• Genoma pequeño

• Especie alógama, con facilidad para realizar cruzamientos

• Gran producción de semillas por frutos

• Corto período juvenil

• Optimización de metodologías de propagación vegetativa

• Mapas genéticos disponibles en especies emparentadas (Eucalyptus spp, Psidium guajava,)

Un nuevo desafío:

Profundizar en la exploración del genoma de A. sellowiana

Proyecto Hacia la caracterización de la estructura del genoma de Acca sellowiana: abordajes genéticos, citológicos y moleculares (2009-2011)

¿Que hemos aprendido estudiando el ADN de las diferentes colecciones de guayabo del país?

ALTA DIFERENCIACION GENETICA ENTRE POBLACIONES

(Baccino, 2011)

CUATRO POBLACIONES (PLANTAS SILVESTRES)

JARDIN DE INTRODUCCION- EEFAS(PLANTAS SELECCIONADAS)

AMPLIA (Y NOVEDOSA) DIVERSIDAD GENETICA ENTRE PLANTAS DE ALTO VALOR AGRONOMICO

(Quezada, 2008)

1. Confirmar el tamaño del genoma del guayabo (contenido total del ADN) con ejemplares de Uruguay

El genoma de A. sellowianaes pequeño.

1C = 0,37pg

Es tres veces menor que el genoma de Eucalyptus

Tamaño del genoma (contenido de ADN en pg)

Metodología: citometría de flujo

0,37 pg

Con

teni

do 1

C d

e A

DN

(pg)

Número de cromosomas

Se confirmó el número cromosómico esperado de 2n = 22.

Todos los cromosomas son metacéntricos con un largo entre 0.74 μm y 2.46 μm.

El par cromosómico 4 se distingue por presentar una región satelital

2. Determinar si existe variación en el número de cromosomas presentes en el genoma dentro de la especie

3. Caracterizar los cromosomas de acuerdo a su morfología y distribución de secuencias de ADN eucromáticas y heterocromáticas

Foto: C. Mazzella

Identificación de sitios específicos en el genoma de A. sellowiana

Utilizando diferentes técnicas de análisis de ADN se detectaron en total 299 marcadores moleculares (cada marcador señala un sitio en el genoma).

4. Identificar secuencias de ADN reconocibles, como señalizadores de sitios específicos en el genoma (marcadores moleculares).

5. Identificar en el genoma la localización de dichos marcadores y generar un mapa genético que describa dicha información

Construcción de mapa genético

• Cruzamiento biparental entre padres contrastantes en caracteresmorfológicos y productivos, que mostraron polimorfismo en los 299 marcadores seleccionados.

•Progenitores heterocigotos, Programa de mejoramiento genético

• Cruzamiento dirigido oct-2008

• Población F1 de 160 individuos sembrados a campo mayo-2009

♀ ♂ BRTCO

X

Población de mapeoCaracterística TCO BROrigen Silvestre Huerta comercialTamaño de fruta Pequeña GrandeColor cáscara Amarilla brillante Verde oscuraGrosor cáscara Muy fina GruesaSabor Muy bueno Sin saborPulpa Fundente No fundenteDesarrollo Bueno BuenoProductividad Muy bueno Muy bueno

Beatriz VignaleF1 (Salto, EEFAS)

Características Mapa Integrado TCO x BR

Número de marcadores mapeados 224Grupos de ligamiento 38Largo total del mapa (cM) 2927,9Largo del grupo mayor (cM) 448,1Largo del grupo menor (cM) 6,4Largo promedio de grupos 77,1Distancia promedio entre marcadores (cM) 16, 0Densidad de marcadores (cM/numero marcadores) 13,1

Ordenamiento de las regiones genómicas definidas por los marcadoresmoleculares definiendo un mapa genético (pseudo test cross, OneMap)

Mapa integrado

E_AAC/M_CTC_291.88_D1.130.0AG8TA_14_C819.6E_AAT/M_CAG_86.27_C839.1E_AAT/M_CAG_122.38_C863.0E_AAT/M_CAG_55.39_C875.4E_AAT/M_CCG_147.9_D2.1886.1E_ACG/M_CAC_106.63_C897.6E_AAC/M_CTC_83.31_C8119.3E_AAC/M_CTA_100.79_C8140.7E_AAT/M_CAG_258.9_C8143.1E_AAC/M_CTA_101.95_D2.18144.5E_AAT/M_CAC_307.87_C8169.2E_ATG/M_CAG_280.68_C8180.4E_ATG/M_CAG_356.11_C8186.0E_ATG/M_CAG_299.63_D2.18186.8E_ATG/M_CAG_190.54_C8200.6E_ATG/M_CAG_116.34_D2.18225.3E_AAT/M_CAC_237.24_C8233.9E_AAT/M_CTC_77.5_C8237.9E_AAT/M_CAC_283.11_C8248.4E_AAC/M_CTC_181.28_C8258.9E_ATG/M_CAG_169.32_C8269.1E_ACG/M_CTA_205.05_D2.18280.4E_ACG/M_CTA_201.17_D2.18307.3E_ACG/M_CTA_68.09_D2.18335.9E_AAC/M_CGA_294.01_D1.13336.0E_AAT/M_CGA_230.63_D1.13353.9E_ACG/M_CCG_101.85_D1.13373.6E_ACG/M_CCG_72.68_D1.13 E_AAT/M_CAC_238.03_D2.18388.1E_AAT/M_CAC_236.02_D2.18402.7AG8TA_03_D1.13428.7

1

CT8AG_08_C80.0CT8AG_01_D1.1322.9E_ACA/M_CAC_395.28_C853.4E_AAT/M_CTA_213.19_C866.8E_AAT/M_CTA_162.0_C874.5E_AAC/M_CGA_290.38_C884.3E_AAC/M_CGA_403.59_C894.5E_ATG/M_CCG_124.7_D2.1899.9E_AAC/M_CGA_360.54_C8109.3E_AAT/M_CCG_296.43_C8123.6E_ACG/M_CCG_81.08_C8132.7E_ACG/M_CGA_129.97_C8137.6E_ACA/M_CAA_130.48_C8151.9E_ACA/M_CAC_269.64_C8171.5E_ACG/M_CCG_441.32_C8198.9E_AAC/M_CGA_243.7_D1.13220.2E_AAC/M_CGA_322.81_C8225.6E_ACA/M_CAA_155.07_C8242.4E_AAC/M_CAA_368.76_C8261.0E_ATG/M_CTT_195.66_C8261.1E_AAC/M_CGA_312.98_D1.13282.0E_AAT/M_CAG_72.8_C8295.9E_ATG/M_CCG_85.23_C8315.7E_ATG/M_CTT_164.44_C8330.5E_AAC/M_CGA_173.58_C8349.5E_AAT/M_CCG_187.61_D2.18355.2E_ACA/M_CAA_86.96_C8360.4E_AAC/M_CTA_77.25_C8378.6E_AAT/M_CCG_88.3_C8400.8E_ATG/M_CTT_324.73_D2.18414.5E_ACG/M_CTC_56.6_C8426.1E_ACG/M_CTC_59.12_C8448.1

2

E_AAT/M_CGA_89.6_C80.0E_AAT/M_CGA_80.96_C814.1E_ACG/M_CTC_72.64_C829.7E_ATG/M_CAC_175.47_C863.5E_ATG/M_CAC_328.23_C883.0E_ATG/M_CAC_128.69_C897.7E_ATG/M_CAC_130.95_D1.13 E_ATG/M_CAC_206.14_C8101.5E_ATG/M_CAC_235.89_C8120.9E_ATG/M_CAC_133.14_C8 E_ATG/M_CAC_157.25_D1.13136.0E_ATG/M_CAC_298.71_C8141.7E_ATG/M_CAC_164.04_C8153.4E_ATG/M_CAC_113.58_C8160.3E_ATG/M_CAC_54.66_D1.13176.0E_ATG/M_CAC_102.73_C8188.2E_ACG/M_CCG_162.2_C8215.4E_ATG/M_CTT_381.14_D1.13235.3E_ATG/M_CTT_152.09_C8237.5E_ATG/M_CTT_222.78_C8243.7E_ATG/M_CCG_109.39_C8254.0E_ACA/M_CAA_144.34_C8262.0E_AAT/M_CTA_72.04_C8274.2E_AAT/M_CCG_132.34_C8285.5

3

CT8TG_03_D1.130.0

GACAC3T_07_D1.1342.1

E_ACG/M_CGA_152.64_D1.1371.6E_ACG/M_CCG_234.94_D1.1379.5CT8TG_01_D2.18100.7CT8TG_04_D2.18113.8CT8TG_08_C8136.2

E_AAT/M_CTA_411.89_C8171.8CT8TG_02_C8181.5E_ATG/M_CCG_451.11_C8196.9E_ATG/M_CCG_449.66_C8203.2E_ATG/M_CCG_404.38_C8217.5

E_ATG/M_CCG_258.29_C8250.3E_AAT/M_CCG_257.31_D1.13260.6

E_AAC/M_CTA_479.5_D1.13291.6E_ACG/M_CAC_152.2_D2.18317.9E_AAT/M_CCG_137.52_D2.18331.0E_AAT/M_CCG_222.05_D2.18334.4

4

E_AAT/M_CTA_200.07_D2.180.0E_AAC/M_CAA_79.03_C817.0E_ATG/M_CCG_414.39_D2.1838.9

E_ACA/M_CAC_267.56_D2.1864.3

E_AAC/M_CTA_209.08_C8104.9E_AAC/M_CGA_86.1_C8129.0E_AAC/M_CGA_114.75_D2.18139.5E_AAC/M_CGA_149.84_C8151.8E_ATG/M_CCG_177.67_D2.18172.0

E_ACA/M_CAC_120.02_D2.18206.9E_AAT/M_CTA_116.03_C8213.2

5

E_AAT/M_CAC_77.61_C80.0E_AAT/M_CAC_78.71_C829.3E_AAT/M_CAC_97.74_C843.1E_AAT/M_CAC_66.91_C859.6E_AAC/M_CTC_101.69_C879.7E_AAC/M_CTC_75.73_C887.5E_AAC/M_CTC_97.74_D1.1398.8E_AAC/M_CTC_77.1_C8105.7

E_AAC/M_CTC_166.91_C8136.1

E_AAT/M_CAC_116.82_C8166.7E_AAT/M_CAC_414.06_D2.18177.8

6

E_ACG/M_CTC_315.96_D2.180.0

Ase04_A436.3

CT8GG_06_D2.1863.2E_ACA/M_CAC_300.42_D1.1373.9E_ACG/M_CGA_142.11_D2.1891.0

E_ACG/M_CTC_306.76_D2.18115.9

7

GACAC3_09_D2.180.0E_ACG/M_CTC_204.58_D2.1824.3E_ACG/M_CTC_115.35_C831.8E_ACG/M_CTC_216.63_D1.1333.5EMBRA72_D1.936.7

8

GACAC3_02_D2.180.0

E_ACA/M_CAC_131.15_D2.1827.5E_ATG/M_CCG_69.74_D2.1836.6E_ACA/M_CAC_115.27_D2.1857.7E_ACG/M_CTC_450.29_C872.3

9

AG8CA_01_D1.130.0E_ACG/M_CGA_145.87_D1.139.0E_AAC/M_CGA_257.77_D1.1316.0Ase19_D1.919.5

10

E_AAC/M_CGA_215.19_D2.180.0E_ACA/M_CAA_107.3_C811.8E_ACG/M_CTC_123.08_D2.1832.9E_ACA/M_CAC_335.99_D2.1846.8

11

E_AAT/M_CAC_152.24_C80.0E_AAC/M_CTC_164.54_D2.1827.2E_AAT/M_CAC_121.23_C830.0E_AAT/M_CAC_64.35_C846.9

12

E_AAT/M_CTA_82.67_C80.0E_AAC/M_CAA_324.55_D2.1819.6E_AAC/M_CGA_185.61_C819.9E_ACA/M_CAC_176.74_C836.8

13

AG8CA_04_C80.0AG8CA_01_C821.4AG8CA_05_C839.7AG8CA_09_C856.3

14

CT8AG_02_D2.180.0CT8AG_05_C82.0CT8AG_09_C830.2

CT8AG_11_C853.6

15

Mapa integrado

Transferencia exitosa de marcadores microsatélites de Eucalyptus (EMBRA) en A. sellowiana.

Comparación de mapas de guayabos

Especie P. guajava A. sellowianaNo cromosómico 2n = 22 2n = 22Contenido 2C ADN (pg) 0,551 0,503Tipo marcadores AFLP, SSR ISSR, AFLP, SSRNo marcadores mapeados 578 (42 %) 224 (75 %)No grupos de ligamiento 11 38Largo total del mapa (cM) 2179,0 2927,9Largo promedio de grupos (cM) 198,1 77,1Rango largo de grupos (cM) 165, 7 – 232,5 6,4 – 448,1Densidad de marcadores 3,8 13,1

Referencia Lepitre et al., 2010 Este trabajo

Estudios biológicos y taxonómicos en la especie frutal nativa Psidium cattleianum

Speroni G., et al.

CSIC I+D (2011-2014)

• Buena adaptación

• Buena producción de fruta

• Alta variabilidad intraespecífica

• Reproducción por semilla

•Citotipos reportados en la literatura 2n= 44, 66, 77 y 88

•No se conoce la diversidad genética de las poblaciones silvestres en Uruguay

•Sistema reproductivo poco estudiado. Especie potencialmente apomíctica

Arazá (Psidium cattleianum)

Color fruto Origen 2n Ploidía Contenido ADN 1C (pg)

amarillo Uruguay 88 8x 2,1

rojo Uruguay 88 8x 1,9

El genoma de Arazá es casi 8 veces mayor que el de guayabo

Tamaño del genoma y número cromosómico en P. cattleianum

Aplicaciones:

Estudio de diversidad genética de las poblaciones silvestres de arazá

Dilucidación del sistema reproductivos mediante análisis genéticos de la progenie de cruzamientos dirigidos

Identificación de marcadores moleculares en el genoma de P. cattleianum

Cruzamientos (Vignale, B.)Prospección (Speroni, G.)

Desarrollo de marcadores moleculares microsatélites en arazá mediante transferencia desde otras Mirtáceas

Origen de los iniciadores microsatélites

No de microsatélites         evaluados

No de microsatélites exitosamente transferidos

Psidium guajava     (Lepitre et al., 2010)

15 11

Acca sellowiana       (Santos et al., 2008)

13 7

Myrciaria dubia          (Rojas et al., 2008)

8 5

TOTAL 36 23

QUE SIGUE?

Continuar las actividades de exploracióndel genoma para ampliar el área explorada

nuevas estrategias (nuevos marcadores)

EXPLORACION

UTILIZACION/EXPLOTACION•Encontrar asociaciones entre secuenciasde ADN y funciones biológicas, caracteres productivos, riqueza de compuestosnutracéuticos, biomédicos.

•Desarrollar herramientas que faciliten elMejoramiento genético

Clara PritschMarianella QuezadaPaula Silva

Gabriela Speroni

Patricio Hinrichsen

Gonzalo Ravest

Dr. AAF García

Onofre Nodari

Karine dos Santos

Cristina MazzellaPaola GaieroSandra Vázquez

Beatriz VignalePamela Lombardo

Danilo Cabrera

Gracias…