pontificia universidad javeriana maestria en ciencias

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS

EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN DE Kappa CARRAGENINA A PARTIR DE Hypnea musciformis

GLADYS ROZO TORRES

TRABAJO DE TESIS Presentado como requisito parcial

Para optar el título de Maestría en Ciencias Biológicas

MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS

Bogotá D.C. Noviembre de 2006.-

14

NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.” Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946.

15

EXTRACCION Y CARACTERIZACIÓN DE KAPPA CARRAGENINA OBTENIDAA PARTIR DE Hypnea musciformis

GLADYS ROZO TORRES

APROBADO _____________________ ______________________ Balkys Quevedo Hidalgo. Alvaro Orjuela Ingeniera Química Ingeniero Químico. Directora Universidad . Nacional de Colombia Jurado 1

_____________________ ___________________ Alba Alicia Trespalacios . Enrique Javier Peña S. PhD Profesora Director Programa de Postgrado Departamento de Microbiología Ciencias-Biología Pontificia Universidad Javeriana Universidad del Valle Jurado 2 Jurado 3

16

A mi hija Laura Bibiana:

Porque el tiempo invertido

en esta investigación, era tuyo,

siempre lo entendiste.

Gracias.

17

Agradecimientos A la profesora Balkys Quevedo por su apoyo y acertada dirección

durante todo el tiempo que duró la investigación.

Al Doctor Carlos Cardona director del Departamento de Ciencias

Básicas de la Universidad Jorge Tadeo Lozano por su apoyo

incondicional.

A Fabián Pescador, estudiante de tesis de la carrera de Biología

Marina, de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, quien arduamente

colaboró en la recolección e identificación de las muestras de algas

utilizadas en la investigación.

A Mauricio Rozo por la digitalización de mapas y la ubicación en el

Sistema de Información Geográfico SIG.

A Claudia Rozo por su constante ayuda, por sus valiosas críticas y

aportes a la investigación, por el soporte económico del proyecto y el

empeño que siempre mostró para la culminación del trabajo.

A Ligia Rodríguez por su colaboración en el proyecto y aporte de

algunos reactivos, sin los cuales no se habría culminado el trabajo.

A la empresa Química Aromática Andina, quien nos facilitó el

equipo para los análisis de textura.

A la paciencia de Edgar y Bibiana, que estuvieron muchas horas sin

mí, para que pudiera culminar con éxito esta investigación

18

INDICE GENERAL

1. Introducción 13

2. Antecedentes bibliográficos 14

2.1 Definición de carrageninas 14

2.2 Mecanismo de gelificación de la carragenina 15 2.3 Propiedades de la carragenina 17 2.3.1 Solubilidad de la carragenina 17

2.3.2 Viscosidad de la carragenina 18

2.3.3 Temperaturas de Fusión y gelificación 19

2.3.4 Fuerza de gel 19

2.3.5 Perfil de textura 21

2.3.6 pH 22

2.3.7 Reactividad frente a las proteínas 23

2.3.8 Espectro Infrarrojo 23

2.4 Aplicaciones comerciales de kappa carragenina 24

2.5 Fuentes de carrageninas 28

2.6 Fuentes de kappa carragenina 30

2.7 Mercado de la kappa carragenina en el mundo 32

2.8 Hypnea musciformis 33

2.8.1 Clasificación taxonómica de Hypnea musciformis 33

2.8.2 Factores que influyen en el contenido de kappa

Carragenina en Hypnea musciformis 34

2.8.3 Ciclo de vida de Hypnea musciformis 36

2.8.4 Pigmentos celulares de Hypnea musciformis 37

2.8.5 Polisacáridos de reserva en las algas rojas 40

2.9 Extracción de kappa carragenina 42

3 Materiales y métodos 50

3.1 Reactivos y equipos 50

3.2 Muestreo 50

3.2.1 Muestreo en la Bahía de Santa Marta 51

3.2.2 Muestreo en el Cabo de la Vela- Guajira 54

3.3 Ensayos Experimentales 55

3.3.1 Análisis de aguas 55

3.3.2 Muestras de algas 56

3.3.3 Extracción y purificación de carragenina 56

3.3.3.1 Decoloración 56

19

3.3.3.1.1 Método de peróxido de hidrógeno 57

3.3.3.1.2 Método de carbón activado 59

3.3.3.1.3 Decoloración con largos períodos de hidratación 61

3.3.3.1.4 Método del hipoclorito de sodio 63

3.3.3.2 Extracción de carragenina 65

3.3.3.3 Precipitación 65

3.3.3.4 secado 66

3.3.4 Determinación de las propiedades fisicoquímica 66

3.3.4.1 Análisis de elementos pesados por Absorción atómica 67

3.3.4.2 Punto de gelificación 67

3.3.4.3 Punto de Fusión 68

3.3.4.4 Espectro Infrarrojo 68

3.3.4.5 Análisis de textura del gel de carragenina 69

3.3.4.6 Determinación de Humedad 69

3.3.4.7 Determinación de proteína 70

3.3.4.8 Determinación de la presencia de almidón floridean 71

3.4 Diagrama general de procedimientos 72

3.5 Programa estadístico de soporte 72

3.6 Diseño Experimental 72

4 Resultados y análisis de resultados 75

4.1 Análisis de aguas 75

4.2 Decoloración de la muestra de algas 75

4.2.1 Decoloración con peróxido 76

4.2.2 Decoloración con carbón activado 77

4.2.3 Decoloración con largos períodos de hidratación 77

4.2.4 Decoloración por tratamiento con hipoclorito de sodio 77

4.3 Extracción de kappa carragenina 80

4.4 Precipitación 82

4.5 Secado 83

4.6 Rendimiento de kappa carragenina 85

4.7 Caracterización fisicoquímica de la carragenina 88

4.7.1 Espectro Infrarrojo 88

4.7.2 Punto de gelificación 91

4.7.3 Punto de fusión 93

4.7.4 Análisis de textura 97

4.7.5 pH 109

4.7.6 Humedad 111

4.7.7 Cenizas 112

20

4.7.8 Análisis de absorción atómica 113

4.7.8.1 Absorción atómica para la muestra de algas 113

4.7.8.2 Absorción atómica para las muestras de carragenina 113

4.7.8.2.1 Análisis del contenido de sodio en kappa carragenina 114

4.7.8.2.2 Análisis del contenido de potasio en kappa

carragenina 115

4.7.8.2.3 Análisis del contenido de Calcio en

kappa carragenina 117

4.7.8.2.4 Análisis del contenido de Magnesio en


4.7.8.2.5 Análisis del contenido de Hierro en


4.7.8.2.6 Análisis del contenido de Manganeso en


4.7.8.2.7 Análisis del contenido de Cobre en


4.7.8.2.8 Análisis del contenido de Cinc en


4.7.9 Almidón Floridean 127

4.7.10 Proteína 127

5 Conclusiones y recomendaciones 129

6 Bibliografía 134

7 Anexos

7.1 Anexo de tablas de Resultados

7.2 Anexos estadísticos

21

INDICE DE TABLAS

Tabla No 1 Cationes inorgánicos determinados en

Kappaphycus alvarezii: 14

Tabla No 2 Absorción en el Infrarrojo de las diferentes carrageninas 23

Tabla No 3 Usos de carragenina en alimentos 25

Tabla No 4 Algunos ejemplos de Carragenophytas 29

Tabla No 5 Fuentes de carragenina por países 31

Tabla No 6 Métodos AOAC utilizados en el análisis de aguas 55

Tabla No7 Diseño experimental de un factorial de dos factores 73

Tabla No 8 Análisis de aguas 75

Tabla No 9 kappa carragenina obtenida en función de

la especie y el pH 85

Tabla No 10 Puntos de gelificación para muestras de carragenina Anexo 7

Tabla No 11 Puntos de Fusión de la carragenina Anexo 7

Tabla No 12 Fuerza de gel de la carragenina

en solución 1,5% de KCl Anexo 7

Tabla No 13 Fuerza de gel de la carragenina

en solución 0,5% de KCl Anexo 7

Tabla No 14 Pendientes de los ensayos de perfil de textura del

gel kappa carragenina preparado en solución al 1,5% de KCl 108

Tabla No 15 Estudio de correlación Fuerza de gel elasticidad Anexo 7

Tabla No 16 pH de la carragenina Anexo 7

Tabla No 17 Humedad en muestras de carragenina Anexo 7

Tabla No 18 Porcentaje de cenizas determinado en dos especies de algas 112

Tabla No 19 Análisis de absorción atómica para dos especies de algas 113

Tabla No 20 Contenido de sodio en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 21 Contenido de Potasio en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 22 Contenido de Calcio en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 23 Contenido de Magnesio en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 24 Contenido de Hierro en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 25 Contenido de Manganeso en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 26 Contenido de Cobre en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 27 Contenido de Cinc en kappa carragenina Anexo 7

Tabla No 28 Contenido de proteína en el alga y en kappa carragenina 128

Tabla No 29 Resumen de las propiedades fisicoquímica de kappa carragenina 129

22

INDICE DE FIGURAS

Figura No 1 Tipos de carrageninas 15

Figura No 2 Mecanismo de gelificación de kappa carragenina 16

Figura No 3 Variación de la fuerza de gel en función de la concentración

de kappa carragenina 20

Figura No 4 Curva obtenida en un perfil de textura de un gel de carragenina 21

Figura No 5 Principales Especies de algas utilizadas en la

producción de carragenina 28

Figura No 6 Estructura de kappa carragenina 30

Figura No 7 Hypnea musciformis 33

Figura No 8 Clorofilas presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 38

Figura No 9 Carotenos presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 39

Figura No 10 Ficobilinas presentes en la pared celular de Hypnea musciformis 40

Figura No 11 Estructura del almidón Floridean 41

Figura No 12 Métodos para la extracción de carragenina 43

Figura No 13 Método para la obtención de carragenina refinada 45

Figura No 14 Área de muestreo en la playa adyacente al aeropuerto Simón Bolívar 52

Figura No 15 Lugar de muestreo, playa aeropuerto Simón Bolívar 53

Figura No 16 Ubicación de la playa de Muestreo bahía de Santa Marta 53

Figura No 17 Ubicación de la playa de muestreo en el Cabo de la Vela Guajira 55

Figura No 18 Diagrama de flujo que muestra la extracción de carragenina

usando peróxido de hidrógeno para retirar el color 58


usando carbón activado de hidrógeno para retirar

el color después de la extracción 60


usando largos períodos de hidratación para retirar el

color antes de la extracción 62

Figura No 21 Diagrama de flujo que muestra la extracción de

carragenina usando Hipoclorito de sodio para

retirar el color antes y después de la extracción 64

Figura No 22 Diagrama general del procedimiento para la extracción de kappa

Carragenina 74

Figura No 23 Muestras de kappa carragenina obtenidas con diferentes

tratamientos de decoloración 79

Figura No 24 Precipitación de kappa carragenina con etanol al 95% 82

23

Figura No 25 Kappa carragenina purificada y filtrada 83

Figura No 26 Aspecto que adquiere un gel de kappa carragenina de acuerdo

con el método de secado 26

Figura No 27 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por especie 87

Figura No 28 Resultados obtenidos en la extracción de

carragenina por pH 87

Figura No 29 Dímero de la estructura básica de la kappa carragenina 89

Figura No 30 Espectro Infrarrojo de kappa carragenina extraída de

Hypnea musciformis a pH 8,6 90

Figura No 31 Estudio del punto de gelificación en función de la especie 91

Figura No 32 Estudio del punto de gelificación en función del pH 92

Figura No 33 Estudio del punto de fusión de kappa carragenina en función del pH 94

Figura No 34 Estudio del punto de fusión de kappa carragenina en función de la

especie 95

Figura No 35 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina en función de la

Especie 98

Figura No 36 Estudio la fuerza de gel de kappa carragenina en

KCl al 1,5% en función del pH de tratamiento 100

Figura No 37 Perfil de textura para la muestra de carragenina

obtenida a partir de Hypnea musciformis 101


obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 10 102


obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 9,0 103


obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 8,6 104

Figura No 41 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina preparado

en soluciones de KCl al 0,5% 105

Figura No 42 Estudio de la fuerza de gel de kappa carragenina preparado

en soluciones de KCl al 0,5% en función del pH de extracción 106

Figura No 43 Perfil de textura para la muestra de kappa carragenina

Obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta pH 9,0 107

Figura No 44 Determinación del pH final de kappa carragenina obtenida

de cada especie de alga 110

Figura No 45 Variación del pH final de kappa carragenina obtenida

de cada especie de alga en función del pH de extracción 110

Figura No 46 Determinación de la humedad de kappa carragenina

en función de la especie 111

24

Figura No 47 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de dos especies de algas 114

Figura No 48 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa

carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 115

Figura No 49 Análisis de absorción atómica para potasio en las muestras de kappa


Figura No 50 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa

carragenina obtenida a partir de algas diferentes 117

Figura No 51 Análisis de absorción atómica para Calcio en las muestras de kappa


Figura No 52 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa


Figura No 53 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa


Figura No 54 Análisis de absorción atómica para Hierro en las muestras de kappa




Figura No 56 Análisis de absorción atómica para Manganeso

en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir

de algas diferentes 122

Figura No 57 Análisis de absorción atómica para Manganeso

en las muestras de kappa carragenina obtenida a

tratamientos de pH diferentes 123

Figura No 58 Análisis de absorción atómica para Cobre


partir de algas diferentes 124



Figura No 60 Análisis de absorción atómica para Cinc


partir de algas diferentes 126

Figura No 61 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 127

25

1. Introducción Esta investigación está enmarcada en el área de la bioprospección,

e involucra el desarrollo de nuevos productos a partir de los recursos

marinos colombianos, y su potencial explotación comercial o industrial.

Las algas en su metabolismo generan compuestos de estructuras

complejas y novedosas, que pueden ser aprovechados por el hombre, por

ejemplo en la producción de aditivos industriales entre los cuales se

destacan las kappa carrageninas que son agentes gelificantes de amplia

utilización en la industria.

En contraste con los abundantes estudios realizados sobre

taxonomía y distribución geográfica de algas en los mares colombianos,

son muy escasos los estudios realizados sobre usos y aprovechamiento

comercial.

La kappa carragenina forma geles termoreversibles de altas

cualidades espesantes y gelificantes que le confieren un lugar

económicamente importante en el país, por ejemplo muchas

preparaciones en la industria de alimentos dependen únicamente de las

propiedades funcionales de este hidrocoloide, para lograr una buena

calidad y aceptables propiedades organolépticas. De otro lado la alta

capacidad de absorción y la buena fuerza de gel sitúan a la kappa

carragenina como un potencial gel hidroretenedor de agua y nutrientes, con

menos sensibilidad a las soluciones salinas que los geles comerciales y con

grandes ventajas medioambientales en la industria Agrícola ya que su

estructura de polisacárido y su origen vegetal lo hacen un buen sustrato en

procesos de germinación o en cultivos que requieran grandes cantidades de

agua, además este soporte es biodegradable.

26

Kappa carragenina se puede extraer de Hypnea musciformis, un

alga nativa del Caribe colombiano, que ha mostrado altos contenidos del

polisacárido (Berchez et al, 1993) y es la primera vez que se usa en

Colombia para la extracción de un valioso polisacárido

El objetivo del trabajo fue diseñar un método para la extracción de

kappa carragenina partir de Hypnea musciformis y caracterizar el producto

mediante la determinación de las propiedades fisicoquímicas del

polisacárido.

Se estudió la influencia de las condiciones de crecimiento sobre el

contenido y la calidad de carragenina en Hypnea musciformis, para lo cual

se usaron dos muestras provenientes de lugares distantes Santa Marta y el

Cabo de la Vela.

Se compararon los resultados obtenidos con muestras de

Kappaphycus alvarezii, un alga exótica que se caracteriza porque presenta

buenos rendimientos de kappa carragenina

27

1. Antecedentes Bibliográficos 2.1 Definición de las Carrageninas

El término carragenina hace parte de una familia de polisacáridos

lineales formados por unidades de D- galactosa- sulfatada en diferentes

grados y con uniones alterantes α 1→3 D-galactopiranosa-4sulfato y β 1→4

D-galactopiranosa 3-6 anhidro; las unidades de disacárido se encuentran

modificadas formando anhídridos y los hidroxilos de la galactosa pueden

estar sustituidos por otros grupos. (Ver figura No.1). Esta variación

estructural da origen a tres principales tipos de carragenina Kappa (к), iota

(ι) y lambda (λ), se conocen algunas otras fracciones precursoras de las

anteriores, pero de menor importancia comercial, como las Mu (М), Nu(N),

theta (θ), y xi (ζ) (Glicksman, 1982). Químicamente estos polímeros son

galactanos altamente sulfatados y la reactividad es debida a los grupos

éster sulfato, que están asociados a cationes; en la tabla No.1 se muestran

algunos datos obtenidos en un análisis de absorción atómica.

Tabla No 1: Cationes inorgánicos determinados en Kappaphycus alvarezii: Los ensayos fueron hechos con absorción atómica.

Determinaciones en peso seco de Kappaphycus alvarezii K % N% Na% Ca% Mg% P% Zn ppm Cu ppm Fe ppm

9.33 1.19 3.97 0,234 0.619 0.030 16.5 2.5 52

Los pesos moleculares de la carragenina se encuentran generalmente en el

rango de 100.000 a 500.000 Daltons.

El contenido máximo teórico de 3,6 anhidrogalactosa encontrado para la κ

carragenina es del 35% (Glicksman, 1982)

28

Figura No 1 Tipos de carrageninas

Tomado de: Glicksman (1982)

La característica comercial más importante de la carragenina es su

capacidad para formar una gran variedad de geles, así, la kappa

carragenina forma geles fuertes y rígidos en presencia de sales de potasio,

pero produce geles débiles cuando se usan sales de calcio en el proceso de

gelificación, mientras que la iota carragenina forma geles elásticos con sales

de calcio y la lambda carragenina forma soluciones muy viscosas pero no

gelifica.

2.2 Mecanismo de gelificación de la carragenina Los geles de iota y κappa carrageninas son térmicamente

reversibles por calentamiento y enfriamiento de soluciones acuosas, las

bases teóricas de la gelificación de kappa carragenina fueron propuestas

por Rees en 1967 y como lo muestra la Figura No. 2, la carragenina existe en

solución en cadenas desordenadas, al enfriarse se acercan las cadenas y se

organizan tridimensionalmente en estructura de gel, si se adiciona un catión

29

la estructura de doble hélice se polimeriza y se estabiliza formado tiras

helicoidales. (Oakenfull et al, 2000)

Figura No 2: Mecanismo de gelificación de la kappa carragenina

El mecanismo de gelificación está fuertemente influenciado por los

electrolitos que se usan, como consecuencia del hecho que la carragenina es

un polisacárido aniónico. La estabilidad de la doble hélice es sensible al radio

de catión y la agregación de las hélices tiene requerimientos altamente

específicos, por ejemplo la gelificación se puede llevar a cabo con todos los

cationes monovalentes a altas concentraciones, pero el K+ es

particularmente efectivo porque forma uniones específicas entre las hélices.

(Michel y colaboradores, 1997).

La gelificación es sensible, al tipo de anión que acompaña el potasio.

Oakenfull y colaboradores (2000), encontraron pequeñas diferencias en la

30

transición de hélice a enrollamiento de hélices usando, acetato, bromuro,

cloruro, citrato y nitrato de potasio.

La temperatura de gelificación varía sistemáticamente con la naturaleza

del anión e influye en el ordenamiento conformacional, un estudio

calorimétrico mostró que el anión acetato induce mayores puntos de

fusión del gel de carragenina (Oakenfull y colaboradores 2000)

2.3 Propiedades de la carragenina 2.3.1 Solubilidad de la carragenina

Se pueden preparar soluciones al 10% de concentración con iota y

κappa carrageninas en agua por encima de 70oC, pero las sales de potasio

y calcio de kappa y iota carrageninas son insolubles en agua fría. (Mshigeni,

1992)

El propilen glicol, los glicoles y los solventes similares en polaridad

con estos alcoholes, son excelentes dispersantes de las carrageninas, la

cantidad del solvente tolerada depende del peso molecular del polisacárido y

del tipo de carragenina, el alto contenido de sulfatos y la disminución de peso

molecular causada por la hidrólisis hacen más hidrofílica la carragenina.

(Mshigeni, 1992)

Las κappa y lambda carrageninas son solubles en soluciones

azucaradas al 65%.

Iota y lambda carrageninas son solubles en soluciones alcalinas al

25%, mientras que κappa carragenina se precipita en estas condiciones.

Todas las carrageninas son insolubles en solventes orgánicos poco

polares. (Mshigeni, 1992)

31

2.3.2 Viscosidad de la carragenina La viscosidad de la carragenina depende de la concentración, la

temperatura, la presencia de otros solutos, el tipo de carragenina y el peso

molecular, incrementa de manera exponencial con la concentración de la

carragenina en solución iónica de potasio, este comportamiento es típico de

polisacáridos lineales con grupos cargados y los cambios en los valores de la

viscosidad se deben a la interacción entre las cadenas de polímero con las

soluciones salinas, que reducen la repulsión entre los grupos sulfato.

La viscosidad decrece de manera exponencial con la temperatura,

pero los cambios son reversibles, enfriamientos abruptos de la carragenina

incrementan la viscosidad aparente.

La viscosidad incrementa con el peso molecular de acuerdo con la

ecuación de Mark-Houwink. (Ecuación No 1)

V= KMx (1.)

Donde V es la viscosidad, M el peso molecular promedio y x un parámetro

que varía con el solvente y el peso molecular del polisacárido utilizado en la

determinación; a bajas concentraciones de sal el factor x es cercano a 1.

Las medidas se viscosidad se suelen tomar a 75oC y 1,5% de

concentración de carragenina en KCl, las carrageninas comerciales

disponibles presentan viscosidades de 5 mPa-s a 800 mPa-s y son

consideradas como fluidos no Newtonianos. Una carragenina comercial

debe disolverse en agua fría ó en agua caliente formando soluciones

viscosas, pero la viscosidad debe aumentar en presencia de sales de calcio o

potasio.

32

El valor de la viscosidad promedio está directamente relacionado con

el peso molecular, la k carragenina usada en alimentos tiene un peso que

está entre 100.000 y 50.000 Dalton, el mayor peso molecular de una

carragenina se ha estimado en 250.000 Dalton.

2.3.3 Temperaturas de fusión y gelificación Los geles de carragenina, son térmicamente reversibles por

enfriamiento, la temperatura de gelificación de una kappa carragenina tiene

un rango entre 35 y 65oC y el punto de fusión entre 55-85oC, las variaciones

son debidas a la concentración de KCl en la cual se prepara el gel. Los geles

de iota carragenina preparados en soluciones de cloruro de calcio presentan

temperaturas de gelificación más elevadas, entre 39 y 71 oC.

2.3.4 Fuerza del gel Es una medida estándar de la fuerza aplicada para provocar una

deformación en un gel, a una concentración y temperatura determinada, la

fuerza está relacionada con la temperatura de gelificación, los iones

presentes y el contenido de anhidrogalactosa, los valores de fuerza de gel

pueden variar desde 127g/cm2 (Mtolera y Buriyo, 2004), hasta 845 g/cm2

(Briones y colaboradores, 2004), dependiendo de las condiciones de

extracción. El gel formado por kappa carragenina en presencia de iones

potasio es rígido y exhibe un alto contenido de 3,6 anhidrogalactosa y un

bajo contenido de sulfatos. Se encuentran geles más elásticos como los

formados por iota carragenina en presencia de calcio.

Las carrageninas preparadas a concentraciones menores al 1,3% en

presencia de cationes pueden formar geles térmicamente reversibles. La

fuerza de gel de las carrageninas se determina usando concentraciones de

1,5 % del catión. En la figura No 3 se aprecia que la fuerza de gel aumenta

con la concentración de KCl y con el % de kappa carragenina en el gel.

33

Figura No 3. Variación de la fuerza de gel en función de la concentración de k carragenina

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

% KCl

Fuer

za d

e ge

l en

g/cm

2

0,5% en kappa

1,0% en kappa

Datos tomados de Briones y colaboradores (2004).

Los valores de fuerza de gel también dependen de la especies de alga

de donde se extrae, por ejemplo geles extraídos de Eucheuma sp tienen

fuerzas de gel de 500g/cm2, este valor depende además del tratamiento

alcalino al que fue sometida la muestra.

La fuerza de gel de la kappa carragenina extraída de una misma

especie de alga presenta variaciones con la estación de recolección, estudios

realizados sobre Hypnea musciformis mostraron un incremento gradual en

la fuerza de gel de marzo ( 57g/cm2) a Octubre ( 521g/cm2) (Guist, 1984) en

muestras recolectadas en Brasil.

De igual manera en cultivos de kappaphycus alvarezii la fuerza de

gel depende de las condiciones climáticas y de nutrientes en el agua.

(Rincones, 1999), (Muñoz, 2004).

Conocer la fuerza de gel de kappa carragenina es importante, porque

de los valores que tome dependen las aplicaciones finales, por ejemplo se

34

puede usar para fabricar empaques, películas o como gelificante de

alimentos (Briones y colaboradores, 2004).

2.3.5 Perfil de textura El análisis de perfil de textura está establecido sobre el reconocimiento de la

textura como una propiedad multiparamétrica. El ensayo está basado en dos

compresiones uniaxiales sucesivas separadas por un tiempo de relajación, el

resultado es una curva de fuerza aplicada en función del tiempo, se

comprime la muestra hasta un 75% de su altura, se afloja el esfuerzo, se

relaja y luego se vuelve a comprimir la curva obtenida para un gel se aprecia

en la figura No 4. (Rao, 1999) Figura No 4 Curva obtenida en un perfil de textura de un gel carragenina

Fuente: Gladys Rozo, equipo Stable Micro systems TA-XT2i

35

La figura No 4 muestra un perfil de textura tomado en un equipo Stable Micro

systems TA-XT2i, de esta curva se pueden obtener los siguientes

parámetros:

El pico F se denomina fracturabilidad y corresponde a la fuerza

necesaria para que se realice la primera ruptura.

La dureza o fuerza de gel es el punto d1t y corresponde a la fuerza máxima

obtenida en la primera compresión.

La adherencia, que corresponde al área de la curva d situada bajo el eje de

las abscisas, se define como el trabajo necesario para despegar el producto

de la placa de compresión.

El carácter gomoso es el producto de la dureza por la cohesión.

La elasticidad es la pendiente de la línea trazada desde el inicio del ensayo

hasta el punto máximo.

El área a1 representa la velocidad de transferencia de energía de molécula a

molécula.

Existen otras definiciones que se pueden obtener de un perfil de

textura, cuando se realiza sobre alimentos, pero para un gel se usan

generalmente los mencionados anteriormente. ( Roudot, 2004).

2.3.6 pH Las carrageninas son estables a valores de pH altos, pero al disminuir

el pH también decrece su estabilidad especialmente si se eleva la

temperatura, a pH bajo ocurre la hidrólisis de la carragenina dando como

resultado una menor viscosidad y menor capacidad de gelificar. Las

carrageninas se pueden depolimerizar por hidrólisis ácidas o básicas a altas

temperaturas, la velocidad de la hidrólisis depende de las condiciones de

temperatura y pH, es muy lenta cuando está formando gel, pero la velocidad

36

aumenta cuando se presenta el estado sol como en lambda carragenina.

(Stanley, 1987).

2.3.7 Reactividad frente a las proteínas

Todos los polisacáridos sulfatados están cargados negativamente a

cierto rango de pH, es por ello que pueden formar complejos con proteínas

que tienen cargas positivas, estas asociaciones cambian los puntos

isoeléctricos de las proteínas. La kappa carragenina tiene la capacidad de

estabilizar la α y β caseína y por eso es usada para estabilizar leches

evaporadas y fórmulas para lactantes. (Nickerson y Paulson, 2005 ) (Ribeiro,

y colaboradores, 2004),

2.3.8 Espectro Infrarrojo La carragenina presenta bandas de absorción fuertes típicas de los

polisacáridos en la región entre 1000 y 1100 cm-1 con señales de absorción

máxima en 1065 y 1020 cm-1 ( Sekkal, et al, 1994). Para sistemas

gelificados y no gelificados, aparecen otras bandas características como las

reportadas en la tabla No 2. (JECFA, 2001).

Tabla No. 2. Absorción en el I.R. de las diferentes carrageninas (JECFA, 2001)

Absorbancia relativa a 1050 cm-1Longitud de onda

(cm-1)

Asignación

molecular

Kappa

Iota

Lambda

1220-1260 Ester sulfato 0.2-1.2 1.2-1.6 1.4-2.0

928-933 3,6 anhidrogalactosa 0.2-0.6 0.2-0.4 0-0.2

840-850 Galactosa-4sulfato 0.1-0.5 0.2-0.4 -

825-830 Galactosa 2-sulfato - - 0.2-0.4

810-820 Galactosa 6-sulfato - - 0.1-0.3

800-805 3,6anhidrogalactosa

-2- sulfato

0.0-0.2 0.2-0.4 -

37

2.4 Aplicaciones comerciales de kappa carragenina Los residentes del condado de Carraghen en la costa sur de Irlanda,

hace más de 600 años, usaban el “ musgo irlandés”,un alga productora de

gel, en los alimentos y medicinas,. Estas algas marinas eran aprovechadas

debido a su propiedad única de gelificar la leche y crecían a lo largo de las

costas de Francia. Con las algas blanqueadas se preparaba un gel de leche

conocido como “blanc-mange”. Este alimento se obtenía enfriando la leche

en la cual se habían cocido las algas.: En los Estados Unidos se preparaba

un alimento similar. Sin embargo, no fue sino hasta la Segunda Guerra

Mundial, cuando se inició la industrialización de algunas especies de algas

que se denominaron carragenofitas.

Hoy el gel de kappa carragenina se usa en coberturas para

alimentos, las coberturas actúan retardando la pérdida de humedad,

aumentando la estabilidad contra el crecimiento de microorganismos en la

superficie, si se usa el gel como portador de agentes antimicrobiales. Las

carrageninas evitan la oxidación de los alimentos porque son buenas

barreras para el oxígeno. En unión con pectinas de bajo metoxilo, gomas

xantán y goma arábiga, pueden satisfacer los últimos requerimientos

alimentarios. Tienen también multitud de aplicaciones fuera del sector

alimentario, como en pastas de dientes, productos cosméticos o

ambientadores, en los que se utiliza para controlar sus texturas y fluidez,

para alargar su periodo de vida o para reducir los costos de producción.

(Dawes, 1986).

En alimentos son usadas como aditivo natural, sin ningún efecto

tóxico conocido; como agentes gelificantes o estabilizantes; una gran

cantidad de productos acuosos de venta hoy en el mercado contienen

carragenina. Un resumen de los usos en el sector de alimentos se aprecia en la

Tabla No 3. (Dawes, 1986)

38

Tabla No 3. Usos de carragenina en alimentos. Tomado de Clinton Dawes, Botánica Marina, 1986

Uso Función Cantidad utilizada aproximada

Geles para postres acuosos Agente fijador 0.7% Gelatina dietética Agente fijador 0.5% Rellenos para pastel Agente fijador 0.5% Jarabes Da cuerpo suspensión 0.2% Polvos de bebidas de frutas y concentrados congelados

Efectos de dar cuerpo y formar pulpa

0.5%

Sustitutos de crema para el café

Estabilización de emulsiones <0.2%

Condimentos, salsas para pizza y barbacoa

Da cuerpo <0.5%

Salsas de mantequilla para vegetales congelados

Adhesión, color uniforme, sensación bucal

<0.5%

Sopas Da cuerpo formación de geles

0.2-1.0

Crema de dientes, lociones Da cuerpo estabilización de emulsiones

<1.0

Suspensiones Forma suspensiones <1.0% Helados Prevenir la separación del

suero 0.015%

Leches pasteurizadas saborizadas

Da cuerpo y suspensión 0.015%

Leches esterilizadas de chocolate

Estabilización de grasas 300 ppm

Leches evaporadas en lata Estabilización de grasas 25-50 ppm Bebidas dietéticas de 900 calorías

Da cuerpo y suspensión 250 ppm

Leches para bebes Estabilización de grasas y proteínas

300 ppm

Rellenos para pastel fríos sin almidón

Agente fijador 0.5-1.0%

Rellenos para pastel fríos con almidón

Fijación inhibición de la sinéresis

0.1-0.5%

Natilla Agente fijador 0.3% Flan horneado Agente fiador 0.3% Productos batidos Estabilización de grasas y

espuma, fijación 0.05%

Cremas, coberturas, postres Estabilización de grasas y espuma, fijación

0.05-0.5

Bebidas espesas malteadas Da cuerpo y estabiliza el exceso

0.1-0.3

39

Desde 1979 la FDA (Food and Drug Administration, U.S.A.), reconoció

a las carrageninas como compuestos que alteran la viscosidad en productos

acuosos y se pueden consumir sin restricción conocida.

La adición de carragenina a productos lácteos es importante porque se

aprovecha la reactividad de las proteínas con un polisacárido sulfatado,

generalmente previene la separación de la capa acuosa en leches

evaporadas y homogeniza controlando la textura del alimento. La adición de

carragenina evita la separación de la capa grasa en los quesos. (Ribeiro, y

colaboradores, 2004 y Nickerson y Paulson, 2005)

Para alimentos basados en agua como jugos se usan mezclas de

carrageninas para dar cuerpo y textura. (Nickerson y Paulson, 2005). En la

preparación de carnes frías la carragenina aporta textura y homogeniza la

mezcla.

En farmacéutica se utiliza para realizar preparaciones de drogas

insolubles en agua, dando estabilidad a las emulsiones, se utiliza en geles

antiácidos, en drogas para curar ulceras y en suspensiones de sulfato de

bario para radiología. ( Xu y colaboradores, 2003).

Se conocen otros usos industriales como: la preparación de pastas

dentríficas, lociones, cremas, bases para pinturas, purificadores de aire y

como medio para inmovilizar enzimas.

La carragenina se vende en forma de polvo fino, el cual, en presencia

de cationes, requiere calor para una solubilización completa. Para compensar

la solubilidad lenta característica del material, se recomienda dispersar la

carragenina con buena agitación en el medio (agua o leche) y calentar el

sistema hasta aproximadamente 82-85ºC, con lo cual se asegura la

solubilización completa del polisacárido.

40

La universidad de Córdoba, España, patentó un procedimiento para

controlar el pardeamiento de bebidas que se produce con el paso del tiempo,

utilizando para ello geles de carragenina en donde se inmovilizaron levaduras

encargadas de prevenir el desarrollo de color. (PTC WO 03/070930).

La empresa Jonsson, radicada en Estados Unidos, en el año 2000,

estableció un protocolo, que se usa actualmente para la preparación de

masmelos, dulces y gomas usando como base kappa carragenina. (PTC WO

00/69275).

Las investigaciones sobre usos y aplicaciones de kappa carragenina

apuntan hacia la síntesis de nuevos compuestos derivados o copolímeros

que presentan actividades antivirales. (PTC WO 00/77019, PTC WO

037093322).

En el campo de la agricultura, kappa carragenina con altas fuerzas de

gel son potenciales geles hidroretenedor con menos sensibilidad a las

soluciones salinas que los geles comerciales y con grandes ventajas

medioambientales ya que su estructura de polisacárido y su origen vegetal lo

hacen biodegradable.

La carragenina es un polisacárido hidrofílico que puede incrementar

las propiedades de los hidrogeles sintéticos (Zhai et al,2004).

Dentro de las nuevas generaciones de geles hidroretenedores se

encuentran los geles por copolimerización de poliacrilamida con Kappa

carragenina, un polisacárido extraído de algas rojas reconocido por su

capacidad de gelificar y con mejores propiedades fisicoquímicas que los

geles superabsorbentes sintetizados hasta la fecha. (Falshaw et al, 2003).

41

En los últimos años se ha estado evaluando el efecto de la aplicación

de geles superabsorbentes sobre el crecimiento de árboles cultivados en

suelos arenosos. Hütermann y colaboradores (1999), estudiaron el efecto de

la adición de un hidrogel superabsorbente de poliacrilamida-kappa

carragenina en plántulas de Pinus halepensis durante estrés hídrico, el gel

de poliacrilamida que emplearon tenía el 40% de los grupos amida

hidrolizados hasta ácidos carboxílicos, con esta metodología encontraron que

la retención de agua en el suelo aumentó exponencialmente con los

incrementos en las dosis de hidrogel y que durante la desecación las

plántulas tratadas con 0.4 % de hidrogel sobrevivieron el doble del tiempo

que las plántulas control, también observaron que el crecimiento de las

plántulas de Pinus halepensis fue tres veces mayor cuando se adicionó el

hidrogel al suelo.

2.5 Fuentes carrageninas Las carrageninas se extraen de diferentes especies de algas rojas, en la

tabla No 4 se aprecia el tipo de carragenina, la especie de alga y el lugar

del mundo donde se encuentra de manera nativa o se cultiva.

En la figura No.5 se presentan algunas Carragenophytas o algas

productoras de carragenina.

Figura No.5 Principales especies de algas utilizadas en la producción de carragenina

Chondrus Crispus (Kappa/Lambda Carragenato)

Eucheuma Cottonii (Kappa Carragenato)

Gigartina, Varias especies (Lambda/Kappa Carragenato)

Hypnea musciformis (Kappa, Carragenato)

Figuras Tomadas de: www. issg Database Ecology of Hypnea musciformis.htlm, 2005

42

Tabla No 4 Algunos ejemplos de Carragenophytas

Especie carragenina país

Chondrus crispus Mezcla de kappa y lambda Francia y regiones

del Atlántico norte

Kappaphycus alvarezii Mayoritariamente Kappa Cultivada en

Venezuela, y México

y nativa de Filipinas

e Indonesia

Eucheuma spinosum Mayoritariamente iota Indonesia

Gigartina skottsbergii Mayoritariamente kappa y

algo de lambda

Argentina y Chile,

cultivada en

Normandía y Gran

Bretaña

Sarcothalia crispata Mezcla de kappa y lambda Chile

Hypnea musciformis Exclusivamente Kappa Brasil, Colombia,

Senegal

G.chamissoi iota Perú y Chile

Iridea sp lambda Francia

En año 2002, el Council of Scientific and industrial Research (PTC WO

02/17707) patentó los métodos para el cultivo de algas productoras de

carragenina de especies comerciales Eucheuma cottonii, Eucheuma

spinosum, y kappaphycus, estas investigaciones presentan: el proceso de

cultivo, el desarrollo de variedades y las metodologías para la propagación,

también se describe la obtención de variedades con aumentos significativos

de biomasa en períodos cortos de tiempo, la variación de la calidad y

cantidad de kappa carragenina, cuando se realizan los cultivos a partir de

tejidos.

43

2.6 Fuentes de kappa carragenina El polisacárido de interés en esta investigación es kappa carragenina,

cuya estructura se ilustra en la figura No 6

Figura No 6 Estructura de kappa carragenina

Originalmente la kappa carragenina fue obtenida de algas que crecían

en ambientes naturales en indonesia y Filipinas, pero partir de los años 70

se iniciaron los cultivos de Kappaphycus alvarezii y Eucheuma

denticulatum en estos países, para satisfacer la demanda creciente de

kappa carragenina en el mundo, los cultivos se extendieron a otros lugares

del mundo como Tanzania, Vietnam y algunas islas de Pacífico como Kiribati

donde hoy se cultivan especies nativas. En China, Taiwán y Filipinas se

siembra Betaphycus gelatinum; en Canadá, Escocia, Estados Unidos y

Francia se cultiva Chondrus crispus; en Chile y Argentina se cultivan

Gigartina skottsbergii y Sarcothalia crispata y Mazzaella laminaroides,

Gigartina canaliculata se cultivan en México y baja California (Falshaw, 2003).

A lo largo de la costa de Brasil se encuentran grandes extensiones de

Hypnea y en algunos lugares de Brasil se ha incrementado su cultivo para

proteger las poblaciones naturales. ( Faccini and Berchez, 2000).

La especie Chondrus crispus fue cultivada en Canadá desde los

años 20, pero no fue sino hasta la segunda guerra mundial cuando adquirió

gran importancia debido a que los coloides eran inaccesibles para el

44

mercado Americano porque las importaciones japonesas estaban

suspendidas.

En los años 70 Canadá era la principal fuente de carragenina,

Chondrus crispus proveía cerca del 70% de la producción mundial, pero en

1992 con los cultivos de Kappaphycus alvarezii ,120.000 toneladas anuales

en peso seco y Eucheuma denticulatum 30.000 toneladas al año en

Filipinas, Indonesia y Tanzania, la producción de Canadá se redujo al

12%. (McHugh, 2001)

En la tabla No 5 se presenta el comportamiento de las fuentes de

carragenina en toneladas de peso en seco para el año 2001, allí se aprecia el

aporte de países nuevos en mercado como Perú, México , España, Portugal

y Corea. (McHugh, 1991)

Tabla No 5. Fuentes de carragenina por países ( McHung, D.J.,1991) Ton % mundial

Chondrus

Canadá 2.000

Francia, España y Portugal 1.400

República de Korea 500

Subtotal 3.900 2.3%

Eucheuma y Kappaphycus

Filipinas 115.000 Indonesia 25.000 Tanzania 8.000 Otros 1.000 Subtotal 149.000 88.5%

Gigartina Chile 14.000

México y Perú 1.500

Subtotal 15.500 9.2%

Total 168.400 100%

45

2.7 Mercado de kappa carragenina en el mundo Las plantas extractoras de Carragenina están ubicadas en Filipinas,

Europa, Estados Unidos y Canadá, en Filipinas se obtiene carragenina

semirrefinada y en los demás países se obtiene carragenina refinada. (Bixler,

1996), (Lillford, 2000)

La carragenina usada actualmente en el mundo para alimentos,

farmacia y cosméticos es un negocio que supera los 200 millones de

dólares (Radmer, 1996). El consumo total de materias primas asciende a

unas 170.000 toneladas de algas marinas en peso seco de las que se

obtienen 30.000 toneladas de carragenina por un valor de 270 millones de

dólares en Estados Unidos. (Lillford, 2000)

En el mundo hay 24 productores reconocidos de carragenina, sin

embargo el 80% del total procesado, corresponde a la producción de tres

empresas, según la FAO el crecimiento anual de los requerimientos de

carragenina para los próximos cinco años está estimado en un 8%.

Habitualmente la extracción de carragenina se hace en lugares muy

alejados del cultivo de algas, lo que significa que para que sea

comercialmente viable, el volumen de producción de cualquier zona debe

ascender a por lo menos 1000 toneladas de peso al año, para poder hacer

frente a los gastos de funcionamiento, el precio en playa debe ser de 200

dólares por tonelada en peso seco. (Lapointe et al, 1982).

En sur América Cuba y Venezuela lograron exportaciones de

Hypnea, en seco hacia Dinamarca para la extracción de carragenina, pero

la cantidad de alga silvestre en esta región no fue suficiente para mantener la

demanda (Smith, 2003). (Jory et al, 2000).

46

En Colombia en el año 2005 se importaron $US3.262.000 dólares de

carragenina, según Proexport pero el país no participa como productor en el

mercado mundial de la carragenina (Sena, 2006)

2.8 Hypnea musciformis 2.8.1 Clasificación taxonómica de Hypnea musciformis

Es un alga con talo pseudoparenquimático, blando, con ramas cilíndricas dispersas alrededor de los ejes; color rojo con las puntas de los ejes recurvadas en forma de gancho (Figura No 7) Clasificación taxonómica: Genero: Hypnea Especie: musciformis Autoridad: (Wulfen) Lamouroux Nombre común: hooked weed Orden: Gigartinales Familia: Hypneaceae . Figura No 7 Hypnea musciformis

Colector: Gladys Rozo, Agosto de 2005.-

47

2.8.2 Factores que influyen en el contenido de kappa carragenina en

Hypnea musciformis.

Hypnea musciformis es un alga Rhodophyta, de donde se ha logrado

obtener kappa carragenina (Berchez, 1993; Oliveira y Berchez, 2000), con

rendimientos que oscilan entre el 35 y el 43%, el contenido de carragenina

se ve afectado por las condiciones ambientales regionales y por el estado de

desarrollo del alga.

Mtolera y colaboradores (2004), reportaron rendimientos del 35% en

ficocoloide, extraído de Hypnea, recolectada en la bahía de Oyster -

Tanzania- en diferentes estaciones monzónicas.

En la India y Florida se han encontrado especies de Hypnea con

altos contenidos de carragenina en los meses de Enero a Abril (Solimabi et

al, 1980).

Algunos autores sugieren que la variación del contenido de

carragenina en el alga se debe a abruptos cambios en parámetros

ambientales como luz, temperatura y salinidad (Collen y colaboradores,

1995; Mtolera y colaboradores, 2004), otros autores sostienen que la

cantidad de carragenina extraída depende de la rapidez con que crece el

alga y que los mayores valores de к carragenina se encuentran en los

períodos de más rápido crecimiento (Rao, 1970).

Se encuentran algunos estudios comparativos con otras

carragenofitas, donde se ha mostrado que esta especie crece un 20% cada

día, con buena iluminación y aguas calmadas, igualmente en la literatura se

encuentran reportes acerca del crecimiento de Hypnea como epifita de

otras especies (Guist et al, 1984).

48

De otro lado Guist y colaboradores (1984) cultivaron Hypnea

musciformis en la Florida durante 15 meses, encontrando un aumento de

biomasa de un 20% diario, con velocidades de crecimiento altas cuando las

temperaturas estuvieron entre 18 y 24oC y con flujos de agua continuos que

contenían fósforo y nitrógeno, mostrando una tasa de crecimiento

inversamente proporcional al nivel de irradiación solar, contrario a las

publicaciones anteriores el contenido de к carragenina de Hypnea cultivada,

fue inversamente proporcional a la velocidad de crecimiento, solamente,

lograron aumentar el contenido de carragenina manteniendo las plantas por

dos semanas en tanques con nutrientes adicionales.

M. Friedlander en 1984 realizó comparaciones entre especies de

carragenofitas cultivadas y silvestres, en las que incluyó Hypnea

musciformis, midiendo velocidad de crecimiento en función de la

temperatura, la intensidad luminosa y el contenido de carragenina, concluyó

que no había diferencias significativas entre las propiedades físicas y

químicas del coloide obtenido del alga cultivada y del alga silvestre.

(Friedlander, 1984).

En Brasil se realizaron estudios sobre cultivos de Hypnea

musciformis in vitro variando la temperatura, la aireación y los nutrientes,

sus mejores resultados, correspondieron a: crecimiento del alga del 20,79%

diario a temperatura de 25oC y en ausencia de aireación. (Bravin y Yoneshigue, 2002), (De Souza, 1990).

En Colombia los estudios se limitan a la propuesta realizada por Bula

Meyer (1990), con base en las observaciones de campo y en mediciones de

temperatura, salinidad, nutrientes, transparencia y movimiento de agua, Bula

planteó, que el factor clave que regula los aspectos fisiológicos de las macro

algas del Parque Tayrona es el asenso de la temperatura por encima de los

49

26oC, como resultado de los fenómenos oceanográficos, que se observan en

la estación húmeda mayor.

El inventario taxonómico de las macroalgas marinas de las costas

colombianas revela una fuente innumerable de especies de gran interés

comercial en todos los aspectos básicos de aprovechamiento (Bula Meyer,

1988; Bula Meyer, 1989).

Hypnea musciformis es la única especie nativa del Caribe

Colombiano, (Díaz-Pulido et al, 2003), que se ha mostrado como promisoria

para la extracción del ficocoloide, kappa carragenina.

Berchez y colaboradores (1989), (1993) realizaron estudios de cultivos

in vitro, con la finalidad de disminuir la presión sobre poblaciones naturales, y

lograron determinar los factores fundamentales para el control del

crecimiento de Hypnea (Bravin y Yoneshigue, 2002; Perpetuo, 2003).

2.8.3 Ciclo de vida de Hypnea musciformis Como la carragenina forma parte de las paredes celulares del alga,

también se ha estudiado la variación del contenido de ficocoloide,

encontrando diferencias significativas y modificaciones de la estructura del

ficocoloide en función del estado de desarrollo del alga, este fenómeno fue

llamado por Yaphe secundarización de la pared celular. (Lahaye y Yahphe,

1998).

Las carregenofitas tienen diferentes estados de desarrollo, se conoce

que por ejemplo en las plantas gametofitas haploides, predomina la kappa

carragenina y en las tetrasporofitas diploides se encuentra

predominantemente lambda carragenina, comercialmente se pueden cultivar

juntas y se obtiene una mezcla de kappa y lambda carragenina que se usa

para la estabilización de productos lácteos. (Dawes et al, 1977)

50

Como la carragenina Nu es precursora de kappa en el ciclo de vida de

las algas carragenofitas es posible encontrar en alguna época de su

crecimiento Nu carragenina y en su estado desarrollo maduro kappa, para el

caso de Hypnea musciformis se reporta que recolectada en su fase final de

crecimiento se obtiene solamente kappa carragenina. (Berchez y

colaboradores, 1993)

2.8.3 Función de la carragenina en las algas rojas Las paredes celulares de las algas marinas contienen polisacáridos de

cadena larga, como la carragenina, que le dan flexibilidad a las algas y les

permiten adaptarse a la variedad de movimientos de las aguas en las que

crecen. Por ejemplo, algunas algas rojas crecen sujetas a las rocas en aguas

muy turbulentas, por lo que han de tener una gran flexibilidad para sobrevivir;

estas algas contienen una cantidad mayor de ese tipo de polisacáridos que

las algas rojas que crecen en aguas tranquilas, es por esta razón que el

contenido de carragenina en las algas dependerá de las condiciones

climáticas en las que sobrevive. (Watt et al, 2003)

2.8.4 Pigmentos en Hypnea musciformis Se ha estudiado la variación del contenido de carragenina en función

del estado de madurez del alga, encontrando diferencias significativas y

modificaciones de la estructura del ficocoloide en función del estado de

desarrollo del alga, este fenómeno fue llamado por Yaphe secundarización

de la pared celular. (Lahaye y Yahphe, 1998).

En Hypnea musciformis y otras algas rojas, a la carragenina la

acompañan una serie de pigmentos que fueron descritos por Rowan (1989):

Clorofilas, carotenos y ficobilinas

51

Las clorofilas a y d son estructuras de tetrapirroles dispuestos en un

anillo con un átomo central de magnesio como se muestra en la figura No 8

Figura No 8 Clorofilas presentes en Hypnea musciformis

CH3

N

N

N

NMg

CH3

CH3

CH3

CH2

H C3

oH

3 oo oo

H

H HH

H C3

Clorofila R: - ; : -CHclorofila CHO;

ad

1 3 CH R = CHR: - R: -CH CH

2 2

1 2 2

R1

R2

3

Los carotenos que se encuentran comúnmente en el género

Rhodophyceae son α, β carotenos y 3-hidroxiderivados como luteína y

Zeaxantina, en la Figura. No 9 se muestran las estructuras de estos

carotenos.

52

Figura No 9 Carotenos presentes en Hypnea musciformis

CH3CH3

CH3

CH3CH3

CH3

OH

OH

α-caroteno

CH3CH3

CH3

CH3CH3

CH3

β caroteno

CH3CH3

CH3

CH3CH3

CH3

luteína

CH3CH3

CH3

CH3CH3

CH3

OH

OH

Zeaxantina

53

Las ficobilinas son tetrapirroles lineales, están unidas a grandes

moléculas de proteína, son hidrosolubles, existen dos tipos de ficobilinas la

ficocianina (responsable de color azul) y la ficoeritrina (responsable color

rojo), las estructuras se aprecian en la figura No 10

Figura No 10. Ficobilinas presentes en Hypnea musciformis

o

H

CH3 CH

CH3

H

CH3 CH2

CH2

COOH

H H

CH2

CH2

COOH

CH3 CH3

H o

CH3 CH

CH2

H

Ficocianina

o

H

CH3 CH

CH3

H

CH3 CH2

CH2

COOH

H H

CH2

CH2

COOH

CH3 CH3

H o

CH3 CH2

CH3

Ficoeritrina

2.8.5 Polisacáridos de reserva de las algas rojas

En los años 1950 y 1960 se descubrió que las algas rojas almacenan

azucares como fuente de energía, en estructuras parecidas a los almidones

denominadas, desde entonces, almidón floridean. (Meeuse, 1960) Los

gránulos de almidón se localizan en el citosol de las células de las algas

rojas (Bouck, 1965)

El almidón floridean , es un homopolímero de la glucosa formado por

enlaces glucosidicos α-1,4 con ramificaciones α-1,6, tal y como se aprecia

en la Figura No.11, La familia Bangiophyceae, almacena almidón con

estructuras de amilasas y amilopectinas, mientras que las algas de la familia

54

Florideophyceae, especies económicamente importantes en la industria de

los ficocoloides de agar, agarosa y carragenina, que se cultivan ampliamente

en varios países del mundo, poseen como polisacáridos de reserva almidón

floridean, cuya estructura está formada solamente por amilopectinas. (Yu et

al, 2002).

Figura No 11 Estructura del almidón Floridean

H

H

H

H

H

CH2

C C

C

C

OH

OH

OH

O

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

O

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

O

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

O

n

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

O

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OH

OH

H

H

H

H

H

CH2

C

C C

C

C

OH

OOH

OH

El almidón floridean es reconocido como una impureza en el agar y la

carragenina, presenta efectos adversos en la fuerza de gel y usualmente

tiene que ser removido por tratamiento enzimático con α-amilasas

tremofilicas. (Yu, S et al, 2002) El almidón floridean presenta bajas temperaturas de gelatinización y

la amilosa libre de lípidos y proteínas le confiere un color claro, los

gránulos de almidón en el citosol llegan a medir entre 1.7 y 3.4 µm y tiene un

promedio de 18 unidades de glucosa en cadenas relativamente cortas, con

un alto grado de ramificaciones (frecuencias de 4,8%).(Yu, S et al , 2002).

55

Cuando se extrae almidón Floridean de algas verdes los ensayos de

coloración con una solución de yodo-yoduro, muestran una formación de

complejos de color oscuro casi negro, mientras que el almidón floridean

obtenido de algas pardas no produce ningún complejo coloreado y las

pruebas de yodo-yoduro dan complejos de colores rojos claros cuando el

almidón proviene de algas rojas. (Fournet et al, 1999).

Actualmente se realizan modificaciones genéticas en las algas, con el

propósito de modificar la síntesis o degradación del polisacárido floridean y

ofrecer una carragenina libre de almidón que proporcione mejores efectos

gelificantes. ( Tucker, 2000)

2.9 Extracción Kappa carragenina Existen dos métodos para producir carragenina basados en principios

diferentes. Hasta los años 70 y 80 la carragenina fue extraída del alga en

solución acuosa, los residuos se removían por filtración y la carragenina se

recuperaba de la solución como un sólido seco, que contenía una buena

proporción del coloide, sin embargo, el método presentaba dificultades de

reproducibilidad y pureza de la carragenina. La carragenina obtenida por

este método recibe el nombre de carragenina filtrada. El método se modificó

utilizando hidróxido de potasio para la extracción con el propósito de reducir

los grupos sulfato y aumentar la 3,6 anhidrogalactosa, algo de proteína,

carbohidratos y sales se solubilizan con este método. La figura No 12

presenta un resumen del método para obtener carragenina semirrefinada. En

este cuadro se aprecian dos métodos que promueven una reacción química

para favorecer la extracción, pero al extracto pulverizado de alga no se le

retiran los componentes coloreados de la pared celular. (McHugh, 2001)

56

Figura No 12 Métodos para la extracción de carragenina

Figura tomada de (McHugh, D.J., 2001)

Actualmente la carragenina refinada se obtiene lavando las algas,

removiendo las sales y calentándolas en una solución alcalina, que puede

ser hidróxido de sodio, por varias horas, el tiempo depende de la especie de

donde se hace la extracción; el álcali es usado para causar un cambio

químico que conduce a un incremento en la fuerza de gel en el producto final,

57

con este proceso la solución de carragenina ahora es muy clara y se

pueden usar dos métodos para recuperar el sólido, ( ver figura No 13), una

precipitación con alcohol o con cloruro de potasio, estos procedimientos

permiten remover algunos grupos sulfato de las moléculas e incrementar la

formación de 3,6 Anhidrogalactosa.

Las algas que no se disuelven se remueven por filtración o

centrifugación; el método descrito puede ser usado para obtener cualquier

tipo de carragenina.

Cuando se adiciona alcohol la carragenina precipita y se separa por

filtración, se lava repetidas veces con alcohol, se seca y se pasa por una

malla de tamaño apropiado, el alcohol puede ser reciclado y el gel obtenido

se purifica por enfriamientos repetidos.

Cuando el gel obtenido se precipita con KCl (ver figura No 13), se presiona

para sacar toda el agua y se obtiene la carragenina en forma de fibras que

se hilan a presión. El método está basado en la habilidad que tiene la kappa

carragenina para formar geles con sales de potasio (McHugh, D.J., 2001)

58

Figura No 13 Método para la obtención de carragenina refinada

Figura tomada de (McHugh, D.J., 2001)

En los últimos años se encuentran patentes que muestran la obtención

de carragenina semirrefinada con los siguientes pasos: decoloración de las

algas, cocción en soluciones de KOH hasta causar la formación de 3,6

anhidrogalactosa, lavado, neutralización, filtrado y secado. Estos

procedimientos se han estudiado siguiendo los procesos de reacción por

medidas de potenciales redox (PTC WO 98/40412).

59

En el año 2003 (PTC WO 03/059957) se reportaron los primeros

ensayos de obtención de carragenina con recuperación de la solución

alcalina, los procesos se realizaron utilizando diferentes tipos de algas en la

extracción de carragenina, el gel se separó por compresión y luego se

realizaron sucesivos lavados con agua destilada hasta neutralizar la

muestra.

A continuación se realizaron estudios para retirar la mayor cantidad

de agua posible de la carragenina utilizando métodos de compresión y

extrusión, al producto obtenido se le retiró el 85% de agua sin calentamiento,

la textura de la carragenina obtenida le permitió a los investigadores de la

compañía Colgate Palmolive fabricar los primeros alimentos para gatos y

perros soportados en geles de kappa carragenina (PTC WO 02/051443).

En este mismo camino la compañía Hill׳s Pet Nutrition (PTC WO

02/051443), publicó un nuevo método de extracción de kappa carragenina

con un porcentaje de humedad final de menos del 15%, apta para la

preparación de comida animal. Sin embrago este método no difiere mucho

del reportado por la empresa Colgate- Palmolive

La compañía Gelymar (PTC WO 02/057477), publicó un proceso de

producción de carragenina que se caracteriza porque presenta solamente el

2% de material insoluble y comprende los siguientes pasos i) preparación

de una suspensión acuosa de algas que contienen carragenina, ii)

tratamiento de la suspensión con álcali o con una mezcla enzimática, iii)

precipitación con alcohol y iv) purificación. Dependiendo de las aplicaciones

comerciales de la carragenina el contenido de material insoluble puede ser

más o menos importante, por ejemplo cuando el contenido de material

insoluble es alto el color se torna amarillo y las aplicaciones son limitadas.

60

La empresa Gelymar (PTC WO 02/057477) realizó ensayos de

extracción de carragenina con diferentes especies de algas entre las cuales

incluyen Hypnea spp, para las cuales aplicaron tratamientos de blanqueo

con soluciones de KCl a 30oC, con hipoclorito de sodio, peróxido de

hidrógeno, hipoclorito de calcio, dicloroisocianato de sodio, ácido bórico,

ozono, oxígeno y carbón activado, encontraron los mejores resultados con

hipoclorito de sodio al 10% y cortando las algas en pedazos de 5 cm2 . La

carragenina obtenida con este proceso tiene pH de 8,0, fuerza de gel 180

gcm-2, cenizas 33,3% y viscosidad de 73cP.

La misma compañía (PTC WO 02/057477), (PTC WO 01/82724)

mostró desarrollos de tratamientos enzimáticos que remueven celulosa y

hemicelulosa usando mezclas de xylanasas/ celulasas logrando

rendimientos del 85% de carragenina en especies como Gigartina

skottsbergii, Eucheuma spinosum, Chondrus crispus, etc. Los

experimentos se realizaron con especies de las cuales se extrae iota

carragenina mostrando también altos rendimientos.

En la patente PTC WO 03/059956, se describen los diferentes

procedimientos para optimizar la extracción de carragenina usando

soluciones alcalinas como: NaOH, KOH, Na2CO3, Fosfatos de sodio, K2CO3

fosfatos de amonio, variando las condiciones de concentración del álcali,

temperatura y tiempo de tratamiento, para obtener la carragenina con los

mayores valores de viscosidad. Los ensayos se realizaron sobre E. Cottonii,

la carragenina con mejor viscosidad (100cp), se obtuvo cuando no se

usaron sales de sodio y para niveles bajos de potasio suministrado como

KOH a temperaturas cercanas a 90oC.

Michel y colaboradores en (1997) estudiaron las propiedades

fisicoquímicas de los geles de carragenina en presencia de varios cationes

61

monovalentes y divalentes a diferentes concentraciones y encontraron que

la kappa carragenina gelifica más rápidamente con KCl que con CaCl2

La carragenina extraída del alga Hypnea musciformis fue analizada

usando carragenasas y espectroscopia RMN de C13, se publicaron los

espectros característicos de la к carragenina (Greer, 1993, Yu, G. y

colaboradores, 2002), de igual manera se reportó el uso de FTIR (infrarrojo

con trasformada de Fourirer), para identificar el hidrocoloide (Sekkal, 1998).

También se han realizado ensayos de cuantificación de kappa carragenina

con espectros de resonancia magnética nuclear. (Tojo.y Prado, 2003).

En Tanzania se realizaron estudios comparativos de la extracción de к

carragenina a partir de Hypnea y K. alvarezii con el método de extracción

desarrollado en la Universidad de Dar es Salaam Tanzania, por Semesi en

1977, los resultados obtenidos son bastantes promisorios para Hypnea, con

fuerzas de gel que pueden llegar hasta 243.06 g/cm2. ( Mtolera, 2004).

En el año 2006 se patentaron los métodos de preparación de

mezclas Kappa carragenina–pectina, se obtuvieron fuerzas de gel entre 1

y 8 Kg/cm2, con bajas viscosidades, cuando está mezcla se adicionó a

productos alimenticios al 10 ó 20% de porcentaje en peso, las condiciones

de textura de los alimentos mejoraron notablemente. ( PTC WO 02/005658).

En el año 2006 se publicó la patente No PTC WO 2006/062792,

donde se describen los nuevos métodos para la obtención de hidrocoloides,

entre los que figuran Kappa carragenina, la innovación permite obtener

carragenina incolora y sin olor, conservando las propiedades de viscosidad y

fuerza de gel.

Los polisacáridos sulfatados se están usando recientemente como

bloqueadores del HIV-1; en la patente PTC WO 037093322 , no solamente

62

se discute el efecto de kappa carragenina y sus derivados en diferentes

infecciones causadas por le HIV-1, sino que muestra un protocolo de

extracción de carragenina grado farmacéutico, que consta de los mismos

pasos estudiados en las patentes anteriores, decoloración, cocción en álcali

por una hora, precipitación con etanol absoluto, purificación por enfriamiento

y secado.

La extracción de kappa carragenina se encuentra descrita en la

patente PTC WO 0182724 , allí se presenta un método para la obtención de

carragenina tipo farmacéutico y su uso como portador de flavonoides y

vitaminas en alimentos, la metodología se divide en clarificación,

tratamiento alcalino, precipitación y purificación por enfriamiento.

63

2. Materiales y métodos 2.1. Reactivos y Equipos Reactivos Carbón activado, marca Merck área BET mínima 80m2/g, densidad

específica: de 1,8 a 2,1, tamaño de poro 150 mµ.

Acido Clorhídrico Merck

Hidróxido de sodio Merck

Cloruro de potasio Merck

Hipoclorito de sodio Merck

Etanol Absoluto Merck

Etanol al 96% Merck

Equipos Absorción atómica: Perkin Elmer modelo 3100

Texturometro: Stable Micro systems TA-XT2i

Potenciómetro: Hanna

Condutivimetro: Hanna

2.2. Muestreo La selección del lugar de muestreo se hizo teniendo en cuenta los

estudios presentados por Márquez ( 1982), quien reportó que para el caso

de Neguanje, Punta la Loma y la playa del Aeropuerto de la Bahía de

Santa Marta las coberturas de Hypnea a lo largo de todo el año, tienen

promedios mensuales entre 5 y 80% de biomasa. De estos lugares se

seleccionó la playa adyacente al Aeropuerto de Santa Marta porque tiene

un fácil acceso, muestra explosiones de abundancia de Hypnea a finales del

año con valores máximos para los meses de agosto, noviembre y diciembre

(Márquez 1982), y no se requieren permisos de las autoridades para tomar

las muestras ya que la zona no está dentro del sistema de Parques

Nacionales.

64

En los meses de Agosto y Septiembre de 2005 hubo afluencia de

Hypnea musciformis sobre las playas del Cabo de la Vela, corregimiento

del departamento de la Guajira, evento que se aprovechó para hacer la

recolección de muestra, con la intención de obtener resultados diferentes

en estas dos áreas del Caribe, que se caracterizan porque están dominadas

por dos fenómenos oceanográficos opuestos de gran importancia sobre la

producción marina, el sector del Cabo de la Vela distinguido por una corriente

de surgencia (upwelling) y el sector de Santa Marta determinado por una

corriente de mar afuera (outwelling), así como por su vecindad con la

desembocadura del río Magdalena, fenómenos que producen efectos sobre

la temperatura, salinidad y concentración de nutrientes en los cuerpos de

agua donde se encuentra el alga de estudio.

Para la recolección de muestras se usó el método de línea de

transectos (Sutherland, 1996), que consiste en muestrear a intervalos

regulares de distancia a lo largo de una línea recta, esta línea puede ser

correlacionada con gradientes de factores ambientales, en la playa del

Aeropuerto al trazar la línea recta se observó que cerca de la rocas había

una mayor concentración de algas por lo tanto se muestrearon todos los

puntos ( Figura No 14).

3.2.1 Muestreo en la bahía de Santa Marta El muestreo se llevó a cabo el 21 de Agosto de 2005 a las 8 A.M., en

la zona costera de la playa adyacente al Aeropuerto Simón Bolívar de la

ciudad de Santa Marta, longitud 74º12״34.15 ׳ W; latitud 11º8״48.3 ׳ N (ver

figuras No 15 y16), en el infralitoral en un hábitat rocoso, en compañía de

un biólogo marino de la Universidad Jorge Tadeo Lozano, sede Santa Marta,

quien identificó el alga, e hizo la recolección buceando desde 50 cm hasta

2 m de profundidad, a lo largo de 500 m de costa, se tomaron cerca de 2 Kg

de Hypnea musciformis removiéndola con la mano y verificando que toda

tenía la misma condición de desarrollo.

65

Se tomaron las unidades experimentales en los sitios

demarcados por una X en al figura No 14, que son todos los lugares de la

playa donde se encontraba creciendo de manera natural Hypnea

musciformis. Figura No 14. Área de muestreo en la playa Adyacente al aeropuerto Simón

Bolívar. Las áreas verdes son zonas sumergidas, sobre las que se encuentran

depósitos algales

66

Figura No 15. Lugar de muestreo, playa Aeropuerto Simón Bolivar

Figura No 16 Ubicación de la Playa de muestreo, bahía de Santa Marta

La muestra de Hypnea se lavó varias veces con agua para limpiarla

de macroinvertebrados, epifitos, sedimentos, se enjuagó brevemente con

agua dulce para remover las sales, después se secó al sol, se empacó

cuidadosamente en bolsas de plástico y luego de papel.

67

Cerca al bentos justo encima de las algas, después de la recolección,

se midió la temperatura, se tomó un litro de agua, se colocó en una nevera

oscura en hielo y se trasladó a la Universidad donde se filtró a través de un

filtro Wathman número 44; las muestras se empacaron en hielo en una

nevera.

Tanto las muestras de Hypnea como el agua recolectada se

trasportaron a Bogotá en avión. Una vez en Bogotá se realizó el análisis de

agua. Las muestras de material vegetal se secaron a 25oC en una corriente

aire, durante 48 horas y luego se almacenaron en un lugar fresco y seco.

A esta muestra se le llamará en el texto: Hypnea Santa Marta

3.2.2 Muestreo en el Cabo de la Vela –Guajira- El muestreo se llevo a cabo el 30 de Agosto de 2005 a las 8 A.M. en

la zona costera del corregimiento del cabo de la Vela, longitud 72º8״54.15 ׳

W y latitud 12º11״36.27׳N (Figura No 17), en el infralitoral en un hábitat

arenoso, en compañía de un biólogo marino, quien identificó el alga, e hizo

la recolección a lo largo de 500 m de costa; se tomaron cerca de 2 Kg de

Hypnea musciformis removiéndola con la mano.

Para tomar una muestra representativa se recolectaron las algas

depositadas sobre la playa en línea recta cada 100 metros, hasta cubrir 500

metros de playa (Sutherland, 1996). A esta muestra se le denominara, en el

texto Hypnea Guajira

68

Figura No 17 Ubicación de la playa de muestreo en el Cabo de la Vela Guajira.

La muestra de la especie Kappaphycus alvarezii, (especie exótica)

fue donada por el señor Raúl Rincones y se utilizó para comparar los

resultados del método empleado para Hypnea. Kappaphycus alvarezii es

una especie reconocida a nivel mundial como productora industrial de Kappa

carragenina (Muñoz et al, 2004, Zuccarello et al, 2006)

2.3. Ensayos Experimentales 3.3.1 Análisis de aguas

El análisis de agua de las muestras recogidas en Santa Marta se

realizó de acuerdo con los métodos reportados la en la tabla No 6

Tabla No 6 Métodos AOAC utilizados en el análisis de aguas.

Determinación Métodos

Conductividad 973.40 A.O.A.C.

pH 973.41. A.O.A.C.

Amonio 973.49 A.O.A.C.

Nitratos 973.50 A.O.A.C.

Nitritos 973.76 A.O.A.C.

Fosfatos 973.55 A.O.A.C.

69

3.3.2 Muestras de algas Las muestras tomadas en Santa Marta se encontraban asociadas con

especies como Chaetomorpha sp, corallina, Caulerpa mexicana y

Dyctiota sp y aunque se limpiaron de estas epifitas en el momento de la

recolección, al llegar a Bogotá se revisaron nuevamente las algas al

estereoscopio para retirar algunos residuos animales y vegetales y así

asegurar la limpieza de la muestra.

La muestra de Hypnea proveniente del cabo de la Vela se sometió a

procesos de lavado hasta retirar el máximo posible de impurezas, utilizando

un estereoscopio para observar el proceso. De igual manera se revisó la

muestra de Kappaphycus alvarezii

A continuación se secaron todas las muestras en un flujo de aire

caliente por 48 horas a 25oC, hasta peso constante y se guardaron en un

desecador.

3.3.3. Extracción y purificación de carragenina El proceso de obtención de carragenina contempla cuatro fases que

son: decoloración, extracción, precipitación y secado. Las figuras No 18, 19

20 y 21 representan los ensayos experimentales completos que se

realizaron para cada proceso.

3.3.3.1 Decoloración Se estudiaron Cuatro métodos para decolorar las muestras de

Hypnea y de Kappaphycus alvarezii: Método de peróxido de hidrógeno al

4% ( PTC WO 02/057477), por absorción de los pigmentos sobre carbón

activado (PTC WO.02/057477), utilizando largos períodos de hidratación y

por acción del hipoclorito de sodio (PTC WO 02/057477, PTC WO

2006/062792)

70

3.3.3.1.1 Método de peroxido de hidrógeno Se pesaron 2,000g de alga seca de las dos especies estudiadas, se

hidrataron durante 12horas con 400ml de agua destilada cada una, luego de

lavarlas cuidadosamente se adicionaron 10 ml peróxido de hidrogeno al 4%

(PTC WO 02/057477), se dejó actuar durante períodos de tiempo de 5, 10,

15 minutos, se lavaron nuevamente con abundante agua destilada, se ajustó

el pH a 8,4 y se realizó la extracción de carragenina, tal y como se muestra

en el diagrama de flujo de la figura No 18, Este ensayo se repitió

aumentando la concentración de peróxido al 8%. Todos los experimentos se

realizaron por triplicado para cada especie.

71

72

E ALCOHOL

PURIFICACION POR CONGELAMIENTO

No3-

No2-

PO4-3

NH4+

pH

ConductividadMUESTREO ANALISIS DE AGUA

LAVADO

SECADO A LA SOMBRA

TRANSPORTE

ALGAS

HIDRATACION

DECOLORACION CON H O (10 ml) 2 2

LAVADO

AJUSTE DE pH (8,4 con NaOH1N)

EXTRACCION A EBULLICION (4HORAS)

MEZCLADO LICUADORA

FILTRADO GRUESO RESIDUO

PRECIPITACIÓN EN ALCOHOL

FILTRACIÓN FINARECUPERACION

PROPIEDADES FISICOQUÍMICA :

Absorción atómicCenizasProteína

S

a

D

AJUSTE DE pH

SECADO EN AIRE CALIENTE (40 C)o

Figura No 18. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de carragenina usando peróxido de hidrógeno para retirar el color.

3.3.3.1.2 Método de Carbón activado Una vez extraída la carragenina de las dos especies de algas

ajustando el pH a 8,4 y en el proceso final de separación por filtración al

vacío, el gel se hizo pasar por un filtro que contenía 2g de carbón activado

(PTC WO.02/057477), con el propósito de retirar los pigmentos que dan

color a la carragenina., este procedimiento se encuentra descrito en el

diagrama de flujo de la figura No 19.

El carbón activado seleccionado tenía un área superficial de 80 m2/g

y un tamaño de poro de 150mµ, que se usa para retención de pigmentos

como los carotenos y el azul de metileno.

El procedimiento se realizó por triplicado para las dos muestras de

Hynea y para la muestra de Kappaphycus alvarezii.

73

MUESTREO ANALISIS DE AGUA

LAVADO

SECADO A LA SOMBRA

TRANSPORTE

ALGAS

HIDRATACION

LAVADO



MEZCLADO LICUADORA

FILTRADO GRUESO RESIDUO

AJUSTE DE pH


FILTRACIÓN FINA CON CARBON ACTIVADORECUPERACION DE ALCOHOL


No3-

No2-

PO4-3

NH4+

pH

Conductividad

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS:Absorción atómica

CenizasProteína


Figura No 19. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de kappa

carragenina usando Carbón activado para retirar el color, después de la extracción.

74

3.3.3.1.3 Decoloración con largos períodos de hidratación En los ensayos preliminares se observó que al aumentar el tiempo de

hidratación de las algas se decoloraban, de acuerdo con este resultado se

estudió la extracción de carragenina hidratando las algas en períodos de 12,

24, 36 y 72 horas, como se indica en el diagrama de flujo de la figura No 20;

al final de la extracción se usó hipoclorito de sodio para aclarar la

carragenina obtenida. Para cada especie se realizaron ensayos por

triplicado.

75


LAVADO

SECADO A LA SOMBRA

TRANSPORTE

ALGAS

HIDRATACION POR 72 HORAS

LAVADO



MEZCLADO LICUADORA

FILTRADO GRUESO

DECOLORACION CON NaClO al 5 / (5 ml) oo

RESIDUO

AJUSTE DE pH


FILTRACIÓN FINARECUPERACION DE ALCOHOL


No3-

No2-

PO4-3

NH4+

pH

Conductividad


CenizasProteína


Figura No 20. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de kappa

carragenina usando largos períodos de hidratación para retirar el color, antes de la extracción.

76

3.3.3.1.4 Método del Hipoclorito de Sodio Se pesaron 2,000g de algas secas, de cada una de las especies se

adicionaron 400 ml de agua destilada, para hidratarlas durante doce horas,

luego se lavaron y se sumergieron en 400ml de agua que contenía 10 ml

de una solución de hipoclorito de sodio al 5% por periodos de tiempo que

variaron entre cinco y quince minutos, se filtró, y el residuo se lavó con

abundante agua destilada, se ajustó a pH 8,4 con HCl 1N y se dejó lista

para iniciar el proceso de extracción, tal y como se presenta en la figura No

21. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada especie.

Teniendo en cuenta las experiencias reportadas por el grupo de

investigación de la Universidad Javeriana en la obtención de agar (Montilla y

colaboradores, 2005) donde se trataba la muestra con hipoclorito antes y

después de la extracción, se hizo un procedimiento de blanqueo al final de

la extracción; la carragenina se trató con solución de hipoclorito de sodio al

5% , durante períodos de tiempo que variaron de cinco a diez minutos En la

figura No 21 se aprecia el procedimiento para la obtención de carragenina

usando hipoclorito de sodio para decolorar las algas antes de la extracción y

tratando la carragenina después de la extracción con hipoclorito de sodio.

77


LAVADO

SECADO A LA SOMBRA

TRANSPORTE

ALGAS

HIDRATACION

DECOLORACION CON NaClO al 5% (10 ml)

LAVADO



MEZCLADO LICUADORA

FILTRADO GRUESO


RESIDUO

AJUSTE DE pH




Absorción atómica (metales pesados)Determinación de cenizasPunto de gelificaciónPunto de fusiónEspectro InfrarrojoPerfil de texturaDeterminación de pHDeterminación de humedadProteínaAlmidón

No3-

No2-

PO4-3

NH4+

pH

Conductividad


CenizasProteína


DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FISICOQUIMICAS

Figura No 21. Diagrama de Flujo que muestra la extracción de carragenina usando hipoclorito de sodio para retirar el color, antes y después de la extracción.

78

3.3.3.2 Extracción de carragenina El Procedimiento elegido para la extracción de carragenina es una

modificación de los métodos reportados por Mtolera and Buriyo (2004),

Muñoz et al (2004), Matsuhiro (1995) y Villanueva (2003), obtenido a raíz de

los ensayos preliminares de decoloración. Se pesaron en una balanza

analítica exactamente dos gramos de alga seca, se adicionaron 300 ml de

agua destilada, se mantuvo húmeda la muestra durante doce horas, a

temperatura ambiente, luego se agregaron 10 ml de hipoclorito de sodio al

5% y se dejó decolorar la muestra por quince minutos, al cabo de los cuales

el alga presentó una coloración amarillo claro, casi blanco, a continuación se

lavó con abundante agua destilada redisolviendo en 300ml de agua

destilada, se ajustó el pH de extracción con unas gotas HCl 1N agitando

fuertemente. Después se calentó a ebullición durante cuatro horas

controlando el pH por adiciones sucesivas de NaOH 1N y agitando

continuamente, posteriormente se licuó en caliente por un minuto, se filtró a

través de una malla de nylon, diseñada especialmente para este

experimento, manteniendo la temperatura por encima de 70oC , se adicionó

una porción de 5ml de hipoclorito de sodio al 5%, se dejó actuar durante

cinco minutos, se ajustó el pH con HCl 1N en caliente.

Los valores de pH se ajustaron a 8,0 , 8.4 , 8.6, 9.0 y 10 en cada uno

de los experimentos, estos valores fueron seleccionados de acuerdo con

los reportados en la literatura (Stanley, 1987; Muñoz et al (2004); Mtolera

and Buriyo (2004); Villanueva et al (2003), PTC (WO 02/057477 ).

3.3.3.3 Precipitación La carragenina se precipitó por adición lenta de 300 ml de alcohol

etílico al 95%, una vez el gel endureció se filtró a través de la malla de nylon

y se recogió en cajas de petri. (Mtolera and Buriyo (2004), Muñoz et al

(2004), Matsuhiro (1995) y Villanueva (2003)) La kappa carragenina

obtenida se purificó utilizando el método de congelación a 4oC,

79

descongelación reportado por (Montilla y colaboradores, 2005), para todos

los procedimientos.

3.3.3.4 Secado

Finalmente algunas muestras fueron liofilizadas y otras se secaron a

30oC en un flujo de aire caliente por 12 horas hasta peso constante,

posteriormente se calculó el rendimiento

Este método se utilizó para la especie Kappaphycus alvarezii y para

las muestras de Hypnea recolectadas en Santa Marta y el Cabo de la Vela

3.3.4. Determinación de las propiedades fisicoquímicas Las propiedades fisicoquímicas para caracterizar el gel fueron

seleccionadas de tal manera que la kappa carragenina pueda ser evaluada

según los criterios de la JECFA para ser usado como aditivo en alimentos y

para que pueda ser usada como gel hidroretenedor en agricultura.

Las propiedades fisicoquímicas, punto de fusión y punto de gelificación

se determinaron para las muestras de κ carragenina obtenidas en cada uno

de los 45 ensayos de pH con las diferentes fracciones de Hypnea y

Kappaphycus alvarezii. Con el propósito de controlar y comparar los

valores obtenidos se uso κ carragenina comercial en cada en ensayo.

Para la determinación de las propiedades que dependen del proceso

de gelificación se ensayaron dos concentraciones de KCl para la

preparación del gel , una al 0.5 %p/v de KCl en agua destilada y otra al 1.5%

p/v de KCl en agua destilada, ( Mtolera 2004, ),( Stanley, 1987),(Barboroux,

1984).

80

Los geles de κ carragenina se prepararon al 1.5 %P/v, pesando en

una balanza analítica exactamente 0,3750 g de carragenina y completando a

volumen de 25 ml. (Mtolera and Buriyo, 2004).

3.3.4.1. Análisis de elementos pesados por Absorción atómica Las muestras de algas se prepararon por digestión vía seca, se

pesaron inicialmente cerca de tres gramos de muestra en una balanza

analítica, se quemaron en la llama directamente y luego se calcinaron a

550oC, durante doce horas, se enfriaron en un desecador, se determinó el

peso final y se calcularon las cenizas.

La muestra calcinada se trató con 10 ml de HCl de concentración 1:1

en agua, se calentó a ebullición con agua bidestilada, se filtro y se completo

a volumen de 50 ml, a continuación se leyeron los metales: sodio, potasio,

calcio, magnesio, hierro, manganeso, cobre y cinc en el equipo de Absorción

atómica Perkin Elmer modelo 3100.

El potasio se determinó porque, el contenido de este metal en el alga

y en la kappa carragenina influyen en la fuerza de gel del polisacárido, el

sodio se cuantificó porque forma parte de los reactivos de síntesis y puede

dar información sobre pureza del gel Los demás metales se cuantifican para

dar información sobre la composición de kappa carragenina que es útil en

caso de ser utilizado como gel hidroretenedor en plántulas (Hüttermann et al,

1999) y para explicar diferencias en el análisis de textura y la fuerza del gel

(Michel et al, 1997)

Para determinar contenido de metales en la carragenina extraída se

pesaron cerca de 0,5g de muestra y se calcinaron a 550oC durante 12 horas,

se enfriaron en un desecador durante doce horas, se determinó el peso final

y se calcularon las cenizas.

81

La muestra calcinada se trató con 10 ml de HCl de concentración 1:1

en agua, se calentó a ebullición con agua bidestilada, se filtro y se completo

a volumen de 50 ml, a continuación se leyeron los metales: Sodio, potasio,

calcio, magnesio, hierro, manganeso, cobre y cinc en el equipo de Absorción

atómica Perkin Elmer modelo 3100

3.3.4.2. Punto de Gelificación La determinación del punto de gelificación se realizó preparando 5ml

de suspensión de las soluciones de κ carragenina al 1.5% en KCl 1,5% en

un tubo de ensayo, luego se calentó en un baño María a 90oC hasta

disolución completa, a continuación se enfrió lentamente en un baño de agua

y con agitación constante, cuando gelificó y fue difícil seguir agitando se

midió la temperatura de gelificación. (Mtolera, 2004), (Baeza, 2003).

3.3.4.3. Punto de Fusión Sobre el gel obtenido en la determinación del punto de gelificación se

suspendió una perla de vidrio y se puso al baño maría, el agua se calentó

lentamente y se midió la temperatura de fusión cuando la perla de vidrio se

desplazo hasta el fondo del tubo. (Freile, 2002)

3.3.4.4. Espectros Infrarrojo Existen tres maneras diferentes de disponer las muestras de

polisacáridos para realizar estudios de espectroscopia I.R.: pastilla, película

o suspensión. Para este ensayo se eligió la técnica de preparación de

pastillas.

La κ carragenina previamente seca por liofilización, extraída a cada

uno de los pH de ensayo, se mezcló en un mortero con KBr en una

proporción cercana al 1% y se colocó en un pastillador donde se comprimió

adecuadamente, el material formó una pastilla del diámetro requerido para

tomar el espectro en el equipo. (Stortz,1995), (Chopin, et al 1999)

82

3.3.4.5. Análisis de textura del gel de carragenina Los ensayos de textura de gel se realizaron para las muestras de

carragenina obtenidas a valores de pH diferentes y provenientes de Hypnea

recolectada en Santa Marta, en el Cabo de la Vela y de la especie

Kappaphycus alvarezii. Adicionalmente el ensayo fue realizado para una

muestra de κ carragenina comercial.

Los geles se prepararon dispersando las muestras de κ carragenina

al 1.5% P/v en KCl de concentración 0.5% p/v. También se realizaron

ensayos dispersando la κ carragenina en KCl de concentración 1.5% p/v.

Las soluciones se llevaron hasta ebullición por algunos minutos, se

colocaron en las celdas de medida , se taparon con papel aluminio y se

dejaron en el refrigerador por 20 horas a 4oC. (Villanueva et al. 2004 ; Michel

et al. 1997 y Nickerson, 2005).

La determinación de la fuerza de gel se realizó de acuerdo con la

norma ISO 9665 /1998, que describe ensayos de fuerza sobre Adhesivos

(Coutr,2000; Baeza, 2003) en el equipo Stable Micro systems TA-XT2i, con

los siguientes parámetros :

Velocidad de pre-ensayo: 0.5 mm/s

Velocidad del ensayo: 0.5 mm/s

Velocidad de post-ensayo: 0.5 mm/s

Distancia: 4mm

Velocidad de adquisición de datos : 100pps

Celda: P/0.5R de 5Kg.

3.3.4.5 Determinación del pH El pH se midió usando un potenciómetro previamente calibrado,

colocando el electrodo en una suspensión 1: 100 en agua, a temperatura de

20oC.

83

3.3.4.6 Determinación de la humedad Se pesaron exactamente 0,50000g de muestra de κ carragenina, se

llevaron a la estufa a 105oC por dos horas, se retiraron, se colocaron en un

desecador, se pesaron y luego se llevaron nuevamente a la estufa hasta

peso constante. (JECFA, 2001)

3.3.4.7 Determinación de proteína La determinación de proteína se realizó por el método Kjeldahl para la

muestra de alga recolectada en Santa Marta y para la muestra de k

carragenina que se obtuvo de Hypnea musciformis a pH 8,6.

El método Kjeldahl se fundamenta en la conversión de nitrógeno total

presente en la muestra a sales de amonio, que se valoran posteriormente

por volumetría ácido-base, consta de de tres etapas, digestión, destilación

por arrastre del amoniaco y valoración.

En la variante Steyemark, (AOAC,973.48) el hidróxido de amonio se

recoge sobre ácido bórico no valorado y se titula directamente el borato de

amonio que se forma, con HCl estandarizado., las reacciones son:

Digestión:

Proteína(s) + H2SO4(l) + catalizador → CO2(g) + H2O(g) + NH4HSO4(ac)

Liberación de amoniaco NH3

NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) → NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)

Arrastre con vapor

NH3(g) + H2O(g) → NH4OH(ac)

Recolección

NH4OH(ac) + H3BO3(ac) → NH4H2BO3 + H2O

84

Titulación

NH4H2BO3 + HCl(ac) → NH4Cl(ac) + H3BO3

Una vez obtenido el valor de la titulación se calcula el contenido de

nitrógeno proteico. Esta determinación tiene como propósito obtener un valor

de contenido de proteína que está relacionado con el contenido de

carragenina en el alga, en el laboratorio de biotecnología de la Universidad

Javeriana, en ensayos para la extracción de agar se ha encontrado que a

mayores contenidos de proteína hay bajos porcentajes de polisacárido.

3.3.4.8 Determinación de la presencia de almidón Floridean. Para la determinación de almidón Floridean se realizó el siguiente

procedimiento ( Pedroza et al, 2006).

Preparación de la solución A ó solución de sales

Se Pesaron 0.936g de NaCl, 6.99g de KH2PO4 y 0.53g de

Na2HPO4.12H2O, se disolvieron todos los componentes en 50 ml de agua

destilada, se ajustó el pH a 5.2 con un potenciómetro.

Preparación de Solución B ó solución de Yodo

Se pesaron 2.2 g de KI y se disolvieron en 30 ml de agua destilada,

se pesó 1.g de I2 y se adicionó a la anterior solución se aforo a 50 ml de

con agua destilada

Preparación de la solución C

A 2 ml de la solución B se añadieron 20 g de KI, y se aforo a 500 ml

con agua destilada.

Prueba para la solución concentrada de carragenina

Se pesó 0.1 g de carragenina y disolvió en 20 ml de agua destilada,

se agregaron 50 ml de agua, se llevó por 1 minuto al horno microondas, se

adicionaron 10 ml de solución de sales (0.936 g NaCl, 6.99 KH2PO4, 0.56 g

Na2HPO4), finalmente se ajustó el pH a 5.6 y se aforó a 100 ml con agua

destilada .

85

A un mililitro de la solución anterior se le adicionó un mililitro de la

solución C y se esperó el desarrollo de color (rojo para floridean y azul para

almidón).

El almidón Floridean se determina porque es una impureza reconocida

en la carragenina, ya que es posible que sea insoluble en alcohol y precipite

con el polisacárido. (Yu S et al, 2002)

3.4 Diagrama general de los procedimientos En la figura No 22 se presenta un diagrama general del procedimiento

empleado para la extracción de kappa carragenina que contempla los pasos

de decoloración, extracción, purificación, secado y caracterización mediante

propiedades fisicoquímicas realizado a todas las muestras de carragenina,

en todos los tratamientos y para las dos especies de algas

3.5 Programa estadístico de soporte Para todos los ensayos se utilizó el Programa estadístico

Statgraphics Plus 5.1, el análisis ANOVA se corrió previa verificación de

normalidad e independencia.

3.6 Diseño Experimental

Se estudiaron simultáneamente los efectos de los factores pH de

extracción y procedencia de la muestra sobre: el rendimiento de κ

carragenina, el punto de fusión de la κ carragenina, el punto de gelificación

de la κ carragenina y la fuerza de gel, mediante un arreglo factorial con un

modelo de efectos fijos y un diseño completamente aleatorizado.

La variable de interés, pH de extracción tenía cinco niveles: 8.0, 8.4,

8.6, 9.0 y 10.

86

La variable de interés, procedencia de la muestra tenía tres niveles,

Hypnea recogida en la playa adyacente al aeropuerto de Santa Marta,

Hypnea recogida en una afluencia en el Cabo de la Vela y Kappaphycus

alvarezii una especie que se caracteriza por altos contenidos de κ

carragenina.

Cada experimento se realizó por triplicado, de tal manera que se

efectuaron 45 procedimientos de extracción que se pueden describir como

aparece en la tabla No 7.

Tabla No 7. Diseño experimental factorial de dos factores. En cada cuadro aparecerá la variable respuesta (ejemplo: % carragenina) obtenida para la

combinación pH- muestra

Factor: pH de extracción Factor:

muestra 8.0 8.4 8.6 9.0 10

Hypnea

Santa Marta

Hypnea

Guajira

Kappaphycus

alvarezii

Este mismo arreglo se efectúo utilizando como variables de respuesta

punto de fusión, luego punto de gelificación, fuerza de gel y las

determinaciones por absorción atómica.

La muestra fue aleatoria e independiente en cada experimento con

un nivel de confianza del 95%. Los datos fueron analizados mediante de

ensayos de normalidad y homogeneidad de varianza.

87

Figura No 22. Diagrama general del procedimiento para la extracción de kappa carragenina


LAVADO

SECADO A LA SOMBRA

TRANSPORTE

ALGAS

HIDRATACION

DECOLORACION CON NaClO al 5% (10 ml)

LAVADO

AJUSTE DE pH (8,0/8,4/8,6/9,0/10 con NaOH1N)


MEZCLADO LICUADORA

FILTRADO GRUESO


RESIDUO

AJUSTE DE pH ( 8,0/8,4/8,6/9,0/10 )




Absorción atómica (metales pesados)Determinación de cenizasPunto de gelificaciónPunto de fusiónEspectro InfrarrojoPerfil de texturaDeterminación de pHDeterminación de humedadProteínaAlmidón

No3-

No2-

PO4-3

NH4+

pH

Conductividad


CenizasProteína


88

4 Resultados y análisis de resultados 4.1 Análisis de aguas

En Santa Marta se tomaron diez muestras de agua para el análisis, en

cada uno de los puntos señalados en la figura No.14 Los resultados

obtenidos se presentan en la tabla No 8, allí se aprecia que en todos los

puntos de muestreo el agua tiene la misma composición, lo que sugiere que

las algas recolectadas son una muestra representativa de la playa del

aeropuerto Simón Bolivar.

Tabla No 8. Análisis de aguas

Muestra No NO3- mg/L NO2

- mg/L PO4-3 mg/L NH4+ mg/L Conductividad

UPS pH

1 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 2 2 0,05 0,3 0,1 10,6 7,8 3 1 0,05 0,3 0,1 10,6 7,8 4 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 5 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 6 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 7 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 8 1 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 9 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8 10 2 0,05 0,3 0,1 11,0 7,8

Promedio 1,6 10,9

Para las muestras tomadas en el Cabo de la Vela Guajira, no se

realizaron análisis de agua porque las algas provienen de lugares que

pueden estar mar adentro y el análisis del agua no correspondería a las

condiciones de crecimiento de la muestra.

4.2 Decoloración de la muestra de algas Las muestras de kappa carragenina de valor comercial deben tener

un color beige, amarillo claro casi blanco, (Villanueva et al, 2003), por esa

razón las algas rojas se deben someter a tratamientos físicos o químicos,

para retirar los pigmentos que naturalmente poseen y que se encuentran

89

descritos en el numeral 2.8.4, a este proceso se le conoce como

decoloración.

4.2.1 Decoloración con peróxido Las algas tratadas con peróxido de hidrógeno al 4% durante cinco

minutos mostraron un color verde claro, pero luego del procedimiento de

extracción, purificación y secado, la carragenina presentaba un color amarillo

verdoso, probablemente debido a residuos de clorofilas y carotenos que no

fueron afectados por el peroxido de hidrogeno, por lo tanto se realizaron

ensayos dejando actuar el peroxido de hidrogeno por períodos de hasta 15

minutos pero no se obtuvieron mejoras notables en el color del producto

final.

Se realizaron algunos ensayos aumentando la concentración de

peróxido de hidrógeno hasta el 8% pero no hubo mejoras significativas en el

color de la carragenina. El método de purificación por congelación,

descongelación no fue suficiente para obtener una carragenina de color

claro.

Este procedimiento presentó además, serios inconvenientes porque

la reacción de oxidación es muy espumosa, formando soluciones que son

difíciles de agitar, homogenizar y filtrar

La extracción de kappa carragenina se realizó a pH 8,4 de acuerdo

con el procedimiento que se muestra en la figura No 18, pero debido a que

el producto no era de un color claro como el esperado, no se le realizaron

ensayos fisicoquímicos de composición y pureza.

Los resultados obtenidos con el peroxido de hidrógeno fueron iguales

para las dos muestras de Hypnea y la muestra de Kappaphycus alvarezii.

90

4.2.2 Decoloración con carbón activado Los resultados obtenidos por la absorción de pigmentos sobre el

carbón activado, no fueron satisfactorios ya que, después de la filtración la

carragenina presentaba un tinte rosado, lo que indica que la adsorción de

ficoeritrinas no fue suficiente, además resultó ser un procedimiento muy

dificultoso porque la carragenina forma un gel que se filtra muy lentamente a

través del carbón.

Las experiencias se realizaron por triplicado para cada especie de

alga, pero no se encontró ninguna diferencia en el color de la carragenina

que pudiera ser atribuida a la especie.

4.2.3 Decoloración con largos períodos de hidratación Ensayos preliminares mostraron que al aumentar el tiempo de

hidratación se retiraban algunos pigmentos de las algas, por lo tanto se

ensayó el procedimiento mostrado en el diagrama de flujo No 20, en este

experimento la muestra se hidrató durante 24, 36, 48 y 72 horas, a

continuación se realizó la extracción de kappa carragenina por triplicado de

las dos especies de algas, a pH 8,4, solamente cuando se hidrató durante 72

horas se logró extraer algunas ficoeritrinas, pero la decoloración no fue

suficiente para obtener una carragenina clara. Por lo tanto a estas muestras

no se les realizaron pruebas fisicoquímicas.

4.2.4 Decoloración por tratamiento con hipoclorito de sodio A continuación se decidió utilizar un procedimiento químico para

decolorar las muestras de algas, el tratamiento con hipoclorito de sodio

como agente oxidante se muestra en la figura No 21, las muestras de

kappa carragenina presentaron un color más claro que el obtenido en todos

los tratamientos anteriores.

91

La reacción que describe el procedimiento de decoloración es:

NaClO + H2O → HClO + NaOH

Cuando el hipoclorito de sodio se coloca en agua se produce el ácido

hipocloroso HClO quien actúa como agente oxidante sobre cada uno de los

pigmentos que hay en las algas rojas, por ejemplo la reacción sobre los

dobles enlaces de las ficoeritrinas sería:

C=C + HClO + 5H2O → Cl- + 5H+ C(OH)-CH

Una vez realizada la extracción y antes de la precipitación se trató el

producto nuevamente con 5ml hipoclorito de sodio al 5% durante cinco

minutos, como se aprecia en el diagrama de flujo de la figura N 21, Los

resultados obtenidos mostraron una carragenina libre de pigmentos.

Los ensayos se realizaron por triplicado, para las dos especies de

algas y se obtuvieron resultados similares, se intentaron tratamientos más

fuertes con hipoclorito de sodio con concentraciones hasta del 8% como se

sugiere en la patente PTC WO 02/057477 ó con tiempos de reacción más

largos, pero no hubo cambios significativos en la apariencia de la kappa

carragenina. Como este polisacárido es sensible a los valores extremos de

pH (Yu, G, et al, 2002), se decidió decolorar a condiciones suaves, tiempos

cortos y concentraciones bajas de hipoclorito.

En la figura No 23 se presenta una comparación de los tratamientos

de decoloración, en la fotografía superior se muestra el color de kappa

carragenina, cuando fue tratada con peróxido, carbón activado o períodos de

hidratación largos, se asemeja a un plástico amarillo, que puede tener tintes

rojizos o verdes, estos colores no aseguran un aspecto agradable de kappa

carragenina para el mercado, aunque se someta a procesos de molienda.

92

Figura No 23. Muestras de kappa carragenina obtenidas con diferentes tratamientos de decoloración

Figura superior: Kappa carragenina tratada con peroxido y carbón activado para

decolorar

Figura inferior: kappa carragenina decolorada con hipoclorito de sodio

La fotografía inferior corresponde a kappa carragenina obtenida

usando hipoclorito de sodio para decolorar antes y después de la extracción.

Allí se aprecia un color más claro con aspecto más atractivo para el

comercio.

El aspecto final no depende de la especie de alga seleccionada para

la extracción, se obtuvo el mismo resultado para Hypnea que para

Kappaphycus.

93

Estos resultados permitieron seleccionar el método de hipoclorito de

sodio, mostrado en la figura No 21, para decolorar e iniciar los estudios de

extracción de kappa carragenina.

4.3 Extracción de kappa carragenina

Debido a que el polisacárido es sulfatado las mejores extracciones se

realizan a valores de pH superiores a 7, en la literatura se reportan

separaciones a valores de pH 8,4 y 9,0 con rendimientos que oscilan entre el

24% y el 37%, (PTC WO 02/057477; Mtolera y Buriyo, 2004).

Con el propósito de establecer el mejor pH para la extracción,

entendido como aquel en donde el rendimiento sea mayor, se seleccionaron

los valores de pH 8,0; 8,4; 8,6; 9,0 y 10, porque presentan niveles

superiores (10) e inferiores (8,0) a los reportados.

Como la decoloración se realizó con una solución hipoclorito de sodio,

el valor de pH de las algas era cercano a 10, así que, para retirar el

exceso de solución, se lavaron las muestras exhaustivamente con agua

destilada, antes iniciar el procedimiento de extracción.

Mtolera y Buyiro ( 2004) sugieren agregar 3g de NaOH sólido por

cada 20g de algas secas, licuar y calentar durante cuatro horas, con este

procedimiento obtienen rendimientos del 25%, pero no controlan el pH

durante la extracción. Yakovleva y colaboradores (2001), hicieron

extracciones a altas concentraciones de KCl en caliente, sin controlar el pH

y reportan rendimientos del 30%, Yu, G. y colaboradores (2002) utilizaron

procedimientos con NaOH y KCl simultáneamente a pH 9,0 con

rendimientos de 30%

94

Conociendo estos resultados y los reportes de Yu, G y colaboradores

(2002), que indican que el polisacárido se hidroliza a valores altos de pH, con

una perdida significativa de viscosidad, generando bajos puntos de

gelificación y bajas fuerzas de gel, se decidió hacer una modificación al

procedimiento, que no se encuentra reportada en la literatura, y que consiste

en realizar la extracción a punto de ebullición ajustando el pH con una

solución diluida de NaOH (1N ) y controlando los valores de pH durante las

cuatro horas de extracción. La figura 22 presenta el procedimiento

desarrollado en esta investigación para determinar la cantidad máxima de

carragenina que se puede obtener a partir de las dos especies de algas

rojas.

El tiempo y la temperatura usados en este procedimiento de extracción

se tomaron del protocolo propuesto por Mtolera y colaboradores (2004) y de

la patente PTC WO 02/057477, luego de cuatro horas de calentamiento se

obtuvo un gel de color amarillo claro, que se licuó y se filtró, el residuo,

generalmente tallos gruesos que no fueron atacados por el álcali, se

separaron. Para decolorar nuevamente el gel obtenido, se adicionó

hipoclorito de sodio, en las condiciones descritas en el procedimiento. Las

soluciones a cualquier pH y provenientes de cualquier especie de alga se

tornaron claras.

En la reacción que ocurre al tratar las algas con una solución alcalina

durante cuatro horas se retiran grupos sulfato y se forman los anillos de 3-6

anhidrogalactosa, que le dan las características fisicoquímicas de viscosidad

y fuerza del gel a la kappa carragenina.

95

4.4 Precipitación Se aprovechó que el polisacárido kappa carragenina es insoluble

en soluciones alcohólicas; para separarlo de la solución madre y debido a

que la propuesta metodológica está orientada a obtener un producto que

pueda ser utilizado en la industria alimenticia, se seleccionó etanol como

agente precipitante. En la literatura se reportan las mejores extracciones con

etanol absoluto, pero este sería un proceso costoso para la industria, por lo

tanto se utilizó etanol al 95%, como agente precipitante (Mtolera y

colaboradores (2004), JECFA (2001)).

Los resultados mostraron un precipitado de color claro, que

difícilmente se separa de la solución. Después de varios ensayos se

encontró que una precipitación en caliente con un enfriamiento lento

produce geles duros fáciles de filtrar, como el que se muestra en las figuras

No 24 y 25

Figura No 24. Precipitación de kappa carragenina con etanol al 95%

El método de purificación utilizado consistió en congelar la muestra a

4OC, durante seis horas y descongelarla, las impurezas solubles en agua

formaron una fase diferente que se separó del gel, después se filtró y se

obtuvo una carragenina como la que se presenta en la figura No 25, la foto

superior presenta un gel fuerte, homogéneo e incoloro y la foto inferior

permite apreciar de cerca la apariencia del gel.

96

Figura No 25. kappa Carragenina purificada y filtrada

Foto superior kappa carragenina recién filtrada. Foto inferior acercamiento para ver detalles

del gel.

4.5 Secado La muestra de kappa carragenina filtrada y purificada, se puede secar

en la estufa 30 o 40 oC, durante doce horas tal y como se reporta en la

literatura.(PTC WO 02/057477), los ensayos preliminares de secado

indicaron que en estas condiciones, se obtiene una carragenina con

97

aspecto plástico, difícil de triturar (figura No 26.b) y la acción del calor puede

oscurecer la muestra (figura No 26.a), aunque se utilice una estufa al vacío,

estos resultados llevaron a proponer dos nuevos métodos de secado para

la carragenina: liofilizado y secado con aíre forzado.

En ambos casos: liofilizado o secado con aire forzado, la carragenina

se obtuvo como un polvo de color claro que se deja moler y tamizar al

tamaño de partícula deseado. En la figura No 26 se aprecia una

comparación del aspecto de una carragenina obtenida utilizando liofilización

o secado con aire (26c), con una carragenina secada en estufa (26a)

Figura No 26. Aspecto que adquiere un gel de kappa carragenina de acuerdo con el método de secado

23.a 23.b 23.c

26a kappa Carragenina seca en estufa a 30oC durante 12 horas

26b. kappa Carragenina seca en estufa al vacío a 30oC durante doce horas

26c. kappa Carragenina liofilizada o seca en estufa de aire forzado.

Observando los resultados anteriores, se decidió utilizar la estufa de

aire forzado para el proceso de secado, ya que el equipo se encuentra

disponible en la Universidad. La liofilización es un procedimiento cotoso y de

difícil acceso, sobre todo en la industria, por esta razón solamente se

liofilizaron las muestras enviadas para realizar análisis infrarrojo.

98

4.6 Rendimiento de kappa carragenina

Una vez seca la carragenina hasta peso constante, se calcularon los

datos de rendimiento con base en el peso seco de alga. Las comparaciones

se realizaron sin olvidar que los orígenes de las muestras son diferentes,

pero se quiere dar un reporte de la cantidad de carragenina que se puede

extraer comercialmente de cada una de las muestras.

Los resultados obtenidos en la extracción de carragenina se muestran

en la tabla No 9, donde se aprecia en la columna 1 el nombre y la

procedencia de la muestra de alga y en el las demás columnas el

rendimiento de carragenina en porcentaje en peso obtenido a cada pH en

ensayos por triplicado. Tabla No 9. Carragenina obtenida en función de la especie y el pH.

% En peso seco de carragenina Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0

14,97 20,00 44,97 40,38 23,07 15,18 21,09 47,27 38,75 24,05

Hypnea musciformis Santa Marta

12,00 20,05 47,46 39,05 24,25 11,41 27,68 82,04 72,86 60,00 12,05 29,03 81,94 70,00 61,50

Kappaphycus alvarezii 11,44 28,04 80,00 71,95 60,09

7,09 13,80 21,12 18,00 15,00 9,20 12,90 20,12 17,50 14,00

Hypnea musciformis Guajira

9,19 14,58 18,19 17,80 14,60

Para el análisis de resultados se utilizó una prueba ANOVA corrida al

95% de confianza, los resultados presentados en el Anexo estadístico No

7.2.1 muestran que hay normalidad en los residuales, por lo tanto la

muestra proviene de una población con distribución normal.

En las figuras No 27 y No 28, se aprecia que los factores especie y

pH tienen efectos sobre el rendimiento y que existe además interacción entre

Estos factores a pH 8,0. En el anexo estadístico 7.2.1, se muestra

que los mayores rendimientos promedio (49,23%) se obtuvieron a pH 8,6

99

para las dos especies, en los valores de pH 8,0 y 8,4 los rendimientos son

bajos 11,4 y 20,8% respectivamente, debido a la hidrólisis de polisacárido, a

valores de pH 9,0 y 10 se presentan rendimientos de 42 y 33%

respectivamente, que aunque se pueden considerar buenos, se obtiene

mejores rendimientos a pH 8,6

El análisis estadístico evidencia que las medias de los grupos por

especie y pH son homogéneas (ver intervalos LSD. Anexo 7.2.1) y

presentan diferencias estadísticamente significativas, así obtener

carragenina a partir de Hypnea recolectada en la Guajira da rendimientos

cercanos al 15%, mientras que de Hypnea recogida en Santa Marta da

rendimientos cercanos al 29% y la especie Kappaphycus se muestra

como la que provee mayor cantidad de carragenina a cualquier pH con

valores cercanos al 51%. Sin embrago la especie de interés es Hypnea por

que ella se encuentra de manera natural en las playas del Caribe

Colombiano.

Revisando los valores obtenidos en % de carragenina para Hypnea se

observa que se obtienen mejores resultados con la muestra adquirida en

Santa Marta (29%) que con la muestra recolectada en al Guajira ( 15%) a

cualquier pH, esto puede ser debido a que la muestra tomada en Santa

Marta estaba fresca y creciendo en su habitad natural, mientras que la

recolectada en la Guajira fue llevada a la playa por las corrientes marinas y

se desconoce el tiempo que permaneció sometida a procesos de

degradación natural.

Figura No 27 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por

especie

100

4.2 Purificación 4.3 Caracterización Física

Rendimiento de Carragenina en función de la especie

Especie

rend

imie

nto

pH88,48,6910

0

20

40

60

80

100

HYG HYS KP

HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira

HYS Muestra de Hypnea recolecta en la playa del Aeropuerto de Santa Marta

KP muestra de Kappaphycus alvarezii .

Figura No 28 Resultados obtenidos en la extracción de carragenina por pH

La especie Kappaphycus alvarezii ha sido reconocida en el mundo

Rendimiento de Carragenina en función del pH de extracción

rend

imie

nto

EspecieHYGHYSKP

0

20

40

60

80

100

8 8,4 8,6 9 10

pH

La especie Kappaphycus alvarezii ha sido reconocida en el mundo

por su capacidad de producir carragenina (Yu. S et al ; 2002, Ask et al,

101

2002), por tal razón se usó como patrón de comparación en esta

investigación, sin embargo la figura No 28 muestra que esta especie es más

sensible a los cambios de pH en el procedimiento de extracción, el

porcentaje de carragenina obtenido pasa de 11,6 % a pH 8,0 a 81,3% a pH

8,6., mientras que la especie Hypnea exhibe cambios menos bruscos.

Mtolera y Buriyo (2004) reportan procedimientos de extracción de k

carragenina con rendimientos entre el 20 y el 35%, sin controlar el pH de

extracción, el protocolo aquí reportado da mejores resultados con

porcentajes de extracción hasta del 47% a pH 8,6, para Hypnea

musciformis.

El rendimiento obtenido para Hypnea con este protocolo es mejor

que el presentado por otros investigadores, Yakovleva y colaboradores

(2001) reportan hasta un 35,5% de k carragenina obtenida de Tichocarpus

crinitus.

4.7 Caracterización Fisicoquímica de la carragenina 4.7.1 Espectros Infrarrojo Con el propósito de verificar la calidad de la carragenina obtenida se

tomaron los espectros Infrarrojo de las muestras extraídas a cada uno de los

valores de pH . En la Figura No 30 se presenta el espectro I.R. para una

muestra de carragenina obtenida a pH 8,6 de la especie Hypnea recolectada

en Santa Marta, allí se aprecia una señal en 1267 cm-1 que corresponde a

la tensión de la unión C-O-S indicando la presencia del enlace ester sulfato

( ver figura No 29 ), la señal en 928 cm-1 se asigna a la tensión del enlace

de 3,6 anhidrogalactosa, (figura No 25); la señal en 848 cm-1 indica la

presencia de galactosa 4 – sulfato. ( Sekkal et al 1993). La ausencia de una

banda ancha centrada en 830cm1 que corresponde a la galactosa- 2 sulfato

indica que el polisacárido no es lambda carragenina, de igual manera la

102

ausencia de la señal fuerte en 805cm-1, correspondiente al enlace 3-6

anhidrogalactosa -2 sulfato indicó que la muestra no es iota carragenina.

(Matsuhiro y Miller, 2002), Estos resultados permitieron confirmar que el

producto obtenido era mayoritariamente Kappa carragenina. El análisis

infrarrojo coincide con los estudios reportados por Villanueva y

colaboradores, (2003) , Watt y colaboradores, (2003) y Chopin y

colaboradores (1999)

Figura No 29 Dimero de la estructura básica de la kappa carragenina

103

4.7.2 Punto de gelificación Los puntos de gelificación se muestran en la tabla No 10 del Anexo y

en la figura No 31; para el estudio de los datos se realizó un análisis ANOVA

al 95% de confianza que se puede ver en el anexo estadístico (7.2.2).

Los resultados estadísticos muestran que hay incidencia del pH en el

punto de gelificación, así en la figura No 31 se observa que los valores de

punto de gelificación son bajos a pH 8,0, (33,3oC), a pH 9,0 (33,4oC) y a pH

10 (32,5oC) y altos a pH 8,6 (37,6oC) y pH 8,4 (36,1 oC)

Figura No 31 Estudio del punto de gelificación en función de la especie

Figura No 4. Los HYG muestra de Hypnea obtenida en un arribazon en el Cabo de la Vela Guajira

Punto de gelificación vs Especie

Especie

Pun

to d

e G

elifi

c

35

ació

n (o

C)

pH88,48,6910

31

33

37

39

HyG HyS KP

HyG Muestra de Hypnea recolecta en la Guajira


KP muestra de Kappaphycus alvarezii

El estudio muestra, también, que el punto de gelificación no depende

de la especie y que no hay interacción entre los factores pH y especie .

105

La Figura No 32 ilustra que no hay diferencias en el punto de gelificacción

que estén determinadas por la especie de donde se ha extraído la

carragenina

Un procedimiento de Duncan de comparaciones múltiples, que puede

ser consultado en el anexo estadístico 7.2.2, revela que no hay diferencias

significativas entre los valores de puntos de gelificación para valores de pH

8,0 (33,3oC) y 9,0 ( 33,4 oC), es decir que estos datos forman un grupo

homogéneo, de igual manera no hay diferencias entre valores de pH 8,0

(33,3 oC) y 10,0 (32,5 oC) ni entre valores de pH 9,0 (33,4 oC) y 10,0 (32,5 oC),

esto significa que a valores de pH altos y bajos la carragenina extraída tiene

puntos de gelificación bajos, probablemente debido a la fracción hidrolizada

por el efecto del pH.

Figura No 32. Estudio de los puntos de gelificación en función del pH

En estos datos se aprecia que el pH de extracción de la carragenina no

afecta significativamente el valor del punto de gelificación, pero es este

punto es dependiente de la especie, así Hypnea recolectada en Santa Marta

presenta los mayores puntos de gelificación a 37,9oC mientras que Hypnea

Punto de gelificación vs pH

pH

o

31Pun

t d

e G

elifi

caci

ón (o

C)

ESpecieHyGHySKP

33

35

37

39

8 8.4 8,6 9 10




106

Pero es importante recordar que la metodología en la determinación

del punto de gelificación puede estar afectando los resultados, ya que la

técnica presentó muchos inconvenientes cuando se realizaron las lecturas

justamente a los pH bajos (8,0) y altos (9,0 y 10,0), es probable que estos

valores sean menores a los registrados y que se requiera de otro estudio,

para encontrar los puntos de gelificación, con mayor precisión, de las

carrageninas obtenidas a pH altos y bajos. Sin embargo como los mejores

rendimientos se obtuvieron a pH 8,6 sólo se tendrá en cuenta este punto de

gelificación para compararlo con los resultados reportados en la literatura.

Mtolera y Buriyo (2004), reportan puntos de gelificación entre 50,50 oC

y 58,75oC para carrageninas extraídas a partir de Hypnea musciformis

recolectada en la Bahía Oyster, pero no reportan pH de extracción; los

valores de punto de gelificación son muy superiores a los obtenidos en este

ensayo, sin embargo Stanley (1987 ) reporta puntos de gelificación para

carrageninas entre 15 y 65oC, para muestras preparadas en KCl al 1%. La

variación en el punto de gelificación se puede asignar al contenido de 3,6

anhidrogalactosa en la carragenina, así puntos de gelificación bajos se

atribuyen a bajos contenidos de 3-6 anhidrogalactosa, pero, si bien es cierto

que un tratamiento alcalino promueve la formación de este anhídrido,

también se propician reacciones de hidrólisis que disminuyen el punto de

gelificación, para dilucidar mejor este efecto se realizaron ensayos de fuerza

de gel que se explicarán más adelante. 4.7.3 Punto de fusión

En el Anexo de tablas, en la tabla No 11 se describen los puntos de

fusión de la carragenina, en ella se aprecian las casillas correspondientes a

los valores de pH 10 vacías, porque experimentalmente no fue posible

determinar el punto de fusión, ya que estas muestras a pesar de gelificar no

resistían el peso de la esfera de cristal que se usa para determinar el punto

de fusión.

107

El análisis de ANOVA se realizó obviando el pH 10 y los resultados se

presentan en el anexo estadístico 7.2.3, este estudio realizado con el 95%

de confianza manifiesta que el punto de fusión depende del pH al que se

extrae la muestra y depende de la especie seleccionada para el estudio, pero

no se advierte una interacción entre la especie y el pH, lo que significa que

cada factor incide de manera independiente sobre los resultados del punto de

fusión. Los valores medios más altos para el punto de fusión se encuentran

para Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta ( 63,16oC) y los más

bajos para Hypnea musciformis recolectada en la Guajira ( 48,33oC). En la

figura No 33 se aprecia además que la especie Kappaphycus alvarezii

tiene valores de punto de fusión superiores ( 57,91oC) a Hypnea Guajira

pero inferiores a Hypnea Santa Marta.

Figura No 33. Estudio de puntos de fusión de kappa carragenina en función del pH.

En la figura No 7 se aprecia que los valores más altos de punto de fusión se

encuentran a pH 8,4 y los valores más bajos se ubican valores de pH 9,0 y

8,0, es decir en los extremos tal y como se registró en los puntos de

gelificación.

Punto de Fusión vs pH

pH

Pun

t

46

o de

Fus

ón o

C

ESPECIEHyGHySKP

50

54

58

62

66

8 8,4 8,6 9




108

Figura No 34 Estudio de puntos de fusión de kappa carragenina en función

de la especie.

Punto de Fusión vs Especie

ESPECIE

Pun

to d

e Fu

són

oC

pH88,48,69

46

50

54

58

62

66

HyG HyS KP




El contraste múltiple de rangos presentado en el anexo estadístico

7.2.3 manifiesta que los grupos de datos conformados por las especies

Hypnea musciformis Guajira y Kappaphycus alvarezii tienen un grupo de

medias entre las cuales no hay diferencias estadísticamente significativas,

mientras que las parejas de medias de Hypnea musciformis Santa Marta y

Kappaphycus alvarezii e Hypnea musciformis Guajira con Hypnea

musciformis Santa Marta, si tienen diferencias en las medias que son

estadísticamente significativas.

Los valores de punto de fusión para k carragenina, extraída de

Hypnea musciformis, reportados por Mtolera y Buyiro (2004) están entre

los 68 y 69oC, estos resultados son cercanos a los determinados para la

109

muestras obtenidas a pH 8,4 de Hypnea musciformis Santa Marta,

(64,7oC).

Stanley (1987 ) reporta puntos de fusión entre 55 y 85 oC para

muestras de carragenina obtenida a partir de Kappaphycus alvarezii, los

resultados de este ensayo coinciden con la literatura, porque como se

muestra en la figura No 34 a pH 8,4 la carragenina extraída de

Kappaphycus alvarezii tiene punto de fusión de 62.3oC.

La variación en los puntos de fusión se debe a la diferencia en el

contenido de 3-6 anhidrogalactosa, así altos puntos de fusión sugieren

mayores contenidos de 3-6 anhidrogalactosa, que se obtienen gracias a la

extracción alcalina realizada, es por eso que a pH bajos el punto de fusión

es menor.

La influencia del factor especie en el punto de fusión se puede explicar

debido a que el contenido de 3-6 anhidrogalactosa formado en el alga,

depende de las condiciones de crecimiento y de condiciones climáticas.

Según Yaphe (1998) el polisacárido en la pared celular de las algas se forma

en mayor cantidad y con mayor contenido de 3-6 anhidrogalactosa en algas

que crecen en presencia de fuertes corrientes y aguas poco calmadas, de

esta manera el alga se aferra al litoral rocoso impidiendo que las corrientes

la arranquen de su habitad, de acuerdo con Yaphe se debe encontrar

diferente contenido de anhidrogalactosa dependiendo de la especie y del

lugar donde habita. Y como el contenido de anhidrogalactosa está

relacionado con el punto de fusión se esperarían diferentes puntos de fusión

para k carragenina extraída de diferentes especies, en este caso Hypnea y

Kappaphycus . (ver anexo estadístico 7.2 3 , contraste de rangos múltiples).

Cuando se trata de la misma especie, en este caso Hypnea

musciformis, creciendo en condiciones climáticas disímiles, se deben

110

encontrar diferencias en el contenido de 3-6 anhidrogalactosa, con seguridad

las muestras recolectadas en el arribazon del Cabo de la Vela, tenían habitad

diferente a las recogidas en Santa Marta, esta es la razón por la cual en el

contraste múltiple de rangos según especie, que se puede observar en el

anexo estadístico, se establecen diferencias significativas entre Hypnea

Santa Marta e Hypnea Guajira en el punto de fusión.

No obstante los puntos de fusión más altos no corresponden con las

condiciones para obtener mejores rendimientos. Los mejores rendimientos

se obtienen de Kappaphycus alvarezii a pH de extracción de 8,6 y los

mayores puntos de fusión los presenta la k carragenina producida de

Hypnea Santa Marta a pH 8,4.

4.7.4 Análisis de textura El estudio de textura, inicia con la determinación de la fuerza de gel,

que se realizó con los estándares reportados en la literatura para la

determinación de la textura de geles. (Coutr,2000; Baeza, 2003). La Tabla No

13 muestra la respuesta (fuerza de gel), en función del pH y la especie, para

soluciones de carragenina al 1,5%, preparadas en KCl al 1,5%, nuevamente

los datos fueron analizados con test ANOVA con el 95% de confianza.

Los resultados dejan ver que hay una incidencia estadísticamente

significativa del pH y la especie en los valores de fuerza de gel. (ver anexo

estadístico 7.2. 4)

En la figura No 35 se aprecia que las mayores fuerzas de gel se

presentan a pH 8,4 (909g/cm2) y 8,6 (732g/cm2) para la especie Hypnea

Santa Marta. Resultados coincidentes con los puntos de fusión y gelificación,

los valores de pH muy altos o muy bajos dan las menores respuestas,

indicando que hay una hidrólisis del polisacárido.

111

Figura No 35 Estudio de Fuerza de gel de kappa carragenina en función de la especie.

Fuerza de Gel en KCl al 1,5% vs Especie

especie

0

200

400

600

800

1000

fuer

za

HYG HYS K

pH88,48,69




Un pH básico durante la extracción forma 3-6anhidro galactosa, unido

a una buena proporción de KCl (1,5%), le confiere a la k carragenina una

mejor estructura generando geles con fuerzas de gel mayores. Estos

resultados concuerdan con los encontrados en el punto de fusión y

gelificación porque allí también a valores de pH altos (9,0 y 10,0) y bajos

(8,0) los resultados son menores.

En la figura No 36 se aprecia la diferencia entre las medias de las

fuerzas de gel de Hypnea Guajira e Hypnea Santa Marta y la diferencia

entre las medias de Hypnea Santa Marta y Kappaphycus (ver anexo

estadístico 7.2.4), sin embargo la especie Hypnea recolectada en Santa

Marta se muestra muy sensible a los cambios de pH.

112

Los valores obtenidos para la fuerza gel de la especie Hypnea Santa

Marta son superiores a los reportados por Mtolera y Buriyo ( 2004), quienes

alcanzan fuerzas de gel máximas de 243g/cm2, talvez, porque ellos no

controlan el pH durante el experimento o por las condiciones climáticas a las

que se encontraban sometidas las algas, antes de su recolección.

Stanley (1987), reporta fuerzas de gel para k carrageninas entre 200 y

1600 g/cm2 para polisacáridos extraídos de Eucheuma sp, las variaciones

son asignadas a la especie y las condiciones de pH de extracción. Lo que

indica que los valores obtenidos en esta investigación están dentro de los

rangos reportados en la literatura, de igual forma k carragenina extraída de

Kappaphycus alvarezii en presencia de NaOH al 2% permite obtener geles

con fuerzas superiores a 521g/cm2 (Andrade, 2000).

Se sugiere que los mayores valores de fuerza de gel para la especie

Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta son debidos al mayor

contenido de potasio en el alga; concentraciones altas del ión potasio

favorecen la formación de hélices que se organizan y dan origen a geles

bastante fuertes (Michel y colaboradores, 1997; figura No 2 de este texto). Al

estudiar la proporción de potasio en el alga y en la k carragenina obtenida

de las muestra recogidas en Santa Marta, se observa que contienen cuatro

veces mas potasio que Hypnea recogida en la Guajira y que Kappaphycus

alvarezii. ( ver Figura No 49 y Tabla No 21 de este documento)

113

Figura No 36. Estudio de fuerza de gel de kappa carragenina en KCl al1,5% en función del p H de tratamiento

Fuerza de Gel en KCl al 1,5% vs pH

pH

fuer

zaespecie

HYGHYSK

0

200

400

600

800

1000

8 8,4 8,6 9




En la figura No 37 se aprecia un análisis de textura típico obtenido

para Hypnea musciformis a pH 8,4, allí se mide la variación de la fuerza en

función del tiempo y el punto máximo es considerado como el punto de

ruptura del gel marcado a 45,219 N, teniendo en cuenta las condiciones del

ensayo se puede calcular el valor en unidades de fuerza, que para este

experimento es 909,9 g/cm2. Cuando se obtiene un triángulo bastante

simétrico se puede decir que el gel es uniforme .

114

Figura No 37. Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 8,4

Si realiza el perfil de textura para muestras con baja fuerza de gel

como aquellas cuyo punto de fusión era bajo, obtenidas a pH 10 o que no

gelificaban bien, se obtienen análisis como los indicados en la figura No 38

115

Figura No 38 Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 10,0

En la figura No 38 se observa que al poco tiempo de colocar el peso

sobre la k carragenina, el gel se rompe y por lo tanto es imposible calcular

una fuerza de gel, este fenómeno se presenta en las muestras extraídas a

pH 10.

Otra diferencia encontrada para las muestras de k carragenina en la

determinación de la fuerza de gel se aprecia en la figura No 39, en donde se

distingue una porción del triángulo que queda por debajo de las abscisas.

116

Figura No 39. Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 9,0

Esta porción se calcula como el área bajo la curva y se obtiene un

valor que corresponde a la adhesividad del gel, que es 41,55gs, para la

carragenina obtenida a pH 10 a partir de Hypnea musciformis. A mayores

áreas bajo el eje X, el gel es más adhesivo significa que cuando el peso que

registró la fuerza de gel regresa al origen trae consigo restos de gel. En

todos los ensayos realizados para la determinación de la fuerza de gel, se

obtuvieron geles más adhesivos a pH altos.

Tener un gel con distribución triangular uniforme no sugiere que sea o

no adhesivo. Así en la figura No 39 se describe un área bajo la curva de

117

34,65g s, que indica un gel adhesivo , aunque es homogéneo, el triángulo es

semejante al de la figura No 40.

Figura No 40 Perfil de textura para la muestra de carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 8,6

Se realizó la determinación de los perfiles de textura para las

muestras de k carragenina, en soluciones de KCl al 0,5, los resultados se

muestran en la tabla No 13 . Como era de esperarse y de acuerdo con la

literatura (Ribeiro, 2004), las fuerzas de gel disminuyen drásticamente, por

ejemplo, el gel de Hypnea musciformis Santa Marta con pH de extracción

8,4.pasó de 900 a 337,08g/cm2

118

El análisis ANOVA (Anexo7.2.5), mostró que existen diferencias

significativas entre la respuesta obtenida variando el pH y variando la

especie, de igual manera hay una interacción entre los factores pH y especie.

En las figuras No 41 y 42 es evidente, que los valores más altos en

fuerza de gel se obtienen a pH 8,4 para la especie Hypnea musciformis

Santa Marta, al igual que en la preparación del gel de carragenina de1,5%

en KCl.

Figura No 41. Estudio de la fuerza de gel kappa carragenina preparado en soluciones de KCL al 0,5%

Fuerza de Gel en KCl al 0,5% vs especie

ESPECIE

FUE

RZA

DE

GEL

pH8,48,69

0

100

200

300

400

HYG HYS K

En la figura No 41 se observa que a pH 9,0 en todas las especies el

valor de la fuerza de gel es muy bajo, cercano a 18,9g/cm2 y es imposible

determinarlo a pH 10, probablemente el gel está bastante hidrolizado, su

peso molecular es pequeño y no se formaron las hélices.

119

Figura No 42. Estudio de la variación de fuerza de gel kappa carragenina preparada en soluciones de KCl al 0,5% en función del pH de extracción.

Fuerza de Gel en KCl al 0,5% vs pH

pH

FUE

RZA

DE

GEL

ESPECIEHYGHYSK

0

100

200

300

400

8,4 8,6 9




Los perfiles de textura revelan muestras muy frágiles y adhesivas. En

la Figura No 43 se aprecia el perfil de textura para una muestra de k

carragenina extraída a partir de Hypnea de Santa Marta, que tiene 18g/cm2

de fuerza de gel, en ella se observa un rompimiento rápido de gel, con poca

adhesividad

120

Figura No 43 Perfil de textura para la muestra de k carragenina obtenida a partir de Hypnea musciformis Santa Marta a pH 9,0.

El gel está preparado en KCl 0,5%

Luego de este estudio se observa que los mayores rendimientos

(47%) en la extracción de carragenina se logran con protocolos de control

de pH a 8,6 con las algas de la especie Hypnea musciformis recolectada en

Santa Marta, pero si lo que se necesita es una carragenina para un uso

industrial particular que requiera altas fuerzas de gel es mejor usar

protocolos a pH 8,4, el rendimiento es menor (22%), pero la fuerza de gel es

mayor (909g/cm2). Estos resultados coinciden con estudios realizados con

anterioridad en el laboratorio de biotecnología de la Universidad Javeriana en

los procesos de obtención de agar microbiológico. (Montilla, 2005).

121

La elasticidad del gel se estudió midiendo la pendiente de la línea

trazada desde el inicio del ensayo hasta el punto máximo., los datos se

encuentran en la tabla No. 14

Tabla No 14 Pendientes de los ensayos de perfil de textura del Gel de kappa

carragenina preparado en solución 1,5% de KCl

1.5% en KCl

Muestra pH Pendiente en N/s

8,0 8,4 8,6 9,0 3,290 95,96 74,065 9,191 3,301 93,92 82,276 7,141


3,300 96,03 73,984 10,063 14,011 56,685 33,455 26,218 14,131 53,667 33,766 26,110

Kappaphycus alvarezii 13,810 53,749 39,610 26,100

8,592 50,368 46,625 20,877 8,186 53,809 41,287 20,839

Hypnea musciformis

Guajira 7,810 53,586 49,579 20,714

Se analizaron los valores de fuerza de gel en función de la pendiente

y se encontró que hay una relación lineal y positiva, lo que indica que los

geles con mayor fuerza de gel son más elásticos. En la tabla No 15 y el

anexo No 7.2.6 se presentan los datos que se usaron para determinar la

correlación lineal simple.

Los resultados de la correlación muestran la ecuación:

Elasticidad = -2,854+0,10852*Fuerza de gel

Esta ecuación representa un modelo lineal que describe una relación

entre elasticidad y fuerza de gel, estadísticamente significativa, con un

coeficiente de correlación 0,9988, indicando una relación fuerte entre las

variables.

122

Dado que el valor p del análisis ANOVA es mayor o igual que 0,1 el

modelo seleccionado, es decir, la ecuación lineal, se ajusta a los datos, para

un nivel de confianza del 99%.

4.7.5 pH A todas las muestras de k carragenina se les determinó el pH

después del proceso de purificación, pero como no hay diferencias

significativas entre los valores de cada ensayo, sólo se muestra en cada

casilla de la tabla No 16 (presentada en el anexo de tablas), el valor

promedio.

Las figuras No 44 y No 45 muestran que el valor del pH final

depende de las condiciones de extracción, pero no de la especie de alga de

partida. El Análisis ANOVA que se presenta en el Anexo 7.2.7 expresa que

no hay interacción entre los factores especie y pH.

La carragenina extraída a pH 8,6 de la especie Hypnea recolectada en

Santa Marta, de donde se obtienen los mayores rendimientos en porcentaje

en peso seco, forma geles con pH 8,0, este valor está dentro del rango

aceptado por la JECFA (2001), para que pueda ser utilizada con fines

comerciales en la industria alimentaría.

123

Figura No 44 Determinación del pH final de kappa carragenina obtenida de cada especie de alga.

Variación del pH de la carragenina vs Especie

Especie

pH c

arra

geni

napH de extracc

88,48,6910

7,4

7,7

8

8,3

8,6

8,9

HyG HyS K




Figura No 45. Variación del pH final de kappa carragenina obtenida de cada especie de alga en función de pH de extracción

Variación del pH de la carragenina vs pH de extracción

pH de extracción

pH c

arra

geni

na

EspecieHyGHySK

7,4

7,7

8

8,3

8,6

8,9

8 8,4 8,6 9 10

124

La k carragenina extraída a pH 8,4 y que presenta la mayor fuerza de

gel tiene un pH final de 7,8 también, aceptado por la JECFA para productos

alimentarios.

4.7.6 Humedad El porcentaje humedad determinado para las muestras de k

carragenina se presenta en la tabla resumen No 17

Tabla No 17 humedad en muestras de carragenina Muestra pH

% de Humedad

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 Hypnea Guajira 9,8% 9,0% 8,0% 9,4% 6,4%Kappaphycus alvarezii 8,0% 9,4% 9,3% 6,9% 7,5%Hypnea Santa Marta 7,5% 9,0% 9,4% 9,4% 9,3%

Los valores de humedad obtenidos para la muestras de carragenina

están dentro de los estándares solicitados por la JECFA, quien determina

que la humedad medida 105oC y peso constate debe ser máximo el 12%,

(JECFA, 2001); la carragenina extraída en esta investigación tiene

porcentajes de humedad, con cualquier tratamiento de pH, por debajo del

valor solicitado.

Se exige la determinación de humedad de la carragenina por parte de

la JECFA porque es indispensable para establecer las condiciones de

almacenamiento y manejo, de tal manera que se pueda realizar un control

microbiológico apropiado.

125

4.7.7 Cenizas La Tabla No 18 presenta los resultados de los ensayos de cenizas

realizados para las algas, con el propósito de tener una caracterización

primaria de la muestra, estos resultados junto con los de absorción atómica

indican, como era de esperarse, que la muestra de Hypnea proveniente de la

Guajira y la de Kappaphycus alvarezii presentan un mayor contenido de

residuos no orgánicos que pueden ser los causantes de las diferencias en la

fuerza gel y el rendimiento, parámetros fisicoquímicos, que se mostraron

dependientes tanto del pH de extracción como de la especie

simultáneamente.

Tabla No 18. Porcentaje de cenizas determinado en dos especies de algas.

Muestra %Cenizas Varianza Hypnea musciformis Guajira 24,98 0,00425Hypnea musciformis Santa Marta 12,43 0,0002916Kappaphycus alvarezii 23,92 0,001233

Los valores de cenizas en las muestras de algas no se encuentran

reportados en la literatura, porque las condiciones de crecimiento, nutrientes

y recolección no son iguales.

126

4.7.8 Análisis de Absorción atómica 4.7.8.1 Absorción atómica para la muestra de algas

En la tabla No 19 se presenta el análisis de absorción atómica de las

muestras de algas, los elementos en mayor composición aparecen en

porcentaje peso a peso sobre peso seco del alga y los elementos en menor

cantidad se expresan en ppm.

Los resultados permiten apreciar que las muestras recolectadas en la

Guajira son ricas en hierro y cobre comparadas con las recolectadas en

Santa Marta.

Los valores de potasio para Kappaphycus alvarezii son más bajos

que los reportados en la literatura para esta especie (Glicksman, 1982),

posiblemente debido a las condiciones de crecimiento del alga.

Tabla No 19. Análisis de absorción atómica para las dos especies de algas.

Análisis de absorción atómica de muestras de algas %p/p %p/p %p/p %p/p %p/p ppm ppm ppm

Muestra

Na K Ca Mg Fe Mn Cu Zn Hypnea musciformis Guajira 3,59 1,14 1,06 1,01 0,52 260 300 48Kappaphycus alvarezii 12,72 1,18 1,70 0,81 0,76 249 188 31Hypnea musciformis Santa Marta 2,17 4,93 0,44 0,67 0,21 42 10 96 Los datos de absorción atómica para las especies en estudio son, también,

una contribución de la investigación a la caracterización de Hypnea

musciformis en Colombia, ya que no se encuentran reportados en la

literatura.

4.7.8.2 Absorción atómica para las muestras de carragenina En cada muestra de carragenina se determinaron por absorción

atómica los siguientes elementos: Sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro,

manganeso, cobre y cinc

127

4.7.8.2.1 Análisis del contenido de sodio en kappa carragenina En la tabla No 20 se aprecian los resultados obtenidos para el sodio

en porcentaje peso a peso, el análisis estadístico (Anexo No 7.2.9) que la

especie tiene un efecto significativo sobre el contenido de sodio.

La figura No 47 muestra que los contenidos más altos de sodio se

presentan en la carragenina extraída de la especie Hypnea recolectada en

la Guajira y los más bajos en la carragenina proveniente de la especie

Hypnea recolectada en Santa Marta, en todos los casos los valores son

superiores a los determinados para las algas, debido a que la extracción se

hace a través de un tratamiento alcalino con hidróxido de sodio. Figura No 47 Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de dos especies de algas.

Contenido de sodio en la carragenina vs Especie

ESPECIE

%p/

p de

sod

io

pH88,48,6910

2,2

4,2

6,2

8,2

10,2

HYG HYS K




En la figura No 48 se observa que el contenido de sodio es

independiente del pH al cual se realiza la extracción. La interacción pH-

128

especie que muestran los análisis estadísticos (Anexo 7.2.9) se debe al

método de síntesis en combinación con el contenido inicial de sodio en la

muestra.

Figura No 48. Análisis de absorción atómica para sodio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes.

Contenido de sodio en la carragenina vs pH

pH

%p/

p de

sod

io

ESPECIEHYGHYSK

2,2

4,2

6,2

8,2

10,2

8 8,4 8,6 9 10




La JECFA no tiene requerimientos de sodio máximos o mínimos en

carragenina, por lo tanto la carragenina obtenida por este método puede ser

aceptada como aditivo en preparaciones para consumo humano. (JECFA,

2001).

4.7.8.2.2 Análisis del contenido de potasio en kappa carragenina La tabla No 21 presenta el contenido de potasio encontrado para

todos los ensayos de extracción de carragenina en porcentaje en peso, la

figura No 49 muestra que solamente la especie es el factor determinante

129

en el contenido de potasio, como era de esperarse ya que el tratamiento de

extracción no involucra tratamientos con potasio.

Figura No 49 Análisis de absorción atómica para potasio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes.




Contenido de potasio en la carragenina vs pH

pH

1,1

1,6

2,1PO

2,6

3,1

3,6

4,1

TASI

O

8 8,4 8,6 9 10

ESPECIEHYGHYSK

Los análisis estadísticos (Anexo No 7.2.10) y la figura No 49 indican

que no hay interacción entre los factores especie-pH que influyan en el

contenido de potasio de la carragenina. En la figura No 49 se muestra que el

contenido de potasio para Hypnea Guajira e Hypnea Santa Marta son

significativamente diferentes al igual que para Hypnea Santa Marta y

Kappaphycus mientras que no hay diferencias entre Hypnea Guajira y

Kappaphycus. Estas diferencias inciden en al fuerza de gel del polisacárido,

el alto contenido de potasio inicial en las algas provenientes de la playa

Aeropuerto de Santa Marta, promueve la formación de geles con fuerza de

gel grandes. (908 g/cm2)

130

4.7.8.2.3 Análisis del contenido de Calcio en kappa carragenina En la Tabla No 22 se muestran los resultados obtenidos en la

determinación del calcio para las muestras de carragenina, el test ANOVA

(Anexo No 7.2.11), indica que el contenido de calcio depende de la especie

y no del pH de tratamiento, además evidencia que no hay interacción entre

especie-pH.

Las figuras No 50 y 51 son los resultados del test ANOVA, indican que

hay diferencias significativas en el contenido de calcio para cada especie.

Figura No 50 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes.

Contendio de calcio en la carragenina vs especie

ESPECIE

CAL

CIO

pH88,48,6910

0

0,2

0,4

0,6

0,8

HYG HYS K




131

Figura No 51 Análisis de absorción atómica para calcio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes

Contendio de Calcio en la carragenina vs pH

pH

% C

alci

oESPECIE

HYGHYSK

0

0,2

0,4

0,6

0,8

8 8,4 8,6 9 10




4.7.8.2.4 Análisis del contenido de Magnesio en kappa carragenina

El contenido de magnesio se presenta en la tabla No 23, figuras 52 y

53 los resultados del test ANOVA (Anexo No 7.2.12) muestran que el valor

del contenido de Magnesio depende solamente de la especie y no del

tratamiento de extracción.

132

Figura No 52 Análisis de absorción atómica para magnesio en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes

Contenido de Magnesio en la carragenina vs pH

pH

% M

agne

sio

ESPECIEHYGHYSK

0,24

0,27

0,3

0,33

0,36

0,39

0,42

8 8,4 8,6 9 10

Figura No 53 Análisis de absorción atómica para Magnesio en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes muestras de algas.

Contenido de Magnesio en la carragenina vs Especie

ESPECIE

% M

agne

sio

pH88,48,6910

0,24

0,27

0,3

0,33

0,36

0,39

0,42

HYG HYS K

133

Las figuras No 52 y 53 muestran que la especie con mayor contenido

de Magnesio es Hypnea recolectada en Santa Marta y que la especie

Hypnea recolectada en la Guajira es quien presenta el menor contenido de

magnesio, los resultados están determinados solamente por el lugar de

muestreo.

4.7.8.2.5 Análisis del contenido de Hierro en kappa carragenina Los contenidos de hierro en las muestras de carragenina se presentan

en la tabla No 24 y los resultados del test ANOVA se encuentran el en

Anexo No 7.2.13.

En las Figuras No 54 y 55 se aprecia que la especie Hypnea

recolectada en la Guajira presenta altos contenidos de hierro 0,30%

comparados con la especie Hypnea recolectada en Santa Marta 0,14%, lo

que sugiere diferentes fuentes de nutrientes.

Figura No 54 Análisis de absorción atómica para hierro en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes especies de algas.

ESPECIE

% H

IER

RO

pH1088,48,69

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

HYG HYS K




134

El test ANOVA, muestra que el único factor estadísticamente significativo en

el contenido de hierro es la especie, lo que indica que la procedencia de la

muestra es el factor que determina el contenido de hierro.

Figura No 55 Análisis de absorción atómica para hierro en las muestras de kappa carragenina obtenida a tratamientos de pH diferentes 4.7.8.3 Análisis del contenido de Manganeso en kappa carragenina

pH

% H

IER

RO

ESPECIEHYGHYSK

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10 8 8,4 8,6 9




El análisis ANOVA mostró que no hay diferencias estadísticamente

significativas, cuando se considera la variable pH, entre ningún par de

medias a un nivel del 95% de confianza.

4.3.8.2.6 Análisis del contenido de Manganeso en kappa carragenina

En la tabla No 25 se presenta el estudio realizado para el contenido de

Manganeso en kappa carragenina, el test ANOVA se muestra en el Anexo

No 7.2.14.

135

Los valores p del test ANOVA muestran que el factor significativo en

el contenido de manganeso es la especie y no el pH tal y como se ve en las

gráficas No 56 y 57. Esto indica que la procedencia de las algas es

predominante en el contenido de Manganeso, de hecho su origen en

diferentes zonas del territorio Colombiano y las condiciones de crecimiento

son las que regulan los contenidos Manganeso en la carragenina.

Figura No 56 Análisis de absorción atómica para Manganeso en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes

Contendio de Manganeso en la Carragenina vs Especie

ESPECIE

ppm

Man

gane

so

pH88,48,6910

0

40

80

120

160

200

HYG HYS K




136

Figura No 57 Análisis de absorción atómica para Manganeso en las muestras de kappa carragenina obtenida a con tratamientos de pH diferentes.

Contendio de Manganeso en la Carragenina vs Especie

ESPECIE

ppm

Man

gane

so

pH88,48,6910

0

40

80

120

160

200

HYG HYS K




4.3.8.2.7 Análisis del contenido de Cobre en kappa carragenina

El contenido de cobre en kappa carragenina determinado por

absorción atómica se muestra en la tabal No 26 en el Anexo No 7.2.15 se

presenta el test ANOVA.

El test ANOVA muestra que le contenido de cobre depende de

la especie y no del tratamiento de pH al cual fue sometida la muestra de alga

para obtener la carragenina.

137

En la figura No 58 se aprecia que los mayores contenidos de cobre se

presentan en la especie Hypnea recolectada en la Guajira ( 273.33 ppm ), y

los menores valores en la especie Hypnea recolectada en Santa Marta (10

ppm), estas diferencias se deben a las condiciones climáticas y geográficas

de donde se obtuvieron las muestras. Figura No 58 Análisis de absorción atómica para Cobre en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de algas diferentes

Contenido de cobre en la carragenina vs Especie

ESPECIE

ppm

Cob

re

pH88,48,6910

0

50

100

150

200

250

300

HYG HYS K




En la figura No 59 se aprecia que los tratamientos de extracción a

diferentes valores de pH no inciden el contenido de cobre, como era de

esperarse, ya que el método no contempla el uso cobre ni en la precipitación

ni en la extracción.

138

Figura No 59 Análisis de absorción atómica para Cobre en las muestras de kappa carragenina obtenida con tratamientos de pH diferentes. Figura No 27

Contenido de cobre en la carragenina vs pH

pH

ppm

Cob

re

ESPECIEHYGHYSK

0

50

100

150

200

250

300

8 8,4 8,6 9 10




4.3.8.2.8 Análisis del contenido de Cinc en kappa carragenina

Por último se realizó un estudio del contenido de cinc en kappa

carragenina, los resultados se muestran en la tabla No 27 y el análisis

ANOVA en el ANEXO No 7.2.16.

Los valores p del análisis estadístico sugieren que el contenido de cinc

depende solamente de la especie, como lo muestra la figura 60, la especie

Hypnea recolectada en Santa Marta es más rica en cinc (88,33 ppm), que la

especie Hypnea recolectada en la Guajira (43,33 ppm), debido a las

diferencias en las zonas de ubicación y crecimiento de las dos algas.

139

Figura No 60 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida a partir de diferentes algas. 5 Conclusiones 6 Recomendaciones

Contenido de Cinc en la carragenina vs Especie

ESPECIE

ppm 50

de

Cin

c

pH88,48,6910

30

60

70

80

90

HYG HYS K

40




En la Figura 61 se aprecia que el contenido de cinc es independiente

del tratamiento de pH seleccionado para extraer la carragenina, y los

resultados del test ANOVA muestran que no hay interacción especie –pH que

determine el contenido de cinc en kappa carragenina

140

Figura No 61 Análisis de absorción atómica para Cinc en las muestras de kappa carragenina obtenida con tratamientos de pH diferentes.

Contenido de Cinc en la carragenina vs pH

pH

ppm

de

Cin

cESPECIE

HYGHYSK

30

40

50

60

70

80

90

8 8,4 8,6 9 10




4.3.9 Almidón Floridean

Para todas las muestras de kappa carragenina se ensayó el

procedimiento de coloración con la solución de yodo-yoduro sin resultados

positivos de coloración, lo que permitió concluir que no hay en la

carragenina obtenida suficiente almidón para que la prueba de positiva, o

que se está trabajando en los límites de sensibilidad del ensayo.

4.3.10 Proteína Como parte de la caracterización, se realizaron determinaciones de

proteína únicamente para la muestra de kappa carragenina obtenida a pH

8,6 a partir de Hypnea recolectada en Santa Marta con el diagrama de flujo

mostrado en la figura No 18, porque con él se obtiene el mayor rendimiento.

141

También se determinó proteína en el alga. Los resultados se muestran en la

tabla No 28.

Tabla No 28. Contenido de proteína en el alga y en kappa carragenina

Muestra % de Proteína

Hypnea musciformis 13,8%

Kappa carragenina 0,15%

Los resultados muestran el contenido de proteína en el alga, que debe

estar relacionado con la época de recolección y con el contenido de kappa

carragenina, muestran además que el método de extracción presentado en

la figura No 18 logra separar el 99 % de proteína que contenía inicialmente

Hypnea musciformis., esto le confiere un color más claro a la carragenina.

No se reportan resultados en la literatura para comparar los

contenidos de proteína ni en el alga ni en la carragenina obtenida.

En la tabla resumen No 29 se muestra la caracterización

Fisicoquímica y el rendimiento para la carragenina extraída a partir de

Hypnea musciformis, recolectada en Santa Marta de donde se obtienen los

mejores resultados, comparada con las exigencias de la JECFA

142

Tabla No 29 Resumen de las propiedades fisicoquímicas de kappa carragenina

Característica Procedimiento de extracción JECFA

(2001) pH 8.4 pH 8.6

Espectro Infrarrojo Numeral 2.38 de este documento

El análisis de las señales indicó que se obtuvo Kappa carragenina.

Punto de gelificación (ºC)

N.R 36.0 37.3

Punto de fusión (ºC) N.R 66.0 64.7 Fuerza de gelificación (g/cm2)

N.R 909.48 732.86

Elasticidad (N/s) N.R 95.3 76.8 pH Entre 8,0 y 11 7.8 8.0 Humedad (%) Máxima 12% 7,9 8,53 Sodio (%p/p) N.R 2.22 2.22 Potasio (%p/p) N.R 4.05 4.03 Calcio (%p/p) N.R 0.08 0.08 Magnesio (%p/p) N.R 0.41 0.41 Hierro (%p/p) N.R 0.14 0.14 Manganeso (ppm) N.R 31 30 Cobre (ppm) N.R 10 10 Zinc (ppm) N.R 88.7 88.3 Rendimiento (%p/p) 13.76 46.56 cenizas Entre el 15 y

el 40% N.R N.R

Viscosidad 5cp a 75oC en preparaciones al 1,5%

N.R N.R

Sulfatos Entre el 15 y el 40%

N.R N.R

N.R: No se reporta.

143

5 Conclusiones y Recomendaciones

Se diseñó un método para extraer kappa carragenina a partir de

Hypnea musciformis que comprendió las siguientes etapas: Lavado,

Hidratación, decoloración, extracción, mezclado, filtrado, Decoloración,

precipitación, filtración, congelamiento y descongelamiento y secado.

El método más efectivo para retirar los pigmentos de Hypnea

musciformis y kappaphycus alvarezii fue la adición de hipoclorito de

sodio al 5% antes y después de la extracción de kappa carragenina.

El método diseñado para la extracción de kappa carragenina a partir

de Hypnea, también da buenos resultados usando el alga exótica

Kappaphycus alvarezii. Arrojando mejores rendimientos.

El método diseñado para la extracción de kappa carragenina a partir

de Hypnea musciformis da mejores resultados (47% rendimiento) que los

reportados en la literatura (20-35%) para la misma especie.

El mejor método de secado para conservar las características físicas

de la carragenina fue usando una estufa de aire forzado a 30oC durante

doce horas

Los mejores rendimientos se obtuvieron con tratamientos a pH 8,6

tanto para Hypnea musciformis como para Kappaphycus alvarezii.

Se obtuvieron mejores rendimientos cuando la extracción de

carragenina se realizó con las muestras de Hypnea musciformis

144

recolectadas en Santa Marta que con la muestra de Hypnea recolectada en

la Guajira

El análisis de los espectros I.R permitió demostrar que el polisacárido

obtenido a partir de Hypnea musciformis era kappa carragenina.

La pureza de kappa carragenina se evidenció en las bandas finas

obtenidas en el espectro Infrarrojo, los bajos contenidos de proteína y

almidón Floridean y el aspecto final de la muestra.

Se realizaron los análisis de Absorción atómica y cenizas para las

muestras de Hypnea musciformis y kappaphycus alvarezii.

Los puntos de fusión y gelificación de kappa carragenina están dentro

de los rangos reportados en la literatura.

Los resultados del análisis ANOVA indicaron que las diferencias en

los puntos de gelificación son debidas los tratamientos alcalinos y no a la

especie de alga, mientras que las diferencias en el punto de fusión

dependen del pH de extracción y de la especie.

En las dos especies de algas estudiadas, Hypnea musciformis y

kappaphycus alvarezii se observó que cuando kappa carragenina presenta

mayor Fuerza gel el rendimiento es menor.

En la carragenina extraída de las dos especies de algas estudiadas,

Hypnea musciformis y kappaphycus alvarezii se observó que la fuerza de

gel es mayor a mayores concentraciones de KCl.

Se encontró una correlación positiva entre la fuerza de gel y el módulo

de elasticidad, independiente del pH de tratamiento y de la especie.

145

Los mayores rendimientos de extracción de kappa carragenina se

encontraron con protocolos a pH 8,6 en Hypnea musciformis, recolectada

en Santa Marta, sin embrago, la fuerza de gel es mayor a pH 8,4.

Las características Fisicoquímicas encontradas para kappa

carragenina, la postulan como un gel promisorio para aditivos en

alimentos, o como un sustrato hidrorretenedor en Agricultura

Se recomienda:

Realizar una evaluación del contenido de carragenina en el alga

Hypnea musciformis recolectada en Santa Marta, en función de la

diferentes épocas climáticas del año, para observar si hay correlación entre

estos factores.

Estudiar la relación proteína – kappa carragenina y su variación en las

distintas épocas climáticas, para detectar los meses de mayor productividad.

Evaluar el contenido de 3,6 anhidrogalactosa para correlacionarlo con

la fuerza de gel y los puntos de fusión y gelificación.

Establecer si la época climática o los nutrientes en el agua influyen en

los valores de la fuerza de gel que presenta el hidrocoloide.

Evaluar las propiedades hidroretenedoras de la kappa carragenina,

con agua y con diferentes concentraciones de iones solubles para proponerla

como posible soporte para cultivos o en reemplazo de suelo para

implementar semilleros.

Realizar una evaluación del potencial y la disponibilidad de Hypnea

musciformis en las playas del Caribe colombiano.

146

En el campo de la bioprospección, realizar estudios

tecnicoeconómicos que validen la posibilidad de aprovechar el alga Hypnea

musciformis como fuente de kappa carragenina.

Si la extracción de kappa carragenina a partir de Hypnea

musciformis, resulta ser económicamente viable, se recomienda hacer

estudios de cultivos para no ejercer presiones sobre las praderas naturales

del alga.

Hacer estudios más detallados para determinar el contenido de

almidón floridean y sulfatos en kappa carragenina.

147

6 Bibliografía Andrade, C. , Azero, E., Luciano, L. and Goncalves, M. 2000. Rheological properties of mixtures of carrageenan from Hypnea musciformis and galactomannan from Cassia javanica. International Journal of Biological Macromolecules. 27(5): 349-353. Ask, E., Batibasaga, A., Zertuche-González, J.A., and de San, M. 2002. Three decades ok Kappaphycus alvarezii ( Rhodophyta) introduction to non endemic locations. Aquaculture 206: 49-57. Baeza, R., Gugliotta, L.M., Pilosof, A.M.R. 2003. Gelation of β-lactoglobulin in the presence of propylene glycol alginate: Kinetics and gel properties. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 31: 81-93. Barbaroux, O., Perez, R., dreno,J.P. 1984. LAlgue rouge Eucheuma spinosum, Possibilités d explotation et de culture aux Antilles. Science et Peche, Bull. Int. Pèches Marit. 348 Berchez, F. and Oliveira, E. 1989. Maricultural essays with the Carrageenophyte Hypnea Musciformis in S. Paulo, Brazil. Workshop-Univ. S. Paulo/ Int. foundation for Science ¨cultivation of seaweed in latin America Berchez, F.A., Pereira, T.L. and Kamiya, N.F. 1993 Culture of Hypnea musciformis ( Rhodophyta, Gigartinales) on artificial substrates attached to linear ropes. Hydrobiologia 260/261: 415-420. Bixler, H.J., 1996. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan. Hydrobiology 326/327:35-57 Bouck., B..G. 1965. Fine structure and organelle associations in brown algae. The journal of Cell biology. 26:523-537. Briones, A.V., Ambal, W.O., Estrella, R.R., Pangilinan, R., Vera, C.J., Rodríguez, N., Villanueva, M.A. 2004. Tensile and tear strength of

148

carrageenan film from Philippine Eucheuma Species. Marine Biotechnology 6:148-151 Bravin, I. and Yoneshigue- V Y. 2002. Influencia de fatores ambientais sobre o crescimiento in Vitro de Hypnea musciformis ( Wulfen) Lamouroux ( Rodophyta). Revista Brasil. Bot. 25( 4): 469-474. Bula Meyer, G. A. 1988. Cultivo y utilización comerciales de las macroalgas marinas. Ingeniería Pesquera-. 6 (1/2): 6-54. Bula Meyer, G. A. 1989 .Las microalgas bentónicas marinas como recurso potencial económico en Colombia. Rev Academia Colombiana de Ciencias., 17(65): 383-387 Bula Meyer, G. A. 1990. Altas temperaturas estacionales del agua como condición disturbadora de las macroalgas del Parque Nacional Tairona, Caribe colombiano: una hipótesis. An. Inst. Invest. Mar. Punta Betin.19: 9-21. Collen, J., Abrahamsson, K., Semesi, A. and Pedersen,. M. 1995. Farming and physiology of the red algae Euchhema: Growing commercial importance in east Africa. Ambio. (24 ):497-501. Chopin, T., Kerin, B. and Mazerolle, R.1999. Phycocolloid chemistry as a taxonomic indicator of phylogeny in the Gigartinales, Rhodophyceae: A review and current developments using Fourier transform infrared diffuse reflectance spectroscopy. Phycological Research. 47(3): 167-170. Court, V., and Road, L. 2000. TA-XT2 Application study. In :Stable Micro Systems (ED). Issued September pp 1-3. Díaz-Pulido G., Díaz Ruiz M., 2003. Diversity of benthic marine algae of the Colombian Atlantic., Biota Colombiana. 4, (2): 203-246. De Souza, F.A. 1990. Perspectives seaweed cultivation in Brazil. En: III Simposio de Ecossistemas da Costa Sul e Sudeste Brasileira: Estrutura, função e manejo. Academia de Ciências do Estado de São Paulo. 4:144-149. Dawes, C.J., Stanley, N.F., Stancioff, D.J., 1977. Seasonal reproductive aspects, chemistry and iota carrageenan from floridian Eucheuma (Rhodophyta, Gigartinales). Bot. Mar. 2: 137– 147. Dawes, C.J. 1986. Botánica Marina. Limusa. México. 673p Falshaw, R., Bixier, H. and Johndro, K. 2003. Structure and performance of commercial Kappa -2-carrageenan extracts. Part III. Structure analysis

149

and performance in two dairy application of extracts from the New Zealand red seaweed, Gigartina atropurpurea. Food Hydrocolloids. 17 (2): 129-140. Faccini, A.L. and Berchez, F. 2000. Management of natural beds and standing stock evaluation of Hypnea musciformis (Gigartinales, Rhodophyta) in south- eastern Brazil. Journal of Applied Phycology 12: 101-103. Freile-Pelegrín, Y. 2002. Efecto del tratamiento de oscuridad y salinidad en el rendimiento y calidad del agar de Gracilaria cornea (Rhodophyceae). Ciencias Marinas. 28 (3): 289-296 p. Friedlander M., Zelikovitch N., 1984. Growth rates, phycocolloid yield and quality of the red seaweeds, gracilaria sp., Pterocladia capillacea, Hypnea musciformis, and Hypnea cornuta, in field studies in Israel. Aquaculture. 40 (1): 57-66. Fournet, I., Zinoun,M., deslandes,E., Diouris,M. and Yves J., 1999 Floridean starch and carrageenan contents as responses of the red alga Solieria Chordalis to culture conditions. European Journal of Phycology 34: 125-130. Glicksman, Martin.1982. Food hydrocolloids. CRC Press. Inc. Boca Ratón Florida. United States. Vol1 219p. Greer, C., Shomer, I., Goldstein, M. and Yaphe, W. 1993. Analysis of carrageenan from Hypnea musciformis by using kappa and ι carrageenanases and C-N.M.R. spectroscopy. Journal of Molecular structure. 294: 227-230. Guist, G.,Dawes,C. and Castle J. 1984. Mariculture of red seaweed Hypnea musciformis. Carbohydrate Research.129:189-196. Global invasive species database, 2005 citados en [en línea], <www. issg Database Ecology of Hypnea musciformis.htlm > [consulta: 10 mayo.2005]. Hüttermann, A., Zommorodi, M., and Reise., K. 1999 Addition of hydrogels to soil for prolonging the survival of Pinus halepensis seedlings subjected to drought. Soil and Tillage Research, 50 :295-304. JECFA. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 2001 In: A conceptual framework for marine agronomy superseding specifications prepared at the 51st JECFA (1998), published in FNP 52. Hydrobiologia 398/399:15– 23.

150

Jory D., Cabrera, T. Polanco , B., Sánchez, R., Millán, J., Rosas J., Alcestre, C., García, E.,Useche M. and Agudo, R. 2000. Aquaculture in Venezuela: perspectives. Aquaculture Magazine. 25(5):51-55.

Lahaye M., Yaphe W., 1998. Effects of seasons on the chemical structure and gel strength of Gracilaria pseudoverrucosa agar (Gracilariaceae Rhodophyta). Carbohyd. Polymers (8 ): 285-301.

Lapointe, B., Williams, l., Goldman, J. and Ryther J. 1982. The mass outdoor culture of macroscopic marine algae. Aquaculture. 28 :375-384. Lillford,P.J. 2000 Commercial requirements and interest: an Update. In: Gums and stabilizers for the food industry 10.( Ed) Williams, P. Phillips, G. O., RSC. The Royal society of Chemistry. Cambridge. pp 387-396. Matsuhiro, B. 1995. Aislamiento y caracterización de ficocoloides. En: Manual de métodos ficológicos. Alveal, K., Ferrario, M.E. (Ed.) E.C. Oliveira y E. Sar . Universidad de Concepción. Concepción, Chile. pg. 657-675. Matsuhiro, B. and MILLER, L. G. 2002. Soluble polysaccharides from rhodymenia: characterization by ft-ir spectroscopy. . Bol. Soc. Chil. Quím.. [online]. sep. 2002, vol.47, No.3 [citado 12 Octubre 2006], p.265-271. Disponible en la World Wide Web: <http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0366-16442002000300010&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0366-1644. Márquez Germán. 1982. Estudios ecológicos en la producción primaria de algas y comunidades bénticas vegetales de la región de Santa Marta, Caribe colombiano. Tesis de grado de magíster. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología. Bogotá Colombia. 320p. McHugh, D.J., 1991. Worldwide distribution of commercial resources of seaweeds including Gelidium. Hydrobiology: 221: 19-29 McHugh, D.J., 2001. Prospects for seaweed production in developing countries. FAO Fisheries Circular No 968 FIIU/C968, 28 p. Meeuse, B.J., Andiers, M. and Wood, J.,A. 1960 Floridean Starch. J. Exp. Bot.11:129-140. Michel, A-S., Mestdagh, M.M. and Axelos, M.A.V. 1997. Physico-chemical properties of carrageenan gels in presence of various cations. International Journal of Biological Macromolecules. 21: 195-200. Montilla, A., Dulce, M., Trespalacios, A., Quevedo, B. y Mercado M. 2005. Obtención de agar bacteriológico a partir de Gracilaria verrucosa: evaluación de la productividad de agar nutritivo con diferentes especies

151

bacterianas. Trabajo de grado profesional. Pontificia Universidad Javeriana. Departamento de Microbiología. Carrera de Bacteriología. Bogotá . Colombia. Mtolera, M.S.P. and Buriyo, A.S. 2004. Studies on Tanzanian Hypneaceae: Seasonal variation in content and quality of Kappa-Carrageenan from Hypnea musciformis (Gigartinales: Rhodophyta). J. Mar. Sci. 3 (1):43-49. Muñoz, J., Freile-Pelegrín, Y. and Robledo, D. 2004. Mariculture of Kappaphycus alvarezii ( Rhodophyta, Solieriaceae) color strains in tropical waters of Yucatán, México. Aquaculture. 239:161-177. Mshigeni, K.E., Bolton, J., Critchley, A.,1992. Sustainable seaweed resource development in sub-Saharan Africa., Mshigeni (E) Windhoek, Namibia. pp 310. Nickerson, M.T. and Paulson, A.T. 2005. Time- temperature studies of κ carrageenan gelation in the presence of high levels of co-solutes. Carbohydrate Polymers. 61: 231-237. Official Methods of Analysis of AOAC international, 2000, 17 ed William Horwitz,editor. USA. Oakenfull, D., Naden, J. and Paterson, J. 2000. Solvent structure and the influence of anions on the gelation of κ- carrageenan and its synergistic interaction with locust bean gum. In: Gums and stabilizers for the food industry 10.( Ed) Williams, P. Phillips, G. O., RSC. The Royal society of Chemistry. Cambridge. pp 220-228. Oliveira, E.C. and Berchez, F.A.S. 2000. Ensayos sobre el cultivo del alga roja Hypnea musciformis ( Rhodophyta, Gigartinales) en São Paulo Brasil. Instituto de Boiciencias y Cebimar, Universidad de São Paulo, Brasil. Patente PTC WO 98/40412. Publicada el 24 de julio de 2003 USA Patente PTC WO 03/059957. Publicada el 17 de septiembre de 1998. USA. Patente PTC WO 02/051443. Publicada el 4 de Julio de 2002. USA Patente PTC WO 02/057477. Publicada el 25 de Julio de 2002. USA Patente PTC WO 03/059956. Publicada el 24 Julio 2003. USA Patente PTC WO 03/070930. Publicada 28 de agosto de 2003 USA Patente PTC WO 02/005658. Publicada 24 de Enero de 2002. USA

152

Patente PTC WO 2006/062792. Publicada 15 Junio 2006. USA. Patente PTC WO 037093322. Publicada 13 Noviembre de 2003. USA Patente PTC WO 02/051443. Publicada 4 Julio de 2002. USA. Patente PTC WO 00/69275 Publicada 23 Noviembre de 2000. USA. Patente PTC WO 01/82724. Publicada Noviembre 8 de 2001. USA. Patente PTC WO 02/17707. Publicada el 7 de Marzo de 2002. USA. Patente PTC WO 00/77019. Publicada el 8 de Noviembre de 2001. USA Pedroza, A., Matiz, A. Y Quevedo B. 2006. Manual de procesos Biotecnológicos. Pontificia Universidad Javeriana. Perpetuo, R. , Correa, M., Yoneshigue, Y., Belluco, F. 2003. Efeito de fatores bióticos no crecimento de Hypnea musciformis (Rodophyta- Gigartinales). Acta Bot. Bras. 17 (2): 279-286. Radmer, R. 1996. Algal diversity and commercial algal products. Bioscience. 46 (4): 263-268. Rao, R., K. 1970. Studies on growth cycle and phycocolloid content in Hynea musciformis (Wulf) Lamour. Bot. Mar 13:163-165 Rao, M.A., 1999. Rheology of Fluid and semisolid foods principles and applications. Aspen (Ed). USA. Cap. 5,6 pp. 219-356. Ribeiro, K.O., Rodrigues, M. I., Sabadini, E. and Cunha, R.L. 2004. Mechanical properties of acid sodium caseinate- κ - carrageenan gels: effect of co-solute addition. Food Hydrocolloids . 18:71-79 Rincones, R., Rubui, J., 1999. Introduction commercial cultivation of the red algae Eucheuma in Venezuela for the production of phycocolloids. Word aqua. Mag 30:57-61. Roudot A., 2004. Reología y análisis de la textura de los alimentos . Acribia (Ed). Zaragoza, España. Cáp.. 11 Pg 117-121 Servicio Nacional de Aprendizaje, Sena, 2006,citados en [en línea], <www. sena. edu. co> [consulta: 02 mayo.2006]. Sekkal, M., Legrand, P., Huvenne, J. P. and Verdus , M.C. 1993. The use of FTIR microspectrometry as a new tool for the identification in situ of

153

polygalactanes in red seaweeds. Journal of Molecular Structure. 294: 227-230. Sekkal, M., Legrand,P. ,Huvenne, J. and verdus, M.1994.The use of FTIR microspectrometry as a new tool for the identification in situ of polygalactanes in red seaweeds. Aquatic Botany. 47(1):53-60. Solimabi, B.,, Kamat, S.Y., Fernández, L., and Reddy, C.V., 1980. Seasonal changes in carrageenan and other biochemical constituents of Hypnea musciformis. Ind. J. Sci. 9:134-136. Sutherland .W. 1996. Ecological census techniques a handbook. Cambridge University Press. Printed in Great Britain. pp 390. Stanley, N. 1987. Production, properties and uses of carrageenan. In Production and utilization of products from commercial seaweeds McHugh D.J. (Ed). FAO. Fisheries Technical . paper No 288. Food and Drug Administration of the United Nations. Stortz, C. 1995. Determinación estructural de polisacáridos de algas: métodos espectroscópicos. En: Manual de métodos ficológicos. Alveal, K., Ferrario, M.E. (Ed.) E.C. Oliveira y E. Sar . Universidad de Concepción. Concepción, Chile. pg. 728-731. Smith, A., 2003,The seaweed resources of the Caribbean. In A.T. Critchley and M. Ohno (Eds).Seaweed resources of the world. Japan international cooperation agency. Yokosuka, Japan. pp 324-330. Tojo, E. and Prado, J. 2003. A simple 1H NMR Method for the quantification of carrageenans in blends. Carbohydrate Polymers. 53 (3): 325-330 Tucker, G. 2000. genetic Engineering as a means to modify polysaccharides. In: Gums and stabilizers for the food industry 10.( Ed) Williams, P. Phillips, G. O., RSC. The Royal society of Chemistry. Cambridge. pp 397-410. Villanueva, R. D., Mendoza, W.G., Rodrigueza, M.R.C., Romero, J. B. and Montaño, M. N. E. 2004. Structure and functional performance of gigartinacean Kappa-iota hybrid carrageenan and solieriacean Kappa-iota carrageenan blends. Food Hydrocolloids. 18:283-292. Villanueva, R.D. and Montaño, M. N. 2003. Fine Chemical structure of carrageenan from the commercially cultivated Kappaphycus Striatum (sacol variety) (solieriaceae, gigartinales, rhodophyta).J. phycol. 39:513-518.

154

Watt, N., Chiovitti, A., Craik, D. and Kraft, G. 2003. The cell wall galactans from Austarlian representatives of the genus Meristotheca ( Soleriaceae, Rhodophyta). Phycologia. 42 (6): 572-581. Xu, J.B., Bartley, J.P. and Johnson, R. A. 2003. Preparation and characterization of alginate-carrageenan hydrogel films crosslinked using a water-soluble carbodiimide . Journal of Membrane Science. 218: 131-147. Yakovleva, I., Yermak, I., Titlyanov, E. , Barabanova, A., Glazunov, V. and Skriptsova, A. 2001. Changes in growth rate, anatomy and polysaccharide content of a sterile form of Tichocarpus crinitus ( Gmel.) Rupr. ( Rodophyta, Tichocarpaceae ) grow under differing photon irradiance in the sea of Japan, Rusia. Botanica Marina. 44: 493-500. Yu, G., Guan, H., Ioanoviciu, A., Sikkander, S., Thanawiroon, C., Tobacman, J., Toida, T. and Linhardt, R. 2002. Structural studies on κ- carrageenan derived oligosaccharides. Carbohydrate Research. 337:433-440. Yu, S. , Blennow, A. , Bojko, M. , Madsen, F. , Olsen , C. and Engelsen, S. 2002. Physico-chemical characterization of Floridean starch of Red algae. Starch/Starke. 54: 66-74. Zhai, M., Zhang, Y., Ren, J., Yi, M., Ha, H. and Kennedy, J.F. 004. Intelligent hydrogels based on radiation induced copolymerization of N-isopropylacrylamide and Kappa carrageenan. Carbohydrate polymers, 58:35-39. Zuccarello, G., Critchley, A. T., Smith,J., Sieber,V., Lhonneur,G.B., West,J.A., 2006. Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (solieriaceae, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 45: 60-70

155

7 Anexos 7.1 Anexo: Tablas de Resultados Tabla No 10 Puntos de gelificación para las muestras de carragenina

Punto de gelificación OC Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0

34 35 36 32 34 34 37 37 33 32


34 36 39 34 34 33 35 39 34 33 35 37 39 33 32 Kappaphycus alvarezii

33 37 38 34 32

32 35 37 34 32

33 36 38 34 32 Hypnea musciformis

Guajira 32 37 36 33 32

Tabla No 11 Puntos de fusión de la carragenina

Puntos de fusión 0C

Muestra pH 8,0 8,4 8,6 9,0 10,0

62 66 64 62 45 61 65 65 60


60 67 65 61 55 60 59 55 45 56 63 58 56 Kappaphycus alvarezii

55 64 59 55

48 50 48 48

47 53 49 49 Hypnea musciformis

Guajira 46 53 48 47

156

Tabla No 12 Fuerza de Gel de la carragenina en solución 1,5% de KCl

1.5% en KCl

Muestra pH Fuerza de gel g/cm2

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0

58,72 908,95 708,0 112,77 20,20 58.74 909,99 783,34 112,77 N.G.

Hypnea musciformis

Santa Marta 58.74 909,5 707,26 120,77 N.G.

157,00 520,85 335,4 269,01 12,03 158,10 520,85 338,25 268,01 N.G.

Kappaphycus alvarezii 155,15 521,60 336,45 268,09 N.G.

100,34 519,94 446,16 220,13 N.G. 103,55 522,15 407,26 219,64 N.G.

Hypnea musciformis

Guajira 100,10 520,10 483,34 218,50 N.G. N.G: no gelificó

Tabla No 13 Fuerza de Gel de la carragenina en solución 0,5% de KCl

0.5% en KCl

Muestra pH Fuerza de gel en g/cm2

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0

338,12 209,12 18,20 15,47 N.G. 338,12 200,22 18,24 N.G.


335,00 197.35 18,22 N.G. 158,10 100,00 8,60 N.G.

N.G. 158,10 98,00 7.52 N.G. Kappaphycus alvarezii 158,30 100,00 7,50 N.G.

56,00 50,00 21,20 N.G. N.G. 58,72 51,00 20.20 N.G.

Hypnea musciformis

Guajira 57,10 50,00 15,47 N.G.

157

Tabla No 15. Estudio de la correlación fuerza de gel y elasticidad

Especie pH fuerza gel g/cm2

Elasticidad N/s

8,0 58,72 3,300 8,0 58,74 3,302 8,0 58,74 3,302 8,4 908,95 95,966 8,4 909,99 93,919 8,4 909,5 96,026 8,6 708 74,065 8,6 783,34 82,276 8,6 707,26 73,984 9,0 112,77 9,191 9,0 112,77 7,141


9,0 120,77 10,063 8,0 157 14,011 8,0 158,1 14,131 8,0 155,15 13,810 8,4 520,85 56,685 8,4 520,85 53,667 8,4 521,6 53,749 8,6 335,4 33,455 8,6 338,25 33,766 8,6 336,45 39,610 9,0 269 26,218 9,0 268,01 26,110

Kappaphycus alvarezii

9,0 268,09 26,100 8,0 100,34 8,592 8,0 103,55 8,186 8,0 100,1 7,810 8,4 519,94 50,368 8,4 522,15 53,809 8,4 520,1 53,586 8,6 446,16 46,625 8,6 407,26 41,287 8,6 483,34 49,579 9,0 220,13 20,877 9,0 219,64 20,839

Hypnea musciformis Guajira

9,0 218,5 20,714

158

Tabla No 16 pH de la carragenina

Muestra pH

pH

8,0 8,4 8,6 9,0 10 Hypnea Guajira 7,5 7,8 8,0 8,5 8,6

Kappaphycus alvarezii 7,4 7,8 8,0 8,5 8,6Hypnea Santa Marta 7,5 7,8 8,0 8,5 8,6

Tabla No 17 humedad en muestras de carragenina Muestra pH

% de Humedad

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 Hypnea Guajira 9,8% 9,0% 8,0% 9,4% 6,4%Kappaphycus alvarezii 8,0% 9,4% 9,3% 6,9% 7,5%Hypnea Santa Marta 7,5% 9,0% 9,4% 9,4% 9,3% Tabla No 20 contenido de sodio en kappa carragenina

Muestra SODIO porcentaje peso a peso

8,0 8,4 8,6 9,0 10,08,22 8,22 8,25 8,25 8,258,22 8,22 8,25 8,22 8,25 Hypnea Guajira

8,22 8,22 8,25 8,24 8,255,38 5,42 5,42 5,38 5,425,41 5,42 5,40 5,40 5,40Kappaphycus alvarezii 5,40 5,40 5,40 5,40 5,382,22 2,22 2,21 2,22 2,212,21 2,22 2,22 2,20 2,20Hypnea Santa Marta 2,22 2,21 2,22 2,20 2,22

159

Tabla No 21. Contenido de potasio en kappa carragenina

Muestra pH

POTASIO porcentaje peso a peso

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 1,13 1,12 1,21 1,18 1,13 1,21 1,12 1,12 1,13 1,12

Hypnea Guajira

1,18 1,21 1,18 1,21 1,21 1,14 1,15 1,17 1,15 1,17 1,15 1,14 1,15 1,15 1,01 Kappaphycus alvarezii 1,15 1,14 1,14 1,14 1,15 4,08 4,03 4,03 4,03 4,08 4,06 4,08 4,03 4,06 4,03 Hypnea Santa Marta 4,03 4,03 4,03 4,08 4,03

Tabla No 22. Contenido Calcio en kappa carragenina

Muestra CALCIO porcentaje peso a peso

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 0,77 0,77 0,75 0,77 0,75 0,75 0,75 0,77 0,77 0,77

Hypnea Guajira


160

Tabla No 23 Contenido de magnesio en kappa carragenina

Muestra

MAGNESIO porcentaje peso a peso

8,0 8,4 8,6 9,0 10,00,25 0,25 0,25 0,25 0,250,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Hypnea Guajira

0,25 0,25 0,25 0,25 0,250,36 0,36 0,36 0,36 0,360,36 0,36 0,36 0,36 0,36Kappaphycus alvarezii 0,36 0,36 0,36 0,36 0,360,41 0,41 0,41 0,41 0,410,41 0,41 0,41 0,41 0,41Hypnea Santa Marta 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41

Tabla No 24. Contenido de hierro en kappa carragenina

Muestra

HIERRO porcentaje peso a peso

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 0,30 0,30 0,31 0,31 0,31 0,31 0,30 0,31 0,30 0,30

Hypnea Guajira


161

Tabla No 25. Contenido de Manganeso en kappa carragenina

Muestra MANGANESO ppm

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 117 117 105 117 117 105 117 105 117 105

Hypnea Guajira

105 117 117 105 105 200 200 200 200 200 200 199 199 199 199 Kappaphycus alvarezii 199 200 200 200 200

30 32 29 29 29 29 29 32 32 30 Hypnea Santa Marta 32 32 29 29 29

Tabla No 26 Contenido de Cobre en kappa carragenina

Muestra COBRE en ppm

8,0 8,4 8,6 9,0 10,0 276 251 293 293 251 251 276 251 293 251

Hypnea Guajira

293 293 276 251 293 182 187 187 187 187 184 184 187 182 187 Kappaphycus alvarezii 187 187 182 187 184

10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Hypnea Santa Marta 10 10 10 10 10

162

Tabla No 27 Contenido de cinc en kappa carragenina

Muestra CINC ppm

8 8,4 8,6 9 10 46 46 46 46 46 46 42 42 46 46

Hypnea Guajira

46 42 42 42 42 32 30 30 30 30 30 30 32 32 30 Kappaphycus alvarezii 32 32 32 32 32 88 88 88 88 89 89 89 88 89 88 Hypnea Santa Marta 89 89 89 88 88

163

7.2 Anexos Estadísticos

Modelo estadístico

Como ilustración se desarrollará solamente el modelo estadístico para el

rendimiento de carragenina, pero se usa el mismo modelo para todos los

parámetros estudiados.

En términos estadísticos lo que se afirma es que el comportamiento

del rendimiento de carragenina (Υ) en el experimento con tres réplicas(κ)

se podrá describir mediante el siguiente modelo:

Υijk = µ + αi + βj + αβijk + εijk Ecuación 1

i = 1,2,3....a

J = 1,2,3,...b

K = 1,2,3 n

Donde µ es la media general de rendimiento, αi es el efecto debido a i-ésimo

nivel del factor pH, βijk es el efecto del J-ésimo nivel de la especie y αβijk es

el efecto de interacción dado por la combinación especie-pH y εijk es el error

aleatorio que supone sigue una distribución con media cero y varianza

constante δ2 (N (0,δ2 ) y son independientes entre sí. Para que la

estimación de los parámetros de este modelo sea única, se asume que los

efectos dados en el modelo son desviaciones respecto a la media global. El

factor especie es cualitativo y el factor pH es cuantitativo. Este modelo

permite identificar el punto óptimo de operación para obtener el mayor

rendimiento de carragenina.

Hipótesis a evaluar y análisis de varianza

Ho Hipótesis nula

164

HA Hipótesis alternativa

Evaluación del efecto de la variable pH sobre el rendimiento de carragenina.

Ho : Efecto del pH = 0

HA Efecto del pH ≠ 0

Evaluación del efecto de la variable especie sobre el rendimiento de

carragenina

Ho : Efecto de la especie = 0

HA Efecto de la especie ≠ 0

Evaluación del efecto de interacción de las variables especie y pH sobre el

rendimiento de carragenina

Ho : Efecto Especie*pH = 0

HA Efecto Especie*pH ≠ 0

Las hipótesis planteadas de acuerdo con la ecuación 1 son :

Ho : α1 = α2 = αa = 0

HA αi ≠ 0 para algún i

Ho : β1 = β2 = βb = 0

HA βi ≠ 0 para algún i

Ho : (αβij) = 0 para todo ij

HA : (αβij) ≠ 0 para algún ij

Estas hipótesis se probaron mediante el análisis de varianza ANOVA ,

cuyo modelo está descrito por la ecuación No 2

SCT = SCA + SCB + SCAB + SCE Ecuación 2

165

Si el valor p es menor al nivel de significancia α prefijado ( 95%), se

concluye que la correspondiente hipótesis es significativa, es decir ese efecto

está activo o influye en la variable respuesta, por ejemplo en el análisis

ANOVA para rendimiento de carragenina los dos valores p fueron menores

de 0,05 por lo tanto hay efecto de los factores pH y especie sobre el

rendimiento de carragenina, pero además el valor p responsable del efecto

de interacción pH * especie, también es menor que 0,1 lo que indica que hay

un efecto significativo de la interacción, es decir la respuesta rendimiento de

carragenina esta determinada por la interacción especie* pH.

Para investigar cuales medias causan las diferencias detectadas en el

ANOVA, se usa el modelo LSD ( diferencias mínimas significativas).

Denotando los tres niveles del factor especie como E1 (Hypnea

recolectada en Santa Marta), E2(Hypnea recolectada en la Guajira) y E3

(Kappaphycus alvarezii) y los cinco niveles de factor pH como: pH8,0; pH

8,4; pH8,6; pH 9,0; pH 10,0 Las hipótesis para esta prueba fueron:

Para el factor especie:

Ho µE1 = µE2

HA µE1 ≠ µE2

Ho µE1 = µE3

HA µE1 ≠ µE3

Ho µE2 = µE3

HA µE2 ≠ µE3

Para el factor pH

Ho µpH8 = µpH8,4

HA µpH8 ≠ µpH8,4

Ho µpH8 = µpH8,6

166


Ho µpH8 = µpH9,0


Ho µpH8 = µpH10,0


Ho µpH8,4 = µpH8,6

HA µpH8,4 ≠ µpH8,6











En el anexo estadístico No 7.2.1 se a aplica un procedimiento de

comparación múltiple para determinar las medias que son significativamente

diferentes unas de otras. Con este método, hay un 5,0% de riesgo de

considerar cada par de medias como significativamente diferentes cuando la

diferencia real es igual a 0.

La gráfica de diagrama de dispersión que se muestra en el análisis

denominado : Scatterploy by level Code, es útil porque permitió observar la

variabilidad de la respuesta en cada punto experimental y concluir que no

hay observaciones atípicas que afecten las conclusiones del estudio.

167

Los supuestos de normalidad, varianza constante e independiente de

los residuos en un diseño factorial se verifican con los métodos gráficos, para

ello se emplea la gráfica que se titula Residual plot for rendimiento, como

todos los puntos caen en una banda horizontal se cumple el supuesto de

varianza constante y el supuesto de normalidad al caer los residuos

alineados en la grafica de probabilidad normal. Las gráficas se presentan

por especie y por pH

Scatterplot by Level Code

rend

imie

nto

Especie

0

20

40

60

80

100

HYG HYS KP

168

Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD

Especie

rend

imie

nto

HYG HYS KP14

24

34

44

54

Residual Plot for rendimientore

sidu

al

predicted rendimiento

-2,1

-1,1

-0,1

0,9

1,9

2,9

0 20 40 60 80 100

Residual Plot for rendimiento

sire

dual

row number

-2,1

-1,1

-0,1

0,9

1,9

2,9

0 10 20 30 40 50

Todos estos análisis se obtienen para cada uno de los parámetros

fisicoquímicos determinados.

169

pontificia universidad javeriana maestria en ciencias

Documents