polinucleótidos. polinucleótido extremo 5 extremo 3 enlace fosfodiéster
TRANSCRIPT
Polinucleótidos
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
ON
N
O
NHH
ON
N
N
N
O
NH
H
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
N
N
N
OH
NH
H
H
HOCH2
OH
Polinucleótido
Extremo 5’
Extremo 3’
Enlacefosfodiéster
5’- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3’
5’-CATTGCGGAATGCC-3’3’-GTAACGCCTTACGG-5’
Formas de representación de polinucleótidos
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O-
CH2
O
PO-
O
ON
NH3C
O
H
O
NN
NNN
H
O
ON
N
O
NHH
NN
NN
NH H
O
H
O
ON
N
N
N
OH
NH
H
NN
O
NH
H
O
O-
CH2
O
PO-
O
O-
CH2
O
PO-
O
O
N
N
N
N
NH
H NN
O
O
H3C
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O O
ON
N
N
N
OH
NH
H
NN
O
NH
H O
O-
CH2
O
PO-
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O-
CH2
O
PO-
O
5’
3’ 5’
3’
Polinucleótidoen doble hélice
Propiedades de los polinucleótidos, 1
1. Absorción de luz UV a 260 nm
% A260,
Hipocromismo
T (ºC)100
110
120En el DNA doble hélice se da elfenómeno de hipocromismo:
el DNA desnaturalizado por el calorabsorbe un 20-30 % más que elDNA nativo
Propiedades de los polinucleótidos, 2
2. Reacción positiva de los polidesoxirribonucleótidos a la difenilamina y al reactivo de Schiff
3. Reacción positiva de los polirribonucleótidos al orcinol
4. Reacción con agentes intercalantes (acridinas)
5. Hidrólisis completa del RNA con álcali; el DNA es resistentea álcali.
Rotura química de polinucleótidos
- Tratando un polinucleótido (DNA) con dimetil sulfato (DMS)tiene lugar la metilación de purinas; por calentamiento a pH neutrose rompe el enlace glicosídico y queda un sitio apurínico; el tra-tamiento ulterior con ácido diluído rompe la cadena por el sitioapurínico.
- Tratando un polinucleótido (DNA) con hidrazina se rompe el enlace glicosídico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi-dínico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena porel sitio apirimidínico.
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
O
O
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
N
N N
NN
H
H
OH
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
O
O
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
N
N N
NN
H
H
OHH3C
DMS
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
O
O
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
N
N N
NN
H
H
OHH3C
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
O
O
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
OH
pH bajo
Sitio apurínico
Calentamiento
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
O
O
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
OH
Sitio apurínico
O
O
-OO-
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
N
N
NH H
O
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
ON
N
N
N
NH
H
-O
H2C
O
P
-O
O
O-
Ácido diluído
Rotura enzimática de polinucleótidos
Endonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados enel interior de una cadena polinucleotídica, y suelen serespecíficas de cada ácido nucleico:
- Ribonucleasas- Desoxirribonucleasas
Exonucleasas: atacan enlaces fosfodiéster situados en losextremos (3’ o 5’) de una cadena polinucleotídica, y suelenatacar indistintamente ambos tipos de ácidos nucleicos:
- Exonucleasa de bazo (rotura tipo b)- Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
ON
N
O
NHH
ON
N
N
N
O
NH
H
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
H
ON
N
N
N
O
NH
H
H
OH
CH2OP
O-O
O-
ON
N
N
N
NH
H
OH
OP
O-O
O-
CH2
OP
O-O
O-
CH2O
N
NH3C
O
H
O
OH
OP
O-O
O-
CH2 ON
N
O
NHH
OH
Rotura tipo a:
Da lugar a unamezcla de5’-nucleótidos
O
-O
H2C
O
P
-O
ON
NH3C
O
H
O
ON
N
O
NHH
ON
N
N
N
O
NH
H
ON
N
N
N
NH
H
O
-O
H2C
O
P
-O
O
-O
H2C
O
P
-O
O
O
-O
H2C
O
P
-O
H
ON
N
N
N
O
NH
H
H
HOCH2
O
P O-O
O-
ON
N
N
N
NH
H
O
P O-O
O-
HOCH2
ON
N
O
NHH
O
P O-O
O-
HOCH2
ON
NH3C
O
H
O
O
P O-O
O-
HOCH2
Rotura tipo b:
Da lugar a unamezcla de3’-nucleótidos
Endonucleasas:
DNAasa I: rotura completa, tipo aDNAasa II: rotura completa, tipo bRNAasa pancreática: rompe (b) enlaces Py-XRNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X
Endonucleasas de restricción
Exonucleasas:
Exonucleasa de bazo: libera 3’-nucleótidosExonucleasa de veneno de serpiente: libera 5’-nucleótidos
Endonucleasas de restricción, 1:
1. Reconocen secuencias específicas, por lo general palindrómicas:
5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’
La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
Endonucleasas de restricción, 2:
2. Suelen romper el polinucleótido dejando extremos cohesivos:
5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’
5’- ATCGTTGCCTACAATTG3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAA
AATTCCCAATAACCCTT -3’ GGGTTATTGGGAA -5’
Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por lamisma endonucleasa de restricción
Endonucleasas de restricción, 3:
3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNApor un número muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula-ción experimental del mismo.
EcoRI GAATTCClaI ATCGATHaeIII GGCCRsrII CGGATCCG
Algunas endonucleasas de restricción:
Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasade restricción EcoRI, que es
5’-GAATTC-3’
En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azarsería de
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324
O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos
Separación electroforéticade fragmentos de restriccióndel DNA.
Una vez separados, se tratancon bromuro de etidio (un agen-te intercalante) y se observan bajo luz UV.
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACG
3’
3’
3’ 5’
5’
5’
1 . S e a u n D N A q u e s e d e se a s e c u e n c ia r :
2 . D isp o n e m o s d e u n o lig o n u c le ó tid o c o m p le m e n ta rio a la s e c u e n c ia , q u e s e h ib r id a c o n e l D N A c u y a se c u e n c ia d e se a m o s c o n o c e r, y q u e v a le c o m o c e b a d o r d e la n u e v a s ín te s is . E s te o lig o n u c le ó tid o e s tá m a rc a d o ra d io a c tiv a m e n te .
TA G G C A C G
Método de Sanger para secuenciación de polinucleótidos
3 . L a m u e s tra s e d iv id e e n c u a tro p a r te s , q u e c o n tie n e n :
A ) L o s c u a tro d e so x in u c le ó s id o tr ifo s fa to s , d AT P, d G T P, d C T P, d T T PB ) D N A p o lim e ra s a I (f ra g m e n to K le n o w )
y e sp e c ífic a m e n te c a d a u n a ,
C ) u n d id e s o x in u c le ó s id o trifo s fa to , q u e a l c a re c e r d e 3 ’ -O H in te r ru m p e la s ín te s is d e D N A a llá d o n d e s e in c o rp o re .
d AT Pd G T Pd C T Pd T T P
d d AT P
d AT Pd G T Pd C T Pd T T P
d d G T P
d AT Pd G T Pd C T Pd T T P
d d C T P
d AT Pd G T Pd C T Pd T T P
d d T T P
M u e stra A M u e s tra B M u e s tra C M u e s tra D
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*
3’
3’
5’
5’
3
4
1 2
1 5
2 1
2 6
Síntesis en presencia de ddGTP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCA*
3’
3’
5’
5’
1
2
6
8
1 3
1 7
Síntesis en presencia de ddATP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCAC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATC*
3’
3’
5’
5’
5
7
1 1
1 6
2 0
2 5
Síntesis en presencia de ddCTP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCGAACGT*
3’
3’
5’
5’
9
1 0
1 4
1 9
2 4
3 1
Síntesis en presencia de ddTTP
G A T C60
50
40
30
20
10
+
-A continuación, las cuatro mezclasse someten a electroforesis en poli-acrilamida-SDS. Este método sepa-ra polinucleótidos en función de sutamaño, de forma que los más cortosse desplazan más rápidamente. Comoel cebador está marcado radioactiva-mente, revelamos la plancha deelectroforesis por autorradiografía.
Con esto leemos directamente lasecuencia complementaria del poli-nucleótido inicial:
5’-AAGGCACATTCGATGCAAT-CGAATCGAACGTCCCAAAAG-GATTCCGGGAAAATG-3’