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Método cromogénico para la identificación y/o recuento de Aeromonas, Pseudomonas y otras bacterias Gram-negativas con el empleo del medio

CromoCen® AGN BioCen, código 4227

Aplicación en muestras alimentos

El método incluye una fase de identificación y enumeración presuntiva con el empleo del medio cromogénico CromoCen® AGN para la detección y enumeración de Aeromonas y Pseudomonas en muestras de alimentos. Posibilita, además, la identificación y/o recuento de E. coli, coliformes totales y Salmonella (no Typhi). Garantiza los resultados en 18-24 h y requiere la confirmación adicional con las pruebas rápidas de oxidasa (para Aeromonas y Pseudomonas), indol y/o glutamato descarboxilasa para E. coli. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este método: Todos los tipos de muestras de alimento en las que se sospeche la presencia de los microorganismos diana. Resumen de la aplicación El medio combina el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) para la detección de actividad galactosidasa, presente tanto en Aeromonas, E. coli, como en el resto de los coliformes; con un sustrato (caseína) para la detección de actividad proteolítica de diferentes especies de Aeromonas y Pseudomonas. La inclusión del sustrato cromogénico 5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido (Magenta-GLR), posibilita la detección de actividad glucuronidasa característica de E. coli y presente además en algunas especies de Shigella (Shigella sonnei). La detección de especies de Salmonella se facilita en este medio por la inclusión de una fuente de carbono degradable por la mayoría de ellas, adicionado como suplemento líquido (propilenglicol); a excepción de Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi. La lactosa, contenida en la caseína, constituye otra fuente de carbono que posibilita la diferenciación de las especies que la degradan, mediante la observación de la variación de la coloración de las colonias y del medio en presencia del indicador rojo neutro. La inclusión de tierra de diatomea en la formulación, posibilita la mejor observación de las características cromáticas de las colonias, la detección de las reacciones de hidrólisis de la caseína, y los elementos químicos que contiene estimulan la producción de pigmentos, en especial de Pseudomonas aeruginosa. La combinación de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperación de los microorganismos de interés. Procedimiento El esquema general para el método se presenta en los esquemas A, B y C. Siembra en placas e identificación Los métodos de siembra en el medio CromoCen® AGN dependen del tipo de muestras a ensayar y el propósito (identificación o recuento). Para la identificación se recomienda la siembra por agotamiento del inóculo en la superficie por estrías y/o el método de inundación de la superficie. Para el recuento, se recomienda el método de inundación de la superficie. Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daños o cambios en su composición y estado. Asegúrese que el pH no disminuya a valores inferiores a 4,5 durante el proceso de pre-enriquecimiento (si se requiere para Aeromonas o Salmonella). El pH de alimentos ácidos y acidificantes es más estable en agua peptona buferada de doble concentración. El método de siembra por agotamiento del inóculo en la superficie (por estrías) consiste en sembrar un inóculo con el objetivo de obtener colonias aisladas para su estudio. Se coloca la placa con el medio de cultivo CromoCen® AGN sobre una superficie lisa. Se esteriliza a la llama un asa de nicrom, se enfría y se toma el inóculo. Se levanta ligeramente la tapa de la placa de Petri y se va arrastrando el inóculo desde un borde de la placa al otro realizando líneas rectas en zig-zag bien apretadas, avanzando hacia el centro. Se gira la placa en un ángulo de aproximadamente de 70 a 90 º y se realiza el estriado entrecruzando los cuadrantes. En el último cuadrante se realiza el zig-zag menos frecuente, es decir, con líneas más separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este método puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el inóculo de partida está muy concentrado. El método de siembra por inundación de la superficie, se ejecuta distribuyendo homogéneamente el inóculo con ayuda de una espátula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule de 0,1 a 0,5 mL de la porción de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen® AGN. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una espátula de Drigalsky estéril (embeber en alcohol y flamear), girando esta última siempre en posición totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 5–10 min para que la muestra penetre en el lecho del agar.

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Para Aeromonas: Se recomienda el enriquecimiento de las muestras sospechosas de Aeromonas en el medio Agua Peptona Alcalina, incubando a 35 ± 2 °C por 18-24 h. Para Pseudomonas: La identificación se realiza inoculando directamente la muestra en la placa o a partir del enriquecimiento en cualquiera de los medios seleccionados. Incube el medio a 35 ± 2 ºC durante 18-24 h. Para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras especies de Pseudomonas productoras de pigmento pioverdina, se recomienda incubarlo a 42 ± 2 ºC. Para E. coli y coliformes: El recuento se realiza a partir de la siembra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ningún paso previo de enriquecimiento. Incube el medio a 35 ± 2 ºC durante 18-24 h. Para la identificación y/o recuento de coliformes fecales, se recomienda incubarlo a 42 ± 2 ºC. Para Salmonella: Incube la suspensión inicial para el pre-enriquecimiento no selectivo a 37 ± 1 ºC durante 18 ± 2 h procediendo luego al enriquecimiento selectivo. Para esto, transfiera 0,1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de Caldo Rappaport-Vassiliadis con Soya (CRVS); transfiera 1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de (Caldo Tetrationato (CTTN). Incube el CRVS inoculado a una temperatura de 41,5 ºC por 24 ± 3 h y el CTTN, a 37 ± 1 ºC durante 24 ± 3 h. Tenga especial cuidado para que la temperatura de incubación no exceda los 42,5 ºC. Con posterioridad a la incubación, utilizando los cultivos procedentes de CRVS y CTTN, inocule con la ayuda del asa la superficie de la placa de Agar X.L.D. (medio selectivo), por agotamiento del inóculo con el objetivo de obtener colonias aisladas. En caso de no contar con placas grandes, utilice dos placas pequeñas, una a continuación de la otra, utilizando la misma asa. Proceda de igual forma con el medio CromoCen® AGN, sembrando por estriado (agotamiento del inóculo) en las placas. Realice tantas réplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo. Incube las placas invertidas a 35 ± 2 ºC (X.L.D. y CromoCen® AGN), agrúpelas en no más de 4 placas por columnas. Con posterioridad a la incubación, examine las placas de ambos medios para determinar la presencia de colonias típicas de Salmonella y las atípicas (sospechosas) que pudieran considerarse Salmonella. En el caso de muestras en las cuales no sea detectado crecimiento de colonias sospechosas en el medio CromoCen® AGN, se procederá a ensayar las colonias sospechosas provenientes de X.L.D. con las pruebas bioquímicas establecidas en el estándar ISO 6579. De manera similar, se procederá a identificar las colonias que pudieran ser consideradas como atípicas en el medio CromoCen® AGN. Algunos órganos regulatorios pueden exigir la confirmación de E. coli por algunas pruebas adicionales a la detección de actividad β-galactosidasa y β-glucuronidasa, respuestas características en el medio CromoCen® AGN. En este caso, la confirmación de las colonias sospechosas de E. coli se puede ejecutar con la prueba de glutamato decarboxilasa y/o la prueba rápida de indol (positivas en ambos casos). Las cepas de Aeromonas de coloración violeta sin halo transparente se confirman con la prueba de oxidasa (positivas) y las colonias violetas oxidasa negativas son confirmadas como coliformes totales. Incube la placa en una incubadora bacteriológica a 35 ± 2 °C por 18-24 h. En la incubadora, coloque las placas en posición horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no más de 4 placas. Al finalizar la incubación, observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Luego de la incubación, examine las placas para determinar la presencia de colonias típicas de los microorganismos diana y las atípicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. Interpretación CromoCen® AGN: El crecimiento típico de las especies de Aeromonas se observa como colonias de color verde y en su mayoría presentan un halo transparente y amplio alrededor de las colonias, o como colonias de color violeta, oxidasa positivas, con o sin halo transparente amplio. Las especies de Pseudomonas, y en especial Pseudomonas aerugiosa, muestran coloración de rosada a naranja, con o sin halo transparente alrededor de las colonias y fluorescencia azul verdosa (en su mayoría). E. coli se identifica por las colonias de color violeta intenso, con halo violeta a su alrededor. Las bacterias del grupo coliformes producen colonias de color violeta de diferentes tonalidades β-galactosidasa negativas. Salmonella (excepto Typhi y Paratyphi) se observan como colonias de coloración rosada intensa con bordes rosados. Las colonias incoloras o con pigmentación propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio. Agar X.L.D.: El crecimiento típico de Salmonella en Agar X.L.D. son colonias con centro negro con un halo ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de color del indicador. El crecimiento de las variantes H2S negativas de Salmonella (ej: S. Paratyphi) son rosadas con centro rosa oscuro. Salmonella lactosa-positivas, en el medio X.L.D. son amarillas con o sin coloración negra.

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Ventajas

•Más rápido. La identificación de Aeromonas, Pseudomonas, E. coli y coliformes se realiza en un máximo de 24 h de manera simultánea y la de Salmonella spp. en un período máximo de 24 h posterior al enriquecimiento. La detección directa y simultánea de varias actividades enzimáticas en un mismo medio eleva la exactitud del análisis. Esto permite la identificación presuntiva directa y la confirmación con las pruebas serológicas de Salmonella sin la confirmación bioquímica, cuyos resultados no presentan diferencia con la identificación por los métodos tradicionales los cuales pueden extenderse hasta 90 h.

•Posibilidad de realizar los ensayos de serología a partir de las colonias coloreadas en el medio sin necesidad de subcultivar en un medio de propósito general sin mostrar interferencias o falsas aglutinaciones.

•Más fácil de utilizar. No necesita esterilización durante su preparación. Disminución de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras de alimentos.

•Más preciso. Sus Sensibilidad y Especificidad diagnósticas son superiores a las de los medios convencionales destinados al mismo propósito para todos los microorganismos de interés.

•Más confiable. El contraste de colores no permite confusión. Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos 1. Base de Medio CromoCen® AGN Composición: Agar-15 g/L; Mezcla cromogénica-13,2 g/L; Bases nutritivas-13 g/L; pH 7,0 ± 0,2 1.1 Preparación: De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporción de 41,2 g/L de agua destilada o desionizada. Adicione 10 mL del suplemento PLG (propilenglicol). Hierva hasta disolución completa y distribuya. No esterilice en autoclave. 1.2 Preparación de las placas del medio CromoCen® AGN: Transfiera inmediatamente a un baño con temperatura de 44 a 47 °C. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en posición invertida en el horno a temperatura entre 35-55 °C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio esté seca. 2. Suplemento PLG Reactivo: propilenglicol Determinación de las características organolépticas: Se ejecuta por simple evaluación visual. Criterios de aceptación: El reactivo debe ser incoloro, transparente, sin presencia de partículas. 3. Prueba Rápida de GAD Composición del reactivo de la prueba rápida de glutamato descarboxilasa (GAD): Acido L-glutámico- 0,1 g; Cloruro de sodio- 9 g; Verde de bromocresol- 0,005 g; Tritón X-100- 0,3 mL; Agua destilada- 100 mL. 3.1 Preparación: El reactivo debe tener el pH 3,5; tener color amarillo y estar transparente. Esterilice el reactivo por filtración y enváselo asépticamente en un frasco de vidrio de color ámbar para su posterior almacenamiento en refrigeración. Se ha comprobado una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un período de 5 meses de almacenamiento. 3.2 Procedimiento: Pique una colonia de interés y prepare una suspensión concentrada en 0,5 mL de solución salina estéril. A esta suspensión añádale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 ± 2 ºC durante 10-13 h, observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considérelo como reacción positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera más rápida y por tanto su respuesta se observa en menor tiempo. 4. Prueba Rápida de indol Prueba de Arnold Weaver

Medios de cultivo: Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptófano. Composición: Hidrolizado enzimático de caseína- 10,0 g; cloruro de sodio- 5,0 g. 4.1 Preparación: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a 121 °C por 15 min. 4.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptófano. Incube a 37 ºC durante 2 h. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. Interpretación: El color rojo en la capa reactiva indica formación de indol. Almacenamiento del medio CromoCen® AGN • Mantenga el frasco con el medio deshidratado herméticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido

de la luz, a temperatura de 15 a 30 °C • Se podrá almacenar las placas listas para el uso por un período de 30 días a temperatura de 2 a 8 °C.

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Para mayor información dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia técnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu

Esquemas para la determinación de los microorganismos diana.

Esquema A. Detección e identificación de Aeromonas por el método cromogénico con el medio CromoCen® AGN

Muestra en agua peptona alcalina (opcional, si es para recuento, no ejecutar) (Homogeneice).

Incube a 35 ± 2 °C por 24 h.

Inocule la placa de CromoCen® AGN por agotamiento del inóculo en la superficie (estrías) o por inundación de la superficie; 0,2-0,5 mL para muestras líquidas, directamente de la muestra o del cultivo en caldo, o con el tamaño de muestra recomendado; o a partir de diluciones.

Incube a 35 ± 2 °C por 18-24 h.

Identifique las Aeromonas como colonias de color verde, con o sin halo transparente amplio, o colonias

violetas con o sin halo transparente. Las colonias de color violeta sin halo son confirmadas para su reacción positiva a la prueba de citocromo oxidasa.

Procese los resultados.

Esquema B. Detección, identificación y/o recuento de Pseudomonas, E. coli y coliformes por el método cromogénico con el medio CromoCen® AGN.

Prepare la muestra según su origen y el método de siembra a emplear. Para muestras sólidas, suspenda la muestra en agua peptonada, agua peptonada tamponada, o según proceda.

De ser necesario, prepare diluciones seriadas según los niveles de contaminación esperados.

Inocule la placa de CromoCen® AGN por agotamiento del inóculo en la superficie (estrías) o por inundación de la superficie con 0,2-0,5 mL para muestras líquidas, directamente de la muestra, caldos, o a partir de las

diluciones seriadas.

Incube a 35 ± 2 °C por 18-24 h. Para coliformes fecales o para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras Pseudomonas (opcional) incube a 42 ± 2 °C por 18-24 h.

Identifique y/o cuente las colonias diana según se describe en el presente método. Confirme si es necesario

con las pruebas adicionales que se describen (GAD e Indol rápido para E. coli, o citocromo oxidasa para Pseudomonas).

Procese los resultados.

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Esquema C. Detección e identificación de Salmonella por el método cromogénico con el medio CromoCen® AGN