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Aplicación de técnicas moleculares para p pel estudio de la biodegradación de
hidrocarburos
Presenta: M. en B. Olivia Tzintzun Camacho
Laboratorio de Residuos Sólidos W-108 y W-103
Técnicas de remediación de suelos
Técnicas tradicionales o Técnicas innovadorasTécnicas tradicionales o establecidas
Técnicas innovadoras
Incineración Extracción de vapores del sueloMezclar enterrar y cubrir Aspersión de aireMezclar, enterrar y cubrir Aspersión de aire
Dispersión sobre el terreno Desorción térmicaSolidificación Deshalogenación química
Reuso y Reciclado Enjuague del suelo in situExtracción con solvente
Lavado del sueloBajo costoMedidas Fitocorrectivas
Biorremediación
-Bajo costo
-Degradación del contaminante
No perjudica las-No perjudica las propiedades del suelo1
1. Rahman et al., 2002
Biodegradación de hidrocarburosLa degradación de hidrocarburos puede darse por:
Cultivos mixtosCultivos puros
Biodegradación de hidrocarburosLa degradación de hidrocarburos puede darse por:
Efectos sinérgicos entre las Efectos sinérgicos entre las poblacionespoblaciones
(M k d(M k d t lt l 2008)2008) Cultivos mixtos(Mukred (Mukred et al.et al., 2008), 2008)
La cooperación entre las La cooperación entre las actividades metabólicas de las actividades metabólicas de las
poblacionespoblaciones(Wang (Wang et al.et al., 2006), 2006)
Degradación por cultivos mixtos
La capacidad de degradación de un consorcio microbiano depende
Asociaciones poblacionales que se establecenLos mecanismos
pueden ser complejospueden ser complejos
CapacidadCapacidad metabólica de cada
una de las cepas
Remover metabolitos Degradar compuestos ¿ De dónde se bti l
(Ghazali et al., 2004).
producidos por otras poblaciones
g poxidados parcialmente obtienen los
microorganismos ?
Identificación de microorganismos degradadoresdegradadores
Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización (DGGE)(DGGE)
Técnica de huella, rastreo o t d l l ( l ltrazado molecular (molecular
fingerprinting )
Identificación de microorganismos degradadores
Procedimiento para DGGE
1. Extracción de DNA
Lisis celular (SDS)
Digestión con (RNAasa)
Precipitación de proteínas
Recuperación d DNALavado del de DNA
(isopropanol)
Lavado del DNA (etanol)
Hid t ióHidratación del DNA
(Buffer TE)
Identificación de microorganismos degradadores
Procedimiento para DGGE
2. Amplificación de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR
Identificación de microorganismos degradadoresReacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)Polimerasa (PCR)
DNA molde
dNTPs
MgCl2Taq polimerasa
Primers
Buffer
Identificación de microorganismos degradadores
3. Visualización de los productos de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR
PCR ió V6 V8
1 2 3 4 5
PCR región V6- V8 16SrDNA
470 pbpb
Identificación de microorganismos degradadores
4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGEAgentes
desnaturalizantes: urea y formamida
44%
54%
Identificación de microorganismos degradadoresdegradadores
4. Preparación del gen de poliacrilamida y desarrollo del DGGE
Muyzer et al., 1996
Identificación de genes catabólicos
gen gen alkalkBB
Pseudomonas oleovorans:Pseudomonas oleovorans:Peters J, Witholt B. Biochim Biophys
Acta (1994) 1196(2): 145-53.
β-Oxidación (Whyte (Whyte et alet al., 2002)., 2002)
Identificación de genes catabólicos
El plásmido OCTde Pseudomonade Pseudomonaoleovoranscontiene dosoperonesalkBFGHJKL yalkBFGHJKL yalkST.
¿Qué se hace
(van Beilen et al., 1994)
¿Qué se hace experimentalmente?
Identificación de genes catabólicosEtapa °C Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 1 min 1
Desnaturalización 94°C 1 min
30Alineamiento 50°C 1 min
Extensión 72°C 2 min
Extensión final 72°C 10 min 1
Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos
Identificar cepas bacterianas(DGGE)( )
Dinámica de las poblacionesdurante la degradación dehidrocarburos.
Identificación de genescatabólicos (PCR)
Expresión de los genesExpresión de los genescatabólicos (PCR-TR)
Díaz-Ramírez et al., 2008
Uso de herramientas moleculares para estudiar la biodegradación de hidrocarburos
Expresión de los genescatabólicos (PCR-TR)
Powell et al., 2006