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Clase entrevista sobre plantas transgénicasTRANSCRIPT
Bioquímica Aplicada Junio 2010
Las plantas transgénicas Juan Pablo Allocati
Cátedra de BioquímicaFacultad de AgronomíaUniversidad de Buenos Aires
Manipulación genética de organismos
Esquema de Producción de una planta transgénica
Sistemas de transferencia genética en plantas
Basados en vectores biológicos
Biología de Agrobacterium tumefaciensVectores basados en el plásmido Ti Genes reporteros
Basados en la transferencia directa de ADN
Transformación por biobalísticaTransformación con whiskers de carburo de silicio
Referencias bibliográficas
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Resumen
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Manipulación genética de organismos
El hombre a manipulado los organismos vivos desde hace mucho tiempo
Mejoramiento genético de plantas desde hace 10.000 años
Mejoramiento genético de animales hace 5.000 años.
Mejoramiento de caninos hace 4.000 años
La producción de organismos transgénicos para uso médico es aceptada
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Manipulación genética de organismos
La información hereditaria (genes)de todos los seres vivos es químicamente idéntica (DNA) y funcionalmente muy parecida.
Muchos genes son compartidos entre bacterias, plantas y animalesincluyendo el ser humano.
¿Qué son los organismos Transgénicos o genéticamente manipulados?
Los organismos transgénicos son aquellos a los que se les ha introducido material genético propio o extraño por métodos de laboratorio que involucran el uso de técnicas de DNA recombinante
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Esquema de producción de una planta transgénica Plantas
Maduras
Plantas transgénicas
fértiles
Polinización
Semillas Embrionesinmaduros
Proliferaciónde células
Callos
Callosseleccionados
Selección
Introducciónde ADN
Regeneración
Brotes regenerados
Enraizamiento
Maduración
Rustificación
Plántulas
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Esquema de producción de una planta transgénica
Las semillas de una planta modificada
heredan de manera estable la nueva
característica de sus padres
Los genes introducidos se transmiten a través de las semillas de generación en generación como cualquier otra
característica (gen) de la plantas
Basados en vectores biológicos
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Sistemas de transformación
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Sistemas de transformación basados en A. tumefaciens
(vector biológico)
¿De dónde surge la tecnología para producir plantas transgénicas?
Surge del estudio de una bacteria del suelo, llamada Agrobacteriumtumefaciens, que de manera natural y hace muchos millones de años modifica genéticamente las células de las plantas.
Esta bacteria existe en los suelos de todo el mundo y ha sido estudiada desde finales del siglo XIX
El ADN bacteriano se integra al genoma de la planta y se expresa
La bacteria se pone en contacto con la planta a través deheridas y transfiere ADN
Agalla de la corona
Célula vegetal infectada
Proliferación celular
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Sistemas de transformación basados en A. tumefaciens
Agrobacterium: Uno de los primeros ingenieros genéticos de la naturaleza
Esta bacteria modifica el genoma de las células vegetales transfiriéndoles genes que las obliga a reproducirse y proveerla de alimento
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Transformación de cotiledones de soja mediante co-cultivo con A. tumefaciens
Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Transformación de Arabidopsisthaliana por infiltración floral conAgrobacteriumtumefaciens
Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001.
Las plantas florecidas se sumergen en un cultivo
de Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas
y se germinan en un medio con agente selector.
Tratar con antibiótico para eliminar al Agrobacterium y seleccionar las células
vegetales transformadas
2-4 semanas
Transpasar los discos de hojas sobrevivientes a medio fresco de selección / regeneración
6-10 semanas
Enraizar las plántulas en selección
4-6 semanas
Rusticar las plantas transgénicas
Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas
Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium
1-2 días
Lavar los discos de hojas
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Tiempos estimados para un protocolo de transformación estándar
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Transformación con A. tumefaciens por infiltración al vacío
La técnica es: Rápida: la proteína recombinante puede obtenerse en aproximadamente una semana. Eficiente: alta eficiencia de transformación; acumulación de proteína comparable con la de plantas transgénicas (hasta 40 mg/kg de hoja). Simple: sólo se requiere equipamiento básico.
Flexible: puede utilizarse para producir proteínas de membrana, enzimas o virus quiméricos, o para ensayar promotores
Control sin Control sin transformar, c/transformar, c/BiBi
transformados en transformados en medio selectivomedio selectivo
Seguimiento de la transformación de embriones de maíz y regeneración de una planta transgénica mediante
la reacción histoquímica de la enzima β-glucuronidasa.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Expresión del gen uidA en plantas de maíz
Basados en la transferencia directa de ADN
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Sistemas de transformación
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Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Sistemas de transferencia directa de ADN
• Ventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector
de los tejidos o plantas transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de
re-arreglos en los transgenes
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Las técnicas de biobalisticafueron desarrolladas en los años 80.
Bombardeo de micropartículas 1984. Sandford et al., describen la técnica de bombardeo de micropartículas para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).
M ecanismo de disparo de un cañón impulsado por He a alta pres ión (PDS 1000/He)
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Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Las técnicas de biobalisticafueron desarrolladas en los años 80.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
La transformación por biobalísticadepende de diversos parámetros.
• Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN
- Método de aceleración de las micropartículas
- Naturaleza química y física, densidad y volumen
de las micropartículas
- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN
- Vacío y distancias de bombardeo
- Diámetro de apertura de la placa de retención
- Número de bombardeos
• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de selección
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
La transformación por biobalísticadepende de diversos parámetros.
• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco
- Genotipo de la planta a utilizar - Tipo y capacidad de regeneración in vitro de los explantos
- Preparación y condiciones de cultivo de los explantos pre- y post-bombardeo
- Requerimientos de temperatura, fotoperíodo y humedad de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado
Respuesta de los genotipos a la transformación
050
100150200250300350400
puntos azules por disparo
BLS14 HL22genotipos
Respuesta de los genotipos a la transformaciónpAct1D+pAcH1 pDMC208+pAcH1
Bioquímica Aplicada
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Transformación Vegetal
Transformación con Whiskers de carburo de silicio.
Nanobiotecnología
A B C
D E F
Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant CellReports, 2000.
A: suspensiones celulares de maíz penetradas por fibras de carburo de silicio (0,3-0,6�m por 10-100�m) recubiertas de ADN (transformación)
B: expresión transitoria del gen uidA luego de la transformación
C: callos resistentes a fosfinotricina
D y E: inflorescencia y fruto de una planta transgénica R0
F: ensayos de resistencia a fosfinotricina con plantas R1 dos semanas después del tratamiento
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
¿Transferencia directa de ADN versus Agrobacteriumtumefaciens?
Vs.
1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformation of plants: biology and biotechnology.Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154, 2006.
2. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends in Biotechnology, 21:95-98, 2003.
3. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003.
4. Bent, A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540-1547, 2000.
5. Microprojectile mediated plant transformation: A bibliographic search. Rajesh Luthra, Varsha, Rajesh K. Dubey, Ashok K. Srivastava and Sushil Kumar. Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), P.O. CIMAP, Lucknow, 226 015, India
6. Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon. United States Patent 6806399. Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. (Haifa, IL)
7. Estudio del comportamiento en cultivo in vitro de líneas de maíz flint: competencia para la transformación genética. Allocati, JP. Tesis Licenciatura. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Universidad Nacional de General San Martín.
8. Transformation of Maize Using Silicon Carbide Whiskers. Jim M. Dunwell. Feb-15-1999; DOI:10.1385/1-59259-583-9:375. Springer Protocols.
9. “Enhancing cytosolic ADP-glucose synthesizing sucrose synthase activity in transgenic potato tubers results in increased starch content.” Baroja-Fernandez, Edurne , Muñoz, Francisco Jose , Moran-Zorzano, Maria Teresa, Allocati, Juan Pablo, Etxeberria, Ed , Alonso-Casajus, Nora, Pozueta-Romero, Javier . Botany and Plant Biology 2007. July 7-11, 2007 * Hilton Chicago * Chicago, Illinois.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal
Bibliografía