Patología del ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial: El Complejo III como centro del sistema

Zaragoza, 8 de noviembre de 2010

Erika Fernández-Vizarra BaileyErika Fernández-Vizarra Bailey

Unidad de Investigación Traslacional I+CS. HUMS

Sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS)

457

16

411 13

1 3

2

Subunidades estructuralesSubunidades estructurales

Proteínas codificadas en el DNA nuclear para la biogénesis del sistema

OXPHOS

Factores de replicación del mtDNAFactores de transcripción del mtDNAFactores de traducción mitocondrial + proteínas del ribosoma mtProteínas necesarias para el importeFactores de ensamblaje

Koopman et al. (2010) Antioxid Redox Signal 12, 1431-1470

Factores de ensamblaje asociados con enfermedad mitocondrial

CIA30/NDUFAF1B17.2L/NDUFAF2C3ORF60/NDUFAF3C60ORF66/NDUFAF4C8ORF38C20ORF7ACAD9

SDHAF1

BCS1L

SURF1COX10COX15SCO1SCO2LRPPRCTACO1

ATP12TMEM70

Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos

Lo que sabemos es fundamentalmente gracias al estudio de:� Los procesos en la levadura Saccharomyces

cerevisiae� Los casos patológicos

Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos

Se conoce con bastante detalle el proceso y los factores implicados en el ensamblaje del Complejo IVSe está estudiando activamente el ensamblaje del Complejo I

No se conoce demasiado del ensamblaje de los Complejos II, III y V en mamíferos

Ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa (Complejo III)

BCS1L

MT-CYB

UQCRB UQCRQ

Estudio del ensamblaje del CIII

1. Determinar la incorporación de las subunidades estructurales

1. Subunidad codificada en el mtDNA (Cytb)2. Subunidades codificadas en el nDNA

2. Determinar los factores necesarios para el ensamblaje y su papel en el proceso

Subunidad codificada en el mtDNA

Traducción in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas en presencia de [35S]-L-Met and [35S]-L-Cys / electroforesis nativa

[35S]-L-Met

[35S]-L-Cys[35S]-L-Met

[35S]-L-Cys

[35S]-L-Cys

[35S]-L-Cys

[35S]-L-Met

CI

CV

CIII2

CIV

Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

1ª dimensión nativa

CI

CV

CIII2

CIV

2ª dimensión: desnaturalizante

Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

CI

CV

CIII2

CIV

1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante

Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

CI

CV

CIII2

CIV

Separación de las subunidades individuales

1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante

Síntesis de proteína in organello.Experimentos de “pulso-caza”

La única subunidad del CIII codificada en el mtDNA

� Mt-Cyb se sintetiza en las mitocondriasaisladas de hígado de ratón y se incorporarápidamente al CIII dimérico (CIII2) maduro

1D native (DDM)

Pulse (45’ label)

2Dde

natu

ring

Chase 45’ Chase 90’

Chase 180’ Chase 270’ Chase 360’

CIII2CV CIV

ND5COICytb

COII/COIII

ND2ND1

ND3ATP6

ATP8

ND5COI

CytbCOII/COIII

ND2ND1

ND3ATP6

ATP8

CIII2CV CIV

Zara et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta

1793, 89-96

Bcs1pCbp3pCbp4p

??

Ensamblaje del CIII en S. cerevisiae

Proteínas codificadas en el DNA nuclear

Importe in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas con los péptidos sintetizados in vitro / Electroforesis nativa

**

*

*

**

CI

CV

CIII2

CIV

Primera dimensión nativa

•Gradiente del gel: 5%→20% Uqcrc1

Cyc1

Uqcrfs1

Uqcrb

Uqcr11

Uqcrh

Uqcrq

Uqcrc2

CICV

CIII2

Uqcrc1

Primeradimensión nativa

/ Segundadimensión

desnaturalizante1D

2D

1D

2D

1D

2D

1D

2D

Uqcrc2

Uqcrfs1 Uqcrb

Cyc1 Uqcr11

SC CIII2SC CIII2

SC CIII2

SC CIII2

1D

2D

1D

2D

Resumen

Subunidades codificadas en el nDNA:� Todas las subunidades se han sintetizado

“in vitro” excepto Uqcr10 (Qcr9p en S.cerevisiae)

� Todas se importan “in vitro” excepto Uqcrh(Qcr6p en S. cerevisiae)

� Una vez importadas, algunas se incorporanal CIII2 en estas condiciones:

• Uqcrc2 (algo)• Uqcrfs1• Uqcrb• Uqcr11

Próximos pasos

Importe in vivo de las subunidades que no se han podido importar in vitro� Estudiar factores necesarios para su

importe/ensamblaje que no están en las mitocondrias aisladas

Determinar composición del complejo(s) en los que se encuentra BCS1L Estudiar la incorporación de las subunidades en casos patológicos� Células de ratón con Cytb mutado� Células humanas con mutaciones en BCS1L

• Si pudiera conseguir células de pacientes con mutaciones en MT-CYB y UQCRB y UQCRQ...

Agradecimientos

Unidad de Investigación Traslacional. I+CS. Hospital Universitario Miguel Servet.UATI Proteómica. I+CS.Universidad de Zaragoza y CNIC (Madrid): Grupo GENOXPHOS.Istituto Neurologico “C. Besta”. Milán (Italia): Dr. Massimo Zeviani.