AgrocienciaColegio de PostgraduadosInstitución de Enseñanza e Investigación en Ciencias Agrícolasagrocien@colpos.colpos.mxISSN: 1405-3195 MÉXICO

2004 Rafael Pérez-Pacheco / Cesáreo Rodríguez-Hernández / Joel Lara-Reyna / Roberto Montes-Belmont /

Gustavo Ramírez-Valverde / Laura Martínez-Martínez PARASITISMO DE ROMANOMERMIS IYENGARI EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS EN LABORATORIO

Y DE ANOPHELES PSEUDOPUNCTIPENNIS EN CAMPO Agrociencia, julio-agosto, año/vol. 38, número 004

Colegio de Postgraduados Texcoco, México

pp. 413-421

413

RESUMEN

Se evaluó en laboratorio el parasitismo del nematodo

Romanomermis iyengari en larvas de mosquitos de tercero y cuar-

to ínstares de Aedes aegypti, Anopheles pseudopunctipennis y

Culex quinquefasciatus, aplicando una dosis de 10 nematodos lar-

va−−−−−1. La efectividad de R. iyengari en larvas de An.

pseudopunctipennis en campo se determinó en criaderos naturales

en Pochutla, en el Estado de Oaxaca, México. R. iyengari parasitó

eficientemente larvas de los ínstares tercero y cuarto de las tres

especies de mosquitos. Las larvas del tercer ínstar de las tres espe-

cies son más susceptibles al parasitismo que las del cuarto. Las

larvas de An. pseudopunctipennis fueron más susceptibles de ser

parasitadas por R. iyengari (85.8-96.7%) en comparación con las

de Ae. aegypti (80-88.3%) y Cx. quinquefasciatus (80.8-91.7%).

Los adultos de larvas parasitadas en los ínstares tercero y cuarto

murieron 3-6 d después de emerger. El desarrollo de la fase pará-

sita del nematodo transcurrió normalmente a través de la pupa y

el adulto del mosquito. La aplicación de R. iyengari a una densi-

dad de 3000 nematodos m−−−−−2 en diez criaderos naturales de An.

pseudopunctipennis produjo 90 a 100% de parasitismo, infesta-

ción de 1.8 a 3.1 nematodos larva−−−−−1 y reducción poblacional de

larvas de 82.2 a 99.0%.

Palabras clave: Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, control bio-

lógico, nematodo.

INTRODUCCIÓN

En México los mosquitos de los géneros Anophelesy Aedes son vectores de patógenos causantes depaludismo y dengue. En el distrito de Pochutla,

en la costa del Estado de Oaxaca, México, se registranlos índices más altos de paludismo del país (Secretaría deSalud, 1996).

El combate a mosquitos vectores de enfermedadesse ha hecho tradicionalmente con insecticidas

Recibido Septiembre, 2003. Aprobado: Julio, 2004.Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 38: 413-421. 2004.

PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIESDE MOSQUITOS EN LABORATORIO Y DE Anopheles pseudopunctipennis EN CAMPO

PARASITISM OF Romanomermis iyengari IN LARVAE OF THREE SPECIES OFMOSQUITO IN LABORATORY, AND OF Anopheles pseudopunctipennis IN THE FIELD

Rafael Pérez-Pacheco1, Cesáreo Rodríguez-Hernández2, Joel Lara-Reyna2, Roberto Montes-Belmont3,

Gustavo Ramírez-Valverde2 y Laura Martínez-Martínez1

1CIIDIR-Oaxaca, Instituto Politécnico Nacional-COFAA. Hornos 1003, Santa Cruz Xoxocotlán,71230. Oaxaca, México. (rperez88@prodigy.net.mx). 2Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco, Km 36.5, 56230. Montecillo, Estado de México. 3CEPROBI, Instituto Politécnico Nacio-nal-COFAA. Carretera Yautepec-Jojutla Km 8.5, 62730. Yautepec, Morelos.

ABSTRACT

A laboratory evaluation was carried out to determine the

parasitic capacity of the nematode Romanomermis iyengari on

III and 1V instar larvae of the mosquitoes Aedes aegypti,

Anopheles pseudopuntipennis, and Culex quinquefasciatus,

applying a dose of 10 nematodes larva−−−−−1. The effectiveness of R.

iyengari in larvae of An. pseudopunctipennis in the field was

evaluated in Pochutla, State of Oaxaca, México. R. iyengari

efficiently parasitize III and IV instar larvae of the three

mosquito species. The III instar larvae of the three species of

mosquitoes were more susceptible to parasitism than the IV

instar larvae. The larvae of An. pseudopunctipennis were the most

susceptible to infestation by R. iyengari (85.8-96.7%) in

comparison with Ae. aegypti (80.0-88.3%) and Cx.

quinquefasciatus (80.8-91.7%). The adults from larvae

parasitized during III and IV died 3-6 d after emergence. The

development of the parasitic phase of the nematode normally

took place during the pupal and adult stages of the mosquito.

Field applications of R. iyengari were made at a density of 3000

nematodes m−−−−−2 to ten natural larval rearing sites of An.

pseudopunctipennis causing 90% to 100% parasitism, infestations

ranging from 1.8 to 3.1 nematodes per larvae, and with larval

population reductions of 82.2 to 99.0%.

Key words: Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, biological control,

nematode.

INTRODUCTION

In México, mosquitoes of the genera Anopheles andAedes are vectors of pathogens causing malaria anddengue. In the district of Pochutla, on the coast of the

State of Oaxaca, México, the highest indices of malariain the country were registered (Secretaría de Salud, 1996).

The fight against disease vector mosquitoes hastraditionally been carried out with organo-syntheticinsecticides which have caused pollution to theatmosphere, intoxication to humans and resistance inmosquitoes. One alternative is the use of the nematode

AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004414

organosintéticos que han ocasionado contaminación alambiente, intoxicaciones a personas y resistencia de losmosquitos. Una alternativa es la utilización delnematodo Romanomermis iyengari, especie nativa de laIndia y empleada por primera vez en México en el Esta-do de Oaxaca (Pérez et al., 1996). R. iyengari se ha eva-luado en laboratorio y campo en diferentes especies deAedes, Anopheles y Culex en Cuba (Santamarina et al.,1992, 1996; Santamarina, 1994), India (Gajanana et al.,1978; Chandrahas y Rajagopalan, 1979) y Rusia(Pridantseva et al., 1990; Vladimirova et al., 1990), dondeha evidenciado su efectividad. En México se han realizadoestudios de diagnóstico (Pérez et al., 1996; Santamarina etal., 1996) para conocer la capacidad parasítica de losnematodos R. iyengari y R. culicivorax sobre larvas demosquitos. Sin embargo, para obtener una caracterizacióncompleta del potencial de estos nematodos, específica-mente de R. iyengari, es necesario evaluar su capacidadpara controlar poblaciones en criaderos naturales de larvasde mosquitos.

En estudios realizados en Cuba, India, México y Rusia(Gajanana et al., 1978; Chandrahas y Rajagopalan, 1979;Vladimirova et al., 1990; Santamarina et al., 1992, 1993,1996; Santamarina, 1994; Pérez et al., 1998), se ha plan-teado que las larvas de los ínstares tres y cuatro son menossusceptibles al parasitismo de los nematodos, en compara-ción con los dos primeros. Pero aún no se ha estudiadoespecíficamente el potencial parasítico de R. iyengarisobre larvas de los ínstares III y IV, ni la continuidad desu biología en larvas, pupas y adultos parasitados. Eneste estudio se realizaron experimentos de laboratoriocon el objetivo de determinar la capacidad parasítica deR. iyengari sobre larvas de Ae. aegypti, An.pseudopunctipennis y Cx. quinquefasciatus de III y IVínstares, así como el desarrollo del nematodo en las fasesde pupa y adulto. Así mismo, se evaluó el control de estenematodo sobre poblaciones naturales de larvas de An.pseudopunctipennis, en 10 criaderos naturales enPochutla, Estado de Oaxaca, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Se obtuvieron larvas de los ínstares tercero y cuarto del mosquito

Cx. quinquefasciatus y los nematodos preparasíticos de R. iyengari de

la planta de producción masiva de nematodos ubicada en las instalacio-

nes del CIIDIR-IPN Oaxaca. Las larvas de Ae. aegypti y de An.

pseudopunctipennis se recolectaron en criaderos naturales localizados

en los alrededores de las instalaciones del CIIDIR-IPN Oaxaca y en

comunidades de la región de la costa del Estado de Oaxaca, México.

Las larvas se capturaron con una red de 10 cm de diámetro por 20 cm de

profundidad de tela de malla de nylon. Se transportaron en agua del

criadero al laboratorio donde fueron seleccionadas para los bioensayos.

Romanomermis iyengari, a species native to India andused for the first time in México in the State of Oaxaca(Pérez et al., 1996). R. iyengari has been evaluated in thelaboratory and in the field in different species of Aedes,Anopheles and Culex in Cuba (Santamarina et al., 1992,1996; Santamarina, 1994), India (Gajanana et al., 1978;Chandrahas and Rajagopalan, 1979) and Russia(Pridantseva et al., 1990; Vladimirova et al., 1990), whereits effectiveness has been demonstrated. In México,diagnostic studies have been made (Pérez et al., 1996;Santamarina et al., 1996) to find out the parasitic capacityof the nematodes R. iyengari and R. culicivorax onmosquito larvae. However, in order to obtain a completecharacterization of the potential of these nematodes,specifically of R. iyengari, it is necessary to evaluate itscapacity for controlling populations in natural rearing sitesof mosquito larvae.

In studies carried out in Cuba, India, México andRussia (Gajanana et al., 1978; Chandrahas andRajagopalan, 1979; Vladimirova et al., 1990;Santamarina et al., 1992, 1993, 1996; Santamarina,1994; Pérez et al., 1998), it has been suggested that thelarvae of instars III and IV are less susceptible to theparasitism of the nematodes, in comparison with thefirst two. However, no specific studies have been madeof the parasitic potential of R. iyengari on larvae ofinstars III and IV, nor of the continuity of its biology inparasitized larvae, pupae and adults. In this study,laboratory experiments were performed with theobjective of determining the parasitic capacity of R.iyengari in larvae of Ae. aegypti, An.pseudopunctipennis and Cx. quinquefasciatus of instarsIII and IV, as well as the development of the nematodein the phases of pupa and adult. Furthermore, anevaluation was made of the control of this nematodeover natural larvae populations of An.pseudopunctipennis, in 10 natural rearing sites inPochutla, State of Oaxaca, México.

MATERIALS AND METHODS

Biological material

Larvae were obtained of the third and fourth instars of the

mosquito Cx. quinquefasciatus and the preparasitic nematodes of

R. iyengari from the mass production plant of nematodes located

in the installations of CIIDIR-IPN Oaxaca. The larvae of Ae. aegypti

and An. pseudopunctipennis were collected in natural breeding sites

located in the vicinity of the CIIDIR-IPN Oaxaca installations and

in communities of the coastal region of the state of Oaxaca, México.

The larvae were captured with a net 10 cm in diameter by 20 cm in

depth, of nylon mesh cloth. They were transported in water from

the rearing site to the laboratory, where they were selected for the

biotests.

PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 415

Cría del mosquito Cx. quinquefasciatus

Para iniciar la cría de Cx. quinquefasciatus se recolectaron

huevecillos, larvas y pupas en agua sucia de estanques y de floreros de

panteones de la Ciudad de Oaxaca, México. Para su desarrollo este

material biológico se colocó en bandejas de plástico de 47×35×12 cm

con agua. Las pupas se recolectaron diariamente y se depositaron en

un recipiente de plástico (24×19×9) cm con agua y se colocó en una

jaula entomológica (60×60×60 cm). Los adultos se alimentaron con

azúcar y agua azucarada; a las hembras se les proporcionó alimento

de sangre de pollo. Los huevecillos depositados por las hembras en la

superficie del agua se recolectaron diariamente, colocándolos en ban-

dejas de plástico (47×35×12 cm) con agua, para su eclosión. En estas

bandejas se desarrollaron las larvas, las cuales recibieron alimento

para peces tilapia (Apitilapia® nivel 1) previamente molido, cada 2 d.

Las pupas se trasladaron a jaulas de emergencia para adultos y el ciclo

se repitió para disponer continuamente de material biológico para los

bioensayos y cría del nematodo.

Cría del nematodo R. iyengari

Se depositaron cinco grupos de aproximadamente 200

huevecillos de mosquito Cx. quinquefasciatus en bandejas de plástico

(47×35×12 cm) con 4 L de agua. Cuando las larvas alcanzaron el se-

gundo ínstar (4 a 5 d) se infestaron con nematodos preparasíticos (ju-

venil 2) de R. iyengari, aplicando una dosis de cinco nematodos por

larva de mosquito. Los nematodos procedían de cultivos con seis se-

manas de almacenamiento. Estos cultivos se inundaron con agua des-

tilada para inducir la eclosión de los huevecillos y la emergencia de

preparasíticos infectivos del sustrato. Cuatro horas después de inun-

dados los cultivos, el agua se decantó y se calculó la concentración de

nematodos en la solución mediante el método de dilución volumétrica

(Petersen y Willis, 1972), para determinar el volumen necesario a

aplicar en las infestaciones.

Después de 8 d, las larvas del mosquito murieron y flotaron en la

superficie indicando el término de la fase parasítica del nematodo (ju-

venil 3). Las larvas muertas de mosquito se pasaron a un tamiz sumer-

gido parcialmente en una bandeja con agua limpia, de tal manera que

al retirar el tamiz se permitió la separación de las larvas muertas del

mosquito y de los nematodos emergidos (juvenil 4), que se fueron al

fondo de la bandeja. Estos nematodos se depositaron en recipientes de

plástico (21×14×6 cm) con arena (previamente esterilizada) inundada

con agua destilada. Dos horas después se eliminó el agua y se taparon

los recipientes para almacenarse durante seis semanas, con el propósi-

to de que los nematodos alcanzaran su madurez sexual, copularan y

ovipositaran.

Experimentos en laboratorio

Se establecieron tres experimentos, uno para cada especie de

mosquito, en el laboratorio, en las instalaciones del Centro

Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regio-

nal (CIIDIR) unidad Oaxaca, del Instituto Politécnico Nacional

(IPN), ubicado en Oaxaca, México.

Rearing of the mosquito Cx. quinquefasciatus

To initiate the rearing of Cx. quinquefasciatus, eggs, larvae and

pupae were collected from dirty water from ponds and flower pots of

cemeteries of the city of Oaxaca, México. This biological material

was placed to be developed in 47×35×12 cm plastic containers with

water. The pupae were collected daily and deposited in a 24×19×9 cm

plastic recipient with water and placed in an entomological cage (60×

60×60 cm). The adults were fed with sugar and sugared water; the

females were provided with chicken blood feed. The eggs deposited

by the females on the surface of the water were collected daily, and

placed in plastic recipients (47×35×12 cm) with water for their eclosion.

The larvae developed in these recipients, receiving tilapia feed fish

(Apitilapia® level 1) which had been previously ground, every 2 d.

The pupae were transferred to emergence cages for adults, and the

cycle was repeated, in order to have a continuous supply of biological

material for the biotests and rearing of the nematode.

Rearing of the nematode R. iyengari

Five groups of approximately 200 Cx. quinquefasciatus mosquito

eggs were deposited in plastic containers (47×35×12 cm) with 4 L of

water. When the larvae reached the second instar (4 to 5 d), they were

infested with preparasitic nematodes (juvenile 2) of R. iyengari,

applying a dose of five nematodes per mosquito larva. The nematodes

were taken from cultures which had been stored for six weeks. These

cultures were flooded with distilled water to induce the eclosion of the

eggs and the emergence of infective preparasites from the substrate.

Four hours after flooding the cultures, the water was decanted, and the

concentration of nematodes in the solution was calculated by means

of the volumetric dilution method (Peterson and Willis, 1972), to

determine the necessary volume to apply in the infestations.

After 8 d, the mosquito larvae died and floated on the surface,

initiating the end of the parasitic phase of the nematode (juvenile 3).

The dead mosquito larvae were passed to a sieve which was partially

submerged in a recipient with clean water, so that when the sieve was

removed, the dead mosquito larvae were separated from the emerged

nematodes (juvenile 4), which sank to the bottom of the recipient.

These nematodes were deposited in plastic containers (21×14×6 cm)

with sand (previously sterilized) filled with distilled water. Two hours

later, the water was eliminated, and the containers were covered to be

stored for six weeks, so that the nematodes could reach their sexual

maturity, copulate and deposit eggs.

Experiments in the laboratory

Three experiments were established, one for each species of

mosquito, in the installations of the Centro Interdisciplinario de

Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), Oaxaca

unit, of the Instituto Politécnico Nacional (IPN), located in Oaxaca,

México.

The biotests were carried out in plastic containers (21×13.5×5.5

cm) with 500 mL of distilled water and 100 mosquito larvae, to which

1000 R. irengari preparasitic nematodes were added by means of a

AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004416

Los bioensayos se realizaron en bandejas de plástico

(21×13.5×5.5 cm) con 500 mL de agua destilada y 100 larvas de mos-

quitos, a las que se adicionaron con pipeta 1000 nematodos

preparasíticos R. iyengari. Como testigo se utilizó un grupo de 100

larvas de tercer ínstar, sin aplicación de nematodos, para determinar el

tiempo de supervivencia de los adultos desde la emergencia hasta su

muerte, en comparación con adultos provenientes de larvas expuestas

al tratamiento con nematodos.

Tres días después de las aplicaciones se recolectaron 20 larvas o

pupas y se depositaron individualmente en frascos de plástico con 30

mL de agua destilada. Los frascos se taparon con una cinta plástica

(parafilm) con perforaciones, para que no escaparan los adultos. Con un

microscopio estereoscópico en cada frasco se cuantificó el número de

mosquitos con y sin nematodos, para calcular el porcentaje de parasitis-

mo (PP). También se cuantificó el número de nematodos emergidos de

los mosquitos parasitados para calcular las medias de infestación (MI).

Las larvas restantes se conservaron en bandejas dentro de jaulas

de madera forradas con tela mosquitera, para cuantificar el tiempo de

emergencia de adultos y registrar su tiempo de vida, con o sin la apli-

cación de nematodos. Los adultos emergidos en las jaulas se alimen-

taron con azúcar y agua azucarada para dar seguimiento al ciclo de

vida del mosquito.

Para observar el desarrollo parasítico del nematodo se disectaron

cinco ejemplares de larvas, pupas y adultos parasitados de cada espe-

cie de mosquito.

Experimentos en campo

El estudio de campo se realizó en las comunidades El Zapote y

San Bernardino, Tonameca, en Pochutla, Oaxaca, México, ubicadas en

altitudes de 100 a 150 m. Se seleccionaron 10 criaderos naturales de

larvas de An. pseudopunctipennis; el tamaño de los cuerpos de agua

para los tratamientos varió de 11 a 114 m2 y el testigo fue de 8 m2.

Antes de las aplicaciones de nematodos en los criaderos se determinó

la densidad larval pretratamiento (DLpre) utilizando un colector cóni-

co (20 cm diámetro y 20 cm profundidad) con un mango (1 m longi-

tud), realizando 10 caladas por criadero (Dubitsky, 1978). Se aplicaron

nematodos a una densidad de 3000 por m2 con mochilas aspersoras de

espalda marca Swiss Mex-82 (Jas cañera, 15 L), adaptando un aguilón

de 1.5 m de longitud para lograr mayor cobertura de la aplicación. En

el criadero testigo no se aplicaron nematodos. Tres días después de las

aplicaciones de nematodos se recolectaron 20 larvas o pupas de An.

pseudopunctipennis por criadero y se disectaron bajo un microscopio

estereoscópico para registrar los PP y las MI. Cinco días después de las

aplicaciones de nematodos se determinó la densidad larval

postratamiento (DLpos) para determinar la efectividad de las aplica-

ciones. Se calculó el porcentaje de reducción (PR) de la población

larval de mosquitos en cada criadero, de acuerdo con la ecuación de

Lawrence y Mulla (1979):

PR= 100 − [(C1/T1 × T2/C2) × 100]

donde C1= DLpre en el testigo; C2= DLpos en el testigo; T1= DLpre

en el tratamiento; T2= DLpos en el tratamiento.

pipette. As a control, a group of third instar larvae were used, without

the nematode application, to determine the time of survival of the adults

from emergence until death, compared to adults from larvae which

had been exposed to the nematode treatment.

Three days after the applications, 20 larvae or pupae were collected

and individually deposited in plastic jars with 30 mL of distilled water.

The jars were covered with plastic tape which had been perforated, so

that the adults could not escape. With a stereoscopic microscope, the

mosquitoes were quantified in each jar with and without nematodes, in

order to calculate the percentage of parasitism (PP). In addition, a

quantification was made of the nematodes which had emerged from the

parasitized mosquitoes, to thus calculate the means of infestation (MI).

The remaining larvae were kept in containers within wooden cages

covered with mosquito netting, in order to quantify the time of

emergence of adults and to register their life span, with or without the

application of nematodes. The adults which had emerged in the cages

were fed with sugar and sugared water to permit the continuity of the

life cycle of the mosquito.

In order to observe the parasitic development of the nematode,

five examples of larvae, pupae and parasitized adults of each mosquito

species were dissected.

Experiments in the field

The field study was carried out in the communities of El Zapote

and San Bernadino, Tonameca, in Pochutla, Oaxaca, México, located

at altitudes from 100 to 150 m. Ten natural breeding sites of An.

pseudopunctipennis larvae were selected; the size of the bodies of water

for the treatments varied from 11 to 114 m2, and the control was 8 m2.

Before the nematodes were applied in the breeding sites, the pre-

treatment larval density (DLpre) was determined using a conical

collector (20 cm in diameter and 20 cm in depth) with a handle (1 m in

length), with 10 samplings per site (Dubitsky, 1978). Nematodes were

applied at a density of 3000 per m2 with a Swiss Mex-82 (Jas cañera,

15 L) back pack sprayer, adapting a 1.5 m long nozzle in order to achieve

greater coverage of the application. Nematodes were not applied in the

control breeding site. Three days after the nematode applications, 20

larvae or pupae of An. pseudopunctipennis were collected per breeding

site, and were dissected under a stereoscopic microscope to register the

PP and the MI. Five days after the nematode application, the post-

treatment larval density (DLpos) was determined to calculate the

effectiveness of the applications. The percentage of reduction (PR) was

calculated for the larval mosquito population in each breeding site,

according to the equation of Lawrence and Mulla (1979):

PR= 100 − [(C1/T1 × T2/C2) × 100]

where C1= DLpre in the control; C2= DLpos in the control; T1= DLpre

in the treatment; T2= DLpos in the treatment.

Statistical analysis

The laboratory experiments were established with a completely

random experimental design with six repetitions per treatment (larvae

PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 417

Análisis estadístico

Los experimentos en laboratorio se establecieron con un diseño

experimental completamente al azar con seis repeticiones de dos tra-

tamientos (larvas de tercer y cuarto ínstares de cada especie). Se hizo

un análisis de varianza (SAS, 2000) y una comparación de medias

mediante la prueba de (Tukey, p≤0.05) para los datos de PP y MI.

Para determinar la efectividad de las aplicaciones de nematodos

en la reducción poblacional de larvas de mosquito en campo, se com-

pararon los datos de DLpre con los de DLpos mediante la prueba de

rangos con signo de Wilcoxon (p≤0.05), (SAS, 2000). Los datos de

PP y MI no se analizaron estadísticamente por carecer de información

para comparar los criaderos.

RESULTADOS

Experimentos en laboratorio

Los PP y las MI causados por R. iyengari en larvasde tercer y cuarto ínstares de Ae. aegypti, An.pseudopunctipennis y Cx. quinquefasciatus fueron ma-yores en larvas del tercer ínstar en las tres especies(Cuadro 1). Hubo diferencia significativa (p≤0.0001)en los resultados de larvas de tercer y cuarto ínstares yse comprobó que los PP y las MI fueron estadística-mente diferentes (Tukey, p≤0.05). Las larvas de An.pseudopunctipennis fueron más susceptibles al parasi-tismo.

En las fases de larva, pupa y adulto de las tres espe-cies hubo desarrollo de la fase parasítica del nematodo,la cual no es afectada por la metamorfosis del mosquito,debido a que su desarrollo biológico fue normal hasta laemergencia del nematodo, provocando la muerte delmosquito adulto.

La fase parasítica del nematodo se localizó en la re-gión del tórax y abdomen de los mosquitos adultos, ocu-rriendo la emergencia de los postparásitos del nematodopor la parte posterior del abdomen. La vida de los adul-tos en la población tratada fue de 3 a 6 d (cuando elnematodo terminó su fase parasítica), en tanto que en eltestigo fue de 40 d. La mayoría de los mosquitosparasitados murieron en la superficie del agua de la ban-deja, lo que permitió observar en el fondo los nematodospostparásitos emergidos.

Experimentos en campo

Los resultados de parasitismo, infestación y reducciónpoblacional ocasionados por el nematodo R. iyengari enlarvas de An. psudopunctipennis en criaderos naturales semuestran en el Cuadro 2. Los PP variaron de 90 a 100%( x = 93%) y las MI de 1.8 a 3.1 nematodos larva−1 ( x =2.3%). Los porcentajes de reducción poblacional variaronde 82.2 a 99.0% ( x = 92.8%) en los 10 criaderos.

of the third and fourth instar of each species). A variance analysis was

made (SAS, 2000), as well as a means comparison with the Tukey test

(p≤0.05) for the data of PP and MI.

To determine the effectiveness of the nematode applications on

the populational reduction of the mosquito larvae in the field, the data

of DLpre was compared with that of DLpos by means of the rank test

with Wilcoxon sign (p≤0.05), (SAS, 2000). The data of PP and MI

was not statistically analyzed, as there was not enough information to

compare the breeding sites.

RESULTS

Laboratory experiments

The PP and MI caused by R. iyengari in third andfourth instar larvae of Ae. aegypti, An. pseudopunctipennisand Cx. quinquefasciatus were greater in third instar larvaein the three species (Table 1). There was a significantdifference (p≤0.0001) in the results of the third and fourthinstar larvae, and it was demonstrated that the PP and theMI were statistically different (Tukey, p≤0.05). The larvaeof An. pseudopunctipennis were more susceptible to theparasitism.

In the phases of larva, pupa and adult of the threespecies, there was development in the parasitic phase ofthe nematode, which is not affected by the metamorphosisof the mosquito, because their biological developmentwas normal until the emergence of the nematode, causingthe death of the adult mosquito.

The parasitic phase of the nematode was located inthe region of the thorax and abdomen of the adultmosquitoes, and the emergence of the nematode post-parasites occurred through the posterior part of theabdomen. The life of the adults in the treated populationwas from 3 to 6 d (when the nematode finished itsparasitic phase), whereas in the control, it was 40 d.Most of the parasitized mosquitoes died on the surface

Cuadro 1. Parasitismo e infestación de R. iyengari en larvas de IIIy IV ínstares de tres especies de mosquitos.

Table 1. Parasitism and infestation of R. iyengari in III and IVinstar larvae of three species of mosquitoes.

Especie Ínstar Parasitismo Media de(%) infestación

Ae. aegypti III 88.3 a 2.4 aIV 80.0 b 1.5 b

An. pseudopunctipennis III 96.7 a 4.1 aIV 85.8 b 2.5 b

Cx. quinquefasciatus III 91.7 a 3.4 aIV 80.8 b 1.7 b

Medias con letras distintas en una columna son significativamente di-ferentes (p≤0.05).

AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004418

La prueba de rangos con signo de Wilcoxon detectódiferencia significativa (p≤0.001) entre las DLpre yDLpos. Además, hubo reducción poblacional por elefecto de la aplicación de nematodos.

DISCUSIÓN

En los estudios de laboratorio se encontró que R.iyengari parasita eficientemente larvas de mosquitos enlos últimos ínstares de desarrollo, con una dosis de 10nematodos larva−1. Los valores de parasitismo y de in-festación muestran que las larvas del tercer ínstar fueronmás susceptibles, en comparación con las del cuarto, loque se atribuye al menor grosor de la pared cuticular delas primeras a consecuencia de un menor depósito dequitina, que facilita la invasión de los nematodospreparasíticos (Petersen, 1975; Santamarina, 1994). Enlas larvas del cuarto ínstar se observó que influyen otrosfactores en los niveles de parasitismo, como el menortiempo de exposición del cuarto ínstar a los nematodospreparasíticos debido a la proximidad de transformacióna pupa, y los movimientos más fuertes de desplazamien-to como reacción al ataque de los nematodospreparasíticos; esto dificulta su acción cuando intentaninsertar su estilete.

La mayoría de los mosquitos parasitados murieronen la superficie del agua de la bandeja, donde se observóla emergencia de los postparásitos; esto permite sugerirque las larvas parasitadas en los ínstares tercero y cuartose desarrollan hasta adultos, y pueden ser un vehículopara la dispersión de los parásitos de forma natural encriaderos cercanos donde se apliquen nematodos.Petersen y Willis (1972) y Kurihara y Maeda (1980)mencionaron que larvas infestadas en el cuarto ínstarpermiten que los adultos diseminen R. culicivorax en

of the water in the container, which made it possible toobserve the emerged post-parasitic nematodes at thebottom.

Field experiments

The results of parasitism, infestation and populationalreduction caused by the nematode R. iyengari in An.pseudopunctipennis in natural rearing sites are shown inTable 2. The PP varied from 90 to 100% ( x = 93%), andthe MI from 1.8 to 3.1 nematodes larva−1 ( x = 2.3%).The percentages of populational reduction varied from82.2 to 99.0 % ( x = 92.8%) in the 10 breeding sites.

The Wilcoxon signed rank test detected a significantdifference (p≤0.001) between the DLpre and DLpos.Furthermore, there was a populational reduction due tothe effect of the application of nematodes.

DISCUSSION

In the laboratory studies, it was found that R.iyengari efficiently parasitizes mosquito larvae in thefinal instars of development, with a dose of 10nematodes larva−1. The values of parasitism andinfestation show that the third instar larvae were moresusceptible compared with those of the fourth, whichis attributed to the reduced thickness of the cuticularwall due to a reduction in the deposition of chitin, whichfacilitates the invasion of the preparasitic nematodes(Petersen, 1975; Santamarina, 1994). In the fourth instarlarvae, it was observed that other factors influence thelevels of parasitism, such as the shorter time of exposureof the fourth instar to the preparasitic nematodes dueto the proximity of the transformation to pupa, and tothe stronger movements of displacement as a reaction

Cuadro 2. Reducción poblacional, parasitismo e infestación de R. iyengari en larvas de An. pseudopunctipennis en Oaxaca, México.Table 2. Populational reduction, parasitism and infestation of R. iyengari in larvae of An. pseudopunctipennis in Oaxaca, México.

Criadero naturalÁrea DLpre† DLpos† Reducción Parasitismo Media de(m2) (larvas m−2) (larvas m−2) poblacional (%) (%) infestación

1 12 431.0 a 19.0 b 96.3 100 2.22 12 500.0 a 12.0 b 98.0 95 3.13 42 335.0 a 4.0 b 99.0 90 2.94 18 750.0 a 25.0 b 97.2 90 2.65 40 280.0 a 5.0 b 98.5 90 2.06 46 477.0 a 7.0 b 98.8 90 1.97 11 5.4 a 1.0 b 84.3 95 1.98 114 10.1 a 2.0 b 83.2 90 1.99 62 19.0 a 4.0 b 82.2 90 1.8

10 75 9.0 a 1.0 b 90.6 100 2.7

Testigo 8 22.0 26.0 — — —

Promedio — 281.7 8.0 92.8 93 2.3

† Medias con letras distintas son significativamente diferentes (p≤0.05).

PÉREZ-PACHECO et al.: PARASITISMO DE Romanomermis iyengari EN LARVAS DE TRES ESPECIES DE MOSQUITOS 419

criaderos naturales, facilitando el establecimiento denematodos de forma natural. Esto se ha comprobado conla distribución geográfica natural del nematodo R.culicivorax en un área restringida de Louisiana y Flori-da, EE.UU. (Savage y Petersen, 1971; Poinar, 1979). Portanto, sería adecuado agregar la presencia de un mosqui-to adulto al esquema del ciclo vital del nematodo (Figura1), debido a que se ha señalado el desarrollo de este cicloúnicamente sobre larvas.

El corto período de vida de los mosquitos adultosparasitados (3 a 6 d) evidencia que los provenientes delarvas parasitadas no serían vectores de enfermedadescomo paludismo y dengue, debido a que en este tiempo devida el patógeno causante de estas enfermedades no lograincubarse (Dirección General de Epidemiología, 1990).En comparación, los mosquitos no parasitados y alimen-tados con agua azucarada murieron hasta 40 d después.

En las larvas de An. pseudopunctipennis se presentómayor parasitismo e infestación, atribuibles a su conduc-ta típica: además de alimentarse en la superficie del agua,para respirar adoptan una posición paralela al plano su-perficial del agua, debido a que carecen de sifón respira-torio. Esta conducta las hace más vulnerables al ataquedel nematodo; por tanto, aumenta la posibilidad de con-tacto con los nematodos preparasíticos que tienen el há-bito de vivir en la superficie del agua (geotropismo nega-tivo). Ae. aegypti y Cx. quinquefasciatus respiran en lasuperficie del agua por medio de un sifón respiratorio, yadoptan una posición oblicua a la superficie del agua y sealimentan de la materia orgánica depositada en elsustrato de los criaderos, conducta que disminuye la po-sibilidad de encuentro con los nematodos preparasíticos(Ross y Smith, 1976).

Estos resultados coinciden con los de Santamarina(1994), que observó mayor parasitismo de R. iyengarisobre larvas de Anopheles albimanus, en comparación

to the attack of the preparasitic nematodes; thus it isdifficult for the nematode to insert its stylet.

Most of the parasitized mosquitoes died on the surfaceof the water in the container, where the emergence of thepost-parasites was observed. Therefore, it can besuggested that the parasitized larvae in the third and fourthinstars develop into adults, and can be a vehicle for thedispersal of the parasites in a natural form in breedingsites in the vicinity of where the nematodes are applied.Petersen and Willis (1971), and Kurihara and Maeda(1980) mentioned that the infestation of larvae in thefourth instar makes it possible for the adults to disseminateR. culicivorax in natural breeding areas, thus facilitatingthe establishment of nematodes in a natural form. Thishas been demonstrated with the natural geographicdistribution of the nematode R. culicivorax in a restrictedarea of Louisiana and Florida, U.S.A. (Savage andPetersen, 1971; Poinar, 1979). Therefore, it would beadequate to add the presence of an adult mosquito to thediagram of the life cycle of the nematode (Figure 1), dueto the fact that the development of this cycle has onlybeen shown with larvae.

The short life span of the parasitized adult mosquitoes(3 to 6 d) shows that those adults which come fromparasitized larvae would not be vectors of diseases suchas malaria and dengue, because in that period of time thepathogen which causes these diseases does not haveenough time to incubate (Dirección General deEpidemiología, 1990). On the other hand, the non-parasitized mosquitoes fed with sweetened water died upto 40 d later.

The larvae of An. pseudopunctipennis presented agreater degree of parasitism and infestation as a result ofits typical behavior; in addition to feeding on the surfaceof the water, it adopts a position parallel to the surfaceplane of the water in order to breathe, due to the fact that

Figura 1. Ciclo vital del nematodo R. iyengari, parásito de larvas de mosquitos.Figure 1. Life cycle of the nematode R. iyengari, parasite of mosquito larvae.

Emergencia del nematodoocasionando la muerte delhospedero

Mosquito adulto

Posparásitos1 semana

1 mes

OviposiciónHuevecillos

Eclosión dehuevecillos

Nematodospreparasíticos(5 d)

Etapa parásita 5-10 d

Adultos

AGROCIENCIA VOLUMEN 38, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2004420

con Cx. quinquefasciatus, Cx. nigripalpus yUranotaenia saphirina; y con los de Santamarina et al.(1996), quienes registraron mayor parasitismo de R.culicivorax en larvas de An. pseudopunctipennis en rela-ción con Cx. quinquefasciatus. Petersen (1975) determi-nó que tres especies de Anopheles fueron más suscepti-bles que especies de Aedes y Culex a la capacidad parasí-tica de R. culicivorax (antes llamado Reesimermisnielseni).

Con los resultados del experimento de campo seevidencia que R. iyengari es un agente efectivo para re-ducir poblaciones de larvas de An. pseudopunctipennisen el área de estudio. Los altos valores de PP (90 a100%), MI (1.8 a 3.1 nematodos larva−1) y reducciónpoblacional (82.2 a 99.0%) se atribuyen a la pequeñaextensión de los criaderos (11 a 114 m2) y a que el aguaestaba estancada, lo que facilitó una aplicación unifor-me de los nematodos favoreciendo su acción al tenermayor oportunidad de búsqueda de las larvas de mos-quito. Pérez et al. (1998) determinaron valores simila-res de PP (85 a 95%), MI de 5.2 nematodos larva−1, yreducción poblacional de 94 a 96%, en cinco criaderosde 15 a 25 m2 de área en An. pseudopunctipennis. Tam-bién Santamarina et al. (1992 y 1993) obtuvieron resul-tados semejantes: PP 75 a 100%, MI 1.2 a 3.0nematodos larva−1 y reducción poblacional de 80 a96%, en criaderos de 12 a 80 m2 de área en An.albimanus, Cx. quinquefasciatus y Cx. nigripalpus.

Los valores de PP, Mi y reducción poblacional pue-den presentar mayor variación en criaderos de grandesextensiones y presencia de agua corriente, debido a queno es fácil garantizar la aplicación uniforme denematodos en toda el área del criadero, por las grandesextensiones, irregularidades topográficas e hidrológicasdel área, y al arrastre del inóculo ocasionado por el aguacorriente, lo cual disminuye la densidad de nematodospor m2 y, por consiguiente, su efectividad.

CONCLUSIONES

R. iyengari (10 nematodos larva−1) parasitaeficientemente larvas de los ínstares tercero y cuarto delos mosquitos Ae. aegypti, An. pseudopunctipennis yCx. quinquefasciatus. Las larvas del tercer ínstar sonmás susceptibles. Las larvas de An. pseudopunctipennisson más susceptibles que las de Ae. aegypti y Cx.quinquefasciatus. El nematodo reduce drásticamentelas poblaciones de larvas de An. pseudopunctipennis encondiciones naturales. El desarrollo de la fase parásitadel nematodo transcurre normalmente a través de lasfases pupal y adulta del mosquito, sin interrumpir suproceso biológico, pero los mosquitos adultos queemergen de larvas parasitadas mueren de tres a seis díasdespués de emerger.

it lacks a respiratory siphon. This behavior makes it morevulnerable to the attack of the nematode; therefore,increases the possibility of contact with the preparasiticnematodes, which have the habit of living on the surfaceof the water (negative geotropism). Ae. aegypti and Cx.quinquefasciatus breathe on the surface of the waterthrough a respiratory siphon, and adopt a position obliqueto the surface of the water, feeding on the organic materialdeposited in the substrate of the rearing sites, thus reducingthe possibility of encountering the preparasitic nematodes(Ross and Smith, 1976).

The results coincide with those of Santamarina (1994),who observed a greater parasitism of R. iyengari in larvaeof Anopheles albimanus, with respect to Cx.quinquefasciatus, Cx. nigripalpus and Uranotaeniasaphirina; as well as with those of Santamarina et al. (1996),who registered a greater parasitism of R. culicivorax inlarvae of An. pseudopunctipennis with respect to Cx.quinquefasciatus. Petersen (1975) determined that threespecies of Anopheles were more susceptible than speciesof Aedes and Culex to the parasitic capacity of R. culicivorax(previously named Reesimermis nielseni).

With the results of the field experiment, it is shownthat R. iyengari is an effective agent in the reduction ofpopulations of An. pseudopunctipennis larvae in the areaof study. The high values of PP (90 to 100%), MI (1.8 to3.1 nematodes larva−1) and populational reduction (82.2to 99.0%) are attributed to the limited extension of thebreeding areas (11 to 114 m2), and to the fact that thewater was stagnant, which facilitated a uniform applicationof the nematodes, favoring their action by providing agreater opportunity to find mosquito larvae. Pérez et al.(1998) determined similar values of PP (85 to 95%), MIof 5.2 nematodes larva−1, and populational reduction of94 to 96%, in five breeding sites between 15 and 25 m2 inarea in An. pseudopunctipennis. Santamarina et al. (1992and 1993) also obtained similar results: PP 75 to 100%,MI 1.2 to 3.0 nematodes larva−1 and populational reductionof 80 to 96%, in breeding sites 12 to 80 m2 in area in An.albimanus, Cx. quinquefasciatus and Cx. nigripalpus.

The values of PP, MI and populational reduction maypresent a greater variation in large scale breeding sitesand in the presence of running water, due to the fact thatit is not easy to guarantee the uniform application ofnematodes in the entire breeding area, because of its largedimensions, topographical and hydrological irregularitiesof the area, and the dragging of the inocula caused by theflowing water, which reduces the density of nematodesper m2, and consequently, their effectiveness.

CONCLUSIONS

R. iyengari (10 nematodes larva−1) efficientlyparasitize larvae of the third and fourth instars of the

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—End of the English version—

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