INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE MISANTLA

TECNICA DE CULTIVOS VEGETALES

Ing. Irma Castillo Carmona

Tipos de crecimiento in vitroCrecimiento Organizado y Desorganizado

Tipos de propagación in vitro

Alexander López Cardeña

Ing. Bioquímica

12/06/13

CULTIVO IN VITRO DE VEGETALES

Cultivo de tejidosPresupone el cultivo de plantas o partes de

plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado

El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados.

La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar

Esta técnica es importante en la propagación de especies de interés agroforestal y agrícola: micropropagación

Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos o pigmentos.

Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de producción.

Cultivo in vitro

Plasticidad

TotipotencialidadEs la capacidad de una célula vegetal de

dar lugar al desarrollo de una planta completa. Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

Cultivo de células vegetalesDefinición

Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.

Tipos de cultivos:

cultivo de células cultivo de tejidos cultivos de órganos

Puede definirse como el conjunto detécnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos,Tejidos, células y protoplastos.

Puede definirse como el conjunto detécnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos,Tejidos, células y protoplastos.

CULTIVO DE TEJIDOSCULTIVO DE TEJIDOS

es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología

Está técnica se basa en la "totipotencialidad celular"; capacidad de una célula vegetal de formar una planta completa bajo ciertas condiciones químicas y físicas, dadas en el cultivo in vitro

se obtiene la propagación rápida y masiva de plantas idénticas a la original a partir de cualquier parte aislada de la planta, sean estos trozos de tejidos, ápices meristemáticos o incluso células aisladas.

Inicialmente se usó esta técnica para la multiplicación masiva de plantas élites o micro propagación y también en la obtención de clones libres de virus.

CARACTERISTICAS

El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

  El cultivo in vitro consiste en

tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.

Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles Multiplicación o reproducción de frutal

in vitro

Tipos de CrecimientoOrganizado:Se refiere al tipo de cultivo que se inicia con una parte organizada de la planta (ápices, hojas, brotes, semillas, etc.) y esa parte u órgano sigue creciendo in vitro manteniendo sus características estructurales. Se aplica también cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido desorganizado.

Desorganizado:Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de tejidos u órganos se produce un tejido sin estructura especifica que contiene un numero limitado de algunos tipos de células especializadas encontradas en una planta intacta. Un tejido desorganizado puede crecer con subcultivos y puede ser mantenido en medio solido o liquido durante varios meses o años. Puede ser usado para iniciar suspensión de células y protoplastos.

Cultivos vegetales Cultivos agronómicos

Cultivos in vitro

1. Cultivos diferenciados ( raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados)

2. Cultivos indiferenciados ( callos, suspensiones)

Cultivos indiferenciadosCallos : en medio

sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular,

Cultivos en suspensión: derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo.

Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)

CallosTejidos no diferenciados ( a veces

diferenciados), en división activa.Frecuentemente se desarrollan a partir de

heridas.

Medio de cultivoMezcla de sustancias en los que las

células, tejidos y órganos pueden dividirse y crecer.

Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na

Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, ISuplementos orgánicos complejos: leche

de coco, extracto de levadura.Reguladores de crecimiento : hormonas.Fuente de carbono: sacarosaCon o sin agar: medio semi -sólido o

líquido.

Reguladores de crecimientoHormonas/ Fitohormonas: Auxinas: grupo de hormonas vegetales

(naturales o sintéticas) que inducen la elongación, o en algunos casos la división celular. Frecuentemente inducen

raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios.

Cytokininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen división celular y frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias.

Reglas generales para la acción hormonal: • Auxina : Cytokinina = ~1 Callo • Auxina : Cytokinina < 1 Tallo • Auxina : Cytokinina > 1 Raíces Son producidos por microorganismos

Terminología y técnicas1. Explanto: porción de tejido u órgano que

se separa de la planta para iniciar el cultivo.

2. Esterilización: procedimiento para la eliminación de microorganismos. Autoclave: aparato en el que el medio, material d

vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121oC, 15 psi, 10-20 min.).

Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.

Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril.

Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco.

Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas.

Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones.

Adventicios: desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.

Organogénesis (formación de órganos)

Formación de tallos, raíces, flores, etc.

¡¡Regeneración de una planta completa!!

Explanto

Organogénesis

Formación de tallos Formación de raíces

Enraizamiento Tallos

Planta completa

Embriogénesis (formación de embriones) Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática).

Embriogénesis Somática

Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática

1. Iniciación: callos embriogénicos2. Proliferación: callos embriogénicos, masas

proembriogénicas (PEM)3. Desarrollo y maduración de embriones :

embriones4. Germinación de embriones (Regeneración)Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:

Masas proembriogénicas Estadío globular Torpedo Embrión somático

Semillas artificiales

Semillas sintéticas (artificiales)1. Producción en masa de semillas genéticamente

mejoradas.2. Procedimientos:Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una

cubierta adecuada, almacenar3. Encapsulación de embriones somáticos:

protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable.

Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.

Variación Somaclonal

Variación fenotípica, genética o epigenética en su origen.

Permite describir la variabilidad genética observada en tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro

Es común cuando se regeneran plantas a partir de callos, o cuando los cultivos se establecen a partir de explantos que no contienen un meristema pre-organizado.

En muchos casos, el grado de variación es proporcional a la duración del cultivo in vitro.

Se aplica para mejora de cultivos

Aislamiento de protoplastosProtoplasto: célula vegetal sin pared

celularProcedimiento:(1). Digestión de la pared celular: celulasa,

hemicelulasa, pectinasa. Son producidos por microorganismos.

(2). Regeneración de la pared celular: usualmente dentro de las 24 hrs.

(3). División celular: la primera división ocurre dentro de las 24-48 hrs

(4). Proliferación y diferenciación

Protoplastos

Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos

Aplicaciones:

1. Remoción de pared para captación de DNA : Microinyección y electroporación

2. estudios de síntesis de pared celular, transporte de membrana, citoesqueleto.

3. estudio de desarrollo de embriones somáticos.

4. hibridización somática (cybridización) de especies sexualmente compatibles o incompatibles, por fusión de protoplastos se obtiene un nuevo germplasma.

Aplicaciones

1. Mantenimiento del background genético deseado: micropropagación.

2. Producción en gran escala de cultivares apropiados: embriogénesis somática

3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivo continuo.

4. Eliminación de virus y otros patógenos.5. Regeneración de plantas obtenidas por

ingeniería genética.

Cultivos diferenciadosRaíces y tallos

transformados: obtenidas por transformación genética con la bacteria patógena del suelo Agrobacterium sp.

Se pueden usar para la producción de metabolitos derivados de raíces, crecimiento rápido, mayor estabilidad genética, mayor productividad.

Tecnología del ADN recombinante El uso de la biotecnología moderna implica,

inicialmente, el conocimiento y aislamiento de secuencias de ADN que corresponden a genes responsables de conferir una característica deseada (fenotipo)

El aislamiento de los genes de interés es realizado por medio de técnicas de clonado molecular

Clonado molecularInducción de la amplificación de una

secuencia de ADN en un organismo vivo.Vectores de clonado (plásmidos o virus):

vectores en los que la secuencia de ADN es introducida usando una DNA ligasa. Cuando es necesario el fragmento de ADN de interés puede ser liberado del vector por medio de enzimas de restricción.

Una vez aislados los genes de interés son incorporados al organismo blanco resultando en un organismo genéticamente modificado (OGM) y esta característica adquirida pasa a ser hereditaria

Es posible transferir genes de animales, bacterias o virus a las plantas.

Se amplían los recursos para el mejoramiento genético.

Los genes de un organismo que son insertados en otro se denominan transgenes y tienen la capacidad de conferirle a este último una determinada característica.

Organismos transgénicosSon excelentes modelos para el estudio de

procesos generales básicos como regulación de la expresión génica y la genética molecular del desarrollo y diferenciación celular

Ofrecen la posibilidad de corrección de numerosas enfermedades hereditarias: terapia génica

Organismos transgénicosPueden funcionar como bioreactores para

la producción de proteínas valiosas o con propósitos industriales

Deben ser capaces de producir la proteína de interés en niveles aceptables sin comprometer el normal funcionamiento de sus células

Deben tener la capacidad de transmitir esta característica a las siguientes generaciones

En el caso de ser un organismo multicelular deben ser capaces de producir la proteína exógena en un órgano definido

Estrategia actualAcoplar a la secuencia de ADN que

codifica para la proteína de interés secuencias de ADN que contengan señales responsables de dirigir altos niveles de producción (promotor) de la proteína deseada en un órgano específico.

Las técnicas para la inserción de ADN en células vegetales (transformación) usadas son:Infección con Agrobacterium tumefaciensElectroporación de protoplastosMétodo biolístico

AvancesLos primeros experimentos a campo con plantas transgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidos y en Francia.En 1996 y 1997 el número de países que ensayó plantas transgénicas a campo aumentó a 45 habiéndose realizado en 2 años mas de 10 mil experimentos.Los cultivos más usados fueron: maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola.Las características genéticas introducidas son tolerancia a herbicidas, resistencia a insectos, calidad de producto y resistencia a virus.

Clonado de plantasLa técnica del clonado in vitro es posible

mediante el cultivo de tejidos

Esta técnica se basa en la totipotencialidad de las células vegetales, por medio de la regeneración in vitro, vía organogénesis o embriogénesis somática

Transformación

Se producen cambios por inserción de un gen proveniente de otro organismo

La transferencia de DNA/genes de un organismo a otro se realiza sin necesidad de reproducción sexual.

La transformación exitosa depende de la incorporación estable del gen nuevo en el genoma de la planta receptora y su subsiguiente transmisión a sucesivas generaciones.

Transformación

RequerimientosMecanismo de transferencia del gen

Mecanismos de transferencia indirectaMecanismos de transferencia directa

Sistemas de regeneración

Transformación indirecta

Mediada por Agrobacterium: Agrobacterium es una bacteria patógena

del suelo para dicotiledóneas y algunas coníferas.

• Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease (tumors)

• Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease (hairy roots)

Las Monocotiledóneas presentan resistencia natural a Agrobacterium.

TransformaciónAgrobacterium tumefaciens & crown

gall diseaseCrown gall disease produce nódulos

anormales en raíces. Los árboles jóvenes no crecen, en los árboles adultos la corteza se pudre.

Esta bacteria entra al árbol a través de heridas.

TransformaciónAgrobacterium tumefaciens La enfermedad crown gall resulta

de la expresión de genes codificados por un segmento de DNA de la bacteria que se transfiere e integra en forma estable al genoma vegetal

El fragmento de DNA bacteriano contiene genes que producen hormonas cuando se expresan en las células vegetales ocasionando divisiones y crecimiento anormales (tumores).

Agrobacterium es un “ingeniero genético natural”(1983).

Es un mecanismo de transferencia entre reinos

Transformación

Transformación mediada por Agrobacterium Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A.

tumefaciens) Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots

(A. rhizogenes) T-DNA: DNA que se transfiere

1. genes para síntesis de hormonas: codifican para enzimas involucradas en la biosíntesis de auxinas y citoquinias. La expresión de estos genes en la célula vegetal causa la enfermedad de agalla de corona o la formación de hairy roots

2. Secuencias en los bordes: 25 bp direct repeats, borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB),a ambos lados del T-DNA. Son los elementos necesarios (en la región del T-DNA ) para dirigir la transferencia del T-DNA.

Transformación mediada por Agrobacterium

PlásmidoTi o plásmido Ri: Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas. Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos

vegetales infectados que son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno.

Clasificación de los plásmidos Ti y Ri:Plásmidos Ti: plásmidos Nopalina

• Octopine plasmid• Agropine plasmid• Succimanopine plasmid

Plásmidos Ri: plásmidos Manopina • Agropine plasmid• Cucumopine plasmid

Genes involucrados en la transferencia del T-DNA

Localizados en la región T-DNA:1.Genes de síntesis de hormonas2. Secuencias de los bordes: LB y RB

Localizados en cualquier región del plásmido Ti:3.Genes de síntesis de opinas4. Genes de virulencia

Localizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci)Síntesis de fibrillas de celulosa por Agrobacterium para cubrir la superficie de la

célua vegetal(irreversible). Clusters de Agro son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.

• chvA ychvB (linked): síntesis y excreción de 1,2-glucan• cel locus: síntesis de fibrillas de celulosa• pscA locus: afectan la síntesis de cicloglicanos y ácido succinilglicano• att locus: afecta proteínas de la superficie celularAlgunos de estos loci se encuentran conservados en otras bacterias del suelo que se

interasocian con plantas

Genes Vir y transferencia de genes T-DNA

Las células vegetales se vuelven sensibles a Agrobacterium cuando son heridas.

El proceso de transferencia se puede dividir en: En la bacteria: proceso de conjugación bacterianaEn la célula vegetal: las células heridas producen

compuestos fenólicos de bajo PM que actúan como inductores específicos de los genes de expresión vir.

Acetosyringona (AS), hirdroxi-acetosyringona (OH-AS)Estos compuestos fenólicos actúan a través de dos sistemas

para Regular la expresión de los genes vir

Transformación mediada por Agrobacterium Uso del plásmido Ti de Agrobacterium

como vector de transformación Se remueven los genes para hormonas

(desarmado) Para la transformación de introducen

genes en el plásmido Ti Clonado de DNA Genes marcadores para selección:

de resistencia a antibióticos Cassetes: Promotor + gen + terminador

Transformación mediada por AgrobacteriumVentajas:Transformación estable

Desventajas:No para monocotiledóneas

Aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro

APLICACIONES

APLICACIONES

Sus aplicaciones van desde estudios teóricos sobre fisiología y bioquímica vegetal, hasta la obtención de plantas libres de patógenos, conservación de germoplasma, producción de metabolitos secundarios, pro--pagación masiva de plantas,mejoramiento genético,inducción de mutaciones,selección in vitro y desarrollo de protocolos de regene--ración de plantas para su utilización en inge-niería genética .

Sus aplicaciones van desde estudios teóricos sobre fisiología y bioquímica vegetal, hasta la obtención de plantas libres de patógenos, conservación de germoplasma, producción de metabolitos secundarios, pro--pagación masiva de plantas,mejoramiento genético,inducción de mutaciones,selección in vitro y desarrollo de protocolos de regene--ración de plantas para su utilización en inge-niería genética .

ACTIVIDADES (APLICACIONES)

I Producción de materiales libre de virus:

Producción de material libre de virus endémicos de Ajo y Papa para luego llevar la semilla libre de virus por el programa de Hortalizas.

Producción de plantas madres de frutales de hoja caduca para vivero.

Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para la introducción y cultivo in vitro de especies de interés hortícola, frutícola, forestales y nativas.

II. Conservación de germoplasma:

Conservación en frío a mediano plazo de más de 500 materiales de interés en diversas áreas de producción.

III. Aplicaciones al mejoramiento genético:      Cultivo de anteras en arroz y rescate de embriones en

trigo para lograr un avance generacional mediante la producción de doble haploides para los programas de mejoramiento.

Inducción de variación somaclonal en durazno para la

mejor tolerancia a bacteriosis

MicropropagaciónMantiene la identidad genética del material

propagado sin introducir ninguna variabilidad genética

Propagación clonal rápida (floricultura, fruticultura, plantas medicinales, silvicultura)

Eliminación de virus (cultivo de meristemas) hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos)

Bancos de germplasmaSemillas sintéticas (embriones somáticos

recubiertos de gel de alginato que también encapsula nutrientes para el desarrollo del embrión)

Resistencia a insectosPuede ser obtenida mediante la utilización de inhibidores de proteasas vegetales o a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gen Bt

Como ejemplos de plantas resistentes a insectos están el maíz, batata y soja transgénicos

Tolerancia a herbicidasEsta modalidad engloba a la mayor parte de las plantas transgénicas actuales

Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña de azúcar

Un ejemplo cotidiano es la Soja Roundup Ready

Resistencia a virusLas perspectivas son cada vez mayores a

medida que aumentan los conocimientos acerca de fitovirus

Silenciamiento génico o protección mediada por ARN

Por medio de la tecnología del Agrobacterium tumefaciens o de la biolística y el cultivo de tejidos, es posible introducir en la planta genes de la cápside viral posibilitándose así la adquisición de resistencia por parte de la planta.

Alteración del color floralDentro del mercado de la floricultura se abren nuevas perspectivas con el clonado de genes asociados con la coloración de las flores.

También se abre la posibilidad de modificar la arquitectura de la planta y de las flores, las fragancias y la mayor durabilidad de las flores.

Obtención de nuevos productos y alteración de la calidad nutricionalLa empresa Calgene produjo aceites ricos en

ácido esteárico.Se alteró la composición en hidratos de

carbono con vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento del contenido de almidón y reducción de amilosa

En el año 2000 se informó la obtención de arroz genéticamente modificado que produce beta- carotenos, precursor de la vitamina A

Ingeniería metabólicaEs posible alterar rutas metabólicas para

permitir que las plantas, o sus células, funcionen como bioreactores (reactores biológicos).

Es posible, de esta manera, la producción de sustancias de valor farmacológico, como por ejemplo, vacunas y biofármacos.

La manipulación del metabolismo secundario de vegetales, por medio de la transformación genética, promete ser una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética aplicada a la industria.

La sobre expresión constitutiva de genes involucrados en la ruta biosintética de metabolitos secundarios podrá aumentar significativamente la cantidad de compuestos útiles producidos en plantas.

Los avances en esta área permitirán aumentar las productividad de metabolitos secundarios obtenidos en cultivos in vitro con la consiguiente reducción de costos de producción o logrando la producción de nuevos compuestos.

Ejemplos de metabolitos secundarios producidos por cultivos in vitro de células vegetalesMetabolito secundario Cultivo productor

Acido rosmarínico Anchusa officinalis

Ajmalicina Catharanthus roseus

Berberina Coptis japonica

Digoxina Digitlis lanata

Ginsenósidos Panax ginseng

Hiosciamina Hyoscyamus niger

Nicotina Nicotiana tabacum

Piretroides Pyrethrum cinerea

Shikonina Lithospermum erytrorhizon

Taxol Taxus cuspidata

Vinblastina Catharanthus roseus

BiotransformaciónSe usan para realizar reacciones bioquímicas sencillas en las que no se necesita diferenciación ni crecimiento celular

Hidroxilación estereoespecífica en posición 12- de la - metil digoxina, glicósido cardiotónico, por células de Digitalis lanata.

Diferencias más importantes en el cultivo de células microbianas, animales y

vegetales

Característica Células microbianas

Células animales

Células vegetales

Tamaño 1-5 μm3 105-106 μm3 105-106 μm3

Forma de crecimiento

Células individuales

Individuales o adheridas a superficies

En grupos

Tiempo de generación

1 hora 20horas >24 horas

Sensibilidad al esfuerzo cortante

baja alta Alta

Requerimiento de oxígeno

Hasta 180 mmol l-

1h-1

0.7-1.0 mmol l-1 h-1

0.5-1.8 mmol l-

1h-1

Requerimientos nutritivos

simples complejos Simples

Población celular alcanzada en cultivo líquido

1010 células ml-1 106 células .ml-1 106 células .ml-1

CONCLUSIÓN

El cultivo de tejidos es base importante para la biotecnología ya que al cultivar por ejemplo tejidos , órganos, células in vitro y con las características que se requieran se pueden obtener diferentes productos de valor para el hombre como los alimentos.

Bibliografía http://books.google.com.mx/books?

id=T9QOAQAAIAAJ&pg=PA1&lpg=PA1&dq=terminos+para+identificar+los+principales+tipos+de+propagacion+in+vitro&source=bl&ots=p36OKbGhei&sig=e_R7U1ZsoyFLf2m-nzKLpZmd7O8&hl=es-419&sa=X&ei=pGkkUbaTH8KO2AWh6IFA&ved=0CDkQ6AEwAA

http://html.rincondelvago.com/cultivo-in-vitro.html

http://www.uam.es/docencia/LAvanFis/CI/CharlaCultinvitro0607.pdf

http://www.slideshare.net/pancharas59/generalidades-de-cultivos-in-vitro

http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales

UNIDAD II

“TECNICAS DE CULTIVO”

MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACION

DOCENTE:ING IRMA CASTILLO CARMONA.

ELABORO :ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA

ING. BIOQUIMICA

MISANTLA VER, A 27 DE MAYO DEL 2013

INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE MISANTLA

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos.

GENERALIDADES

*Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.

*Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.

La composición mineral se define en forma precisa en cada uno de los medios y está dada tanto por los macronutrientes(N, P, K, S, Mg y Ca) como por los micronutrientes (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I y Fe). Estos nutrientes deben estar en una concentración tal que permita el adecuado crecimiento celular.

COMPOSICIÓN

Los requerimientos de nitrógeno son generalmente provistos por una mezcla de nitrato y amonio en concentraciones variables entre 3 y 50 mM. Cuando estas fuentes son suplementadas en forma individual se afectan, generalmente en forma negativa, tanto el crecimiento del cultivo como la producción de metabolitos .Pero, dado que el uso de nitrato exige una mayor demanda energética para la asimilación del nitrógeno si se compara con el amonio, algunos explantos crecen mejor si se les suministra nitrógeno reducido (Krikorian, 1991), recomendándose en este caso la adición de un ácido orgánico como el succinato como agente bufferante.

Muchas células vegetales son sensibles a los niveles de fosfatos en el medio.

Precisamente, el mantenimiento de los niveles de fosfato por debajo del óptimo para el crecimiento estimula entre 3 y 4 veces la acumulación de cinamoil-putrescina en cultivos de suspensiones de Nicotiana tabacum e incrementa la síntesis de alcaloides en Catharanthus roseus (Misawa, 1985). Habitualmente, los fosfatos son almacenados en la vacuola y adquiridos desde allí para el crecimiento.

Generalmente se agrega calcio en mayores concentraciones que en los medios microbianos, variando entre 1 y 3 mM.

El hierro es esencial para el crecimiento celular y se agrega al medio de cultivo en una concentración de 0,01 a 0,15 mM. Se aconseja la utilización del quelato Fe-EDTA que aumenta la solubilidad del hierro.

La naturaleza y concentración de los micronutrientes empleados en los medios de cultivo surgen principalmente de resultados empíricos al evaluar la capacidad de cada elemento de afectar el crecimiento

Puede ser necesario añadir al medio de cultivo algunas vitaminas hasta que los cultivos prosperen. Las vitaminas favorecedoras del desarrollo de cultivos in vitro y que se añaden rutinariamente en la mayoría de los medios de cultivo son: tiamina (B1), piridoxina (B6) y ácido nicotínico (Otras vitaminas que suelen ser útiles son ácido pantoténico, biotina, riboflavina (B2), colina, cianocobalamina (B12) y ácido fólico. El ácido ascórbico (vitamina C) se considera benéfico en algunos casos, pero probablemente debido más a su capacidad reductora que a su papel como vitamina.

El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) se realiza con las siguientes sustancias:

PREPARACIÓN

*Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua del volumen final deseado, y sobre ella se van añadiendo uno por uno todos los componentes hasta su completa disolución. Posteriormente se ajusta el volumen final con agua y se almacenan.

*Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

ELABORACIÓN DE SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG

Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Usar 10 ml de la solución stock de micronutrientes para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Usar 10 ml de la solución stock de hierro quelado para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

Usar 10 ml de la solución stock de vitaminas para preparar 1 L de medio de cultivo MS.

En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en un adecuado estado de nutrición y libre de enfermedades y plagas. Si en el material presentase algún problema habría que descartarlo o realizar los tratamientos adecuados.

MATERIAL VEGETAL

*El cultivo del meristemo apical de un tallo se emplea para la obtención de plantas libres de virus ya que estos patógenos tienen dificultades para alcanzar esta zona cuando la planta está creciendo activamente

CULTIVO DE MERISTEMOS

El microinjerto es una variante del cultivo de meristemos que consiste en colocar el ápice caulinar sobre una microplanta in vitro. El meristemo sería el injerto y la microplanta el patrón.

MICROINJERTO

El callo es una masa de células indiferenciadas, coherente y amorfa que se multiplica de una manera desorganizada. Se puede inducir in vitro mediante la transferencia de órganos vegetales establecidos in vitro a medios de cultivo adecuados, que frecuentemente posen la auxina 2,4 D.

CULTIVO DE CALLO

Se pueden considerar dos situaciones dependiendo que el explanto que se va a emplear esté protegido en el interior de un órgano, como el embrión, o esté en contacto con el exterior, como brotes y yemas.

Para los explantos en el interior de órganos hay que realizar los siguientes pasos:

Lavar el explanto con agua y jabón Lavar por 30min con cloro 10ml a 100mil de agua Realizar una asepsia superficial del órgano con

etanol al 70 %. Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el

explanto. Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O.

*Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento activo y de un tamaño ligeramente superior al deseado. Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en un recipiente con agua destilada.

*Lavar los explantos con abundante agua estéril y depositarlos sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua.

Con un material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo:

*Cortar una pequeña porción del extremo del explanto (por donde se cortó inicialmente) y clavar verticalmente la parte basal (inferior) en el medio de cultivo.

*Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en oscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.

*Vasos de cristal para el cultivo esterilizados con el medio

CRISTALERÍA

Agua esterilizada

Cultivo in vitro de plantas

*BISTURI

LOS INSTRUMENTOS DE TRABAJO

*MECHERO

*AUTOCLAVE

*PINZAS

El paso previo a la instalación in vitro de un material vegetal es la asepsia superficial. El protocolo de este proceso dependerá de las características del tejido empleado. Para trabajar en condiciones asépticas, es recomendable realizar este proceso en una cámara de flujo laminar y emplear material estéril. El ambiente debe mantenerse limpio con la superficie de trabajo desinfectada con etanol al 70% antes y después de usarla. Se debe usar bata de laboratorio y lavarse bien las manos.

CÁMARA Y EL CUARTO DE TRANSFERENCIA

Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar o campana de flujo laminar es un recinto que emplea un ventilador para forzar el paso de aire a través de un filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1 micras. Este tipo de equipos se fabrican en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo, que normalmente permanece limpia y estéril

CAMARA DE FLUJO LAMINAR

*Dentro de estas cabinas o campanas se trabaja con obleas de semiconductor, cultivos celulares o cualquier otro sistema que deba mantenerse limpio y deba evitarse la contaminación con partículas minúsculas. Estas cabinas están diseñadas para proporcionar un aire limpio y constante a una velocidad de paso de aire de 0.30 a 0.50 metros por segundo para así barrer la superficie de la zona de trabajo y evitar la suspensión de partículas así como una posible contaminación de las muestras.

*El aire es inyectado a la zona de trabajo a través de un filtro HEPA o ULPA e insuflado en forma de un flujo laminar o flujo unidireccional, muy suave, hacia el usuario. La superficie de trabajo de la cabina se construye generalmente de acero inoxidable grado 304 o superior para facilitar su limpieza y aumentar su durabilidad por el uso, con acabados sanitarios, sin espacios o juntas donde las esporas pueden llegar a acumularse.

Características y uso

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_Cultivo_in_vitro.pdf?sequence=6.

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%204%20%20Medios%20de%20cultivo.pdf

BIBLIOGRAFÍA

INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE MISANTLA

TÉCNICAS DE CULTIVO GENERAL

UNIDAD III

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

DOCENTE: IRMA CASTILLO CARMONA

ELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA

MISANTLA VER, A 29DE MAYO DEL 2013

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES*La ciencia del cultivo de tejidos

vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación.

MICROPROPAGACIÓN

TÉCNICAS USADAS EN LA MICROPROPAGACIÓN

La estimulación de las yemas axilares o adventicias es el proceso más común que se conoce para la micro propagación de las plantas. Aquí, las citocininas causan una generación continua de estas yemas en la base del cultivo que prolifera. Cada yema desarrolla en un tallo enanizado el cual a su vez puede producir más yemas en su base. Esta proliferación de tallos y yemas continuará siempre que sea mantenido un suministro adecuando de citocinina junto con nutrientes y espacio físico por subdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos a medio fresco cuando sea necesario.

*Técnica de propagación vegetativa de plantas en condiciones in vitro.

*Producción masiva a precios competitivos.

*Cultivo aséptico de un explanto en un medio de cultivo artificial y en condiciones ambientales controladas.

Tipos de técnicas de micropropagación

Por brotación de yemas axilares.

Por brotación de yemas adventicias:

•directa•indirecta

Etapas de la micropropagaciónPor brotación de yemas axilares.*Elección y preparación de la planta madre (etapa 0).

*Establecimiento del cultivo y elección del medio de cultivo (etapa 1).

*Multiplicación (etapa 2).

*Elongación y enraizamiento(etapa 3).

*Aclimatación (etapa 4).

Etapa 0: Elección y preparación de la planta madre.

Crecimiento en condiciones de sanidad controlada.

Tratamientos de rejuvenecimiento.

Pre tratamientos con reguladores de crecimiento.

EMBRIOGÉNESIS SOMATICA

*Este método, teóricamente, es el más eficiente para la producción masiva de plantas in vitro debido a la naturaleza bipolar del embrión, la posibilidad de ser automatizado todo el proceso productivo, los altos coeficientes de multiplicación en cortos períodos de tiempo, al poder aplicarse los principios de la cinética microbiana y la posibilidad de encapsular estas estructuras y obtener semillas artificiales

La embriogénesis somática es la formación de un embrión a partir de una célula, sin la necesidad de la fusión de gametos .Esto no es un fenómeno artificial y es conocido en la naturaleza como una forma de apomixis llamada embrionía adventicia, descrita por primera vez por Strasburges en1878 aunque fueron Reinert (1958) y Steward et al. (1958)quienes dieron crédito por primera vez a la descripción de la embriogénesis somática en el año 1958.

ORGANOGÉNESIS

ORGANOGÉNESIS

Evento morfogenético que se caracteriza por su desarrollo unipolar

ORGANOGÉNESIS DIRECTA

Formación de órganos directamente sobre la superficie de explantos cultivados intactos. El proceso no implica la formación de callo.

*ESPECIE: Allium cepa L., cebolla*VÍA DE REGENERACIÓN: Organogénesis

directa

SUSPENSIÓN CELULAR

SUSPENSIÓN CELULAREn las últimas décadas se han desarrollado diferentes

sistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener y propagar células vegetales.

Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrimentos. Medios de cultivo Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo de tejidos de tabaco, como también el medio B-5 de Gamborg et al. (1968).

Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubación de trozos de callos friables en medios líquidos que, están en movimiento continuo. Comúnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el medio líquido con los trozos de callo dispersos en el, hasta llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de tos frascos; estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 °C de temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan establecidas después de varios días. Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilución baja (por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de suspensión celular. Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más alta, según el objetivo para el cual se haya establecido la suspensión.

PROTÓPLASTOS

PROTÓPLASTOS

MICROPROPAGACIÓN CLONAL

MICROPROPAGACIÓN CLONALLa propagación clonal o vegetativa de plantas es una producción a

partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidos vegetales que conserven la potencialidad de multiplicación y diferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces a partir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos. Este tipo de propagación tiene esencialmente tres variantes, que son: 1) la micropropagación a partir de tejidos vegetales en cultivo in vitro; 2) la propagación a partir de bulbos, rizomas, estolones, tubérculos o segmentos (esquejes) de las plantas que conserven la potencialidad de enraizar, y 3) la propagación por injertos de segmentos de la planta sobre tallos de plantas receptivas más resistentes.

La propagación clonal o vegetativa de plantas es una producción a partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidos vegetales que conserven la potencialidad de multiplicación y diferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces a partir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos. Este tipo de propagación tiene esencialmente tres variantes, que son:

1) La micro-propagación a partir de tejidos vegetales en cultivo in vitro;

2) La propagación a partir de bulbos, rizomas, estolones, tubérculos o segmentos (esquejes) de las plantas que conserven la potencialidad de enraizar, y

3) La propagación por injertos de segmentos de la planta sobre tallos de plantas receptivas más resistentes.

BIBLIOGRAFIAhttp://agronomia.criba.edu.ar/carreras/ia/arc

hivos/Materias/563/Apuntes/CultivoTejidosMorgan.pdf

*Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales

*Obtención de plantas libres de virus

*Mejoramiento genético

*Conservación del germoplasma

*Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales en el país

ELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA

INGENIERIA BIOQUIMICA

Principios activos de los vegetalesunidad IV

APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias).

Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones, algunas de ellas se ilustran en la

Figura 1:

Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones,

Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.

Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año

Obtención de plantas libres de virus

Producción de semillas sintéticas

Aplicaciones del cultivo de tejidos

Obtención de metabolitos secundarios

Producción de nuevos híbridos

Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)

Germinación de semillas.

Producción de haploides.

Estudios fisiológicos diversos.

Obtención de plantas libres de virus

Producción de material libre de virus endémicos de Ajo y Papa para luego llevar la semilla libre de virus por el programa de Hortalizas.

Producción de plantas madres de frutales de hoja caduca para vivero.

Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para la introducción y cultivo in vitro de especies de interés hortícola, frutícola, forestales y nativas.

Mejoramiento genético

Otros ejemplos de mejoramiento genético

Cultivo de anteras en arroz y rescate de embriones en trigo para lograr un avance generacional mediante la producción de doble haploides para los programas de mejoramiento.

Inducción de variación somaclonal en durazno para la mejor tolerancia a bacteriosis.

Conservación del germoplasma

Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales en el país

Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas

Eliminación de virus y propagación de clones de yuca

Cultivos de tejidos de camote Micropropagación de plátanos y

bananas Cultivos de tejidos de caña de azúcar Cultivos de anteras en el arroz Cultivos de tejidos en la caña de azúcar Propagación in vitro de café

BIBLIOGRAFÍA

http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de_tejidos.htm

http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de_tejidos.htm