p capitulo 15 vinc segunda edicion

5/13/2018 P CAPITULO 15 Vinc Segunda Edicion - slidepdf.com

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Héctor Rocha L. Principios de Medicina Molecular

796




797

GENES 1

1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA CELULAR 800

a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS 802

b) AMPLIFICACIÓN POR CLONACIÓN 803

c) BIBLIOTECAS DE GENES 806

d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS 806

e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 808

f) SECUENCIACIÓN DEL DNA 813

2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES 814

a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o Polimorfismo en el Largo

del Fragmento de Restricción 815

b) VNTR (Variable Number Tandem Repeats) o Reticiones en Tandem (una tras otra)de Número Variable 816

c) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) o DNA Polimórfico Amplificado alAzar 818

d) AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) Polimorfismo en el Largo delFragmento Amplificado 818

e) STS (Sequence Tagged Site) o Sitio Marcado por la Secuencia 819

f) EST por Expresed Sequence Tag o Expresión de la secuencia marcadora 819

g) MARCADORES MICROSATÉLITES 821




798

GENES 2

3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR 823

a) MUTACIONES 825

b) CARIOTIPO 828

c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO 829

d) MAPEO DE LOS GENES 829

e) MAPEO LIGADO A MARCADORES 830

f) EMPLEO DE RFLP POR RESTRICTION FRAGMENT POLYMORPHISM

O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS 831

g) MAPEO DE UN GEN 833

h) EMPLEO DE VNTRS POR VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS OREPETICIONES EN TANDEM DE NUMERO VARIABLE 834

i) MAPAS FISICOS O MAPAS DE ADN 837

j) MAPA CITOGENETICO 837

k) LA HIBRIDACIÓN IN SITU 838

l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION 839

m) MAPEO TOP-DOWN 840

n) MAPEO BOTTOM-UP 841

4) GLOSARIO 844




799




800

1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

La Medicina Molecular se caracteriza por estudiar las enfermedades y su curación a nivelmolecular. Para ello emplea las herramientas de la Biología Molecular y la Bioquímicaaplicadas tanto en el estudio de las Proteínas como de los Ácidos Nucleicos.Entre estas herramientas podemos empezar por aquellas enzimas denominadasEndonucleasas de Restricción. Estas enzimas son originalmente empleadas por lasbacterias para defenderse de las infecciones causadas por Fagos, es decir las bacteriasrestringen a los Fagos.

Fig. 1 - 16. Secuencias de corte reconocidas por distintas Endonucleasasde Restricción.

Así, cuando aparecen secuencias de DNA que el fago ha introducido en la bacteria, seproduce el corte de estas mientras que las secuencias similares, propias de la bacteria se metilan para no ser reconocidas por la misma enzima.A su vez los sitios de corte, se caracterizan por estar flanqueados por secuencias cortasde simetría bicatenaria. Una vez ocurrido el corte, ambos extremos pueden formar ladosasimétricos o cohesivos. Sin embargo, otras enzimas de restricción cortan en el mismosector en ambas hebras quedando ambos lados romos.

Eco R1 5’ G A A T T C 3’3’ C T T A A G 5’

Hae III 5’ G G C C 3’3’ C C G G 5’

Hind III 5’ A A G C T T 3’3’ T T C G A A 5’

Bam H1 5’ G G A T C C 3’3’ C C T A G G 5’

: Sitios de corte




801

Fragmento cortadopor Hind III

Vectorcortado por

Hind III

Unión entre DNA delvector y fragmentoEmpleando la enzimaLigasa

CromosomaBacteriano

Molécula de DNA Recombinante

DNARecombinante

Recombinante introducidoa la bacteria

DNA del Vector

Las Endonucleasas de Restricción son más de 400 y reconocen y cortan cerca de 100sitios diferentes. Algunos de estos sitios, se encuentran frecuentemente o cada unoscuantos cientos de pares de bases, mientras que otros se hallan esporádicamente, cada

10.000 pb

Fig. 2 - 16. Concepto de DNA recombinante destinado a ser amplificado por clonación.




802

En promedio las enzimas de restricción cortan en sitios reconocidos que tienen 4, 6 y 8pares de bases (fig. 1 – 16), produciendo segmentos sucesivos de 256, 4000 y 64.000bases de largo en el genoma humano.

Las endonucleasas de restricción hicieron posible la tecnología del DNA recombinante(fig. 2 – 16), ya que con estas enzimas se pueden cortar segmentos de DNA que tengandistintos orígenes y posteriormente juntarlos y proceder a ligarlos, empleando unaenzima denominada Ligasa, que produce la unión 3´, 5´ Fosfato o en otras palabras,forma el Fosfodiester. Posteriormente, bajo las condiciones adecuadas (altaconcentración de CaCl2 , etc) las moléculas de DNA recombinante pueden entrar a lasbacterias y replicarse, autónomamente o bien pueden integrarse al cromosoma celular.

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a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS

Algunas enzimas de E.Coli se emplean para el manejo de los fragmentos de DNA con

que se trabaja en la Medicina-Molecular. Así tenemos que el DNA puede ser sometido avarios tratamientos, se puede marcar con grupos Fosfatos como P32 (así se lo ubica enuna radioautografía), se puede amplificar con los cebadores adecuados (para aumentar

Tabla 1 - 16Enzima Actividad Uso

Transcriptasa Inversa DNA polimerasa RNAdependiente de origen viral

Se emplea para convertirRNAm en su copiacomplementaria de DNAccontinuo

DNA Ligasa Une covalentemente la uniónFosfodiester 5´ Fosfato al grupo

3´ Hidroxilo

Se emplea en losprocedimientos donde se

requiere DNA recombinanteFosfatasa Alcalina Elimina fosfatos del extremo 5´

del DNASe emplea para reemplazarel fosfato 5´ por otroradiactivo

Polinucleótido kinasa Introduce el γ Fosfato de ATP enel extremo 5´ del DNA

Tac (ThermophylusAcuaticus) DNApolimerasa

DNA polimerasa termoestableque resiste los cambios detemperatura para abrir(desaparear ambas hebras) ycerrar (aparear hebrascomplementarias) el DNA

Técnica PCR (PolymeraseChain Reaction)

Amplifica ambas hebras deun segmento de DNA, apartir de unos cebadoressintéticos (de secuencia

conocida) que se apareancon su parte

complementaria. Al repetir elproceso en ciclos de frío(apareamiento) y calor

(desapareamiento) de lashebras

Endonucleasas deRestricción

Reconocen sitios de simetríabicatenaria de 4, 6 y 8 pbs cortandejando lados cohesivos y romos

DNA recombinante, mapeo,etc.




803

su número de copias), transcribir desde RNA a DNA (se emplea una TranscriptasaInversa de un retrovirus) o se puede cortar en lugares específicos (con Endonucleasasde Restricción). Algunas de estas enzimas se observan en la Tabla 1 - 16.

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b) AMPLIFICACION POR CLONACION

Uno de los vectores (fig. 3 – 16), que se emplea para introducir DNA exógeno o foráneoa la bacteria es el Plásmido, mientras que el DNA foráneo puede ser DNAc (Ver Glosarioal final), obtenido de un RNAm (por Transcriptasa Inversa) o DNA genómico (fragmentosde DNA al azar de un organismo). Es posible aquí sintetizar una segunda hebra al DNAccon una DNA pol I y luego se pueden insertar ambas hebras en un Plásmido o un vectorLambda, para ser posteriormente amplificado por clonación. La clonación se lleva a cabo

en vectores contenidos en levaduras, bacterias y partículas virales. El empleo de uno uotro dependerá del tamaño del fragmento a clonar.El Plásmido (fig. 3 –16), es normalmente conocido por ser un DNA doble hebra circularextracromosómico y autoreplicante de la bacteria, es distinto al genoma normal y no esesencial para la sobrevivencia de la célula. Son conocidos por conferir ventajas selectivasa la bacteria (resistencia a antibióticos).

Fig. 3 - 16. Características del vector pBR322

Los Plásmidos pueden ser transferidos de célula en célula y algunos de ellos se puedenintegrar al genoma de la bacteria. Una célula huésped puede tener muchas copias de unplásmido. En la actualidad existe una serie de plásmidos artificialmente construidos, quecuentan con sitios específicos para cargar DNA foráneo y se pueden seleccionar alentregar a la bacteria resistencia a algún antibiótico. Esto permite separar aquellasbacterias que han adquirido el Plásmido de las otras que no. Algunos de estos plásmidos,pueden también ser replicados en levaduras.

Otros Plásmidos constituyen lanzaderas que son capaces de replicar tanto en E. Colicomo en levaduras y son conocidos por las siglas YIP o Yeast Integrating Plasmid, YRP por Yeast Replicating Plasmid, YEP por Yeast Expression Plasmid y aún por el nombre

Resistencia a laAmpicilina

Resistencia a laTetrac iclina

Ori C

PLASMIDO

VectorpBR322




804

de YCP por Yeast Centromer Plasmid. El uso de cualquiera de ellos depende del tamañodel segmento de DNA que se quiera amplificar.

Mediante los plásmidos se puede crear una biblioteca genómica o colección noordenada de clonos formada por fragmentos superpuestos de DNA amplificado,perteneciente a un organismo cualquiera. La relación de unos con otros de losfragmentos se puede establecer posteriormente por mapeo físico, hasta poner orden enla biblioteca, es decir tener una colección de fragmentos amplificados, pero contiguos.Esto significa que donde termina la secuencia de uno empieza la del otro. Esta coleccióndebe corresponder en total, a un sector específico de un gen.Los clonos individuales (fragmentos amplificados) se colocan en placas demicrotitulación en dos dimensiones con múltiples pocillos en el plano, donde la ubicaciónde cada uno es conocida por el número de la fila y columna, fig. 35 - 16.

Otro vector a emplear, puede ser una partícula viral o un bacteriófago como el fago

Lambda que contiene 40kb de DNA doble hebra (fig. 4 – 16). A este se puede integrarDNA humano de un tamaño que bordea las 15 a 25kb. Esto se logra por acción de lamisma endonucleasa de restricción y posterior unión mediante la enzima Ligasa.Posteriormente al infectar una bacteria y entrar en la etapa lítica se generan nuevascopias del fago que se amplificará junto con el DNA humano, produciendo tantas copiascomo partículas virales existan.Otro bacteriófago, es el conocido como P1, que puede acomodar más DNA que elLambda y constituye el tipo P1- PAC por P1- Plasmid Artificial Chromosome ocromosoma artificial de plásmido.

Forma lineal Bacteriópfasgo Lambda

Secuenciade cabeza y

cola

Región b2.No esencial

parasobreviven

cia

GenesRec.

Implicados en

recombinación

Genes deRegulación

RS: Lísis del huesped

OP: Sints. DNA

RSOP

RS

OPSecuencia decabeza y cola

Región b2 noesencial para

lasobrevivencia

Genes deRegulaciónson genes

que inician yterminan el

proceso

Genes Rec.Implicados en

Recombinación

Cos: LadosCohesivos

Cos: LadosCohesivos.La hebra es

complementariaal otro extremo

Lados Cohesivos

Forma circular del Bacteriófago Lambda

Fig 4 — 16. Caracteríosticas del fago Lambda.




805

Un vector aún, de mayor capacidad que los anteriores se denomina Cósmido, y seencuentra construido artificialmente de forma quimérica o mixta con genes del plásmido,para resistencia a antibióticos y otros del Fago Lambda como transportador. Contiene el

gen cos (Cohesivo) del fago, cuya actividad promueve el empaquetamiento del DNAforáneo en la partícula viral para posteriormente infectar una bacteria tipo E. Coli, lo quepermite la replicación del DNA foráneo con fragmentos de 30 Kb a 45 Kb de largo.

Continuando con la descripción de los vectores, tenemos a los YAC, por Yeast ArtificialChromosome (fig. 5 – 16) o cromosoma artificial de levadura. Contiene todos loselementos que un DNA necesita para funcionar como cromosoma en el organismohuésped y se puede cargar con uno de los mayores fragmentos de 400 Kb a 500 Kb. Seencuentra construido con un fragmento telomérico, que entrega los extremos necesariospara la replicación, más fragmentos centroméricos y las secuencias correspondientes,que indican y promueven el sitio de origen de la replicación que es necesario en lalevadura (YCP + Telómeros). También contienen genes que se emplean en la selección

de las levaduras que sí han tomado el vector.

A fin de propagar estos vectores en E. Coli antes de cargarlos con DNA, se les haincorporado un sitio denominado Ori C o de inicio u origen de la replicación bacteriana yun gen que les entrega resistencia a la Ampicilina. Este último se emplea paraseleccionar las bacterias que han tomado el YAC.

Fig. 5 - 16. Características del YAC.

En general una vez que se tiene el DNA humano integrado, mediante el empleo de lasEndonucleasas de Restricción y Ligasas en un vector, se procede a amplificarlomediante la Clonación, proceso por el cual se producen múltiples copias exactas de unsolo gen u otro segmento del DNA para así obtener suficiente material de estudio.El resultado de esta amplificación en distintos segmentos de DNA genera una bibliotecade clonos o colección de clonos hechos de una serie de fragmentos de DNA que sesuperponen representando el genoma entero del organismo.

SECUENCIA DEREPLICACIONAUTÓNOMA

CENTROMERO

TelomerasaTelomerasa

Marcador deSelección

Sitio Ori deplasmido y gen

Amp

Bam H1 Bam H1

Eco R1




806

Otro tipo de clonación ocurre cuando se divide una célula haciendo múltiples copias de símisma y este es el caso de la conocida oveja Dolly. En este caso se recurrió a laclonación produciendo animales genéticamente idénticos a la oveja donadora de los

núcleos de células mamarias, los que fueron posteriormente implantados en oocitosfecundados.

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c) BIBLIOTECAS DE GENES.

El objetivo de la clonación, fuera de amplificar copias del DNA sirve para aislar genes,expresar genes y generar clonos que se emplean como sondas para el análisisgenómico. Por lo tanto, para reponer los clonos se debe echar mano a la biblioteca.

Durante el procedimiento de aislar genes se debe seleccionar un clono de los muchos

presentes en una biblioteca, empleando para ello una sonda formada por unpolinucleótido de DNA o bien un anticuerpo. Una vez que se ha aislado un gen se debeestudiar su expresión mediante un vector de expresión, que consiste en la acción de unpromotor específico para este gen y sus condiciones de cultivo en alguna célulahuésped.

Cuando se emplean clonos como sondas para el análisis genómico es posibledeterminar el número de copias de un gen en el genoma, sus relaciones taxonómicas yla construcción de mapas por ligación de caracteres.

Biblioteca Genómica: Se produce cuando todo el DNA genómico se digiere y losfragmentos sé clonan dentro de un vector apropiado. De esta manera es posible disponer

de muestras de todo el genoma del organismo representando a las secuencias quecodifican y no codifican.

En el caso de que se busque un gen se empleará un vector de inserción que permiteamplificar un gran segmento (YAC). En otro caso cuando se necesita una fuente desondas para mapeo por ligación se necesitaran inserciones menores en vectores(plásmidos). Idealmente una biblioteca de este tipo debe disponer de muchas copias decada gen.

Biblioteca DNAc: Esta biblioteca se genera a partir de RNAm y Transcriptasa Inversa, detal manera que solo se representarán los genes que solo se expresan y no aquellosque permanecen silenciosos o aquellos segmentos que separan los genes y constituyen

la mayor cantidad de DNA. Por lo tanto el número de genes de que se dispongadependerá del tejido que se esté considerando y el estado de desarrollo en que este seencuentre.

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d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS.

Un gen puede ser identificado mediante el empleo del DNAc (DNA complementario, sinintrones) obtenido desde su propio RNAm. De esta forma se pueden identificar lossegmentos de DNA que portan sus características e incluso a cual de todos loscromosomas corresponde. Con este fin se emplea la técnica denominada Southern




807

Blotting y Northern Blotting. La primera de ellas consiste en separar los fragmentos dedistinto tamaño producto de una digestión con Endonucleasas de Restricción en un gel deAgarosa (fig. 6 – 16). Luego se trata el gel con NaOH para denaturar el DNA (separar

ambas hebras), se neutraliza este y el DNA es transferido a un filtro de nitrocelulosa o aun papel filtro de nylon, mediante difusión capilar o bajo corriente eléctrica (fig. 7 – 16).Posteriormente, se fija el DNA al papel filtro por tratamiento con UV o “baking”. El mismopapel filtro se pone luego en contacto con la sonda radioactiva o fluorescente que alreconocer su secuencia complementaria hibridiza, identificando a la hebra que despuésde una radioautografía (si la sonda es marcada radiactivamente), mostrará las bandascorrespondientes a los segmentos del gen o exones que se encuentran presentes.En el caso del Northern blotting, se separa RNA por electroforésis (fig. 6 – 16), el queluego es transferido al papel filtro de nitrocelulosa, para ponerlo en contacto con unasonda DNAc y proceder a visualizarlo como se describió anteriormente.Existe otro desarrollo aún, de este mismo tipo y que se denomina Western blot, en elcual se separan ahora, proteínas por electroforésis con una mezcla: detergente (Sodio

Dodecil Sulfato: SDS) en un polímero de separación (Acrilamida) denominada SDS-Poliacrilamida. Las proteínas separadas por peso molecular se transfierenelectroforéticamente a papeles filtros de nitrocelulosa. Luego, se detectan mediante unareacción con anticuerpos marcados con Yodo 131 o con Fluoresceína.

Fig. 6 - 16. Serparación de ácidos nucleicos mediante electroforésis

Fig. 7 - 16. Técnica de traspaso o Southern Blotting. Los ácidos nucleicos sonarrastrados por las toallas absorbentes.

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Suministro deenergía a loselectrodos

Gel

Hendidurasdonde se ponela muestra

Buffer

Capas de adsorbentes de toallas

de papel

Hoja de NitrocelulosaGel de Agarosa

Buffer

Hojaadsorbente




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e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION).

El análisis de los genes responsables de una enfermedad puede ser llevado a cabo enmuestras extremadamente pequeñas como son los fibroblastos fetales extraídos dellíquido amniótico. De esta manera se pesquisan posibles enfermedades genéticas antesdel nacimiento, así mismo se puede detectar la identidad del DNA perteneciente acualquier tejido, pelos, piel, sangre, semen dejado en la escena de algún crimen. Estatécnica es capaz de amplificar secuencias específicas de DNA, circunscrito a tan solo undeterminado sector millones de veces, no se requiere de todo el genoma intacto. Inclusomodificaciones a la misma técnica permiten detectar mutaciones puntuales de una solabase y niveles de expresión de los genes en muestras muy pequeñas de tejidos.

Fig. 8 - 16. Amplificación por medio de cebadores

La técnica presenta un solo inconveniente comparada con la amplificación por clonación,que siempre es necesaria en los trabajos preliminares y consiste en la síntesis in vitrode un segmento de oligonucleótidos complementario al segmento de DNA aamplificar. Este segmento constituye el cebador o extremo 3´ para la enzima DNAPolimerasa, que genera las hebras complementarias (fig. 8 – 16). De esta manerasubiendo la temperatura la doble hebra se desune, separándose. A continuación al bajarla temperatura, esta vez se aparea con los cebadores o primers, dejando estos elextremo 3´ para que la DNA pol de Thermophylus Aquaticus (resistente a los cambioscíclicos de temperatura), empiece la replicación del segmento a amplificar.Posteriormente se repite el ciclo produciéndose nuevas copias cada vez que loscebadores se unen a sus respectivas secuencias complementarias. En 5 ciclos elsegmento original de DNA se puede amplificar 2, 4, 16, 256, 65536 veces.

5´

CEBADOR

CEBADOR

5´ 3´

3´

5´

3´ 5´

3´

3´

3´

5´

5´

HEBRANUEVA

HEBRANUEVA

UN SOLO

CICLO DEREPLICACIÓ

5´ 3´3´ 5´

DNA Pol + dNCT + M




809

El producto amplificado se puede analizar mediante electroforésis en Agarosa, seguidode tinción con Bromuro de Etidio, que se intercala entre las bases del DNA y lo hacevisible a la luz UV. Por otro lado, también se puede marcar el producto con nucleótidos

radioactivos en la posición γ P32 , de esta manera el P32 se incorpora en los productos yestos pueden ser visualizados por radioautografía después de separarse porelectroforésis en Agarosa..Variaciones de esta técnica se logran aplicándola al producto de la enzima TranscriptasaInversa o RT-PCR, es decir a partir del RNA total producido por una célula del tejido, laenzima Transcriptasa inversa produce DNAc, el cual es un segmento continuo de soloexones. Posteriormente al agregarse los cebadores adecuados que aparean con losextremos del DNAc, es posible amplificarlo. De esta manera se puede distinguir elproducto de tan solo un gen entre cientos de ellos que se encuentran expresados en uncierto tejido, en otras palabras se dice que se abre una ventana.

Fig. 9 - 16. Comparación entre gen normal y mutado por PCR- SSCP. La migración

anormal de una sola hebra se debe a la mutación

Otra variación de estas técnicas, donde se puede aplicar PCR, es posible cuando sereconocen mutaciones puntuales en genes ya descritos o caracterizados. Esta técnica sedenomina PCR-SSCP por PCR - Single Strand Conformation Polymorphism oReacción en cadena de la Polimerasa con Polimorfismo en la Conformación de unaSola Hebra (Fig. 9 – 16), y consiste en explotar el cambio conformacional que seproduce en una sola hebra entre el segmento del DNA que posee un gen mutadocomparado al segmento normal sin mutación. Para ello se amplifica una secuencia de

CCTGAGGAG

GGACTCCTC

CCTGAGGAG

GGACTCCTC

CCTGT GGAG

GGACACCTC

CCTGT GGAG

GGACACCTC

GEN β-GLOBINA NORMAL GEN β-GLOBINA MUTADO

MIGRACION NORMAL MIGRACIÓN ANORMAL

GEN β-GLOBINA GEN β-GLOBINAUna sola hebra Una sola hebra

Amplificación por medio decebadores

Material amplificado, muchascopias a electroforésis




810

100 a 200 pb de un gen mutado y uno normal, empleando los cebadores que circunscriben el sector de la mutación. Posteriormente sobre el producto amplificado,se lleva a cabo la separación de ambas hebras y la electroforésis en Poliacrilamida

(medio poroso de mayor resolución que la Agarosa), se discrimina aquí la forma de las

Fig. 10 - 16. Reacción en cadena de la Ligasa.

hebras observándose una diferencia en la migración de ambas, la normal y la que poseela mutación.

Otra técnica más empleada para detectar mutaciones puntuales en genes ya conocidos ysecuenciados en pacientes con alto riesgo de poseer un alelo mutante, se denominaLigase Chain Reaction (LCR) por Reacción en Cadena de la Ligasa (Fig. 10 – 16).Consiste en emplear una Ligasa termoestable que une dos Oligonucleótidosadyacentes siempre que estos hibridicen totalmente con la hebra complementaria.

Si la hebra complementaria es la original o “wild type”, la hibridación es de 100% yambos oligonuclótidos son ligados por la enzima, es decir se produce la unión 3´ OH conel 5´ Fosfato formando el Fosfodiester. Ahora, en el gen mutante si ambosoligonucleótidos aparean con el resto de su longitud, pero no en el extremo 3´ de cadaOligonucleótido donde se encuentra precisamente la mutación puntual, ya que las basesnormales del oligonucleótido no corresponden a las complementarias en el DNA de cadahebra mutada. Se produce aquí una joroba que impide a la Ligasa unir los extremos delos oligonucleótidos adyacentes. Por lo tanto, solo los correctos correspondientes al“wild type” serán amplificados y no los que no se unieron.

De esta manera examinando el número de copias de ambos genes original y mutante seconoce si el paciente lleva la enfermedad

C C T G A G G A G

G G A C T C C T C

C C T G T G G A G

G G A CA C C T C

G E N β -G L O B IN A N O R M A L G E N β - G L O B I N A M U T A D O

C C T G A G G A G

G G A C T C C T C

C C T GT G G A G

G G A CA C C T C

N O R M A L A N E M IA F A L C IF O R M E

T

A

T

A

L i g a s at e r m o e s t a b l e

O l i g o n u c l e ó t i d o sL i g a d o sU n ió n 5 , ´ 3 ´

A p a r e oc o r re c t o A p a r e o

i n c o r re c t oO l i g o n u c l e ó

t i d o s

O l i g o n u c l e ó t i d o sL i g a d o s

O l i g o n u c l e ó- tido sN o l ig a d o s

N u e v o sO l i g o n u -

c l e ó ti d o s N oL i g a d o s




811

La Transgénesis (fig. 11 – 16), es una técnica que consiste en introducir genes foráneospara su estudio en la línea germinal de algunos animales. Una de las primerasexperiencias se llevó a cabo al introducir en ratones el gen de la hormona del crecimiento,

obteniéndose individuos con doble tamaño que el normal.

Fig. 11 - 16. Transgénesis.

Para ello se emplean vectores preparados con genes que codifican factores detranscripción, que promuevan la expresión del gen necesario y se inyectan en el núcleode huevos fertilizados.

Enzima d e restricciónque corta parcialmente

Fragmentossuperpuestos

Unuión de losfragmentosusando la

enzima Ligasa

DNA vector cortada con lamisma enzima derestricción




812

Fig. 12 - 16. Separación por electroforésis de la hebra replicada en presencia de los4 dNTPs más un ddNTP

Los huevos a su vez, se trasplantan al útero de las hembras receptoras para eldesarrollo de las crías transgénicas. El DNA de las crías se emplea luego para detectar lapresencia del gen activo.

Si el transgene posee herencia Mendeliana significa que se transfiere en la líneagerminal. Esta técnica se emplea en plantas y animales de campo para introducirresistencia a enfermedades e infecciones, así como también para producir hormonas yproteínas humanas presentes en la leche animal.

Un desarrollo de esta última técnica es la Terapia Génica practicada en humanos, sinembargo, existen barreras éticas que impiden su aplicación hasta ahora. En el futuro sepretende reemplazar de esta manera genes enfermos por los correctos. Si se introducen

los genes en células somáticas y no en la línea germinal se impedirá el traspaso del genhacia los descendientes. Se ha practicado esta técnica en la médula de los huesos,fibroblastos y hepatocitos. Los vectores que se emplean en estos casos son derivados deretrovirus, que cuentan solo con las regiones promotoras transcripcionales, como LTRs(Long Terminal Repeats) para manejar la expresión del gen de interés. Se ha logradoéxito solo en células en cultivo y aún no se ha pasado totalmente a la etapa en humanos.

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dA T P dA TP dA TP dA TP

dG TP dG TP dG TP dG TP

dC TP dC TP dC TP dC TPdTTP dTTP dTTP dTTP

d d A T P d d G T P d d T T P d d C T P

Posi l los do nde se sep aran los f ragm entosrepl icados c on las mezclas de N ucleót idos q ue

se observan m ás arr iba




813

f) SECUENCIACIÓN DEL DNA

Para establecer que dos clonos específicos son adyacentes en el genoma se deben

construir bibliotecas de clonos con fragmentos que se superpongan parcialmente. Estasbibliotecas de clonos se ordenan dividiendo los incertos en pequeños fragmentos ydeterminando que clonos tienen secuencias comunes.

Uno de los métodos tradicionales que aún perdura es el de Sanger y consiste en elempleo de un dideoxinucleótido trifosfato (ddNTP) durante la replicación del DNAmediante la DNA pol I. Este nucleótido carece del grupo 3´-OH por lo que la enzima sedetiene después que lo adiciona por su lado 5´ al extremo 3´ del Deoxiribonucleótidoanterior y no puede continuar replicando en base a la hebra molde (figs. 12 y 13 – 16).De esta manera si se agrega un ddGTP junto a un dGTP se producirá una competenciaentre ellos por ocupar un lugar en la hebra naciente. Cuando la hebra madre tiene

Fig. 13 - 16. Secuencia de los fragmentos que se encuentran en cada pocillo del gel

Citosina en su secuencia, la hebra hija adicionará dGTP y una fracción adicionaráddGTP para detenerse produciendo una población de fragmentos que se detienen osiguen cada vez que en la hebra madre aparece una Citosina. Por lo tanto si contamoscon cuatro mezclas de los cuatro dNTPs, más cada uno de ellos con ddNTP distinto,tendremos una población de hebras hijas o hebras nacientes que se detendrán cada vezque aparezca la base complementaria a la que tienencomo ddNTP. Por lo tanto se dispondrá de una población de fragmentos de distintostamaños que se pueden separar por electroforésis ocupando cuatro pocillos, cada unocorrespondiente al nucleótido que se encuentra como ddNTP.

SECUENCIA DE 3́ TCGATCGATCGATCGATCGA 5́LA HEBRA MADRE:SECUENCIA DELA HEBRA HIJA: 5́ AGCTAGCTAGCTAGCTAGCT 3́

FRAGMENTOS EN CADA POSILLO

ddA AddG AGddC AGCddTAGCTddA AGCTAddG AGCTAGddC AGCTAGCddTAGCTAGCTddA AGCTAGCTAddG AGCTAGCAGddC AGCTAGCTAGCddTAGCTAGCTAGCTddA

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP




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Fig. 14 - 16. Técnica de Chromosome Walking

Otra técnica empleada para llenar huecos durante la secuenciación es la denominadaChromosome walking (fig. 14 – 16) o caminar sobre el cromosoma. Mediante esta, séhibridiza un cebador de secuencia conocida a un clono al azar de una biblioteca genéticay se sintetiza la hebra complementaria, posteriormente esta se aísla y su secuenciaterminal 3´ , se emplea como cebador para continuar replicando la hebra complementariao continuar caminando sobre el cromosoma. Sin embargo, debido a que los cebadoresdeben ser sintetizados químicamente el gran número de cebadores que se necesita para

avanzar presenta una desventaja. Volver al inicio

.2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES.

Se encuentran constituidos por distintas secuencias que no son parte de los genesy entre ellas tenemos:

a) sitios específicos de corte para las enzimas de restricción.b) secuencias repetidas en tandem de 8 a 16 pares de basesc) secuencias repetidas en tandem de 4 a 6 pares de bases

GEN SECUENCIADO

CEBADOR

CEBADOR

CEBADOR

CEBADOR

CEBADOR

5́

3́5́ 3́

Marcador que

flanquea el gen

Marcador que

flanquea el gen




815

Todas estas secuencias se heredan según la genética Mendeliana, así tenemosque mientras más relacionadas se encuentren dos personas, compartirán un

número mayor de fragmentos de igual tamaño como producto de las enzimas derestricción. Esta técnica es la más antigua y se llama RFLP por RestrictionFragment Length Polymorphism o Polimorfismo en el Largo del Fragmento deRestricción.

a) RFLP ( RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMODEL FRAGMENTO DE RESTRICCIÓN

Esta técnica se basa en los polimorfismos que existen en la secuencia de loscromosomas, es decir, el mismo cromosoma en dos personas distintas, presenta unavariación cada 200 a 500 pb en la secuencia. Esta variación crea o hace desaparecerun sitio de restricción y se alterará con ello el tamaño de los fragmentos. No

requiere de secuenciación, pero sí de una biblioteca creada a partir de fragmentos deDNA clonados en un vector. Luego se emplea una sonda basada en DNA genómico oDNAc. Se debe emplear una separación electroforética en geles de Agarosa.El DNA del organismo que interesa se digiere con endonucleasa de restricción y luego essondeado con una biblioteca de DNA clonado. Los apareamientos de la sonda con elDNA se observan por radioautografía o fluorescencia. Se puede detectar siempre elmismo sitio y sirve para mapeos. Los polimorfismos se detectan como diferencias enpesos moleculares manifestado por la migración en el gel de Agarosa de los fragmentosdel DNA del huésped.

Fig. 15-16. Los fragmentos producidos por los sitios de corte por la enzima de restricción sevisualizan mediante un Southern Blot con su respectiva sonda.

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ALELO A

ALELO B

SITIOS DE CORTEPOR LA ENZIMADE RESTRICCIÓN

ALELO A ALELO B

SONDA MARCADA*

*

*




816

b) VNTR (VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS) O REPETICIONES EN TANDEM(UNA TRAS OTRA) DE NÚMERO VARIABLE

Por otro lado, al agregar cebadores o partidores sintéticos que aparean conaquellos sectores de la hebra que flanquea a secuencias repetitivas en tandem, selogra observar que mientras más relacionadas se encuentren dos personas mayorserá el número de fragmentos amplificados coincidentes, es decir con igualnúmero de secuencias repetitivas y por consiguiente igual tamaño.

Así tenemos que esta técnica se puede aplicar a los VNTR por Variable NumberTandem Repeats o Número Variable de Secuencias Repetidas en Tandem (cabezacon cola como los carros de un tren). Estos segmentos se encuentran inter-espaciados en el genoma humano.

El número de secuencias repetitivas en un locus (lugar particular del cromosoma)varía con las personas, es decir presenta polimorfismos (pueden tener un mayor oun menor número de repeticiones). Además, en cada persona existe un alelopaterno y otro materno de distintos tamaños o número de la misma secuenciarepetitiva. Así que, mientras más emparentados se encuentren las personas lossegmentos repetitivos serán cada vez más similares. Ocurre que en mellizosidénticos, al ser su DNA cortado por la misma Endonucleasa de Restricción o en elcaso de que sus secuencias repetitivas sean amplificadas por cebadoresespecíficos ubicados en los flancos y ambos separados por Electroforésis, losfragmentos y las repeticiones deberán de ser todas iguales.

Fig. 16a - 16. Los fragmentos obtenidos por endonucleasade restricción, que corta los sitios que flanquean a las secuenciasrepetitivas, se separan por tamaño mediante Electroforesis.Finalmente se visualizan aquellos que se unena una sonda fluorescente o marcada con P32. Esta sonda esuna secuencia complementaria a la región que se repiteFig. 16b – 16. La sonda se une a los fragmentos con distinto númerode secuencias repetitivas ya que se trata de secuenciasRepetitivas de distinta naturaleza con distintos tamaños.Esta sonda es complementaria a las múltiples secuenciasrepetitivas (Sonda Multilocus)

a) RFLP expuesto a sondade VNTR (aparea con solouna secuencia repetitiva)

en seis individuosdistintos

b) VNTR disperso engenoma. Sonda VNTRmultilocus (aparea con

distintas secuenciasrepetitivas) en 5

individuos distintos




817

Algunas secuencias repetitivas se encuentran en un solo locus (lugar) específico en elgenoma humano. Las sondas construidas en base a estas secuencias, son sondas de unsolo locus (un solo tipo de secuencia repetitiva) y dejan un patrón de distribución típico

cuando se usan como sondas para hibridar Southern Blots de RFLPs, es decir a como sedenomina a los traspasos de RFLPs, fig. 16a - 16. En este caso, la visualizaciónproducida por sondas de un solo locus de la VNTR previamente cortada conendonucleasas de restricción es más fácil de interpretar, puesto que cada individuo nodebe de tener más de dos bandas claras constituidas por una región no codificante conla misma secuencia repetitiva, pero en distinto número presente en el alelo paternoy materno, que puedan coincidir o diferir entre ellas para determinar su relación oidentidad.Otras secuencias con VNTRs se encuentran en muchos loci (mezcla de fragmentos

con varios tipos de secuencias repetitivas) en el genoma humano o bien lavisualización de estos fragmentos mediante sondas VNTR de múltiples locus,producen más información puesto que se sondean de 10 a 30 loci o lugares en el

cromosoma donde se encuentran secuencias repetitivas, pero distintas. Estos locise encuentran dispersos entre los cromosomas humanos como se observa en Figura 16b

– 16, dando origen a muchas más bandas que se pueden comparar para identificara los individuos.Análisis de un solo locus por sonda VNTR o análisis por VNTR de múltiples locus sepueden usar con fines forénsicos o para determinar paternidad.

Fig. 17 - 16.Dos tipos de secuencias repetitivas visualizadas con sus respectivas sondas endistintos alelos

En la figura 17-16, se observan dos secuencias repetitivas con sus respectivos alelos junto a los sitios de corte por las Endonucleasas de Restricción. Ambas pueden seridentificadas por los fragmentos que aparecen en el Southern Blot a la derecha de lafigura 17-16. En distintas personas variará el número de repeticiones y por lo tanto la

SECUEN CIAS REPETITIVAS ENTANDEM

10 Kb

3Kb

9Kb

6Kb

10Kb

9K b

6K b

3K bAlelos derepetición larga

Alelos derepetición corta

Sitios de corte por laEndonucleasa de R estricción

ELECTROFORESIS




818

posición de las bandas, si son parientes algunas bandas tendrán igual número derepeticiones entre ellos.

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c) RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) O DNA POLIMÓRFICOAMPLIFICADO AL AZAR.

Esta técnica requiere de PCR, pero no de clonación ni de secuenciación. Puede detectarvarios loci o sitios mediante el empleo de cebadores cortos de 10pb que tienen unasecuencia al azar, es decir, se amplifican sectores del DNA también al azar y queresultan en la presencia o ausencia de polimorfismos. Los cebadores demasiado cortospueden ser afectados por las condiciones de hibridación al DNA, en este caso seemplean bajas temperaturas para hibridizar. Los resultados pueden no ser siemprereproducibles. No es apropiada para mapeos comparativos. Solo cuando un par decebadores se dispone correctamente, es decir, se encuentran bien orientados y lo

suficientemente, cercanos los segmentos amplificados pueden ser comparados entreindividuos para observar su relación.

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d) AFLP ( AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ) POLIMORFISMO ENEL LARGO DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO.

Se encuentra basada en PCR y no requiere de enzimas de restricción o amplificación porclonación. Esta vez el cebador tiene 15 pb fijos y 2pb al azar. La porción fija entregaestabilidad al cebador y la sección al azar significa que amplificará muchos loci o sitios,los que pueden llegar a 100 con un solo tipo de cebador.

Fig. 18 – 16. Los cebadores se unen a los extremos de los segmentos que se deseaamplificar. En distintos alelos los mismos cebadores amplificarán fragmentos de distinto

SECUENCIAS REPETITIVAS ENTANDEM

10 Kb

3Kb

9Kb

6Kb

10Kb

9Kb

6Kb

3Kb

Electroforésis de

FragmentosAmplificados

CEBADORES




819

largo o número de repeticiones que caracterizan a cada individuo. Mientras másemparentados, el número de repeticiones será igual

El polimorfismo se detecta como la presencia o ausencia de una bandacorrespondiente al DNA amplificado. Es útil para “fingerprinting” o tipificación desospechosos, tipificación de semillas, animales finos o de pedigrí, etc. No es útil paramapeos. Por ejemplo en dos individuos tomados al azar o heterogéneos, no relacionadosentre sí, se detectará la amplificación del mismo sitio, pero en uno de ellos el fragmentoamplificado por los mismos cebadores es más largo o más corto que en el otro (Fig.18 –16) y se notará la diferencia durante la visualización de los fragmentos después deuna electroforésis con la respectiva sonda marcada contra la secuencia o las distintassecuencias repetitivas.

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e) STS (SEQUENCE TAGGED SITE) O SITIO MARCADO POR LA SECUENCIA.

Los cebadores han sido diseñados para amplificar una región determinada que posee unpolimorfismo entre dos o más individuos. Los elementos mapeados como clonosindividuales, contigs o regiones secuenciadas en distintos laboratorios y quepertenecen a distintas personas se pueden comparar por STS. Esta técnicaconsiste en amplificar una secuencia corta reconocida de 200 a 500pb que no se repite yque sirve como secuencia marcadora de un lugar específico común a todos los genomashumanos, se le emplea como hito marcador o señal en el camino. Se puede formar elmapa sabiendo la posición de las secuencias STS en los segmentos del mismocromosoma, pero de diferentes personas en estudio.Mediante PCR se puede detectar esta secuencia única en el genoma. No se requiere declonación, pero si de información sobre la secuencia. Los cebadores son de 18 a 20 pb y

están diseñados para amplificar este fragmento conocido de secuencia corta y única(STS) por RAPD-PCR, al contar con ambos cebadores y en presencia de todas las otrassecuencias genómicas distintas, por lo tanto las STS definen una posición dentro delmapa físico o bien se pueden obtener de un clono de RFLP y generar hitos o mojonesmarcadores que mapean posiciones únicas dentro del genoma. Los polimorfismos sedetectan como diferencias de tamaño en productos amplificados.

El anterior es un buen método de mapeo y es confiable, todo depende de la selección deun buen par de cebadores. Con ellos se pretende crear un mapa de 100 kB deresolución teniendo cerca de 30.000 marcadores STS distintos. Para lograrlo se procedemediante el corte del DNA en pequeños trozos o por segmentos, los que se amplificanpor clonamiento fabricando innumerables copias, es decir, se implanta un plásmido

cargado con el segmento a amplificar y se hace que se replique en la bacteria. Una vezamplificados, los segmentos se alinean para reflejar el orden que llevan en loscromosomas al superponer las secuencias marcadoras.Las STS son útiles para localizar y orientar el mapeo junto a los datos de secuenciareportados por diferentes laboratorios y a la vez sirven de hitos para desarrollar un mapafísico del genoma humano.

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820

f) EST POR EXPRESED SEQUENCE TAG O EXPRESIÓN DE LA SECUENCIAMARCADORA.

Se emplea PCR que no requiere de clonación, pero si se requiere de información de lasecuencia. Detecta una zona específica del genoma y es bueno para el mapeo. Elpolimorfismo se detecta como diferencia de tamaño en el producto amplificado, aunquetoma tiempo crear un buen cebador representado por secuencias parciales de DNAc de18 a 20 pb, como cebadores que proveen de marca específica para un gen.

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g) MARCADORES MICROSATÉLITES.

Sirven para detectar regiones hipervariables del genoma. Los Microsatélites sedenominan por los nombres de: Simple Sequence Repeats (SSR) o Short TandemRepeats (STR).

Estas secuencias son cortas de 2 a 5 bases y se repiten múltiples veces flanqueadaspor DNA único. Se encuentran bien distribuidas dentro del genoma humano. Es posibleencontrar una STR trimérica o tetramérica por cada 20Kb.

Muchos de estos loci o sitios son altamente polimórficos, varían entre individuos ya quetienen secuencias repetidas de distinto tamaño o con distinto número derepeticiones. Es posible distinguirlas unas de otras mediante la amplificación pormedio de cebadores o partidores de la técnica de PCR (previamente diseñados),que se encuentran dirigidos a aparearse, con las regiones constantes oconservadas que las flanquean. Posterior a la amplificación se pueden visualizarestos sectores mediante una sonda complementaria a la parte repetitiva, despuésde su separación electroforética.

Este procedimiento es útil en aplicaciones forénsicas y paternidades. Existen variasventajas cuando se emplea tecnología basada en amplificación de marcadores STRcomparados a los RFLP con enzimas de restricción. La amplificación, por su parterequiere de solo un par específico de cebadores para el sitio que flanquea a lassecuencias repetitivas.

Fig. 19 -16 Los tres sistemas emplean marcadores que buscan diferencias entre individuos.

CEBADORES

RFLP

VNTR

STR

2-4 pb

16-70 pb

SITIOS DERESTRICCIÓN




821

En la figura 19-16, se observan los distintos sistemas empleados cronológicamente(RFLP, VNTR y STR) para discriminar molecularmente los individuos. El más antiguo(1980, RFLP) emplea sitios de restricción como blancos para la enzima Eco R1. Los

fragmentos obtenidos son separados por electroforésis en Agarosa y detectados porSouthern Blot empleando una sonda radioactiva. Ambos alelos eran detectables porvariaciones en su largo. Estas, eran características heredables que resultaban de lapresencia o ausencia del sitio de restricción en un locus determinado.

Luego, las VNTR empleadas desde 1985 en adelante contenían muchos alelos en cadalocus individual, que no se debían a la variabilidad del sitio de corte, sino que a lavariabilidad en el número de copias de una secuencia de consenso desde 15 a 70 basesque se encontraba repetida en tandem y a la vez era flanqueada por un par de sitios derestricción.

Posteriormente, se descubrieron repeticiones con polimorfismos en di, tri y

tetranucleótidos llamados STR. Tienen la misma estructura que las VNTR, pero lasrepeticiones de consenso en tandem son de dos a cuatro bases y son más compatiblescon la técnica de PCR, ya que se pueden emplear varios cebadores o partidores(previamente diseñados) para amplificar muchos locus repetitivos a la vez.

En la actualidad con el objeto de reconocer personas y/o tipificar exhaustivamente unDNA, sin importar que se encuentre parcialmente degradado o no, se ha recurrido alempleo de cebadores tipo Múltiplex (Fig. 20 -16). Es decir, estos cebadores tienen másde un par y se encuentran marcados con distintas moléculas fluorescentes y aparean enmúltiples regiones que flanquean zonas repetitivas iguales o distintas. Se tiene cuidadoen que el diseño de los cebadores o partidores no sea superponible y que se encuentrenespaciados. De esta manera, es posible amplificar múltiples alelos del genoma al mismo

tiempo y cada uno de ellos posee un color determinado.

La probabilidad de encontrar alelos idénticos en dos individuos disminuye con elaumento de los sitios polimórficos, haciendo el ensayo mucho más específico ydiscriminatorio.

Una vez hecha la amplificación se separa el DNA por electroforesis capilar, consistenteen un capilar relleno con formamida bajo un campo eléctrico. Después de su separaciónse procede a su lectura con un láser para reconocer los distintos colorescorrespondientes a aquellos cebadores apareados y que han amplificado múltiples locus.La lectura de las bandas es transformada en peaks de distintos colores correspondientesa la fluorescencias de las sondas que han amplificado un locus determinado

De esta manera cada persona distinta tendrá un número de peaks determinados y puedeser reconocida entre otras. Mientras mayor sea el número de locus amplificados mayorserá la certidumbre.Esta técnica se emplea para comparar sospechosos frente a la evidencia, test depaternidad, reconocimientos históricos, investigación de personas desaparecidas,identificación de victimas de desastres, identificación de soldados y de delincuentes.Empleando 13 sitios de secuencias STR multilocus, es posible encontrar una serie depeaks repetidos de 1 en 594 trillones.

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822

Fig. 20 – 16. Región multilocus amplificada por una mezcla de varios cebadores fluorescentes detres colores distintos. Si la persona es homozigoto para una región el peak es más largo y si esheterozigoto el peak es más pequeño.

3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR

Una de las metas de la Medicina Molecular es predecir las enfermedades antes de quelos signos y síntomas se manifiesten en el individuo. Por ambicioso que esto parezca, sepretende alcanzar tal capacidad en un futuro cercano, mediante diversas técnicas. Deesta manera, es imperante explorar y analizar las unidades de información que seencuentran inmersas en el material hereditario conocido como DNA y que se identifica

por el nombre de gen, junto a los factores que influyen tanto en su control como en suexpresión. Al caracterizar el tipo de anomalías que pueda afectar a los genes, se esperapoder predecir la susceptibilidad de las personas a este tipo de enfermedades y a la vezencontrar la forma de evitarlas y en el caso de que estas ocurran, cómo curarlas.

Este último desarrollo de la Medicina, comenzó con la revolución tecnológica que ocurrióalrededor de la década del 70, cuando se aplicaron nuevos diseños experimentales quemás tarde permitieron seleccionar, identificar y amplificar los genes humanos. Desdeentonces hasta el año el año 2000 se han descubierto cerca de 4000 enfermedades, cuyoorigen es atribuido al mal funcionamiento de uno o varios genes, como son por ejemplolos casos de Hipercolesterolemia familiar, Fibrosis Cística, Fenil Cetonurea y distintos tipos de Hiperamonemias junto a algunos tipos de cáncer, como son el de

Colon o el de Mamas.Es también necesario considerar que a medida que progresan las técnicas y se hacenmás comunes, las consideraciones éticas y morales junto a la legislación deben marchara la par. De esta manera los resultados adversos obtenidos mediante la examinación deun paciente, deberán ser tan solo del dominio del equipo de profesionales tratante de laenfermedad y nunca entregados a los pacientes, sin el debido tacto y menos aún a lasinstituciones públicas o privadas. En general una persona joven, que tiene toda una vidapor delante, se reciente y puede sufrir daño psicológico, al saber que debe enfrentarenfermedades para las cuales no se encontraba preparada, en vez de dejar estas al azary al estilo de vida. Este es un tema que puede generar un intenso debate en el futurocercano.

Regiones multilocus con 3 secuencias repetitivas de distinto tamaño

Escalera alélica: Regiones de múltiples peaks correspondiente a los distintos alelosexistentes en la población y que se emplea como estándar

Alelos de una persona común

Alelos de otra persona no relacionada con la primera




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Para comprender los alcances de esta nueva medicina debemos comenzar por estudiarlas unidades de la herencia o las subunidades del DNA. Estas comprenden aquellasestructuras que almacenan la información útil para generar un individuo. Bastan cerca de

30.000 genes para definir un ser humano. En ellos reside la estructura de las proteínas junto al conocimiento implícito para sus interacciones tridimensionales en sumicroambiente hasta el comportamiento de un organismo entero. Sin embargo, los genesforman tan solo una pequeña parte de los cromosomas que tienen una mayor parte deDNA no codificante o de “relleno”.

Los cromosomas humanos se encuentran divididos en dos juegos de 22 autosomas másun cromosoma sexual, que puede ser X o Y (Fig. 21-16). Cada una de las células de unorganismo son totipotenciales es decir, tienen la información para generar un individuocompleto. Este hecho se conocía hace ya algún tiempo, desde que se logró clonar ranasa partir de núcleos de células extraídas del intestino de una rana adulta, hasta laaparición de la famosa oveja “Dolly”. Esta última fue clonada a partir del núcleo de una

célula de la glándula mamaria. Esto significa que todas las células de nuestroorganismo poseen la misma información, pero los genes que se expresan sondiferentes. Cada tejido es caracterizado por la expresión particular de sus genes, lo queocurre durante un proceso denominado diferenciación celular y que acontece durante laEmbriogénesis.Por lo tanto dependiendo del balance en la expresión de las células totipotencialesalgunos genes se prenden y otros se apagan, sin embargo el potencial genético paraconvertir un hepatocito en neurona, aún se encuentra presente en el tejido diferenciado,pero se lo encuentra silencioso.

Fig. 21 - 16. Cromosomas humanos ordenados por tamaño mostrando sus bandeos.

En general, este tipo de disposición de la expresión genética, nos dice que los genespueden ser inducibles y constitutivos. Los constitutivos se expresan siempre paraque la célula subsista y codifican para enzimas que son responsables de las reacciones




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enzimáticas y síntesis de estructuras llevando a cabo las labores básicas, mientras quelos genes inducibles se encuentran inactivos la mayoría del tiempo y solo se expresanpara reacomodar el metabolismo o la estructura de la célula bajo determinadas

circunstancias. Hay que considerar que dentro de estos genes, un subgrupo fue inducidodurante la embriogénesis y mantiene a la célula diferenciada en lo que ya és, sea estauna neurona, hepatocito, miocito, etc. y una vez logrado este propósito permanecensilenciosos.

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a) MUTACIONES

La compleja interacción entre los genes determina el funcionamiento de nuestrometabolismo y sus defensas, sin embargo las mutaciones que se adquieren durante elcurso de la vida pueden llegar a ser heredadas (Fig. 22 - 16) o “congénitas”, pasandopor la línea germinal. Por otro lado también pueden ser somáticas (Fig. 23 - 16) o

adquiridas, cuando en el transcurso de la vida solo pasan de célula en célula y no a losdescendientes (efecto de la luz UV, tóxicos ambientales, etc.). Las primeras puedenafectarnos o predisponernos a enfermedades que van desde insignificantes, es decir,algo así como la intolerancia a ciertas dietas, hasta la inhabilitación total de la persona,como es el caso de las enfermedades congénitas del metabolismo (Hiperamonemias,Fenilcetonurea, etc.). Por otro lado, entre las mutaciones somáticas, podemos contar conla predisposición al cáncer provocado por el tabaquismo o a los melanomas provocadospor el exceso de exposición a la luz solar.

Oocito Espermio

Mutación

+

Hueso PancreasNeurona

Fig. 22 - 16. Mutaciones en la línea germinal pueden ser heredadas.

Dentro de este último punto, ocurre que algunas personas pueden ser más susceptiblesque otras a las enfermedades adquiridas, resaltando lo complejo que es su control y queparece depender de la expresión de varios genes a la vez.




825

Podemos citar que si una función determinada depende de los genes A, B, C y D, estase lleva a cabo en un 100%, sin embargo, si la misma función se puede llevar acabo en un 80% con tan solo A, B y C, debido a que D se encuentra mutado. Esta

persona será más propensa a sufrir una enfermedad determinada por falta delcontrol aportado por D. Aunque no es seguro de que así sea, no se tiene la certezaexacta de que se producirá una falla, pero es lo más probable.

Mutación

Células mutadas Células normales

Fig. 23 - 16. Mutaciones somáticas solo pasan decélula en célula y no son heredadas.

En los humanos los genes se encuentran en pares y una copia pertenece a cada padre.Cada una de estas copias recibe el nombre de alelo, los cuales pueden ser del tipo

dominante o recesivo (Fig. 24a - 16). El alelo dominante (D) en las enfermedadesautosómicas, se expresa y prevalece independientemente de sí su contrapartida esdominante (DD) o recesiva (Dd), mientras que el recesivo (d) se expresa si sucontrapartida es también recesiva (dd). En el caso de que una persona posea un gen recesivo con la enfermedad y otro dominante normal, prevalece el normal, siempreque este último no sea desactivado o se pierda. Sin embargo, la persona heterozigotapara el gen recesivo es portadora de la enfermedad y tiene un 25% de probabilidad depasar el gen alterado a cada individuo de su descendencia. Si ahora ambos padres sonportadores, la probabilidad de producir descendencia portadora en cada embarazo es de50% (Fig. 24a - 16). Estas probabilidades se hacen posibles, en especial en aquellosgrupos étnicos cerrados, con poco intercambio genético con la población mundial.

Por otro lado, es necesario aclarar que no todos los alelos mutados pueden conducir auna enfermedad. El cáncer de mamas, cuyo responsable es un gen dominante y no elrecesivo, tiene solo un 80% de riesgo y no de 100% a edades superiores a 65 años, yaque intervienen otros genes que se encuentran coludidos con el alelo mutado y de estosúltimos dependerá en parte, que el mal aparezca o no. Este hecho indica que para hacerposible un cáncer, deben existir distintas mutaciones simultáneas o bien que estassean del tipo acumulativo y que ocurran durante todo el transcurso de la vida. Porejemplo, en la enfermedad denominada Alzheimer se requieren mutaciones en loscromosomas 1, 14, 19 y 21. A la vez que esta enfermedad se encuentra asociada a lasobreproducción de Apo E (Apoproteína E). Esta última participa en el transporte de los




826

lípidos y cuando sus niveles se encuentren alterados, constituiría la señal marcadora dela enfermedad.

Fig. 24a - 16. La persona homozigota que porta los alelos recesivos (dd) tiene un 100% deprobabilidad de padecer la enfermedad.Fig. 24b - 16. Mutaciones en distintas partes del mismo gen producen diferentes síntomas.

Por otra parte, ocurre de que las mutaciones pueden caer en distintos segmentos de unmismo gen (Fig. 24b - 16), produciendo manifestaciones clínicas que van desde el rangode severas a leves e incluso silenciosas, como es el caso de la Fibrosis Cística.

En otros casos los genes mutados se pueden heredar, ya que se transportan en célulasreproductivas, por lo que la mutación estará presente en todos los tejidos del individuoproducto de estos genes.Así tenemos que los desórdenes hereditarios pueden ser también causados por un alelomutante o un solo gen, como es la distrofia muscular de Duchenne, el Retinoblastoma ola Anemia falsiforme, comparados con otros desordenes que son poligénicos, es decirocurre que más de un gen o alelo se encuentra involucrado. Se necesita aquí de lainteracción de varios genes para causar la enfermedad. Entre ellas tenemos las

enfermedades al corazón, diabetes y algunos tipos de cánceres.

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Dd Dd

DD Dd Dd dd

D

d

Gen o Alelo Dom inante

Gen o Alelo Recesivo

Ambos padres portadores

Hombre Mujer Hombre MujerNorma l Portadora Portador Enferma

25% 50% 25%

Hombre Mujer

Gen de la Fibrosis Cística

Normal Mu tación 1

M utación 2 M utación 3

Sinsíntomas

Síntomasleves

Síntomasseveros

Síntomas decarácter

intermedio

b)a)




827

b) CARIOTIPO

Un primer avance en la búsqueda del origen de las enfermedades genéticas, lo

constituyó la obtención del Cariotipo. Mediante esta técnica se puede visualizar a loscromosomas y sus características presentes en una muestra de sangre extraída a unadeterminada persona. Luego se procede a sincronizar la división celular y posteriormentese observa la disposición de los cromosomas en metafase. Se determina así el númerode ellos, la composición de los cromosomas sexuales y se identifica cualquiera anomalíaque se presente en cuanto a su forma, ya que les puede faltar o sobrar un segmento, locual nos entrega una idea de la cantidad de DNA que portan. El Cariotipo nos permitirátambién determinar cual es el sexo real de una persona, así como los problemas deinfertilidad que puedan existir.

Metacéntrico

Submetacéntrico

Acrocéntrico

BANDEO DE UN

CROMOSOMA

p

q

TELOMEROS CENTROMERO

Fig. 25 - 16. Tipos de cromosomas que se encuentran en un Kariotipo

Los cromosomas pueden ser distinguidos por su tamaño y por la posición delcentrómero, que puede llegar a ser Metacéntrico (Fig. 25 - 16), cuando se ubicaequidistante a ambos extremos del cromosoma. Submetacentricos, cuando elcentrómero se encuentra fuera del centro, ya que un par de brazos del cromosoma esmayor que el otro p (brazo corto) y q ( brazo largo) y finalmente Acrocéntrico, cuandoel centrómero se encuentra en un solo extremo.

Otro tipo de identificación que se puede llevar a cabo sobre los cromosomas lo constituye

su bandeo. Este aparece bajo ciertos tratamientos químicos que dependen de lacomposición de las bases y la estructura de la cromatina. Así tenemos, que el bandeo Ctiñe Centrómeros, luego el bandeo R es el inverso del C y tiñe regiones nocentroméricas como los brazos p y q. A continuación tenemos el bandeo G, que seobtiene con la tinción de Giemsa, produciendo bandas a lo largo de su estructura ypor último el bandeo Q que se obtiene con Quinacrina y produce fluorescencia. Los dosúltimos bandeos G y Q son suficientes para permitir la identificación de cada cromosomay proceder a su arreglo por tamaño y número de bandas para observar el Cariotipo.

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828

c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO

El Proyecto Genoma Humano (HGP) auspiciado por Europa y Estados Unidos partió en

octubre de 1990 y pretendió secuenciar todo el DNA de la especie humana incluyendolos 80.000 a 100.000 genes supuestos genes , que resultaron ser solo 30.000 y queconstituyen el patrimonio humano, más el DNA “de relleno” en un periodo de 13 años.Es decir, se reconoció la secuencia de aproximadamente 3 x 109 bases que forman elmaterial genético humano y se trabaja en la actualidad dilucidando todos los mecanismosde control posibles. Otros desarrollos consistirán en el análisis de los productos proteicosde los genes y la observación de cromosomas teñidos con sondas fluorescentes enlugares específicos donde se encuentren las posibles anomalías. A la vez se llevaron acabo estudios paralelos en otros organismos como Drosophylas, Levaduras y E. Coli,para desarrollar la tecnología e interpretar la función de los genes en humanos. Lastareas fundamentales se desarrollaron a través de varios métodos independientes deanálisis que garantizaron su validez. A continuación se ilustran algunos de los métodos

empleados: Volver al inicio

d) MAPEO DE LOS GENES

Consiste en emplear una técnica que permita determinar el orden de estos y de otrosmarcadores (secuencias específicas que no son genes), junto al espacio que ocupan encada cromosoma y a la vez determinar la distancia que exista entre ellos. Así se pudoidentificar ciertos genes asociados a determinadas enfermedades y las propiedadesbiológicas de las cuales son responsables, constituyendo la columna vertebral del mapeofísico. De esta manera se pretende mostrar el arreglo de los genes y los marcadores desecuencia del DNA. Estos mapas se construyeron en varias escalas y niveles de

resolución.

X

Y

PRESENCIA DE AMBOS ALELOS EN ELPADRE Y LA MADRE

HIJOS

XX

Y Y

MARCADORESEN EL PADRE Crossing-over o

recombinación

X

Y

Fig. 26 - 16. El material genético del padre sé recombinó durante el proceso de espermatogénesis.La frecuencia de estos eventos de crossing-over ayudan a determinar la distancia entre losmarcadores

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829

e) MAPEO LIGADO A MARCADORES

El Mapeo ligado a marcadores se encuentra constituido por los mapas de menorresolución y dependen de regiones expresadas del DNA (genes), como secuenciasque no se expresan, pero cuya pauta de herencia (secuencia específica) puede serreconocida y seguida (Ver marcadores moleculares en Herramientas) en losdescendientes.Los genes se pueden analizar por sus características fenotípicas, como X e Y en lafigura 26 - 16 o bien pueden ser reconocidos por sus características polimórficas, es decir las formas alternativas de un alelo o bien la presencia de distintos alelos entre losdiferentes individuos de una familia, como ocurre con el color de los ojos, el pelo, laestatura. En cambio entre las secuencias que no se expresan y que pueden ser seguidas,encontramos a los polimorfismos representados por secuencias repetitivas en su DNAque pueden variar en tamaño y número de repeticiones en los distintos individuos.

En el mapeo ligado a marcadores se emplean las frecuencias con que se expresan losmarcadores o las características ligadas a los genes que aparecen en los descendientespara asignar las ubicaciones en el cromosoma. Este reconocimiento se lleva a cabodespués de la gametogénesis cuando han pasado por la recombinación o “crossing-over”.Es así posible construir un mapa observando cuan frecuentemente dos marcadores ogenes se heredan juntos o cuan frecuentemente dos marcadores o genes pasan desdelos padres hacia los hijos. Mientras más juntos en el cromosoma, es menos posibleque se separen y mientras más lejos es más posible que se hereden separados yaparezcan en distintos hermanos y no en uno solo de ellos.

De esta forma es posible asignar un par de genes o marcadores a un área específica del

cromosoma, donde las distancias se miden en términos de Centimorgans (cM), en honora un genetista de ese apellido. Dos marcadores se encuentran separados por 1cMcuando aparecen separados por recombinación, tan solo el 1% de todas las veces (el99% salen juntos) y esto equivale en un mapa físico a la distancia de 1 millón de paresde bases entre los dos marcadores.

Por otro lado, dentro de los marcadores determinados por la secuencia cuya pauta puedeser seguida se encuentran ciertas secuencias con simetría bicatenaria que constituyenpolimorfismos. Esto significa que la misma secuencia se ubica en distintos lugares endiferentes individuos y son reconocidas por ciertas enzimas denominadasEndonucleasas de Restricción (Ver herramientas).

Cada una de estas enzimas es capaz de reconocer una secuencia específica, pero comoesta se ubica en distintas posiciones en los distintos individuos, tanto en el DNA “derelleno” como en los genes que son de interés. Al ser cortadas generan una población defragmentos de distinto largo o polimorfismos típicos de cada individuo. Cadaendonucleasa actúa produciendo un patrón típico de cortes para cada individuo. Estosfragmentos se pueden emplear para reconocer sectores específicos del DNA tanto en losmapas físicos como en aquellos mapas de entrecruzamiento o recombinación y la técnicaderivada de esta análisis se denomina RFLP.

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830

f) EMPLEO DE RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) OPOLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN

En la Fig. 27 - 16 se observa el empleo de la técnica denominada RFLP. Esta técnica esutilizada para estudiar aquellos casos donde una enfermedad genética produce unpatrón típico de fragmentos polimorfos distribuido entre los progenitores ydescendientes. Esta observación se logra mediante el análisis de los productos de unadigestión con una o más endonucleasas de restricción, lo que deja un patrón reconocidode cortes que se visualiza por una electroforésis.

Los fragmentos obtenidos por digestión enzimática (endonucleasa de restricción) seseparan por electroforésis en un gel de Agarosa según tamaño y carga. Los fragmentosde DNA migrarán desde el Cátodo (-) hacia el Ánodo (+) de acuerdo a:

a) su carga negativa (Fosfatos), que aumenta con el largo del fragmentob) el diámetro de los poros del gel..

En aquellos individuos considerados como mellizos univitelinos o en aquellos casos enque los distintos genes poseen ambos alelos idénticos, se produce un patrón típico dehomocigotos, es decir la endonucleasa de restricción cortó el DNA entregandofragmentos del mismo tamaño y que en el gel se superponen en la misma posición (Fig.27 – 16).

Por otro lado, los fragmentos de distinto tamaño que aparecen en el gel serán típicos delos polimorfos o provenientes de genes heterozigotos de cada padre y dan una bandasuperior y otra inferior (Fig. 27 – 16).

En ambos casos los fragmentos se distinguirán al visualizarlos pasando luz UV por ellos otiñendo con Bromuro de Etidio, colorante que se intercala en el DNA y lo hace visible.

Cómo resultado de la migración de los segmentos de DNA es posible observarinnumerables bandas, sin saber cuales son las que corresponden al gen de la cadena β de la hemoglobina. Luego, para identificar al gen en esta población de fragmentos dedistinto tamaño, se debe usar una sonda o hebra de DNA o RNA con marca radiactiva oinmunológica o fluorescente a la UV. Esta sonda debe corresponder a una secuencia debases específica, complementaria al segmento del gen de la cadena β.

Ahora, para que la sonda reconozca y se una a la hebra complementaria correspondienteal gen de la cadena β, entre los fragmentos del gel. Se debe proceder a un tratamientocon una solución salina capaz de separar ambas hebras. Posteriormente se traspasauna de ellas por difusión a un papel de nitrocelulosa. Esta última técnica se denominaSouthern Blot (ver herramientas) o técnica del traspaso.




831

Er GEN NORMAL Er

Er GEN CON DELECION Er

GENOTIPOS :PADRE MADRE HIJO HIJA HIJO GUAGUA

Padre Madre Descendencia

Gen de la cadena β de la Hemoglob ina

Homocigoto Homozigoto Heterozigoto Homozigoto

Normal Anormal Normal Normal

Frag-mentosdobles

Fig. 27 - 16. Se observa la técnica de RFLP. Donde se estudia una familia que posee unadelación en el gen de las cadenas β de la Hemoglobina.

A continuación, al disponer de un patrón de fragmentos representados tan solo por unade las hebras del DNA en el papel de nitrocelulosa, es posible agregar la sonda en unmedio acuoso de menor salinidad, para observar como esta se aparea a su fragmentocomplementario, marcándolo para ser posteriormente identificado por medio defluorescencia, una radioautografía o mediante un procedimiento inmunológico.

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832

GEN

2 4 6 8 10 12 Kb

4Kb 6Kb

Posición desconocida del GEN

10Kb

6Kb

4Kb

10 Kb

6 Kb

4 Kb

Tratamiento con ambas enzimas derestricción Eco R1 y Hind III 10 Kb

6Kb

5Kb

4Kb

GEN

SONDARADIACTIVA

Eco R1 Eco R1 Eco R1

Hind III Hind III

1Kb 4Kb 5Kb 1KbHind III Eco R1 Eco R1 Hind III Eco R1

10 Kb

GEN

Visualización delos fragmentos

por Southern Blot

g) MAPEO DE UN GEN

En la Fig. 28 - 16 se observa un gen que sé mapea físicamente para conocer su posiciónmediante el empleo de dos Endonucleasas de Restricción Eco R1 y Ind. III. La Eco R1produce dos fragmentos de 4 y 6 Kb, mientras que la Hind III solo uno de 10Kb. La acciónde ambas enzimas simultáneamente, produce fragmentos de 1, 4 y 5 Kb. Los fragmentosfueron sometidos a la técnica de Southern Blot y visualizados mediante una sonda paraubicar finalmente al gen entre los dos fragmentos de 1Kb, que no se observan en lasFig. 28 - 16. Mapeo de un gen mediante dos enzimas de restricción

radioutografías, pues la sonda no se une a ellos.




833

De esta forma es posible ubicar el gen en un mapa físico, al saber por queendonucleasas de restricción se encuentra flanqueado o bien en que patrón reconociblees fragmentado por estas enzimas.

Es también posible saber el tamaño en Kb de los fragmentos, conociendo la cantidad deDNA que comprende cada uno de ellos por medio de estándares consistentes en distintospesos moleculares conocidos que no aparecen en la figura anterior.

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h) EMPLEO DE VNTRS POR “VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATSSÉQUENCE” O NÚMERO VARIABLE DE SECUENCIAS REPETITIVAS Y EL USO DELOS STS POR “SEQUENCE TAGGED SITES” O SITIOS MARCADOS PORSECUENCIA.

Otra de las metodologías para detectar polimorfismos hace uso del DNA microsatélite que

presenta un Número Variable de Secuencias Repetitivas o Variable Number TandemRepeats Sequence (VNTRS). Las secuencias repetitivas se encuentran asociadas oligadas a algún gen o alelo y al variar en tamaño o número de repeticiones entre unapersona u otra, desplazan los sitos de restricción produciendo fragmentos dedistintos largos o polimorfos, que se pueden separar por electroforésis y visualizar porradioautografía o tinción con Bromuro de Etidio.De esta manera, es posible ordenarlos para generar un mapa de la sección basado enlos genotipos y tamaños de los fragmentos (Fig. 29 -16).Lo que se busca por estas técnicas es la diferencia entre los sitios de restricciónreconocidos por una misma enzima o mezcla de ellas, para así tener fragmentos dondese relaciona su tamaño con el genotipo.

Fig. 29 - 16. Las secuencias VNTR tienen distintos tamaños los que se pueden atribuir apolimorfismos.

0 1 2 3 Kb

Alelo a

Alelo b

Alelo c

Sitios de

restric-ciónfijos:

Sitios derestriccióndesplazados

por tamaño delas VNTRs

VNTRs

3,0 Kb

2,5 Kb

2,0 Kb

GENOTIPOS:

aa ab bb bc cc ac




834

Una vez que se han caracterizado varios genes en un mismo cromosoma es posibleordenarlos mediante su reconocimiento por medio de marcadores moleculares (verherramientas). Estos marcadores se pueden generar por diferentes técnicas como se

observará más adelante. Una de ellas consiste en los STS o Sequence Tagged Sites porSitios Marcadores caracterizados por la Secuencia. En esta técnica se emplean doscebadores de 18 a 20 bases que amplifican por PCR (Reacción en Cadena de laPolimerasa, ver herramientas), una secuencia conocida de DNA. Esta secuencia seemplea como un hito o letrero caminero (el mismo letrero en distintos caminos osecuencias), para saber si los genes caracterizados por las endonucleasas de restricciónse encuentran antes o después de ellos.

Por otro lado algunas de las alteraciones que sufren los genes pueden hacer desaparecer o crear nuevos sitios de restricción. Estos sitios de corte varían deposición de un individuo a otro, dando fragmentos de distintos tamaños o bien si sonnormales se pueden llamar polimorfismos de un mismo gen o alelos a y b como

ocurre en la Figura 30 - 16.

Fig 30 - 16. Dos alelos de un gen presentan una secuencia distinta en el sitio de corte por laendonucleasa de restricción, lo que permite estudiar sus genotipos. En los Southern Blotsrespectivos se observa una doble banda formada por alelos a,a largos de 3Kb y dos cortosb,b de 2 Kb, más el afectado con un nuevo sitio de restricción (al medio) a de 3Kb y b de 2Kb.El fragmento de 1 Kb no es visible pués la sonda no se unió a él.

0 1 2 3

Alelo aAlelo b

Sonda

a a b

a b b

Genotipos

3Kb

2

1

SOUTHERN BLOTS

Alelo bconsitio

nuevo




835

Ambos genes de la figura 30 – 16, tienen una secuencia diferente que les hace capacesde producir distintos genotipos. En el caso normal que este gen codificara para unaenzima podría dar origen a Isoenzimas o bien Aloenzimas. Esto significa que su

secuencia aminoacídica difiere en uno u otro aminoácido, pero cataliza la mismareacción, lo que se traduce en una adaptación para ser activa a una temperatura o a unpH diferente de la copia originalComo se puede observar, en estas técnicas se hace uso de las diferencias más leves queexistan en la secuencia de deoxiribonucleótidos entre uno u otro individuo, de esta forma

Fig. 31 - 16. Mapeo por restricción. Se ordena un fragmento de 8Kb por las posiciones relativasen el corte de las enzimas de restricción Sal I y X ho l.

se pueden detectar los distintos genotipos de que están constituidos. En generalentre los mismos humanos, se asume que puede existir una variabilidad de un 0.3% en lasecuencia total de las bases que constituye el DNA de cada persona, comparado con el1,7% de diferencia entre hombre y Chimpancé Bonomo.En la figura 31 - 16, se observa un ejemplo de cómo ordenar mediante endonucleasasde restricción (Sal I y Xhol I) y electroforésis un fragmento de DNA de 8Kb.Mediante esta técnica se separan los fragmentos de distintos tamaños producidos por las

enzimas de forma individual y ambas juntas.De similar forma es posible alinear grandes fragmentos de DNA como se observará másadelante con el fin de mapear un sector de un cromosoma mediante el procedimientodenominado top-down.

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8 , 0 K b

4 , 7

3 , 3 1

S i nD i g e s t i ó n S a l I X h o l S a l I + X h o l

6 , 5 K b

3 , 3 13 , 1 9

1 , 5 1

S a l I X h o l

3 , 3 1 K b 3 , 1 9 K b 1 , 5 1 K b




836

i) MAPAS FÍSICOS O MAPAS DE ADN.

Se basan en la formación de clonos que contribuyen a proveer de la distancia física real

entre marcadores presentes en el cromosoma expresado en kilobases. Los mapas

AnálisisCitológico

Análisismolecular

Célulasdonadoras

Radiación

Célulasdonadorasirradiadas

Células deratón

Células híbridas

Célulasclonadas

Fig. 32 - 16. Mapeo obtenido por fusión de células de ratón con humanas cuyos cromosomas hansido sometidos a Rayos x para cortarlos. Posteriormente se observa en los híbridos la aparición delos caracteres o marcas. Mientras más cercanas menos posible de separarse y es más probableque aparezcan juntos.

Físicos indicarían en un camino cuantos Kilómetros faltan para llegar a una ciudad o gen,mientras que el mapa genético sería algo así como lo que dice un lugareño, que laciudad queda más adelante o que ya la pasó, pero no sabe a cuantos Kilómetros.Los mapas físicos proveen de las bases para la aislación y caracterización de genesindividuales u otras regiones del DNA que presenten interés, así como proveen dematerial para el mapeo molecular a distintas resoluciones.

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j ) MAPA CITOGENÉTICO

De esta manera, el mapa citogenético o mapeo de los cromosomas, que se basa en elbandeo observado sobre los cromosomas teñidos (Fig. 25 – 16) es un mapeo de bajaresolución. Otro de estos mapeos similares, consiste en el análisis de los híbridosobtenidos por radiación (Fig. 32 - 16), se analiza aquí la frecuencia con que dosmarcadores se separan después de radiación por rayos X que rompe ambas hebras delDNA en el cromosoma. Posteriormente las células humanas irradiadas se fusionan conotras intactas de ratón y se procede a estudiar los genotipos o fenotipos de los conjuntosde células descendientes a partir de un par original humano-ratón fusionado, que portan




837

variados cromosomas. La distancia se mide aquí en CentiRay (cR) que equivale alintervalo en el cual existe un 1% de probabilidad de ruptura inducida por irradiación.Se pueden emplear marcadores no polimórficos ya que se requiere de tan solo un

cromosoma para determinar la frecuencia de aparición de marcadores ligados entre sí,dependiendo de la distancia que los separa después de la fragmentación

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k) LA HIBRIDACIÓN IN SITU

Entre las técnicas para confeccionar los mapas se encuentra la hibridación in situ, queconsiste en emplear una sonda de una secuencia no específica del DNA, constituida por un DNA genómico (cualquier trozo de DNA) o bien una sonda específica, como elDNAc (DNA complementario sin intrones obtenido del RNAm con TranscriptasaInversa). Su localización se puede detectar al observar la sonda unida a la hebra de DNAcomplementaria del cromosoma intacto. El DNAc marcado se emplea como una sondaespecífica para detectar las regiones expresadas o Exones de un gen donde se aparea.Las sondas de DNAc pueden reconocer las posiciones de los genes que más interesaidentificar y que se pueden ubicar en las cercanías de otro mapa generado por técnicasde marcadores ligados (linkage map).De esta forma se pueden emplear distintas sondas y se pueden ubicar distintassecuencias marcadoras al mismo tiempo. La sonda se marca con biotina, dioxigenina odinitrofenol de tal manera que pueda ser reconocida por proteínas específicas a estasmoléculas, como son los anticuerpos o la avidina que se unirá a la biotina. En resumen,la sonda después de hibridizar, acompañada de su grupo específico, recibe a unaproteína que se une a la sonda y que tiene una porción conjugada con una moléculafluorescente, como la fluoresceína o la rhodamina, etc., que posteriormente señala el

lugar permitiendo su visualización.

Fig. 33 - 16. En la figura A, una sonda de 1 kbp aparea con un exón de una sola copia de un gen.En la figura B, la sonda es de 40kpb y aparea inespecíficamente en varios sitios. En la figura C,La Sonda anterior es acompañada por un exceso de DNA repetitivo.

S O N D A

A B C




838

l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION O HIBRIDACIÓN IN SITUCON FLUORECENCIA

Una de estas técnicas se denomina FISH (Fluorescence In Situ Hibridization oHibridación In Situ con Fluorescencia) (fig. 33 – 16) y es de baja resolución por lo que sepueden detectar cromosomas en núcleos en interfase cuyos marcadores o genes seencuentran separados de 2 a 5 Mbp.En los cromosomas en interfase o prometafase, cuando son menos compactos sepueden incluso

Fig. 34 - 16. Clonación y subclonación de un fragmento de DNA el que seamplifica y mapea por endonucleasas de restricción para disponer dematerial para su secuencia

ordenar los marcadores para que el mapa morfológico y molecular sean colineales. Aúnes posible amplificar los fragmentos correspondientes mediante PCR (Ver herramientas)al disponer de los cebadores adecuados y se pueden incluso aislar y caracterizar genesindividuales y otras regiones de interés del DNA, a la vez que esta técnica provee desustratos para la secuencia del DNA.Por otro lado, aquellos mapas genéticos obtenidos por análisis de la recombinación(lynkage map) no son lo suficientemente precisos para aislar un gen, por lo tanto se

CromosomaHumano

Fragmento de 400Kbclonado en YAC

Subclono proveniente de unYAC: Cromosoma artificial de

levaduraFragmento de 40 Kbclonado en cosmido

Cosmido

Cada subclono es mapeado porenzimas de restricciónPlasmido

4 Kb clonadas enun Plásmido

Secuencia nucleotídica parcial delgen de laβ-Globina Humana

Eco R1 Eco R1 Eco R1 Eco R1 Eco R1 Eco R1 Eco R1

Bam H1 Bam H1 Bam H1 Bam H1 Bam H1 Bam H1 Bam H1




839

debe recurrir a un nuevo tipo de mapas físico. Para obtenerlos se debe emplear una seriede clonos que amplifican segmentos de DNA. Es decir, fabricando un YAC (YeastArtificial Chromosome), CAC (Cosmid Artificial Chromosome) o un LAC (Lambda Artificial

Chromosome), como se observa en la Fig. 34 – 16.Estos vectores se superponen cubriendo todo un sector del cromosoma y dan la ideafísica de la distancia entre los marcadores o genes en el cromosoma. La distancia seexpresa aquí en Kb y se pueden ordenar por los cortes provocados por las enzimas derestricción Eco R1, Bam H1 como ocurre en las figura 35 – 16. Se empieza con bajaresolución y posteriormente se refinaLos mapas físicos son diferentes de los genéticos aunque tienden a ser iguales hacia elfinal cuando se tiene toda la secuencia.

Fig. 35 – 16. Mapa top-down de macrorestricción basado en la superposición demacrofragmentos.

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m) MAPEO TOP-DOWN

La aproximación top-down, se lleva a cabo cuando se dispone de un fragmento de grantamaño. Este se aísla mediante electroforésis de pulso en dos dimensiones (40Kpb a10Mpb) o bien es un cromosoma aislado por citometría de flujo (aislado de células en

división donde se separan por diferencia de flujo y cantidad de DNA presente), omediante células híbridas humano–ratón (que se propagan hasta dejar en su contenidocromosómico tan solo un cromosoma humano). A continuación el fragmento se corta conuna enzima de restricción que digiere en menos sitios de los realmente existentes paraella, produciendo fragmentos de gran tamaño (Fig. 35 – 16). Estos fragmentos se puedenordenar y proceder a cortarlos en fragmentos menores que a su vez también se puedenordenar como se observa en la Figura 36 – 16.

CromosomaSe empleanendonuclea-

sas derestricción

que no cortanen todos los

sitiosposibles:

Se reconocenlos fragmentos

por lasuperposiciónde los sitios de

corte

De los 8 sitios

de corte, en unprincipio solose corta en 4

Cortesposteriores




840

Fig. 36 -16. clonación mediante Cósmidos, se separan porElectroforésis después de su digestión con una o másEndonucleasas de Restricción.El fragmento A no está relacionado con los otros.

De esta manera se genera un mapa de macrorestricción y se determina el orden y la

distancia entre los sitios de corte por estas enzimas que son capaces de cortar rara vez.Así se producen mapas de mayor continuidad que los contig, pero la resolución es baja yno se pueden encontrar los genes en ellos ya que van de 100Kb a 1 Mb.

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n) MAPEO BOTTOM-UP

La aproximación desde abajo hacia arriba (bottom-up) consiste en subdividir enpequeños trozos los fragmentos mayores. Estos forman una biblioteca que se puedeClonar en un vector, generando millones de copias idénticas que posteriormente sepueden alinear por superposición. La biblioteca debe ser indexada o bien cada volumen osegmento de DNA debe estar ordenado y clasificado, es decir a que colección pertenece

1234567891011

12131415161718192021222324252627282930

A B C D E




841

y en que posición se debe de encontrar. En la Figura 34 -16, se observan los fragmentosde cinco clonos de cósmidos que han sido digeridos. Se procedió a digerir con Hind III,una enzima de restricción con 6 pb en el sitio de reconocimiento, se marcó y luego se

digirió con Mbo I, que reconoce solo 4 pb en el sitio de corte. Los fragmentos sesepararon posteriormente mediante electroforésis en Acrilamida y aquellos marcados sereconocieron por radioautografía (Fig. 36 - 16).En este caso corresponderá a un arreglo multidimensional de los clonos donde se sabela posición de cada uno de ellos. De esta manera se puede decir, que los cósmidos C, E,D, B se encuentran superpuestos en este sentido, mientras que A no se relacionaba conellos (Fig. 37- 16).

Fig. 37 - 16. Superposición de fragmentos cortados por lasendonucleasas para indicar la continuidad del macrofragmentomayor formado por fragmentos contiguos.

Así se visualiza el orden existente en el cromosoma original, aquellos fragmentos que sesuperponen son contiguos y presentan en el gel de Agarosa igual migración, o bien lasbandas se encuentran a la misma altura unas de otras. Los fragmentos alineados de estamanera, se ordenan ahora en la biblioteca, por clonos contiguos y se denominan Contigs(Fig. 38 - 16).

En el caso de que el mapeo, por marcadores ligados (lynkage map) indique que en estosfragmentos alineados reside un gen, se pueden emplear los clonos contiguos de cadauno de ellos para

Fig. 38 - 16. Se localizan las posiciones relativas de las secuencias clonadas de la biblioteca.Se determinan los fragmentos y clonos contiguos.

Fragmentos contiguos

Las superposiciones sedetectan por mapa de

restricción, secuencia o

hibridizaciones.

Biblioteca de Clono s

Se determinaque C lonos

s o ncon t iguos

C

E

D

B




842

Determinar la secuencia de las bases. El mapeo por Contigs genera mapas muydetallados, pero solo de áreas pequeñas. No se pueden extender a algunas regiones del

cromosoma, pues estas no se pueden clonar.

En la Figura 39 - 16, se pueden apreciar los distintos mapas desde la menor a la mayorresolución. Entre ellos tenemos al mapa genético obtenido por frecuencia derecombinación de los genes o polimorfismos, seguido por aquel obtenido mediantealineación de fragmentos de restricción y el alineamiento por superposición de una seriede fragmentos representados por clonos contiguos que generan una biblioteca, parallegar finalmente a la secuencia individual de cada fragmento.

Fig. 39 - 16. Tipos de mapas con diferentes resoluciones

MAPA GENETICO PORRECOMBINACION

2-5cM

MAPA FISICO PORFRAGMENTOS DE RESTRICCION

1-2Mb

MAPA FISICO DE BIBLIOTECAORDENADA DE COSMIDOS

CONTIGUOS QUE SESUPERPONEN

MAPA FISICO DE MAYORRESOLUCION

SECUENCIA de BASES1b

Gen o poliomorfismo

1mB 2mB 0,5mB 2,5mB

MAPA FISICO DE MENORRESOLUCION O MAPEO

CROMOSOMICO5Mb

TOP - DOWN

BOTTOM- UP




843

En general en la figura 39 – 16, aparece el diseño general a seguir para obtener el Mapafísico del genoma humano

Fig. 40 - 16. Estrategia general para secuenciar el genoma humano.

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AGCTCTAGCGATGCAG

Mapa genético por recombinaciónde marcadores tipo RFLP y STSseparados por 1cM o 1Mb

Mapa físico de marcadores RFLP ySTS, donde se observa el orden y ladistancia de alrededor de 100kbentre los marcadores

Clonos superpuestos de 0,5 a 1Mb

CROMOSOMA

SECUENCIAS DE LOSFRAGMENTOS

CLONADOS LAS QUE SEEMPALMARAN

POSTERIOORMENTE ENLOS LUGARES DONDE SE

SUPERPONGAN




844

GLOSARIO

A

Alelo:Forma alternativo de un sitio genético. Se hereda separadamente un alelo por cadapadre. Pueden tener información como los genes o pueden ser sectores sin informacióncomo son las secuencias repetitivas de distinto tamaño según cada padre.

Amplificación:Aumento en el número de copias de un fragmento específico de DNA. El procedimientopuede ser in vivo por clonación de un vector o in vitro por PCR.

Autoradiografía:

Es una técnica que emplea película impresionable por rayos X para visualizar moléculasmarcadas radiactivamente. Se emplea para analizar el largo y número de los fragmentosde DNA después de separados por electroforésis.

Autosoma:Es un cromosoma que no esta involucrado en la determinación del sexo. El genomahumano diploide consiste de 46 cromosomas con 22 pares de autosomas y un par decromosomas sexuales denominados X e Y.

B

Bacteriófago:Es un virus cuyo huésped es una bacteria. Se emplean estos virus como vectores paraamplificación de fragmentos de DNA.

Banco de Clonos:Colección de clonos consistente en fragmentos superpuestos de DNA que representan elgenoma de un organismo.

Biblioteca ordenada:Clonos primarios de DNA recombinante en Fagos, Cósmidos o YACs, que se colocan enun arreglo en dos dimensiones en placas de microtitulación.

Biotecnología:Conjunto de técnicas biológicas desarrolladas por medio de la educación básica yaplicadas a la investigación y desarrollo de un producto. En especial en la industria delDNA recombinante.

C

Centimorgan (cM):Unidad de medida de la frecuencia de recombinación. Un centimorgan es igual a laprobabilidad de 1% que un marcador en un sitio genético esté separado de otromarcador en otro sitio debido a la recombinación en una sola generación. En humanos1cM es en promedio equivalente a 1 millón de pares de bases.




845

Centrómero:Región especializada del cromosoma donde las fibras del huso se unen durante ladivisión celular.

Clono:Una copia exacta de material biológico, que puede ser un segmento de DNA que constituya un gen u otra región, o bien una célula completa o un organismocompleto.

Clonación:La obtención de múltiples copias exactas de un solo gene, un segmento de DNA o unorganismo completo. La colección de moléculas de DNA copiadas o clonadas sedenominan bibliotecas de clonos. Otro tipo de clonos lo constituyen las líneas celularesconstituidas por células descendientes de una sola célula original. Un tercer tipo de clonoal inyectar el núcleo de una célula cualquiera organismo superior en un oocito produce un

animal completo genéticamente idéntico al patrimonio genético del núcleo inyectadocomo la conocida oveja Dolly.

Clonamiento posicional:Es una técnica destinada a identificar genes responsables de enfermedades en elcromosoma.El gen puede cartografiarse, aislarse y clonarse sin ningún conocimiento del productogénico.

Contig.:Grupo de fragmentos de DNA copiados o clonados que representan fragmentossuperpuestos de un cromosoma particular.

Cósmido:Vector de Clonación construido artificialmente que contiene el gen cos del fago lambda.Los cósmidos pueden ser empaquetados en partículas de Fago Lambda para infectar E.Coli. Se pueden introducir en estos huéspedes bacterianos fragmentos de hasta 45kb.

Cromosoma:Estructura genética autoreplicante de la célula que contiene el DNA celular que mantieneen su secuencia nucleotídica el arreglo lineal de los genes. En procariontes la totalidaddel genoma es llevado en un solo cromosoma. En eucariontes existen una serie decromosomas cuyo DNA se encuentra asociado a una serie de proteínas.

Cromosoma Artificial de Bacteria:Es un vector denominado BAC por Bacterial Artificial Chromosome, que se emplea paraclonar fragmentos de 100 a 300 Kb en células de E. Coli. Su componente principal es elplásmido F que se encuentra en esta bacteria.

D

Deleción:Es cuando falta una o más bases en una de las hebras del DNA.

Desorden de un solo gen:Desorden hereditario causado por un alelo mutante de un solo gen.




846

Diploide:Contenido total de material genético consistente de cromosomas apareados, un

cromosoma por cada padre.

DNAc o DNA Complementario:DNA que se sintetiza empleando RNA mensajero como hebra patrón mediante unaTranscriptasa Inversa. La hebra de DNAc se emplea como una sonda durante el mapeofísico de los cromosomas.

Dominio:Porción discreta de una proteína con su propia función.

E

E. Coli:Bacteria común que se ha estudiado intensivamente debido a su pequeño genoma,tamaño, carencia de patogenicidad y facilidad de crecimiento en condiciones delaboratorio.

Electroforésis:Método de separación de moléculas como fragmentos de DNA y Proteínas desde unamezcla de moléculas similares. Se somete la mezcla a un campo eléctrico sobre unamatriz porosa produciéndose la separación al chocar las moléculas con los poros de lamatriz de distinto tamaño. La migración se debe a la carga y los choques al tamaño de lasmoléculas para atravesar los poros. Agarosa y Acrilamida son los polímeros que seemplean para ácidos nucleicos y proteínas.

Enzima de Restricción o Endonucleasa:Es una enzima que reconoce secuencias cortas con simetría bicatenaria y las corta. Sonoriginarias de un mecanismo de defensa bacteriano contra el DNA inyectado por losbacteriófagos.

EST:Expressed Sequence Tag por Etiqueta de Secuencia Expresada o Marcación deSecuencia Expresada. Se usan estas secuencias específicas que marcan el DNA comopuntos de referencia, para comparar fragmentos de distintas personas y ubicar los genesantes o después de estas secuencias marcadoras.

Eucarionte:Célula u organismo cuyo núcleo es una entidad discreta y que consta de una membrana,además, poseen formas subcelulares incluidas en el núcleo. Constituyen todos losorganismos excepto partículas virales, bacterias y algas azul-verdosas.

Exón:Secuencia del DNA que codifica para proteína.

Exonucleasa:Una enzima que rompe nucleótidos secuencialmente desde un extremo de un fragmentolineal de DNA.




847

Expresión Genética:Es el proceso por el cual la información del gen se convierte en estructuras

Funcionales de la célula. La expresión de un gen consiste en la transcripción y latraducción en proteína o tan solo la transcripción en RNA.

F

FISH por Fluorescence In Situ Hibridization:Aproximación a un mapa físico que usa una marca de fluoresceína unida a una sondaque hibridiza con cromosomas en metafase y con la cromatina menos condensada de lainterfase.

G

Gameto:Célula reproductiva madura de macho o hembra conocida como esperma o huevo conun número haploide de cromosomas.

Gen:La unidad física y funcional de la herencia. Es una secuencia ordenada de nucleótidoslocalizado en una posición particular de un cromosoma particular que codifica para unproducto funcional como lo es el RNA o las proteínas.

Genética:Estudio del patrón como se heredan las características específicas de un individuo uespécimen.

Genoma:Todo el material genético en los cromosomas de un organismo en particular. Su tamañose encuentra representado por el número de bases.

H

Heterozigoto:La presencia de alelos diferentes en uno o más lugares de los cromosomas homólogos.

Homebox:

Se traduce textualmente como boletería o lugar caracterizado por una secuencia corta denucleótidos cuya secuencia de bases es virtualmente idéntica en todos los genes que lacontienen. Se encuentra desde la mosca de la fruta hasta humanos. Se encuentrarelacionada con la expresión de un grupo particular de genes durante el desarrollo.

Homología:Igualdad entre secuencias de DNA o proteína entre individuos de una misma especie yentre especies.




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Hibridización:Es el proceso de juntar dos hebras complementarias de DNA o una de DNA y otra deRNA para formar una molécula de doble hebra.

I

Informática:Es el estudio de la aplicación de técnicas computacionales y estadística para el manejode la información. dentro del proyecto Genoma Humano se deben buscar los datos de lasdistintas secuencias y compararlos para encontrar la continuidad y ala vez predecir laestructura y función de la información almacenada en los genes y traducida a proteínas.

Interfase:Periodo durante el ciclo celular cuando el DNA es replicado en el núcleo y es seguido por

la mitosis.

Intrón:Es la secuencia de DNA que se encuentra entre los exones de un gen y que no codificapara proteína. Solo separa los dominios de una proteína en el gen.

In vitro:Significa fuera de un organismo vivo.

K

Kariotipo:Fotomicrografía de los cromosomas individuales arreglados de acuerdo a un formatoestándar mostrando su número, tamaño y forma de cada tipo de cromosoma. Se empleaen mapeo físico de baja resolución para correlacionar anormalidades groseras (trisomia21) con enfermedades características.

Kilobase(kb):Unidad de largo de un fragmento de DNA y corresponde a mil bases.

L

Loci:

(Plural de locus o varios locus) Posición en un cromosoma donde se encuentran variosgenes.

Locus:Posición de un gen u otro marcador en un cromosoma. Lleva implícito el entendimientode que es una secuencia que se expresa.

M

Mapa de Exclusión:Indica en que cromosomas o regiones no se encuentra un determinado gen.




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Mapa de Macrorestricción:Es un mapa que indica el orden y distancia a la cual las enzimas de restricción cortan losfragmentos de DNA o los cromosomas.

Mapeo:Ubicación de los genes u otras secuencias que forman hitos o son marcadoras yse encuentran en el genoma humano u de otro organismo

Mapeo físico:Es un mapa de lugares que pueden ser identificados por sus características locales comolo son sitios de corte por enzimas de restricción, secuencias repetidas en tandem, genes,etc. Su distancia se mide en pares de bases. En humanos el mapa de más bajaresolución es él bandeo de los cromosomas y el de más alta es la secuencia de bases decada cromosoma.

Mapeo por ligamiento o unión:Es un mapa que indica las posiciones relativas de los lugares o regiones donde seencuentran los genes (loci). Se determina la posición observando cuán a menudo seheredan juntas las características otorgadas por el loci (varios genes). La distancia semide en centimorgans (cM).En algunos casos se emplea RFLP para producir mapas por ligamiento. Se estudian ladisposición de un gen o el patrón de cortes por enzimas de restricción en una familiamultigeneracional y se observa si se encuentra asociado a alguna enfermedad. En estecaso se estudia la segregación de un patrón de cortes determinado y una enfermedad entres o más generaciones de una familia. Por lo tanto un cierto patrón de cortescorresponderá a la herencia de una característica o enfermedad. Existe ligamiento si elpatrón determinado y la enfermedad se encuentran en el mismo cromosoma y en el caso

contrario significa que el cromosoma no contiene el locus de la enfermedad.

Mapeo por deleción:Descripción de un cromosoma empleando sitios específicos donde han ocurridomutaciones por deleción empleados como marcadores de áreas específicas.

Mapeo por restricción:Mapa que indica el orden y la distancia entre las secuencias que sirven de sustratos delas enzimas de restricción en el cromosoma o un fragmento de DNA.

Marcador:Lugar físico identificable en un cromosoma que puede ser el sitio de corte de una enzimade restricción o un gene cuyo patrón de herencia pueda ser monitoreado. Los marcadorespueden ser regiones expresadas de los genes o secuencias que no codifiquen, perocuyo patrón de herencia pueda ser reconocido y seguido.

Megabase (Mb):Significa un millón de bases y es equivalente a 1 cM.




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Meiosis:Dos divisiones celulares consecutivas en células diploides destinadas a formar gametos,pero solo una replicación de DNA dando origen a cuatro células haploides.

Minisatélite:Son secuencias de DNA repetidas de 2(AG AG) a 100 (AGAGAGAGAGAG.........AG100)nucleótidos de longitud que se pueden encontrar entre dos sitios de restricción.

Mutación:Cualquier cambio heredable en la secuencia del DNA.

N

Núcleo:

Organelo celular en Eucariontes que contiene el material genético.

O

Oncogene:Un gen que se encuentra asociado con el cáncer. Los Proto-oncogenes se encuentranregulando el crecimiento y la diferenciación celular durante el desarrollo y posteriormentepermanecen silenciosos durante la vida del organismo. Sin embargo, pueden mutar a losdenominados oncogenes y estimular el crecimiento sin control.

P

P1-Cromosoma Artificial Derivado ( PAC):Un vector para clonar fragmentos de DNA de 100 a 300kb con un promedio de 150 kb enE. Coli. Se basa en el bacteriófago con genoma P1.

PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa:Técnica para amplificar fragmentos de DNA que emplea dos cebadores de al menos 20pares de bases con una secuencia conocida. Estos aparean con el fragmento y sirvenpara iniciar la replicación que emplea la enzima resistente al calor Taq –1 DNApolimerasa, ya que se emplean ciclos sucesivos cambios de temperatura para abrir ycerrar la doble hebra apareando con los cebadores para así amplificar el fragmento en

presencia de los nucleótidos y su enzima.

Plásmido:DNA circular extracromosómico que se replica autónomamente en la bacteria. No esesencial para la sobrevivencia de la célula bajo condiciones no selectivas y son capacesde integrar fragmentos de DNA foráneo. Se emplean como vectores de clonación.




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Polimorfismo:Diferencia en la secuencia de DNA entre individuos. Las variaciones genéticas quesuceden en más del 1% de la población se consideran útiles para el análisis genético por

ligación.

Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP):Se emplean para distinguir copias normales de copias mutantes y también se empleancomo marcadores genéticos ya que se hereda un determinado patrón de cortes. Lavariación entre los individuos ocurre en el tamaño de los fragmentos producidos por lasenzimas de restricción. El tamaño polimórfico de los fragmentos se emplea en el mapeofísico y de ligación genética.Existe una base cambiada cada 200 nucleótidos en el DNA de uno a otro individuonormal y estas variaciones crean o destruyen sitios de corte para las endonucleasas derestricción. Distintas personas tendrán distintos patrones de corte aunque sean normales.De esta manera el patrón de cortes puede seguirse en distintas generaciones para

identificar un gen o una región intergénica, así como regiones reguladoras adyacentes eintrones.

Procarionte:Célula u organismo que no posee una membrana que rodee su material genético. Engeneral son las bacterias.

Promotor:Un sitio en el DNA donde se une la RNA polimerasa para iniciar la transcripción.

Proyecto Genoma:Es la investigación y desarrollo de nuevas técnicas para el mapeo y secuenciación detodo el genoma humano.

R

Recombinación:Proceso mediante el cual la progenie cuenta con una combinación distinta de genes quelos otorgados por sus padres. Esto ocurre por crossing-over o entrecruzamiento decromátidas hermanas. Durante la meiosis se rompe el cromosoma de la madre y el padrepara intercambiarse. Este proceso puede resultar en un intercambio de alelos entre

ambos cromosomas.

S

Secuenciar:Determinación del orden de los nucleótidos o la secuencia de bases en una molécula deDNA o RNA o bien el orden de los aminoácidos en una proteína.




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Secuencia Complementaria:Es la secuencia de ácidos nucleicos de una hebra cuyas bases puede aparear con laotra hebra para formar una doble hebra.

Secuencia Conservada:Secuencia de bases o aminoácidos que no ha cambiado a pesar del proceso evolutivo.

Secuencia Genómica:Orden de las bases de un fragmento particular de DNA

Secuencias Repetidas en Tandem (TRS):Copias múltiples de las mismas secuencias de bases en un cromosoma. Se empleancomo marcadores de mapeo físico

Secuencias Repetidas en Tandem de Número Variable (VNTR):Grupos de secuencias ampliamente repetidas de 14 a 100 nucleótidos que constituyenpolimorfismos entre los humanos. Tienen distintos tamaños entre una y otra persona, esdecir, producen alelos y a la vez sirven de marcadores genéticos por encontrarse enalgunos casos en las cercanías de algún gen o en un locus dado. Producen undeterminado patrón de bandas al ser cortadas con endonucleasas de restricción cuandolos sitios de corte se encuentran flanqueándolas.Las bandas se visualizan después de una separación electroforética en un gel, como lahuella molecular del DNA o “Fingerprinting”, ya que es específico para cada individuo, sinimportar de qué tejido venga.

Sitio marcado por su secuencia o Sitio de etiquetaje de la secuencia (STS):Secuencia específica única ubicada en los cromosomas y que sirve de hito o marcadorde la posición de los genes al comparar los mapas físicos de las secuencias de distintaspersonas. Se pueden localizar en genes ya secuenciados y emplearlos de marcadorespor hibridación in situ,para que se empleen como sitios de referencias.Otros marcadores STS son las Etiquetas de secuencias expresadas (EST) obtenidos declonos de DNAc pertenecientes a genes que se expresan demasiado en un tejido (comoejemplo la cadena α de la hemoglobina en eritroblastos). También se pueden localizarpor hibridación in situ.

Otro marcadores STS son los segmentos P transponibles de las cepas salvajesen Drosófilas que al ser transpuestas a las cepas de laboratorio crean sitios de

secuencia específica donde se han insertado

Sitio de Corte por enzima de Restricción:Sitio específico donde actúa la enzima de restricción. Cada persona posee estos sitios,pero se encuentran ubicados en distintas partes del DNA.




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Sitios de corte infrecuentes:Algunas enzimas de restricción cortan los sitios cada 100 pares de bases y otras laspoco frecuentes cada 10.000 pares de bases.

Sonda:Hebra de DNA o RNA marcadas inmunológica o radiactivamente que se emplean paradetectar secuencias complementarias por hibridación.

Southern Blotting:Transferencia por absorción a papel de nitrocelulosa de los fragmentos de DNAseparados por electroforésis para detección de la secuencia específica por medio desondas radiomarcadas.

T

Telómero:Extremo final del cromosoma. Se encuentra involucrado en la replicación y estabilidad delas moléculas de DNA lineales.

Transformación :Proceso por el cual el material genético que lleva una célula se altera por incorporacióndel DNA exógeno.

V

Vector:Molécula de DNA que se origina de un virus, plásmido u algún otro organismo superioren el cual otro fragmento de DNA de tamaño apropiado puede ser integrado sin pérdidade la capacidad de autoreplicación del vector. Los vectores sirven para introducir DNAforáneo en células anfitrionas donde se pueden reproducir o amplificar en grandescantidades. Como ejemplos tenemos a plásmidos, cósmidos y cromosomas artificiales delevaduras. Los vectores son moléculas recombinantes que contienen secuencias dedistintos orígenes.

Vector de Clonación:Molécula de DNA que se origina de un virus, bacteria o célula de un organismo superior

(levadura) dentro de la cual un fragmento de DNA de un determinado tamaño puede serintegrado sin pérdida de la capacidad de auto replicación del vector. Los vectoresintroducen DNA ajeno a las células huéspedes donde puede ser reproducido en grandescantidades. Ejemplo son los plásmidos, cósmidos y los cromosomas artificiales delevadura (YAC).




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Y

YAC. o Cromosoma Artificial de Levadura:Es un vector que se emplea para clonar fragmentos de DNA de hasta 400kb. Seconstruye de la s secuencias teloméricas, centroméricas y de las necesarias para darorigen a la replicación en levaduras.

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REFERENCIAS

Human Biology Web Sitehttp://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html

DNA Forensic Crimehttp://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html

Fingerprinting via Southern Blottinghttp://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html

p capitulo 15 vinc segunda edicion

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