Cuantificacin de xido de cromo en heces y alimentos (Furukawa y Tsukahara, 1966)

El xido de cromo es el marcador ms ampliamente utilizado durante la evaluacin de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El mtodo aqu presentado es una modificacin del propuesto por Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinacin del contenido de xido de cromo en dietas y heces.

Reactivos

Acido ntrico concentrado, gr.

Acido perclrico, g.r.

Materiales y equipo

Espectrofotmetro

Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml

Matraces kjeldahl de 100 ml

Matraces volumtricos de 25 ml

Procedimiento

Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habr eliminado previamente escamas y cualquier otra materia extraa; mantngalos a sequedad. Pese con precisin de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullicin suave por un mnimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de lquido y contine habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de cido ntrico y siga digiriendo. Al trmino la solucin debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar.

Ya fra la solucin, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de cido perclrico. Realizar la adicin dentro de una campana de extraccin y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestin incompleta se puede presentar una reaccin explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y contine la ebullicin hasta que la solucin vire de verde a amarillo limn; apague el digestor y deje enfriar. Ya fro se debe formar un anillo rojizo en el borde del lquido; en caso de no formarse o si el lquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente.

Pase el lquido fro a un matraz volumtrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotmetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultneo a la muestras usando solamente los cidos y agua destilada.

Clculos

a) Calcule la cantidad de xido de cromo (mg) presente en la muestra:

X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4

Donde

Y = absorvancia0.0032 y 0.2089 son constantes

b) Calcule el % de xido de cromo en la muestra:

O.C.% = 100(X/A)

Donde

X = peso del xido de cromoA = peso de la muestraNitrgeno Proteico y No ProteicoEsta tcnica permite reconocer la porcin de nitrgeno de origen proteico y no proteico de los materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales.

Reactivos

Acetato de cobre monohidratado en solucin al 3 % p/v.

Sulfato de aluminio y potasio (2 H2O) en solucin al 10% p/v.

Antiespumante de silicona.

Materiales y Equipo

Matraces kjeldhal de 800 ml.

Embudos buchner de 12 cm de dimetro.

Matraces kitazato.

Papel filtro Whatman no. 541 Schleicher y Schill no. 1505, de 18 cm.

Procedimiento

Pese 2 g de muestra con ms de 25% de protena cruda, lg para rangos de 25 50% de protena y 0.5g para materiales con ms de 50% de protena cruda. Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos grnulos de antiebullente y una o dos gotas del antiespumante.

Caliente a ebullicin durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque). Cuando la muestra est todava caliente agregue 2 ml de la solucin de sulfato de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y caliente a ebullicin, adicione 50 ml de la solucin de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y deje enfriar. Filtre usando vaco. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fra.

Para evaluar el nitrgeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrgeno total de kjeldahl. El nitrgeno no proteico se analiza por medio de la misma tcnica a partir del lquido filtrado. Los resultados respectivos de los slidos y lquidos por medio de kjeldahl ofrecern directamente los datos de nitrgeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.

FIGURA 12Determinacin del contenido de nitrgeno proteico y no proteico en alimentos.

4.6. Determinacin de Protenas por el Mtodo de Lowry.

El mtodo ms preciso para la determinacin de concentraciones proteicas es probablemente el mtodo de hidrlisis cida. La mayor parte de los otros mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de las protenas y no pueden ser obtenidas concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no es la excepcin, pero es sensiblemente constante de protena a protena, lo cual ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una alternativa completamente aceptable con un rigor absoluto en todas las determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren mezclas de protenas o extractos crudos.

Reactivos

Reactivo de formacin compleja. Preprese inmediatamente antes de usarse, mezclando las soluciones A, B y C en proporcin 100:1:1 respectivamente.

Solucin A: 2% (P/V) Na2CO3 en agua destilada.

Solucin B: 1% (P/V) CuSO4.5H2O en agua destilada.

Solucin C: 2% (P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada.

Solucin de Hidrxido de sodio 2N.

Reactivo de Foln (disponible comercialmente): sese en concentracin 21N.

Estndares: Use una solucin madre de protena estndar (por ejem. fraccin V de albmina de suero bovino) conteniendo 4 mg/ml de protena en agua destilada, almacenada a -20C. Prepare los estndares diluyendo la solucin madre con agua destilada tal como se indica en la siguiente tabla:

PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA

Solucin madre (l)01.252.506.2512.5025.0062.50125.0250.0

Agua (l)500499498494488475438475250

Concentracin de protena (g/ml)010205010020050010002000

Procedimiento

1. A 0.1 ml de muestra o sol. estndar, adicinele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a 100C durante 10 min a bao mara hirviendo para hidrolizar la muestra.

2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agrguele 1 ml del reactivo de formacin de complejo recin preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min.

3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Foln, agite con un mezclador de vrtice y deje reposar a temperatura ambiente durante 3060 min (no exceda este tiempo).

4. Lea la absorvancia a 750 nm si la concentracin de la protena fuera menor a 500 g/ml, 550 nm si fuese entre 100 y 2000 g/ml.

5. Trace una curva estndar de absorvancia como funcin de concentracin inicial de protena y sela para determinar el contenido de protena en la muestra.

NOTAa. Si la muestra se encuentra como precipitado, disulvalo en NaOH 2N e hidrolice como en el paso 1. Use alcuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2.

b. Todas las clulas u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA.

c. Mezcle rpidamente en cuanto el reactivo de Foln sea adicionado; esto es importante para obtener una adecuada reproductibilidad.

d. Se requiere un grupo de estndares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.