日泌 尿会 誌, 80巻, 3号, 1989年 349

Ouchterlony法 お よ びWestern blotting法 に よ る

抗 γ-seminoprotein抗 体 お よ び抗prostate-speci丘c

antigen抗 体 の 認 識 抗 原 の 比 較 検 討

社会保険埼玉中央病院腎センター

出口 隆 松井 宏江 江原 英俊 小林 克寿

東京共済病院泌尿器科

斉 藤 功

岐阜大学泌尿器科

篠 田 育男 高橋 義人 栗 山 学

坂 義人 河 田 幸道

ANALYSIS OF ANTIGENS RECOGNIZED BY ANTI-y-SEMINOPROTEIN ANTIBODY AND

ANTI-PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN ANTIBODY BY MEANS OF

OUCHTERLONY METHOD AND WESTERN BLOTTING METHOD

Takashi Deguchi, Hiroe Matsui, Hideo Ehara and Katsutoshi Kobayashi

Kidney Disease Center, Shakaihoken Saitama Chuo Hospital

Isao Saito

Department of Urology, Tokyo Kyosai Hospital

Ikuo Shinoda, Yoshito Takahashi, Manabu Kuriyama, Yoshihito Ban and

Yukimichi Kawada

Department of Urology, Gifu University School of Medicine

Antigens recognized by anti-y-seminoprotein (y-Sm) antibody and anti-prostate-specific antigen

(PA) antibody were analyzed immunologically by Ouchterlony method and Western blotting method. The double immunodiffusion test demonstrated that anti-y-Sm antibody and anti-PA antibody reacted against an identical antigen in seminal fluid or prostate homogenate. In the immunoblotting examination, anti-y-Sm antibody and anti-PA antibody formed a single and identical band, which gave a molecular weight of 33, 000, in seminal fluid and prostate homogenate. This study demonstrated that anti-y-Sm antibody and anti-PA antibody recognized a single and identical antigen in seminal fluid and

prostate homogenate and suggested that an identical material could be measured in sera of patients with prostate cancer by immunoassay systems using anti-y-Sm antibody and anti-PA antibody.

要 旨: Ouchteroly法 とWesternblotting法 を用 いて抗 γ-seminoprotein(γ-Sm)抗 体 と抗prostate-

specic antigen(PA)抗 体 とが認識 す る抗原 の比較検 討 をお こな った. Ouchterlony法 で は, 抗 γ-Sm

抗体 お よび抗PA抗 体 は精 液 あ るい は前立腺 組織 ホ モジ ネー ト中に 同一 の抗原 を認 識 す る ことが示 され

た. Westernblotting法 で は, 抗 γ-Sm抗 体 お よび抗PA抗 体 は, 精 液 お よび前立 腺組 織 ホ モジ ネー ト

中 に分 子量33, 000の 単一 の 抗原 を認 識 す る こ とが示 され た.こ れ らの結 果 よ り抗 γ-Sm抗 体 お よ び抗

PA抗 体 は, 分 子量33, 000の 単 一で 同一 の抗原 を認識 す るこ とが示 され, これ らの抗 体 を用 いた免 疫学 的

な測 定系 で は, 前立 腺癌 患者血 清 中の 同一 の物質 が測定 され て い る可 能性 が あ る もの と思わ れ た.

350

緒 言

近 年, 前 立 腺 性 酸 性 フ ォス フ ァタ ーゼ(PAP)1),

γ-seminoprotein(γ-Sm)2)お よ びprostate-specic

antigen(PA)3)が, 前立 腺癌 の腫 瘍 マ ーカ ー として,

前立 腺 癌 のdetectお よ びmonitorに 有用 で あ る こ と

が示 され て きた.PAPは γ-Smお よびPAと は, 生 化

学 的 に も, 免疫 学 的 に も異 な る物質 であ る4)5)が, γ-Sm

とPAと に つ い て は そ の 類 似 性 が 示 さ れ て い

る6)～11). しか しなが ら, 前 立 腺癌 患者 血 清 中 の γ-Sm

とPAと の相 関性 は必ず し も高 くな く, 両 者 は異 な っ

た腫瘍 マー カー と して評 価 され て ぎて い る12)～14). そ こ

で, わ れわ れ は, 免 疫学 的測 定系 で用 い られ てい る抗

γ-Sm抗 体 お よび抗PA抗 体 が認 識 す る抗 原 をOuch-

terlony法15)お よ びWestern blotting法16)に て 比 較

し, その認識 抗 原 の異 同を検 討 したの で報告 す る.

材料 と方 法

1.材 料

岐阜 大学病 院 泌尿器 科 を不 妊 を主訴 として受診 した

10名 の成人 男子 の精液 を混合 し, その一 部 を蒸 留水 に

て透析 をお こない遠沈 後 その上 清 を試料 と した.良 性

前 立腺肥 大症(BPH)患 者2名 よ り外科 的 に摘 出 した

前 立腺組 織 を個 々 にホ モジ ナイザ ーに て ホモ ジナ イズ

し, 1,000xgで5分 間遠 心 し, そ の上 清 を試料 とした.

2.方 法

Ouchterlony法15}

1%ア ガ ロースを用 い, 直 径4mmのwellをpunch

outし, 各wellに 約10μ1の ウサ ギ抗 γ-Sm抗 体(中 外

製 薬 よ り供 与), ウ サ ギ 抗PA抗 体(P-17: 米 国,

Roswell Park Memorial Institute, Diagnostic Im-

munology Research and Biochemistry Department

よ り供 与), 精 液 お よ び 前 立 腺 組 織 ホ モ ジ ネ ー トを 入

れ, 18時 間incubateし た. 蛋 白 染 色 は0.1%Coomasie

blue溶 液 を 用 い た.

Western blotting法L6)

精 液 お よび 前 立 腺 組 織 ホ モ ジ ネ ー トを メ ル カ プ トエ

タ ノ ー ル で 還 元 し, Laemmli17)の 方 法 に し た が って

SDS-ポ リア ク リル ア マ イ ドゲ ル 電 気 泳 動 を お こ な っ

た あ と, ニ ト ロセ ル ロ ー ス 膜 に 転 写 した.転 写 し た ニ

ト ロセ ル ロ ー ス 膜 を 牛 血 清 ア ル ブ ミ ソ溶 液 に て 非 特 異

的 な蛋 白質 の 付 着 を ブ ロ ッ ク した 後, 抗 γ-Sm抗 体 と

抗PA抗 体 用 と に 切 り離 し, そ れ ぞ れ の ニ ト ロ セ ル

ロ ー ス 膜 上 に ウサ ギ 抗 γ-Sm抗 体 お よ び ウ サ ギ 抗PA

抗 体 を マ ウ ン トし室 温 で30分 間incubateし た.リ ン 酸

緩 衝 食 塩 水(PBS)に て 洗 浄 後, horseradish perox-

idase標 識 ヤ ギ 抗 ウ サ ギIgG抗 体(MBL社)を 同 様 に

マ ウ ン ト し, 室 温 で30分 間incubateし た . PBSに て洗

図2 Western blotting法

1.分 子 量 マ ー カ ー: Phosphorylase b(分 子 量

97, 400), Bovine serum alubumin(66, 200), Oval-

bumin (42, 700), Carbonic anhydrase O31, 000),

Soybean trypsin inhibitor(21, 500), Lysozyme

(14, 400), 2.精 液 一 抗PA抗 体, 3. BPH前 立 腺 組織

ホ モジ ネ ー トー抗PA抗 体, 4.精 液 一抗 γ-Sm抗 体,

5.BPH前 立 腺 組 織 ホ モ ジネ ー トー抗 γ-Sm抗 体

図1 Ouchterlony法

1.精 液, 2.BPH前 立 腺 組 織 ホモ ジ ネ ー ト, A .抗

PA抗 体, B.抗 γ-Sm抗 体

351

浄 し, diaminobenzidineを 含 む 発 色液 に ニ トロセル

ロー ス膜 を浸 漬 し発 色 させた .分 子量 マ ーカー(Bio-

Rad社)も, 同様 に ニ トロセ ル ロース膜 に転 写 し,

Coomasie blue溶 液 にて蛋 白染 色 をお こな った.

結 果

Ouchterlony法

精液 あ るい はBPH前 立腺 組 織 ホ モ ジネ ー トは, そ

れ ぞれ 抗 γ-Sm抗 体 お よび抗PA抗 体 に対 して一本 の

沈 降線 を形 成 し, そ れ ら沈 降線 は融合 し, 抗 γ-Sm抗

体 お よび抗PA抗 体 が, 精液 あるい は前立 腺組 織中 の

同一抗原 を認 識 して い るこ とが示 され た(図1).

Western blotting法

抗 γ-Sm抗 体 お よび抗PA抗 体 は, 精液 とBPH前

立腺 組織 中 に単一 の抗原 を認 識 し, しか も, そ れ らの

抗原 の分 子量 は, 精 液 あ るいは前 立腺 組織 中の いずれ

に おい て も33, 000で あ り, す べて一 致 した(図2).

Ouchterlony法 お よびWestern blotting法 の 検 討

で は, 異 な った2名 のBPH前 立腺 組織 ホ モジ ネ ー ト

を用 いた が, 結 果 に差 は見 られ なか った.

考 察

γ-Smは 原 ら2)によ り精 液 よ り分 離 され, PAは,

Wangら3)に よ りBPH前 立腺 組 織 お よび精 液 よ り分

離 され た.γ-Smお よ びPAは 生 化 学 的 に は 類 似 の

protease活 性 を示し7)8)l0), 免疫学的 に も抗 原性 の類 似

性 が示 唆 されて きた6). また, わ れわ れ は, γ-Smお よ

びPAの 前立 腺組 織 内で の局 在 につ いて, 同様 の局 在

形式 を示 す ことを報告 して きた11). そ して, 1987年 に

Schallerら10)に よ り γ-Smに つ いて, Lundwallら9)に

よ りPAに つい ての ア ミノ酸 配列 が決 定 され, 両者 と

も237個 の ア ミ ノ酸 か ら な る 同 一 のpolypeptideを

main bandと す るこ とが 明 らかに された. 一方, 臨床

的 に は, γ-Smお よびPAは, 抗 γ-Sm抗 体 お よび抗

PA抗 体 を用 いた免 疫学 的 な測 定系 にて測 定 され, 前

立腺癌 の 腫瘍 マ ー カー とし, 前立 腺癌 のdetectお よび

monitorに 有 用 であ る こ とが認 め られ て はい る が, そ

れぞ れ独立 した マー カー として評価 され て きた13)14).

しか も, 前 立腺 癌患 者 の同一血 清 にお け るそ れ らの測

定 系 に よ り得 られた γ-Smお よびPAの 動態 に関 して

は, 両 者 の間 に相関 性を示 してい ない12).し か しなが

ら, 今回 のOuchterlony法 お よびWestern blotting法

に よる検討 で は, 抗 γ一Sm抗 体 お よび抗PA抗 体 は,

精 液 中 お よ び前 立 腺 組 織 ホ モ ジ ネ ー ト中 に 分 子 量

33, 000の 単一 で, しか も同一 の抗 原 を認識 す る こ とが

明 らか に な った. この こ とは, 抗 γ-Sm抗 体 お よび抗

PA抗 体を利用した免疫学的な測定系においては, 前

立腺癌患者の血清中の同一物質を測定している可能性

のあることを意味している. 現在, 血清中のγ-Smお

よびPAの 測定は, それぞれ条件の異なった測定系に

よりおこなわれており, そのためにγ-SmとPAと の

間に, 高い相関性を示さないのか, その理由は明確で

はない.しかしながら, γ-Smお よびPAの 生化学的特

徴および構造が決定され, 両者の類似性が証明され,

さらに, 今回の検討より抗 γ-Sm抗 体および抗PA抗

体が同一抗原を認識することが示 されている. した

がって, 今後は抗 γ-Sm抗 体および抗PA抗 体を用い

た同一条件下の測定系で, 同一患者血清中の γ-Smお

よびPAの 測定をおこない, 臨床面でのその両者の相

関性を確認するとともに, さらに, γ-Smお よびPAの

それぞれの前立腺癌の腫瘍マーカーとしての独立性に

ついても再検討を要するものと思われる.

なお, 本研究の一部は, 財団法人上原記念生命科学財団の

助成によった.

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(1988年11月8日 受 理)