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BIOLOGÍA EN AGRONOMÍA
Volumen 4, No. 1 Marzo de 2014
ISSN 1853-5216
Universidad Nacional de Catamarca
Secretaría de Ciencia y Tecnología ‐Editorial Científica Universitaria
ISSN: 1853-5216
RIZOBIOS NATIVOS QUE NODULAN ALFALFA (Medicago sativa L.) Y
GARBANZO (Cicer arietinum L.) EN CATAMARCA, ARGENTINA
Delgado, Eber Alexander; Contreras, Sergio Leandro; Almaraz, Sabrina Cristina;
Esnarriaga, Dayana Naimid; Toledo, Daniel Matías; Di Barbaro, María Gabriela.
Cátedra de Microbiología Agrícola. Departamento. Biología. Facultad de Ciencias Agrarias.
Universidad Nacional de Catamarca. Avda. Belgrano y Maestro Quiroga. (4700). Catamarca
Argentina. E-mail: [email protected]
Recibido: 12/12/2012 Aceptado: 10/11/2013
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RESUMEN
Las cepas microbianas nativas por su adaptabilidad a las condiciones
ambientales locales son potencialmente más eficientes en la interacción con las
plantas que las cepas foráneas procedentes de formulaciones comerciales,
particularmente las cepas bacterianas nativas o naturalizadas que nodulan plantas
leguminosas son frente a las comerciales más eficientes y efectivas fijadoras del
nitrógeno atmósférico y se las consideran como más promisorias en su selección
debido a la adaptación ecológica local, por lo que el aislamiento y estudio permanente
es de gran importancia. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar
fenotípicamente las bacterias (rizobios) que nodulan raíces de alfalfa (Medicago sativa
L.) y de garbanzo (Cicer arietinum L.). Se realizó la identificación de estructuras
nodulares y el aislamiento de rizobios, desde nódulos previamente esterilizados
superficialmente, por el método de agotamiento en superficie con la técnica de
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siembra en estrías en superficie en medio YEMA e incubadas en estufa a 27 °C. Se
efectuó el examen microscópico de bacteroides observándose diferencias
morfológicas y de tamaño. Se aislaron diez cepas de características coloniales y
fenotípicas diferentes (5 cepas de alfalfa y 5 cepas de garbanzo). Estos resultados nos
permiten establecer que existe una diversidad de rizobios nativos con capacidad de
nodular alfalfa y garbanzo.
PALABRAS CLAVES: Medicago sativa; Cicer arietinum; Fijación del Nitrógeno
Atmósférico; Rizobios.
NATIVE RHIZOBIA NODULATING ALFALFA (Medicago sativa L.) AND
CHICKPEA (Cicer arietinum L.) CATAMARCA, ARGENTINA
SUMMARY
Native microbial strains for their adaptability to local environmental conditions are
potentially more efficient interaction with plants that foreign strains from commercial
formulations, particularly native or naturalized bacterial strains that nodulate
leguminous plants are facing the most efficient commercial and effective fixing of
atmospheric nitrogen and are considered most promising in your selection because of
local ecological adaptation, so that isolation and continuous study is of great
importance. The aim of this work was to isolate and characterize phenotypically
bacteria (rhizobia) that nodulate roots of alfalfa (Medicago sativa L.) and chickpea
(Cicer arietinum L.). Nodular structures identification and isolation of rhizobia was
performed, from previously sterilized nodules superficially, by the method of surface
depletion technique streaking amid YEMA surface and incubated in an oven at 27 °C.
Microscopic examination of morphological and bacteroides observed size differences
was performed. Colonial ten strains of different phenotypic characteristics and (5
strains of alfalfa and chickpea 5 strains) were isolated. These results allow us to
establish that there is a diversity of native rhizobia capable of nodular alfalfa and
chickpea.
KEY WORDS: Medicago sativa; Cicer arietinum; Atmospheric Nitrogen Fixation;
Rhizobia.
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INTRODUCCIÓN
Uno de los atributos más importantes de las leguminosas es su propiedad de fijar
nitrógeno atmosférico cuando vive en simbiosis con bacterias específicas. Las
leguminosas son un grupo amplio, que incluye plantas de importancia económica
como la soja, el trébol, la alfalfa, las judías y los guisantes, se caracterizan por tener
las semillas dentro de una vaina. Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,
Mesorhizobium y Azorhizobium son bacilos móviles Gram negativos. La infección de
las raíces de una leguminosa con la especie apropiada de algunos de estos géneros
bacterianos conduce a la formación de nódulos radicales, que son capaces de
convertir el nitrógeno gaseoso en nitrógeno combinado, en el proceso llamado fijación
del nitrógeno atmosférico. Este proceso ha alcanzado una importancia tan grande y
básica para la construcción de material vegetal como la respiración y la fotosíntesis
(Carrillo, 2003; Frioni, 2006; Frioni, 2011).
La importancia de este proceso queda demostrada en base a la evaluación
actual de la FAO donde adjudican a la fijación simbiótica anual en el mundo un valor
de depósito al suelo de 10 veces la producción anual de abonos y fertilizantes
comerciales. Éste fenómeno ha promovido las prácticas de inoculación artificial
(Cardoso et al; 1992).
Como las cepas bacterianas nativas o naturalizadas que nodulan plantas
leguminosas son frente a las comerciales más eficientes y efectivas fijadoras del
nitrógeno atmosférico y se las consideran más promisorias en su selección debido a la
adaptación ecológica local, por lo que el aislamiento y estudio permanente es de gran
importancia (Gili et al., 1997). Por lo que el objetivo de este trabajo fue aislar,
identificar y evaluar la diversidad de rizobios nativos o naturalizados que nodulan
cultivos de leguminosas.
MATERIAL Y MÉTODO
Se trabajaron con plantas de alfalfa (Medicago sativa L.) y de garbanzo (Cicer
arietinum L.) cultivadas de fincas localizadas en los Distritos “El Hueco” y “Pomancillo
Oeste” respectivamente, departamento Fray Mamerto Esquiú, provincia de Catamarca,
lugares que presentan como tipo de suelo dominante Torriortent ústico.
Estos cultivos se desarrollaron sin que se realicen prácticas de inoculación a sus
semillas con formulaciones comerciales de inoculantes en el momento de la siembra.
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De un lote de 23.671,50 m2 de superficie, se extrajeron con pala 20 plantas de
alfalfa de semanas de edad; y se extrajeron 10 plantas de garbanzo, en fase
fenológica de llenado de vainas, de un lote de 2.500 m2 aproximadamente. Se
acondicionaron y se trasladaron al laboratorio donde se realizó el reconocimiento de la
presencia de nódulos sobre las raíces y raicillas de las plantas, que previamente
fueron enérgicamente lavadas.
Se observó morfología nodular y se extrajeron los nódulos, con los cuales se
realizaron observaciones al microscopio, coloraciones bacterianas (la técnica de
tinción diferencial de Gram- Nicolle) y aislamientos.
Para la realización de las observaciones al microscopio de los bacteroides se
procedió a aplastar nódulos entre dos portaobjetos y con el líquido nodular obtenido se
realizó un frotis y posteriormente coloraciones simples y de Gram Nicolle.
El aislamiento de rizobios se realizó a partir de nódulos y se utilizó para su
cultivo el medio YEMA. Los aislamientos se realizaron según la técnica descripta en la
guía de trabajos prácticos de la asignatura Microbiología agrícola (Pernasetti y Di
Barbaro, 2010).
Obtenidos los cultivos puros se realizaron coloraciones y observaciones
microscópicas y para su conservación se efectuaron repiques en tubos de vidrio con
tapa a rosca que contenían medio de cultivo YEMA estéril en pico de flauta y con la
rotulación correspondiente.
Para la caracterización, autenticación e identificación de los aislamientos se
procedió a realizar pruebas de infección en alfalfa y en garbanzo; y pruebas
bioquímicas.
Autenticación de los cultivos aislados
Para ser autenticadas y caracterizar las cepas obtenidas se procedió a realizar
un bioensayo en cámara de cultivo, en el cual se inocularon semillas de alfalfa y de
garbanzo y se sembraron en contenedores con arena estéril y se cultivaron hasta la
aparición de nódulos en las raíces de las plántulas. En el bioensayo se realizaron los
siguientes tratamientos:
1. Testigo de semillas lavadas.
2. Testigo de semillas con curasemilla.
3. Semillas lavadas e inoculadas.
4. Semillas con curasemilla e inoculadas.
Cuatro tratamientos por cepa, dos repeticiones con 10 semillas cada uno y para
cada leguminosa.
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Las observaciones se efectuaron cada 7 días, realizándose la extracción de las
plántulas y registrando la presencia de nódulos en las mismas.
Pruebas bioquímicas
Se efectuaron las siguientes pruebas bioquímicas:
- Prueba del Citrato la cual consistió en repicar las cepas puras obtenidas en
medio Citrato de Simmonds cuya única fuente carbonada es el citrato.
* Prueba positiva (+): formación de colonias de rizobios.
* Prueba negativa (-): ausencia de colonias.
- Prueba del TSI (o Agar hierro triple azúcar) se basó en la siembra de cada
cepa en la superficie inclinada y en profundidad del tubo de ensayo con medio TSI.
Los siguientes colores representarían las siguientes reacciones.
* Rojo: reacción negativa. Lactosa negativa.
* Amarillo-Rojo: reacción sesgada. Ácido (amarillo) - alcalino (rojo).
* Ennegrecimiento: Reacción de H2S. Formación de sulfuro de hidrógeno por la
reacción del H2S con el ión ferroso en el medio (en ausencia de reacción extrema
ácida).
* Amarillo: reacciones extremas. Fermentación de lactosa. Ruptura del agar en el
fondo (gas) y formación de ácido en la parte superior (amarillo).
Para todo este trabajo se requirió de la realización periódica de diferentes
actividades tales como:
Preparación y acondicionamiento del material para aislamiento
De acuerdo a los requerimientos nutricionales de los rizobios se utiliza un medio
de cultivo específico y diferencial YEMA (Manita 10 g; PO4K2H 0.5 g; SO4 Mg 0.2 g; Na
Cl 0.1 g; Cl3 Fe (sol. acuosa 10%) 2 gotas; SO4 Mn (sol. acuosa 10%) 2 gotas;
Extracto de Levadura 1 g; Rojo Congo (sol. acuosa 1/400) 10 ml; Agar agar 15 g y
Agua destilada 1000 ml). El cuál se preparó y esterilizó por el método de vapor
saturado a presión en autoclave. También se esterilizaron cajas de Petri, pipetas y
agua.
Siembra y aislamiento de rizobios desde nódulos
Los aislamientos se efectuaron en cámara de flujo laminar a partir de nódulos
(adheridos a una pequeña porción de raíz) previamente lavados con bicloruro de
mercurio 0,1 % durante 1 minuto y se enjuagó varias veces (6) con agua destilada. Se
aisló por el método de agotamiento en superficie con la técnica de siembra en estrías.
Las cajas de Petri se llevaron a estufa para su incubación (27 °C). Se repicaron las
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colonias típicas de rizobios en cajas de Petri con medio YEMA hasta obtener cultivos
puros.
Purificación y observación microscópica
Las cepas aisladas fueron coloreadas según la técnica de tinción diferencial de
Gram Nicolle como prueba de pureza para descartar la presencia de posibles
contaminantes y verificar su pertenencia a la familia de las Rizhobiaceae.
Colección o registro en cepario
Los cultivos puros obtenidos fueron almacenados en tubos con medio YEMA en
agar inclinado (pico de flauta) los cuales se llevaron a incubación a la estufa (27 °C),
luego de desarrolladas las colonias se las llevó bajo refrigeración (2 °C). Por cada
cepa se realizaron tres réplicas (por triplicado).
Registros de cultivos
Identificados los géneros que nodularon al cultivo de alfalfa (Medicago sativa) y
garbanzo (Cicer arietinum) se los registró y denominó con una sigla.
RESULTADOS
Identificación de la estructura nodular y examen microscópico del bacteroide
Alfalfa
Del total de las muestras extraídas el 100% de las plantas presentaban nódulos
en sus raíces. Los nódulos tenían forma de manos, dedos, corazones y tréboles, eran
de color rosado y estaban generalmente ubicados en la raíz principal, indicando una
alta especificidad y eficiencia. En la observación de los frotis realizados con el líquido
nódular al microscopio, los bacteroides presentan formas típicas de X e Y, y además
respondían a la coloración del tipo Gram negativa (G-) y en forma discontinua (tinción
metacromática).
FOTOS 1, 2 y 3: Raíces noduladas, nódulo en forma de corazón y bacteroides de
nódulos de alfalfa de tres semanas de edad.
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FOTOS 4, 5 y 6: Raíces noduladas, nódulo en forma de dedito y bacteroides de
nódulos de alfalfa de tres semanas de edad.
Garbanzo
Las plantas presentaban abundantes nódulos de gran tamaño tanto en la raíz
principal como en las raíces secundarias. Morfológicamente presentaban forma
coraloide y una disposición en racimos, que al cortarlos transversalmente se observó
una coloración rojo intenso lo que presume una elevada actividad fijadora. En la
observación de los nódulos al microscopio los bacteroides presentan formas
redondeadas y, en comparación con la alfalfa son más pequeños. Además, responden
a la coloración del tipo Gram negativa (G -) y en forma homogénea (tinción
monocromática).
FOTOS 7, 8, 9 y 10: Raíces noduladas, nódulo en forma coraloide, corte transversal
de nódulo y bacteroides de nódulos de garbanzo.
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Siembra y aislamiento de rizobios de alfalfa y garbanzo desde nódulos:
La velocidad de crecimiento fue moderado ya que a las 72 horas de incubación a
27 ºC se observó la presencia de colonias rosada, blanquecinas algunas translúcidas y
otras opacas de consistencia gomosa relativamente grandes. También se
desarrollaron colonias de color rosa intenso que correspondían a microorganismos
contaminantes por lo que se realizaron repiques para obtener cepas puras se
obtuvieron 5 cepas de alfalfa y 5 de garbanzo.
FOTOS 11, 12, 13, 14, 15, 16 y 17: Características coloniales de aislamientos de
rizobios de alfalfa en medio de cultivo YEMA.
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FOTOS 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24: Características coloniales de aislamientos de
rizobios de garbanzo en medio de cultivo YEMA.
Purificación y observación microscópica:
La coloración de Gram Nicolle de todos los aislamientos realizados resultaron
ser Gram Negativas (G -) corroborando de esta manera una de las características
principales y su pertenencia a la familia de las Rizhobiaceae. Morfológicamente las
bacterias cultivadas en medio YEMA presentaban formas bacilares propias de su
estado en vida libre.
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FOTOS 25 y 26: Bacilos rosados de alfalfa (izquierda) y de garbanzo (derecha)
Autenticación de los cultivos aislados de alfalfa.
Con el fin de comprobar la capacidad de inducir la formación de nódulos en la
raíz de la planta hospedera, las 5 cepas de obtenidas de nódulos de alfalfa se las
utilizó para inocular semillas de alfalfa, las cuales estaban tratadas con curasemillas
por lo cual se procedió a lavar un lote. En estado de plántulas se pudo observar la
presencia de nódulos lo cual indica que los aislamientos obtenidos son efectivamente
rizobios (Cuadro 1).
CUADRO 1: Nodulación en plántulas de alfalfa inoculadas con cepas nativas.
EMERGENCIA (%) PRESENCIA DE NÓDULOS
TRATAMIENTOS LAVADAS NO LAVADAS LAVADAS NO LAVADAS
Testigo 80 75 1 2
C1 80 70 2 -
C2 40 35 - 1
C3 40 40 3 1
C4 50 70 1 6
C5 60 100 1 4
Se regaron las plántulas cada 2 días incorporando aproximadamente 60 ml de
agua. Hubo una mortandad del 10 al 40 % en casi todos los tratamientos, exceptuando
al correspondiente a la cepa 5 (C5).
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Se presentó nodulación tardía y dudosa en los tratamientos testigos (sin
inocular), se presume que ocurrió por contaminación con material de los otros
tratamientos.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento para el garbanzo (Cicer arietinum L.).
FOTOS 27, 28, 29 y 30: Conformación de cepario de rizobios.
Pruebas bioquímicas
Los resultados de las pruebas bioquímicas permiten identificar los aislamientos
obtenidos.
- Prueba del Citrato: Luego de las 72 horas de incubación de las siembras de todas
las cepas en medio Citrato de Simmonds, los resultados fueron para cada una de las
cepas negativo (-) definido por la ausencia de colonias, dada por la incapacidad de
crecer a partir de la única fuente carbonada de medio de cultivo Citrato de Simmonds
(el citrato) (Foto 21).
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FOTO 31: Prueba del citrato.
Prueba del TSI (o Agar hierro triple azúcar)
Todas las cepas resultaron negativas para el hierro, en ninguno de los tubos se
presentó ennegrecimiento, lo que indica que no hubo formación de sulfuro de
hidrógeno por la reacción del H2S con el ión ferroso en el medio.
En dos cepas resultaron negativas para lactosa por la presencia de color rojo.
Mientras que en un aislamiento resultó una reacción sesgada.
Los tres aislamientos restantes manifestaron en los tubos color amarillo y
presencia de gas, indicándonos que la reacción fue glucosa y lactosa positiva.
FOTOS 32, 33 y 34: Prueba del TSI o Agar hierro triple azúcar.
CUADRO 2: Posibles géneros de los aislados de rizobios de nódulos de alfalfa y de
garbanzo, determinados por pruebas bioquímicas y hospedero nodulante.
Prueba Bioquímica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Utilización de citratos - - - - - - - - - - TSI - - sesgada + + + + + + +
Reacción con Fe - - - - - - - - - - Crecimiento en YEMA Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido Lento Lento Lento Lento Lento
Hospedero Alfalfa
Alfalfa
Alfalfa
Alfalfa
Alfalfa
Garb.
Garb.
Garb.
Garb.
Garb.
Posible género A A S R R M M M M M +: Respuesta positiva -: Respuesta negativa A: Allorhizobium M: Mesorhizobium R: Rhizobium S: Sinorhizobium
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Los resultados permitieron identificar los géneros de los aislamientos. Los cinco
aislamientos obtenidos de nódulos de alfalfa corresponden a tres géneros diferentes
de rizobios: Sinorhizobium, Rhizobium, Allorhizobium. Los cinco aislamientos de
nódulos de garbanzo pertenecen al género Mesorhizobium (Cuadro 2).
Registro de cultivos
Identificados los géneros que nodularon a los cultivos de alfalfa (Medicago
sativa) y de garbanzo (Cicer arietinum) se los registró y denominó con una sigla.
Ficha de Alfalfa
* Nominación de las cepas: MS CS; MS N.E; MS SA; MS ED y MS MT.
* Origen: coleccionista.
* Huésped: Medicago sativa.
* Género del rizobio nodulante: Sinorhizobium, Rhizobium, Allorhizobium.
* Lugar: Distrito El Hueco. Dpto. Fray Mamerto Esquiú. Provincia de Catamarca.
Ficha de Garbanzo
* Nominación de las cepas: GZO CS; GZO N.E; GZO SA; GZO ED Y GZO MT.
* Origen: coleccionista.
* Huésped: Cicer arietinum L.
* Género del rizobio nodulante: Mesorhizobium.
* Lugar: Finca Los Pozos. Atención: Sergio Rodríguez.
CONCLUSIÓN
Se logró cumplir con los objetivos propuestos. Se aislaron diez cepas de
características coloniales y fenotípicas diferentes de rizobios de alfalfa (Medicago
sativa L.) y de garbanzo (Cicer arietinum L.). Estos resultados nos permiten establecer
que existe una diversidad de rizobios nativos con capacidad de nodular alfalfa y
garbanzo.
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BIBLIOGRAFÍA
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