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Obtención de vacunas comestibles, problemática de su utilización y
posibles soluciones. Revisión bibliográfica actual.
Trabajo de Fin de Máster
Carla Rebeca Moreno Valarezo Tutora: Margarita Cacho Máster en Agrobiotecnología Julio 2013
Agradecimiento Al Gobierno de Ecuador y a la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación como entidad responsable del proceso de becas Convocatoria 2012-‐2013, a mi tutora Margarita, a la Universidad de Salamanca y al personal docente del Máster en Agrobiotecnología. A mi madre, mi tía y mi hermano que han hecho que este sueño sea una realidad y al infinito apoyo de mi familia, amigas y amigos (los que he encontrado aquí y los que me esperan allá). A la mágica experiencia de aprender y … crecer A Salamanca, por su color.
INDICE
INTRODUCCION 1
DESARROLLO 3
HISTORIA DE LAS VACUNAS 3
TIPOS DE VACUNAS 5 VACUNAS CONVENCIONALES 5 Vacunas atenuadas 5 Vacunas inactivadas 5
NUEVAS VACUNAS 5 Vacunas vivas recombinantes 5 Vacunas basadas en virus vivos atenuados por eliminación de genes implicados en virulencia. 5 Vacunas basadas en virus vivos portadores de genes heterólogos 6
Vacunas subunidad recombinantes 6 Vacunas basadas en proteínas recombinantes 6 Vacunas basadas en VLPs 6
Vacunas ADN 6 Vacunas en plantas 6
PLANTAS TRANSGÉNICAS EN LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS 8 SELECCIÓN DEL MATERIAL 8 SELECCIÓN DEL PROMOTOR 10 ROL DE LOS ADYUVANTES 11 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN 12 SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO EN PLANTAS 13 Expresión estable en plantas transgénicas 14 Subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, (LT-‐B) y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) 17 Antígeno de superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B 19
Expresión vía cloroplastos 20 Transformación transitoria de expresión rápida 26 Proteína de la cápside del virus de Norwalk (NVCP) 28
Cultivos de células vegetales 28 Expresión en semillas 29 Otras vacunas 32
BENEFICIOS Y DESVENTAJAS 32 BIOSEGURIDAD/ ACEPTACIÓN DEL PÚBLICO 33 RENTABILIDAD ECONÓMICA 34 ENSAYOS CLÍNICOS 35
CONCLUSIONES 37
BIBLIOGRAFÍA 39
INDICE DE TABLAS E ILUSTRACIONES TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LOS DIFERENTES CULTIVOS UTILIZADOS PARA EXPRESIÓN
DE ANTÍGENOS ........................................................................................................................................................ 8 TABLA 2. CONSTRUCCIONES GÉNICAS, SEÑALES DE EXPRESIÓN, DISEÑO DEL PÉPTIDO, PARA
LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS EN PLANTAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS. ................. 11 TABLA 3. TRANSFORMACIÓN ESTABLE VS. EXPRESIÓN TRANSITORIA. .............................................. 15 TABLA 4. EXPRESIÓN ESTABLE DE ANTÍGENOS EN PLANTAS .................................................................. 21
ILUSTRACIÓN 1. ESTRATEGIAS DE PRODUCCIÓN DE UN ANTÍGENO EXPRESADO EN TEJIDOS DE PLANTAS COMO CANDIDATO PARA UNA VACUNA. ..................................................................... 14
INTRODUCCION La inmunoprofilaxis, definida como la prevención de una enfermedad a través de la
inmunidad conferida por la administración de sueros o vacunas, es una de las
intervenciones medicas más rentables, permite el control y la posible erradicación de
enfermedades epidémicas a nivel mundial y con especial énfasis en los países en vías
de desarrollo. La vacunación constituye uno de los mayores éxitos de la medicina
moderna. A las vacunas se les debe la eliminación y control de plagas importantes
para la humanidad como la viruela, poliomielitis, cólera o sarampión, permitiendo así
un ascenso en la curva demográfica a finales del siglo XIX (Carrasco y Almendral
2006). Sin embargo en la actualidad existen ciertos factores que podrían interferir en
la aplicación de programas de inmunización, como por ejemplo la falta de una
infraestructura adecuada para la atención sanitaria, personal capacitado, coste de
algunas vacunas. En base a este panorama, se requieren cambios en la forma de
producción, distribución y administración de las vacunas para hacerlas ampliamente
disponibles. Estos objetivos condujeron a los investigadores a la idea de producir
vacunas comestibles mediante la ingeniería genética (Mor, Gómez-Lim et al. 1998).
La evolución de la genética de plantas ha llevado a cambiar el concepto de
producción de alimentos a producción de plantas como biorreactores para la
obtención de proteínas terapéuticas recombinantes. Las plantas transgénicas que
expresan proteínas recombinantes son vehículos económicos y convenientes para la
producción de antígenos protectores (Rigano, Manna et al. 2009). Además aportan
una tecnología viable para la producción de proteínas a nivel industrial; entre sus
ventajas se encuentran: el bajo coste de producción, la posibilidad de un
almacenamiento estable en semillas (Hood 2002), poco riesgo de contaminación con
patógenos de seres humanos (Daniell 2006). Varias técnicas usadas en biotecnología
vegetal como el fitomejoramiento moderno, propagación clonal, hibridación
somática, cultivos de suspensión de protoplastos, cultivos de raíces y transformación
genética juegan un rol importante en el establecimiento del uso de plantas como
“organismos sustitutos de producción” (Tiwari, Verma et al. 2009).
Según Han, Su et al. (2006) el ejemplo mas notable, es la producción de vacunas
comestibles a través de plantas transgénicas; la planta es utilizada como biorreactor
para expresar el antígeno específico y producir vacunas con capacidad de prevenir
enfermedades.
El uso de tecnología recombinante en el campo de la industria de las vacunas ha
revolucionado la forma en la que los antígenos son generados y ha provisto de
medios más seguros y efectivos para proteger a los organismos contra bacterias,
virus y parásitos. En la actualidad, las plantas transgénicas son reconocidas como
fuentes viables para el desarrollo de vacunas orales, debido a que se ha demostrado
que los antígenos procesados en plantas provocan respuesta inmune al ser probados
en humanos y animales (Lamphear, Streatfield et al. 2002), (Moravec, Schmidt et al.
2007). Una vacuna debe ser lo suficientemente potente para limitar su dosis a un
tamaño practico y asequible. Además debe permanecer potente, eficaz y segura
durante el transporte y el almacenamiento (Lamphear, Streatfield et al. 2002).
El campo de administración de las vacunas orales incluye también el de los animales,
se cree que éstas serán un medio efectivo de inmunización para mitigar
enfermedades epizoóticas que se puedan contagiar a otros animales o humanos.
(Moravec, Schmidt et al. 2007).
El panorama general de vacunación indica que en la actualidad se inmuniza a más de
100 millones de niños menores de un año con las tres dosis necesarias de vacuna
triple (difteria, tétanos, tos ferina o DTP). Sin embargo, según cifras de la OMS y
UNICEF quedan todavía sin vacunar 24 millones de niños, en el 2007 más del 10%
de niños menores de un año de países en vía de desarrollo no recibieron ninguna
dosis de DTP, frente a un 2% en países industrializados.
La mayor parte de los niños no inmunizados viven en los países más pobres, donde
su situación se combina a numerosos factores que acaban con la esperanza de
vacunación: servicios de salud con infraestructura frágil, topografía difícil, conflictos
armados, entre otros problemas (UNICEF,OMS). Razón por la cual la investigación
en el campo de las vacunas orales producidas por plantas es una forma efectiva de
mitigar este problema.
El presente trabajo tiene como objetivo realizar una recopilación bibliográfica sobre
la obtención de vacunas comestibles, evolución histórica, beneficios y desventajas de
su utilización.
DESARROLLO
HISTORIA DE LAS VACUNAS
La vacunología es una ciencia multidisciplinaria que involucra aspectos básicos y
continuos avances con la finalidad de lograr productos prácticos y que puedan salir a
la venta. Considerando el proceso de evolución en el campo científico de fabricación
de vacunas, se puede decir que la era moderna ha sido la era más productiva de
todas. La ciencia de la vacunología y la inmunología fueron descubiertas hace apenas
dos siglos por los estudios científicos de Edward Jenner sobre la prevención de la
viruela mediante la inoculación del virus de la viruela de las vacas en 1796
(Hilleman 2000) o también conocida como variolación. Jenner observaba que las
personas que habían superado la viruela no la volvían a padecer y que las lecheras
que contraían una enfermedad llamada vacuna, que consistía en una manifestación
mucho más débil de la viruela humana, nunca llegaban a enfermar de viruela. Con el
fin de probar sus observaciones Jenner transfirió material de una lesión de vacuna -
pústula en las ubres de vacas- al brazo de un niño. Posteriormente el niño fue
inoculado con pus de viruela humana seis semanas más tarde, el niño no enfermó ya
que estaba inmunizado y protegido (Carrasco y Almendral 2006).
Ya en China se practicaba la variolación desde la Edad Media (Quer 2003) con
métodos muy parecidos a los de Jenner. Durante el siglo XVIII esta pasó a ser una
practica muy común tanto en Europa como en Norte América. A Jenner, quien es
considerado el padre histórico de la inmunología y de la vacunación, le siguen en el
siglo XIX los estudios realizados por Louis Pasteur, Robert Koch, Emil von Behring
y Paul Ehrlich. Louis Pasteur demostró que el virus de la rabia se podía atenuar in
vivo por repetidos pases intracerebrales en conejos. La estirpe viral obtenida por
Pasteur ha sido el prototipo para la mayoría de preparados vacunales contra el virus
de la rabia (Carrasco y Almendral 2006). Robert Koch realizó un gran aporte por sus
estudios en tuberculosis y los llamados Postulados de Koch que establecen las
condiciones para que un organismo sea considerado la causa de la enfermedad. Emil
von Behringm recibió el primer Premio Nobel en Medicina por sus estudios sobre
anticuerpos e inmunoterapia. Paul Ehrlich hizo aportaciones importantes sobre la
inmunidad de cadena lateral, quimioterapia y se le atribuye también el desarrollo del
primer medicamento sintético para la sífilis, Salvarsan. El siguiente avance se dio en
los años 30 con la adaptación de la estirpe 17D del virus de la fiebre amarilla (YFV)
a cultivos in vitro en explantes de tejidos y su atenuación por 160 pases en embrión
de pollo (Hilleman 2000), (Carrasco y Almendral 2006). Esta estirpe constituye en la
actualidad la base de las vacunas y se considera una de las primeras demostraciones
de que los virus se podían cultivar y producir in vitro. En 1940 se da otro paso
importante por J.F. Enders y su equipo, la demostración de que el virus de la polio
(PV) se podía multiplicar en tejidos no nerviosos y que en cultivos celulares se
podían producir virus susceptibles de ser inactivados (vacuna Salk) o atenuados por
repetidos pases (vacuna Sabin) (Carrasco y Almendral 2006).
En la era moderna surgen la vacunas contra (bacterias) el neumococo, meningococo
y la Haemophilus influenzae. Posteriormente los esfuerzos se dirigen hacia la
preparación de vacunas vivas contra las enfermedades pediátricas: vacuna contra el
sarampión, vacunas contra las paperas, vacuna contra la rubeola y posteriormente el
surgimiento de la vacuna triple vírica (SPR), la misma que es considerada como la
bandera insignia de la inmunización pediátrica y continúa administrándose con gran
éxito. Otro esfuerzo desarrollado es la vacuna contra la varicela. En 1971, Saul
Krugman y colaboradores demostraron que el antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B (HBV) presente en altas concentraciones en el plasma humano de
portadores asintomáticos, confería inmunidad frente al virus. La vacuna contra la
hepatitis B está dentro del programa de la OMS como campaña de vacunación
rutinaria para inmunizar a bebés en más de 100 países (Hilleman 2000).
La primera demostración de la expresión de un antígeno como vacuna dentro de una
planta se produjo en 1990. Curtiss y Cardineau expresaron el antígeno de la
superficie de la proteína A (SpaA) de Streptococcus mutans en tabaco. Esta
investigación fue seguida por la expresión en plantas del antígeno de superficie
(HBsAg) de la hepatitis B, la enterotoxina termolábil de E. coli responsable de la
diarrea, la proteína de la cápside del virus de Norwalk y la glicoproteína del virus de
la rabia. Los antígenos producidos en estas plantas indujeron anticuerpos IgA e IgG
cuando fueron probadas en ratones y humanos (Sala, Manuela Rigano et al. 2003).
TIPOS DE VACUNAS
VACUNAS CONVENCIONALES
Obtenidas a partir de los virus originales y sin manipulación genética. Pueden ser:
vacunas inactivadas y vacunas atenuadas.
Vacunas atenuadas
Compuestas por virus vivos atenuados de manera natural o en un laboratorio vía
cultivo in vitro bajo condiciones controladas. Se realiza una selección de mutantes
con virulencia reducida, lo que favorece una replicación mas lenta en el huésped,
provocando una reproducción de la infección original pero sin causar síntomas
clínicos.
Vacunas inactivadas
Están compuestas por virus inactivados químicamente (tras el tratamiento con
formaldehído, B-propiolactona, bromoetilenimina –BEI-, etc.) o por tratamiento
físico (radiación, calor, etc.). Se las considera más fáciles de preparar, más estables y
más seguras.
NUEVAS VACUNAS
Se distinguen vacunas vivas recombinantes (equivalentes a las atenuadas) y vacunas
subunidad recombinantes (equivalentes a las inactivadas). Se encuentran también las
vacunas ADN, vacunas peptídicas y vacunas en plantas.
Vacunas vivas recombinantes
Vacunas basadas en virus vivos atenuados por eliminación de genes implicados
en virulencia.
Deleción mediante el uso de ingeniería genética de los genes implicados en la
virulencia de un virus en particular.
Vacunas basadas en virus vivos portadores de genes heterólogos
Consiste en la introducción de un gen que codifique una proteína viral inmunogénica
implicada en neutralización, en el genoma de otro virus. El virus que expresa un gen
foráneo se llama virus recombinante.
Vacunas subunidad recombinantes
Que agrupan a:
Vacunas basadas en proteínas recombinantes
No han tenido mucho éxito ya que la administración aislada de proteínas individuales
no ha resultado eficaz debido a que no es capaz de reconstruir todos los epítopos de
interés para provocar una inmunogenicidad efectiva.
Vacunas basadas en VLPs
De Virus Like Particles o pseudopartículas se obtienen por la capacidad de las
proteínas virales para autoensamblarse en estructuras multiméricas que son
morfológica y estructuralmente idénticas a la partícula viral original. Son muy
seguras debido a que no contienen ADN o ARN de los virus originales.
Vacunas ADN
Inmunización con ADN plasmídico conteniendo genes de antígenos inductores de
protección. Dentro de la célula huésped, el gen de interés se expresa desde el ADN
plasmídico y si logra producir grandes cantidades de proteína, inducirá respuesta
inmune.
Vacunas en plantas
Mediante la utilización de plantas como biofactorías. Se puede utilizar la planta
como medio de expresión de los antígenos vacunales o empleando virus de las
plantas como portadores de epítopos neutralizantes procedentes de otros virus.
Permitiendo así el concepto de vacunas comestibles (Carrasco y Almendral 2006).
Con la llegada de la ingeniería genética se ha planteado la posibilidad de producir
vacunas en plantas transgénicas, en órganos de la planta (hojas, frutos), extractos
crudos (seco o en polvo) o proteínas purificadas, que al ser administrados de manera
oral o parenteral produzcan proteínas inmunológicas que desencadenen la respuesta
inmune (Sala, Manuela Rigano et al. 2003).
El concepto original de vacuna comestible implica que la fruta o vegetal transgénico
que expresa un antígeno de un virus o una bacteria puede ser comido crudo sin
necesidad de un procesamiento previo y actúe como vacuna para que desencadene la
suficiente respuesta inmune contra una enfermedad específica. Este concepto ha ido
evolucionando y se lo ha reemplazado por antígenos de vacunas derivados de
plantas. La primera razón, diferentes frutas de la misma planta pueden expresar
diferentes niveles de antígeno, por lo cual se vuelve difícil obtener una concentración
homogénea del antígeno; se necesitaría para este proceso al menos un mínimo de
procesamiento, antes de la incorporación en formulaciones o cápsulas para la
vacunación oral. Segunda razón, es importante asegurarse por completo de la
separación de frutas o vegetales destinados a la alimentación humana o animal de
aquellos destinados a usos farmacéuticos como las vacunas.
La expresión de antígenos en tejidos de plantas abre una alternativa importante como
respuesta a la demanda de vacunas más baratas, más seguras y de mejor calidad
(Tiwari, Verma et al. 2009).
Una planta ideal usada para la producción de vacunas debería tener las siguientes
características:
Susceptibilidad a la transformación
Expresión en tejidos comestibles que puedan ser consumidos crudos, debido
a que los antígenos son sensibles al calor.
Que los tejidos seleccionados sean ricos en proteínas debido a que la proteína
de la vacuna será solamente un pequeño porcentaje del total de proteína.
El tejido seleccionado no debe producir moléculas tóxicas.
Correcto plegamiento del antígeno de la proteína (Tiwari, Verma et al. 2009)
(Rybicki 2009).
Preservar el antígeno por un largo período de tiempo en condiciones
ambientales.
Inducir a la inmunidad protectora.
Proteger contra digestión enzimática en el tracto gastrointestinal.
Entrega efectiva del antígeno insertado a tejidos de la mucosa, incluyendo
células M (Nochi, Takagi et al. 2007).
Provocar respuesta inmune en el intestino (Chikwamba, Cunnick et al. 2002).
PLANTAS TRANSGÉNICAS EN LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS
SELECCIÓN DEL MATERIAL
Un importante paso para la producción de vacunas transgénicas es la selección del
material, se debe tener en cuenta dos consideraciones importantes: expresión alta del
antígeno y que sea fácil de almacenar y administrar (Han, Su et al. 2006).
La Tabla 1 presenta las características de las plantas usadas con frecuencia para la
expresión de antígenos, sus ventajas y desventajas.
El contenido total de proteína en las hojas es baja, razón por la cual se considera una
estrategia no recomendable, las hojas tienen una actividad proteasa alta, la presencia
de pigmentos y compuestos fenólicos hace que la purificación de proteínas
recombinantes desde las hojas sea difícil y caro. La implementación de buenas
prácticas de manufactura se hacen más difíciles debido a la manipulación de grandes
contenidos de biomasa.
La producción de antígenos de vacunas derivados de plantas debe tener entre sus
consideraciones la económicamente competitiva. La expresión de altos niveles de
proteína recombinante se ve también influenciada por factores medio ambientales.
Estos altos niveles se pueden obtener en suspensiones de células, cultivos de raíces
(in vitro) y de semillas (in vivo). Las semillas representan también una herramienta
fundamental para la producción y extracción de proteínas a nivel comercial. Las
semillas recombinantes ofrecen la posibilidad de usarlas directamente como vacunas
orales. Se ha demostrado que las proteínas expresadas en las semillas son altamente
estables durante mucho tiempo y en condiciones climáticas diversas (Tiwari, Verma
et al. 2009) (Chikwamba, Cunnick et al. 2002).
Tabla 1. Características de los diferentes cultivos utilizados para expresión de antígenos
Planta Ventajas Desventajas Alfalfa Sistema de transformación
relativamente eficiente Alto contenido de proteínas en las hojas Hojas comestibles Vacunas de animales
Dispersión de polen en el campo Problema para limpiar el campo por su sistema radicular profundo
Planta Ventajas Desventajas Legumbres o Cereales Tecnología de producción
ampliamente establecida Alto contenido de proteína en semillas Almacenaje estable de proteína en semillas Aptos para vacunas de animales Procesamiento de la semilla a nivel industrial establecido
Sistemas de transformación ineficientes Desnaturalización de la proteína y pobre inmunogenicidad al cocinar los granos (excepto el de maíz)
Patata Fácil, sistema de transformación eficiente Promotores específicos disponibles Propagación clonal, bajo potencial de cruzamiento en el campo Procesamiento industrial del tubérculo establecido
Bajo contenido de proteína en el tubérculo No es palatable en su forma cruda, al cocinarlo la proteína se desnaturaliza y pierde inmunogenicidad.
Tomate Sistema de transformación relativamente eficiente Fruto lista para comer Promotores específicos disponibles Cultivo en invernadero establecido Procesamiento industrial del fruto establecido
Bajo contenido de proteína Ácido del fruto puede ser incompatible con algunos antígenos o al momento de administrar a niños. No hay un sistema in vitro para probar la expresión del fruto.
Tabaco Fácil, sistema de transformación eficiente Abundante material para caracterización de proteína
Alcaloides tóxicos Dispersión de polen
Banana Cultivada ampliamente en países en vías de desarrollo donde las vacunas son necesarias Se comen crudas tanto por niños como adultos Propagación clonal, bajo potencial de cruzamiento en el campo Una vez establecido el cultivo, la fruta está lista de 10-12 meses
Sistemas de transformación ineficientes Poca información sobre expresión génica, especialmente sobre promotores para la fruta Superficies grandes para el cultivo, muy caro en invernadero.
Adaptado de (Warzecha and Mason 2003)
SELECCIÓN DEL PROMOTOR
La selección de un buen promotor es de gran importancia para alcanzar altos niveles
de expresión del antígeno que codifica el gen, y un alto nivel de expresión de la
proteína. El promotor CaMV35S del virus del mosaico de la coliflor ha sido
ampliamente utilizado por ser un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo la
expresión en otros tejidos que no sean el órgano objetivo de preparación del antígeno
es un desperdicio de recursos. Se ha demostrado que la expresión de una proteína
con el promotor CaMV35S no permite una expresión génica regulada, aunque el
promotor CaMV35S expresa genes en un nivel relativamente alto en hojas y raíces,
se ha encontrado un bajo nivel de proteína total (2-5% en producto fresco) en estos
tejidos. Con el promotor CaMV35S se ha reportado niveles de expresión de cerca
del 0.2% de proteína soluble total (TSP) en hojas (Tiwari, Verma et al. 2009).
La mayoría de los fármacos producidos por plantas se han logrado mediante
transformación nuclear, donde el gen de interés es incorporado directamente en el
genoma nuclear de la planta. El promedio de acumulación de proteína ha alcanzado
un 0,01-0,4%, lo cual es un dato muy bajo en relación al costo efectivo de
producción de moléculas que puedan generar respuesta inmune e inducir tolerancia
en los individuos. De todos modos, el uso de esta tecnología permite determinar el
sitio o el tejido donde la proteína se va a expresar lo cual es una ventaja. Hay una
alternativa y es la integración del gen en el genoma del plasto. Una vez integrado los
transgenes expresan grandes cantidades de proteína debido al gran número de copias
del cloroplasto lo cual es una elección rentable, además de que esta tecnología
permite una tasa de expresión uniforme del transgen y no hay silenciamiento génico.
Sin embargo las ventajas se reducen al saber que esta técnica sirve para pocas
especies y que la expresión plasmídica ofrece menos opción para modificaciones
post traslacionales (Rigano, Manna et al. 2009). Por ejemplo, la glicosilación de las
proteínas a menudo determina la solubilidad, estabilidad e inmunogenicidad de los
antígenos, los cloroplastos no tienen la maquinaria de glicosilación para realizar este
proceso (Tiwari, Verma et al. 2009).
La Tabla 2 muestra las diferentes estrategias llevadas a cabo para lograr una mejor
expresión del antígeno en plantas genéticamente modificadas.
Tabla 2. Construcciones génicas, señales de expresión, diseño del péptido, para la producción de vacunas en plantas genéticamente modificadas.
Objetivo Enfoque Optimización del uso de codones Adaptar el uso del codón a los preferidos por
los genes de las plantas Optimización de la secuencia del epítopo Adaptar la composición A+T a aquellas
encontradas en los genes de las plantas. Eliminar secuencias que desestabilicen el ARNm.
Selección del promotor Este debe ser: constitutivo de la planta, específico de tejido, inducible por factores ambientales
Dirigir la proteína al cloroplasto Integrar la secuencia de ADN en el ADN nuclear y usar un péptido de transito al cloroplasto N-terminal: la proteína se acumulará en el cloroplasto
Dirigir la proteína al retículo endoplasmatico Usar una señal reguladora específica del retículo endoplasmatico como SEKDEL
Integración del ADN del epítopo en el ADN del cloroplasto
Usar un promotor viral cuando el epítopo está integrado en el virus de la planta.
Integración del ADN del epítopo en un vector viral
Uso de un promotor viral cuando el epítopo se integra en el virus de la planta. Uso de un virus defectuoso para mejorar el rendimiento y la seguridad ambiental
Expresar ARNm policistrónico Integración en el ADN de la planta de un poli epítopo bajo una única señal de expresión
Selección de genes marcadores Uso correcto del gen seleccionado Remover el gen después de la selección
Adaptado de (Sala, Manuela Rigano et al. 2003)
ROL DE LOS ADYUVANTES
Una función de los adyuvantes es activar las células dendríticas (DC) y las células
presentadoras de antígenos (CPA) en el sitio donde se libera el antígeno. La
activación de las CPA mejora su capacidad de enviar señales coestimuladoras para la
activación de las células T y las células B ante el encuentro con un antígeno (Roitt,
Burton et al. 2008).
Según la OMS en muchas vacunas se añaden adyuvantes para aumentar su
inmunogenicidad y eficacia. Se han utilizado como adyuvantes las sales de aluminio
(alumbre) y se consideran generalmente inocuas.
En el estudio de Moravec, Schmidt et al. (2007), donde se produjo una subunidad de
toxina termolábil (LT)B en semillas de soya como vacuna oral administrada a
ratones, se usó el anti FimHt como adyuvante. El extracto de semillas no
transgénicas administrado a los ratones no tuvo ningún efecto sobre la producción de
anti FimHt IgG, sin embargo la administración conjunta de FimHt con extracto de
soya transgénica con LTB mejoraba significativamente la respuesta anti FimHt IgG.
El futuro de las vacunas comestibles dependerá en la factibilidad de producir
suficiente cantidad de vacunas inmunogénicas. Las vacunas comestibles que posean
inmunogenicidad y no requieran de adyuvantes adicionales serán las vacunas más
exitosas tanto para uso humano como animal (Pascual 2007).
“La administración de antígeno solo, rara vez es suficiente para inducir una respuesta
inmunitaria potente, aún cuando el antígeno esté compuesto por una proporción alta
de determinantes no propios; se requiere la administración conjunta de un
adyuvante“ (Roitt, Burton et al. 2008).
Se ha demostrado que un poderoso adyuvante es el LT-B, las subunidades no tóxicas
de LT-B y CT-B son considerados inmunógenos potentes. Estas subunidades evitan
la tolerancia cuando se administran por vía mucosal y generan fuertes respuestas
séricas y mucosas. Usado como adyuvante, el LT-B provee seguridad y es una forma
de inmunización mucosal rentable contra patógenos entéricos que pueden ser
controlados por subunidades de vacunas recombinantes (Chikwamba, Cunnick et al.
2002).
MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN Los métodos de transformación más frecuentes son:
Método mediante Agrobacterium tumefaciens
Método de biobalística
La bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens es usada para transferir un pequeño
segmento de ADN o ADN-T en el genoma de la planta. El ADN-T se localiza en un
plásmido que se denomina Ti (inductor de tumores). Tras la transferencia de ADN-T
se integra el genoma nuclear de la planta y su expresión induce el fenotipo tumoral.
Posteriormente la planta se regenera por completo a partir de una única célula. Para
la expresión de antígenos en plantas éste método es ampliamente utilizado.
Debido a que el sitio de inserción es al azar y el número de copias de ADN-T
insertadas pueden variar, el nivel de expresión del antígeno es diferente entre los
transformantes.
Durante la construcción del vector de expresión, el gen de interés es insertado entre
los elementos de regulación del ADN que controlan la transcripción del ARNm y la
maduración en las células de la planta.
Para iniciar la transformación pequeños cortes de la planta son inoculados con
Agrobacterium tumefaciens que se adhiere al sitio de la herida. El ADN-T del
plásmido binario es transferido a la célula de la planta, donde se integra establemente
en el cromosoma nuclear. Los explantes son cultivados en un medio de agar
conteniendo el gen marcador, por ejemplo un antibiótico para destruir las células de
A. tumefaciens. Muchas células de las plantas son totipotentes, por lo cual pueden
regenerar en una planta completa. Una célula transformada puede producir brotes
con raíces para ser posteriormente trasplantada a un invernadero (Mason and Arntzen
1995). El método de Agrobacterium tumefaciens permite la integración en el ADN
nuclear.
El método de la biobalística se basa en el bombardeo de microproyectiles. Los
microproyectiles cubiertos con moléculas de ADN o ARN son acelerados a alta
velocidad para atravesar la pared y las membranas celulares para integrarse en el
genoma nuclear (Mishra, Gupta et al. 2008).
La integración del gen o el epítopo en el ADN circular del cloroplasto (ADNcp) es
una opción para la expresión estable. La transformación se realiza con frecuencia
mediante la biobalística y tiene como resultado sitios específicos para la integración
(Sala, Manuela Rigano et al. 2003).
SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO EN PLANTAS
El gen que codifica el antígeno de organismos patógenos (virus, bacterias) que
previamente ha sido caracterizado y cuyos anticuerpos están disponibles puede ser
manejado de dos formas. La primera es insertar el gen completo en un vector de
transformación de plantas entre el extremo 5´y 3´ para permitir la transcripción y
acumulación de la secuencia codificante en la planta. La segunda opción es
identificar el epítopo en el antígeno y utilizar el fragmento de ADN para construir
genes mediante la fusión con las proteínas de la cápside del virus de plantas como
por ejemplo TMV o CMV. El virus recombinante es usado para infectar plantas. Las
vacunas comestibles son utilizadas para ensayos inmunológicos (Mishra, Gupta et al.
2008) (Mason and Arntzen 1995). La Ilustración 1 muestra las estrategias de
producción de un antígeno en plantas.
Adaptado de (Mishra, Gupta et al. 2008) Ilustración 1. Estrategias de producción de un antígeno expresado en tejidos de plantas como candidato para una vacuna.
Expresión estable en plantas transgénicas
La expresión estable ofrece dos opciones: la inserción del gen en el genoma nuclear
o en el genoma del cloroplasto.
La cantidad de tejido de la planta que se convertirá en vacuna debe tener un tamaño
práctico para su producción en campo y su administración. Debido a los bajos
niveles de expresión del antígeno en ciertos estudios, se ha estudiado diferentes
factores que pueden influir en la expresión del gen en plantas. Entre ellos se incluye
uso del codón, promotor, señales de poliadenilación.
La Tabla 3 permite observar las diferencias entre el sistema de transformación
estable (nuclear o por cloroplasto) y el de expresión transitoria, del cual se hablará
más adelante.
Tabla 3. Transformación estable vs. expresión transitoria.
Transformación Nuclear
Transformación Por Cloroplasto
Expresión Transitoria
Aplicabilidad Mayoría de especies Especies limitadas Mayoría de especies Herencia del rasgo Mendeliana Materna (excepto
pocas especies) No
Tiempo para el desarrollo
Largo Muy largo Bajo
Niveles de expresión Bajo/Moderado Alto Alto Expresión exclusiva en ciertas partes de la planta (frutas, granos, etc.)
Logrado mediante el uso de promotores específicos
Improbable, solamente en algunas frutas como tomates
No
Procesamiento de la proteína
Eucariota Procariota
Silenciamiento génico
Si Se desconoce No
Riesgo con el ambiente
Medio Bajo Alto
Posibilidad para expresión simultanea de múltiples transgenes
Posible mediante el cruce de diferentes líneas transgénicas
Posible mediante el uso de mensajes policistrónicos
Bajo por la limitación del tamaño del gen
Adaptado de (Warzecha and Mason 2003)
Una amplia gama de tipos de plantas y sistemas han sido usados como medio de
expresión de antígenos en plantas, entre ellos se incluye varias especies de Nicotiana
spp., Arabidopsis thaliana, alfalfa, espinaca, patatas, fresas, zanahorias, tomates, aloe
vera y algas unicelulares (Rybicki 2010).
Se han obtenido algunos avances importantes en este campo como por ejemplo en A.
thaliana, incluyendo antígenos del virus de la gastroenteritis transmisible porcina
(Gómez, Carrillo et al. 1998), antígeno IpaC de Shigella flexneri (MacRae, Preiszner
et al. 2004), antígeno de Mycobacterium tuberculosis (TB) ESAT-6 (Rigano, Dreitz
et al. 2006), antígenos contra la hepatitis B/ virus de la inmunodeficiencia humana
(partículas HBV/HIV y proteína HIV p24) (Greco, Michel et al. 2007), y proteína L1
del virus del papiloma humano (Kohl, Hitzeroth et al. 2007). En tabaco se han hecho
importantes estudios, por ejemplo en Nicotiana tabacum var. Samsun se expresó la
subunidad B de la toxina del cólera (CTB), detectándose suero IgG anti CTB en los
ratones a los que se les administró la dosis (Jani, Singh et al. 2004).
Sin embargo las propiedades agronómicas de plantas modelo como la A. thaliana o
Nicotiana tabacum las hacen poco útiles dentro del marco de vacunas comestibles
(Rybicki 2010).
En cuanto a plantas con características agronómicas están las frutas y los tubérculos,
como los tomates en los que se han expresado algunos antígenos: la glicoproteína G
del virus de la rabia (McGarvey, Hammond et al. 1995), glicoproteína del virus
respiratorio sincitial F (Sandhu, Krasnyanski et al. 2000), antígeno F1-V contra la
Yersinia pestis (Alvarez, Pinyerd et al. 2006), un antígeno sintético HBV/HIV
(Shchelkunov, Salyaev et al. 2006), antígeno de superficie (HBsAg) del virus de la
hepatitis B (Lou, Yao et al. 2007), etc.
Los tubérculos de patatas también han sido usados como medios de expresión de
antígenos: enterotoxina termo lábil de Escherichia coli (LT-B) (Mason, Haq et al.
1998), proteína del virus Norwalk (Mason, Ball et al. 1996), proteína VP60 del virus
de la enfermedad hemorrágica del conejo (Castanon, Marin et al. 1999), proteínas E7
y L1 del virus del papiloma humano (Franconi, Bonito et al. 2002), entre otros.
En cuanto a los cultivos de hoja comestible se encuentran la alfalfa, espinaca, lupinos
y lechugas para la producción de antígenos (Rybicki 2010).
Uno de los antígenos con frecuencia expresados en plantas transgénicas son las
toxinas LT y CT de la Escherichia coli y el Vibrio cholerae. La diarrea causada por
Escherichia coli enterotoxigénica (ECET) es una enfermedad modelo para el
desarrollo de vacunas a base de plantas. La ECET es la causa más común de diarrea
infecciosa en climas tropicales, ocurre principalmente en niños y es conocida
también como la enfermedad del viajero. Su transmisión ocurre al beber agua
contaminada por la bacteria.
La enterotoxina lábil cal calor de Escherichia coli (LT) es el mayor factor de
patogenicidad de ECET. La subunidad B de LT (LTB) es de especial interés por su
inmunogenicidad, actividad adyuvante y su falta de toxicidad, lo que la hace un
candidato viable para la preparación de vacunas contra la diarrea provocada por
ECET (Rosales-Mendoza, Soria-Guerra et al. 2008).
La diarrea provocada por ECET tiene mucho en común con el cólera. La estructura y
función de LT son similares a la toxina del cólera (CT), las dos contienen
subunidades A y B cuyas secuencias de aminoácidos muestran una similitud del 80%
y tienen el mismo modo de acción (Rosales-Mendoza, Soria-Guerra et al. 2008).
Subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, (LT-B) y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB)
El primer estudio realizado por Mason, Haq et al. (1998) en el que se construye una
planta transgénica de patata expresa un gen sintético de la subunidad B de la
enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli, (LT-B). La expresión del gen se
realizó bajo el control de un promotor constitutivo (CaMV35S) y produjo la
acumulación de LT-B en hojas y tubérculos. Se demostró la capacidad inmunogénica
en ratones que previamente habían sido alimentados con el tubérculo transgénico
crudo, además se comparó la IgG e IgA con aquellas producidas por ratones
alimentados por sonda con la bacteria LT-B. Los ratones inmunizados con la patata
LT-B tuvieron mayores niveles de anticuerpos anti LT-B tanto en el suero como en
la mucosa que aquellos inmunizados con LT-B bacteriano. Ninguno de los ratones
estuvo completamente protegido, sin embargo este estudio mostró la factibilidad de
una vacuna comestible contra Escherichia coli.
Posterior a este se realizaron más estudios, Chikwamba, Cunnick et al. (2002)
construyeron una planta de maíz capaz de expresar la subunidad B de la enterotoxina
termolábil de Escherichia coli. Al alimentar ratones con el maíz transgénico, se
obtuvieron anticuerpos IgA e IgG anti LT-B. El maíz transgénico fue diseñado para
sintetizar los polipéptidos LT-B que se ensamblan a estructuras oligoméricas con
afinidad a los gangliósidos GM1. Al ser tan similares entre sí la toxina LT-B y la CT-
B del cólera, el estudio también involucró la medición de anticuerpos anti CT-B que
estimulaban la respuesta inmune. La transformación se hizo mediante bombardeo de
partículas y expresó un rango entre el 0.01% - 0,05% de LT-B del total de proteína
soluble. Los ratones alimentados con maíz transgénico mostraron una acumulación
menor de líquido en el intestino que aquellos que no fueron inmunizados. Se
concluyó que el maíz transgénico que expresa LT-B tiene características similares a
la bacteria nativa LT-B como el peso molecular, la capacidad de unión GM1 y que
induce a la inmunidad. Los resultados obtenidos demuestran que el maíz puede ser
eficazmente transformado para producir, acumular y almacenar antígenos
funcionales.
Jani, Meena et al. (2002) expresaron la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) en
plantas de tomate con un nivel del 0.02 al 0.04% del total de proteína soluble tanto
en hojas como en fruto. Mishra, Yadav et al. (2006) expresaron la subunidad B de la
toxina del cólera (CtxB) en hojas de tabaco transgénico. Con el fin de mejorar la
expresión del transgén, hicieron una construcción con ubiquitina (Ub). Las plantas
transgénicas de tabaco expresaron CtxB o Ub-CtxB. CtxB acumuló en las hojas de
tabaco niveles 2.5 mayores de plegamiento de la proteína en la construcción con
ubiquitina. En los mejores resultados, CtxB acumuló 0.9% de proteína de la hoja
soluble total. La CtxB producida en hojas de tabaco tuvo mayor afinidad de unión a
los receptores GM1. Nochi, Takagi et al. (2007) desarrollaron una vacuna oral a base
de arroz que expresó la subunidad de la toxina B del cólera (CTB). Se calcula que un
promedio de 30 ug de CTB por semilla fueron acumulados en los cuerpos proteicos
del arroz, lo que representa un 2.1% del total de proteína de la semilla. El
endospermo del arroz contiene dos órganos de almacenamiento de proteínas, PB-I
(prolaminas) y PB-II (gluteinas), que se distinguen entre sí por su forma, densidad y
composición proteica (Pinciroli 2010). Para examinar el grado de acumulación de
CTB en los cuerpos proteicos del arroz que resistían la digestión de la proteasa en el
estómago, todas las semillas fueron sujetas a un tratamiento con pepsina. Un
promedio del 75% de CTB acumulado en el arroz permaneció intacto después del
tratamiento con pepsina. Estos resultados sugieren que la mayoría de CTB expresada
en el arroz transgénico puede ser protegida de las condiciones del tracto intestinal.
También se observó que las semillas de arroz que expresaban CTB fueron captadas
por las células M, enterocitos especializados en la captación de antígenos luminales y
que cubren las placas de Peyer, y que además indujeron a la producción de
anticuerpos IgG e IgA con actividad neutralizante. Los ratones inmunizados con
arroz que expresaba CTB no mostraron signos clínicos de diarrea después de una
exposición a CT. El arroz transgénico permaneció estable y mantuvo su capacidad
inmunogenica a temperatura ambiente por 1.5 años. El trabajo concluyó que la
vacuna era efectiva para la inducción de inmunidad protectora comparada con otras
vacunas de las mucosas. Sharma, Singh et al. (2007) expresaron la subunidad A
(TCPA) de Vibrio cholerae en plantas de tomate. La subunidad A es conocida como
un antígeno capaz de proveer inmunidad ante la colonización de las bacterias. En el
estudio se generaron 2 epítopos P4 y P6 del TCPA con la finalidad de generar
antígenos más potentes, estos fueron fusionados con la subunidad B de la toxina del
cólera (ctxB) y expresados en tomate. Las proteínas quimérica CTB-P4 y CTB-P6
acumularon entre 0.17 y 0.096% de proteína soluble total en el fruto del tomate.
El grupo de Rosales-Mendoza, Soria-Guerra et al. (2008) demostró que la ingestión
de zanahorias transgénicas que expresan la subunidad B de enterotoxina termolábil
de Escherichia coli, protegió a ratones contra la toxina del cólera. En el trabajo se
midió la inmunidad inducida por la ingestión de tres dosis semanales de 10 ug de
LTB derivada de zanahorias transgénicas. Las zanahorias transgénicas provocaron
respuestas inmunes, se observó IgG e IgA anti LTB. La respuesta fue menor
comparada con la administración de dosis puras de LTB recombinante (rLTB). Sin
embargo la inmunidad lograda en el estudio es suficiente para proteger a los ratones
contra el cólera. Las raíces de zanahoria contenían 3ug de LTB por gramo de raíz
fresca (23 ug/g de biomasa seca). El contenido de proteína en la zanahoria es bajo y
según los autores la mejor manera de administrarla como vacuna es como producto
congelado mezclado con leche o agua e incrementar la dosis para obtener mejores
resultados.
Antígeno de superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B
La hepatitis B es una infección hepática potencialmente mortal causada por el virus
de la hepatitis B (VHB). Constituye un importante problema de salud a nivel mundial
y es el tipo más grave de hepatitis viral. Puede causar hepatopatía crónica y conlleva
un alto riesgo de muerte por cirrosis y cáncer hepático. Según la OMS en el mundo
hay unos 2000 millones de personas infectadas por el VHB y más de 350 millones
con infección hepática crónica. Cada año mueren unas 600000 personas a causa de
los efectos agudos o crónicos de la hepatitis B.
El antígeno de superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B, consta de una
glicoproteína que se inserta en la superficie del virus, cuando se detecta en la sangre
indica la infección de hepatitis B (Tiwari, Verma et al. 2009).
El primer reporte de una vacuna desarrollada contra la hepatitis B fue el de Mason,
Lam et al. (1992) en plantas de tomate con una bajo nivel de expresión (0.01%) del
total de proteína soluble. Posteriormente Kapusta, Modelska et al. (1999) expresaron
el HBsAg en hojas de lechuga encontrando anticuerpos en los ratones alimentados
con las plantas transgénicas. Al administrar a voluntarios humanos las hojas de
lechuga desarrollaron anticuerpos IgG. Posteriormente Shchelkunov, Salyaev et al.
(2006) expresaron un gen sintético de fusión que codificó los epítopos
inmunogénicos ENV y GAG del virus de la inmunodeficiencia (VIH-1). He, Jiang et
al. (2008) expresaron el antígeno de superficie del gen (HBV-S2 + S/HBsAg M) bajo
el control del promotor E8 en plantas de tomate y tabaco. El promotor E8 reguló la
expresión del antígeno en los tomates maduros pero no en las hojas de tabaco, flores
o semillas, lo que sugiere que podría actuar de manera específica según la especie.
Expresión vía cloroplastos
La ingeniería genética de cloroplastos ofrece muchas ventajas, entre las que se
incluyen altos niveles de expresión, reducción de contaminación cruzada por el
transgén vía herencia materna y expresión de genes múltiples en un solo evento de
transformación. La expresión de antígenos contra cólera, tétano, ántrax, parvovirus
canino va desde 4-31% de la proteína soluble total en cloroplastos transgénicos
(hojas) y en otros plastos como en zanahoria o tomate. Entre las ventajas adicionales
están la disponibilidad de marcadores libres de antibióticos y la facilidad de
administración (Daniell 2006).
Dentro de los estudios realizados sobre expresión de antígenos vía cloroplasto está la
vacuna contra el ántrax (Bacillus anthracis) mediante el antígeno protector (PA)
expresado en tabaco (Koya, Moayeri et al. 2005) (Watson, Koya et al. 2004), vacuna
contra la amebiasis causada por (Entameoba histolytica) mediante el antígeno de
superficie LecA, logrando una producción del 6.3% de proteína total soluble
(Chebolu and Daniell 2007), vacuna contra el cólera (Vibrio cholerae) mediante la
producción de la toxina del cólera (CT), acumulando un 31% de proteína soluble
total (Daniell, Lee et al. 2001) (Molina, Hervás‐Stubbs et al. 2004), vacuna contra
la peste (Yersinia pestis) mediante la expresión de F1, una proteína capsular de la
superficie de la bacteria (Daniell 2006), vacuna contra el parvovirus canino mediante
la expresión en cloroplastos de tabaco el péptido sintético 2L21 (Molina, Hervás‐
Stubbs et al. 2004).
La transformación vía cloroplasto no es un procedimiento estándar, debido a lo cual
está limitada para un número pequeño de cultivos. Debido a que los cloroplastos
derivan de bacterias antiguas no poseen la maquinaria eucariota para modificaciones
postraduccionales, por lo tanto son incapaces de sintetizar cadenas de glicanos
(Yusibov and Rabindran 2008).
La Tabla 4 muestra un resumen de las investigaciones que permitieron expresar de
manera estable antígenos en plantas.
Tabla 4. Expresión estable de antígenos en plantas
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Tabaco/hoja CaMV35S V. cholerae Cólera Subunidad B de la toxina del cólera (CTB)
Patata/tubérculo, hoja
Mannopine synthase
V. cholerae Cólera CTB
Patata/tubérculo, hoja
Mannopine synthase
V. cholerae Cólera CTB
Patata/tubérculo, hoja
Mannopine synthase
V. cholerae e IDDM
Cólera y Diabetes
CTB-INS (insulina)
Patata/tubérculo, callo
Mannopine synthase
V. cholerae y rotavirus
Cólera y Gastroenteritis
CTB-enterotoxina del rotavirus (NSP4)
Tabaco/hoja (cloroplasto)
Operon RNAr (Prrn)
V. cholerae Cólera CTB
Patata/tubérculo Mannopine synthase
V. cholerae, rotavirus y E. Coli
Cólera, gastroenteritis y diarrea
CTB-NSP4/CTA2,CFA/1
Tomate/fruta, hoja CaMV35S V. cholerae Cólera CTB Patata/tubérculo Mannopine
synthase V. cholerae y rotavirus
Cólera y gastroenteritis
CTB-NSP4
Tabaco/hoja CaMV35S V. cholerae Cólera CTB Tabaco/hoja CaMV35S V. cholerae Cólera CTB-InsB3
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Tabaco/hoja CaMV35S V. cholerae Cólera CTB Tabaco/raíces CaMV35S V. cholerae y
Erysipelothrix rhusiopathiae
Cólera y erisipela
CTB-Antígeno protector de la superficie (SpaA)
Lechuga/hoja CaMV35S V. cholerae Cólera sCTB-KDEL Tabaco/hoja psbA V. cholerae y
Parovirus Canino (CPV)
Cólera, gastroenteritis hemorrágica
CTB-2L21
Tomate/fruta Específico de fruta E8
V. cholerae Cólera CTB
Arroz/semilla Específico de endospermo GluB-1
V. cholerae Cólera CTB
Cacahuete/semilla Específico de semilla legumin
V. cholerae y Rabia
Cólera y Rabia CTB- glicoproteína
de la rabia (RGP)
Tomate/ fruta y Tabaco/hoja, flor, semilla
Específico de fruta E8 y CaMV35S
V. cholerae y Virus de la Hepatitis B (HBV)
Cólera y Hepatitis
CTB y HBsAg
Arroz/semilla Endospermo de trigo Bx17 HMW
V. cholerae Cólera CTB
Patata/tubérculo, hoja
CaMV35S E. coli Diarrea Subunidad B de la toxina termolábil al calor (LTB)
Patata/hoja, tubérculo
CaMV35S E. coli Diarrea LTB
Patata/tubérculo Específico de tubérculo patatin
E. coli LTB
Maíz/semilla CaMV35S E. coli y Virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV)
Diarrea y Gastroenteritis transmisible porcina
LTB y proteína S de TGEV
Maíz/semilla Específico de endospermo gamma zein
E. coli Diarrea LTB
Tabaco/hoja CaMV35S E. coli enteropatogénica (EPEC)
Diarrea Subunidad A de la formación de pilus estructurales (BfpA)
Tomate/fruta, hoja CaMV35S E. coli Diarrea LTB- epítopo 3 de la zona pelucida de los ratones (ZP3)
Arabidopsis thaliana/hoja
CaMV35S E. coli-M, tuberculosis
Diarrea y Tuberculosis
LTB-ESAT-6
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Tabaco/hoja CaMV35S E. coli Diarrea LTB – SEKDEL Ginseng siberiano CaMV35S y
Ubiquitina E. coli Diarrea LTB
Soya/semilla Específico de semilla glicina
E. coli Diarrea LTB
Zanahoria/ hoja, raíz
CaMV35S E. coli Diarrea LTB
Tabaco/cloroplasto
Prrn E. coli enterotoxigénica (ETEC)
Diarrea LTB- toxina estable al calor (ST)
Patata/ tubérculo CaMV35S Virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV)
Diarrea Epítopo neutralizante de PEDV (COE)
Tabaco/hoja CaMV35S Virus de la diarrea epidémica porcina
Diarrea Epítopo neutralizante de PEDV (CO-26K)
Tabaco/hoja CaMV35S Virus de la Hepatitis B (HBV)
Hepatitis HBsAg
Tabaco/hoja CaMV35S HBV Hepatitis HBsAg Lupina/callo, Lechuga/hoja
CaMV35S HBV Hepatitis HBsAg
Patata/tubérculo Específico de tubérculo patatin y CaMV35S
HBV Hepatitis HBsAg y HBsAg-VspS/VSPL
Tabaco NT1 y celúlas en suspensión de soya W82
CaMV35S
HBV
Hepatitis
HBsAg
Tomatillo cherry(hoja, tallo, fruta
CaMV35S HBV Hepatitis HBsAg
Tabaco/cultivode células NT-1
CaMV35S HBV Hepatitis HBsAg-VSPS
Patata/ tubérculo Específico de tubérculo patatin y CaMV35S
HBV Hepatitis HBsAg S y antígenos preS2
Tabaco/ hoja y Tomate/hoja y fruta
CaMV35S HBV Hepatitis y Gastroenteritis
HBsAgM/S y NVCP
Banana/ fruta, hoja
Ubq3 y enzima formadora del etileno
HBV Hepatitis HBsAg
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Tabaco/ cultivo de células en suspensión
Ubq3 y EFE HBV Hepatitis HBsAg
Patata/ tubérculo, raíces
EFE HBV Hepatitis HBsAg
Tomate/futa CaMV35S HBV Hepatitis HBsAg-ENV, epítopos GAG de HIV-1
Patata/ tubérculo CaMV35S HBV Hepatitis HBsAgM Tomate/fruta Específico
de fruta 2A11
HBV Hepatitis PRS-S1S2S
Patata/ tubérculo, Tabaco/hoja
Específico de tubérculo patatin y CaMV35S
Virus de Norwalk (NV)
Gastroenteritis Proteína de la cápsida del virus (NVCP)
Patata/hoja, tubérculo
CaMV35S Rotavirus bovino grupo A (GAR)
Diarreas severas en humanos y animales
Proteína de la cápside VP6
Alfalta/hoja CaMV35S Rotavirus bovino (BRV)
Gastronteritis en mamíferos
eBRV4
Alfalfa/hoja CaMV35S Rotavirus Gastroenteritis viral
PBsVP6 rotavirus humano grupo A
Patata/ tubérculo, hoja
CaMV35S Rotavirus Gastroenteritis Glicoproteína de la cápside VP7
Patata/ tubérculo, hoja
CaMV35S Virus de papiloma humano (HPV)
Cáncer cervical HPV11 L1 proteína de la cápside
Tabaco/hoja, patata/ tubérculo
CaMV35S Virus de papiloma humano (HPV)
Cáncer cervical HPV 16 partículas similares a virus
Tomate/ hoja, fruta
CaMV35S Virus de la rabia Rabia RGP
Tomate/ hoja, fruta
CaMV35S Virus de la rabia Rabia RGP
Tomate/ hoja, fruta
CaMV35S Virus de la rabia Rabia Nucleoproteína de la rabia (RNP)
Arroz/ hojas, semillas
Ubiquitina y gluteina
Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV)
Enfermedad de Newcastle (ND)
NDV
Tabaco/ hoja CaMV35S Virus del sarampión (paramyxovirus)
Sarampión MV-H
Zanahoria/ hoja, raíces
CaMV35S Virus del sarampión
Sarampión MV-H
Tabaco/ hoja CaMV35S Virus del sarampión
Sarampión MV-H
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Cacahuete/ hoja CaMV35S Virus de la Peste bovina
Peste bovina Proteína H del virus de la peste bovina
Berza/ hoja, Coliflor/ flor madura
CaMV35S y OCS3MAS sintético
Virus vacuna, Coronavirus humano SARS
Viruela y SARS humano
Proteína B5 del virus vacuna y epítopo del coronavirus
Arabidopsis/ hoja CaMV35S Virus de la gastroenteritis porcina (TGEV)
Gastroenteritis transmisible (TGE)
Glicoproteína S
Patata/ tubérculo CaMV35S TGEV TGE Glicoproteína S Tabaco/ hoja Promotor
sintético super
TGEV TGE Glicoproteína S
Arabidopsis/ hoja CaMV35S Fiebre Aftosa (FMDV)
Fiebre aftosa Proteína estructural VP1
Patata/ tubérculo, hoja
CaMV35S FMDV Fiebre aftosa Proteína estructural VP1
Alfalfa/ hoja CaMV35S FMDV Fiebre aftosa Proteína estructural VP1
Patata/ hoja, tubérculo
CaMV35S Enfermedad hemorrágica del conejo
Enfermedad hemorrágica del conejo
Proteína estructural VP60
Patata/ tubérculo CaMV35S RHDV Enfermedad hemorrágica del conejo
Proteína estructural VP60
Tabaco/ hoja CaMV35S Streptococus mutans
Bacteremia y endocarditis infecciosa
Antígeno A
Tabaco/ hoja CaMV35S Virus de la estomatitis vesicular (VSVG)
Síndrome respiratorio severo
Glicoproteína VSVG
Tabaco/ semilla Esecífico de semilla gluteina Gt3
Citomegalovirus humano (HCMV)
Enfermedad del sistema nervioso central
Glicoproteína B
Arabidopsis/ hoja CaMV35S Parvovirus canino Enfermedad del parvovirus canino
Proteína de la cápside del parvovirus canino VP2 (CPV)
Trébol blanco/ hoja
CaMV35S Bacillus anthracis Ántrax Antígeno protector
Tabaco/ hoja (cloroplasto)
Operón ARNr(Prrrn)
Clostridium tetani Tétano TetC
Tabaco, Berza/ hoja
rbCS y CaMV35S
Virus vacuna Viruela Proteína B5
Tomate/ fruta Específico de fruta E8
Virus de la inmunodeficiencia VIH
SIDA Proteína Tat de VIH-1
Adaptado de (Tiwari, Verma et al. 2009)
Transformación transitoria de expresión rápida
La expresión transitoria ocurre durante un período corto de tiempo, pocos días o
hasta culminar el ciclo de vida de la planta, sin ser heredado por la progenie. Un
sistema de transformación transitoria utiliza a Agrobacterium tumefaciens. Esta
técnica consiste en la infiltración de todo el tejido de la planta en una suspensión de
Agrobacterium, el ADN-T es transferido a una alta cantidad de células, donde se
puede integrar o permanecer como un episoma, y en cualquier caso expresará su
utilidad. Esta transformación somática transitoria o conocida también como
Planta/tejido Promotor Patógeno/Agente causal
Enfermedad Antígeno
Patata/ tubérculo CaMV35S Causado por neuro degeneración
Alzheimer Beta amiloide humano (AB)
Tomate/ hoja CaMV35S Causado por neuro degeneración
Alzheimer Beta amiloide humano (AB)
Arroz/ semillas Específico de semilla gluteina A
Causado por inflamación del cartílago
Artritis Péptido Colágeno tipo II
Cacahuete / callus CaMV35S Virus de la lengua azul
Lengua azul Gen VP2
Papaya/ clones embriogénicos (ETgpC)
CaMV35S Taenia solium Cisticercosis Péptidos sintéticos KETc1, KETc2, KETc7.
Tomate/ hoja, fruta
CaMV35S Intoxicación por organosfosforados
Pancreatitis severa y daño al miocardio
Acetilcolinesterasa humana (AchE)
Tomate/ fruta CaMV35S y específico de fruta E8
Virus sincicial respiratorio (RSV)
Enfermedad del tracto respiratorio
RSV proteína F
Tabaco/ hoja, lechuga/ hoja
CaMV35S Coronavirus Síndrome respiratorio
Proteína s de SARS-CoV
Tabaco/ hoja CaMV35S Virus de la influenza aviar H5/ variante HA1
Gripe aviar H5/HA1 variante HDEL
Tomate/ fruta CaMV35S Yersinia pestis Peste bubónica Proteína de fusión F1-V
Tabaco/ cloroplasto
psbA Yersinia pestis Peste bubónica Proteína de fusión F1-V
Tabaco y Arabidopsis/ hoja
CaMV35S Virus de la inmuno deficiencia humana (VIH) y hepatitis B (HBV)
SIDA y hepatitis B
HIV-1 recombinante/ partículas similares a virus HBV.
“agroinfección” permite altos niveles de expresión sin las incertidumbres inherentes
de la regeneración y propagación de plantas transgénicas y al igual que los vectores
virales permite elegir el momento propicio (Rybicki 2009).
Haynes, Cunningham et al. (1986) concluyeron que el epítopo de un antígeno puede
ser expresado en una planta mediante su unión con un péptido viral que se
autoensamble en partículas similares a virus. En la investigación realizaron
experimentos en el sistema de expresión de E. Coli usando la proteína de la cápside
del virus del mosaico del tabaco (TMV) fusionado con el virus de la polio.
El TMV ha sido usado como uno de los primeros y más establecidos medios de
expresión transitoria, existen también investigaciones en las que usan el virus del
mosaico del caupí (CPMV), el virus del mosaico de la alfalfa (AIMV) con la
finalidad de producir antígenos recombinantes en plantas. La mayor limitación de
usar la proteína de la capside del TMV es que no más de péptidos de 25 aminoácidos
pueden ser usados para la fusión, excluyendo a varias moléculas de importancia
biomédica (Tiwari, Verma et al. 2009).
Entre los estudios realizados están el de Durrani, McInerney et al. (1998) que
mediante el CPMV se expresó un péptido de 22 aminoácidos de la proteína de la
transmembrana gp41 del VIH-1 IIIB (CPMV- VIH/1). Los ratones inmunizados con
CPMV- VIH/1 produjeron anticuerpos IgA e IgG2a. Chichester and Yusibov (2007)
expresaron mediante agroinfiltración en Nicotiana bethamiana una fusión entre una
liquenasa (LicKM), una enzima termoestable de Clostridium thermocellum, y el
dominio 4 del agente protector de Bacillus anthracis (PAD4) y el dominio 1 del
factor letal (LFD1). Todos los animales que recibieron la vacuna fueron capaces de
desarrollar anticuerpos IgG1.
Se ha desarrollado una tecnología que supera ciertas limitaciones del método de
Agrobacterium como un agente infeccioso que permite replicas virales. Este nuevo
método es utilizado para la amplificación génica transitoria y de alto nivel de
expresión industrialmente, se lo conoce como “Magnifection” y combina las ventajas
de tres sistemas biológicos: eficiencia del vector, eficiente suministro de ADN
mediante Agrobacterium, velocidad y nivel de expresión/rendimiento del ARN del
virus de una planta (Gleba, Klimyuk et al. 2005).
Proteína de la cápside del virus de Norwalk (NVCP)
Las partículas similares a virus (VLP) son producidas por expresión recombinante de
la cápside del virus o sus proteínas de envoltura que forman estructuras similares a
un virión altamente inmunogénicas pero carentes de material genético del virus
(Huang, Elkin et al. 2005). El virus de Norwalk es considerado como un agente
importante de gastroenteritis epidémica. Las proteínas recombinantes de la cápside
del virus de Norwalk (rNV) expresadas en forma de partículas similares a virus
(VLPs) en plantas se ha comprobado que son oralmente inmunogenicas en ratones y
humanos. En el estudio realizado por Zhang, Buehner et al. (2006) el gen sintético
incrementó la expresión de rNV en plantas de tomate y patata las cuales formaron
VLP. Dosis de tomate liofilizado (64 ug rNV – 40 ug VLPs) administrados a ratones
indujeron a IgG e IgA anti NV en la mayor parte de los casos. Mientras que dosis de
tubérculos de patata liofilizados que contenían 120 ug rNV (90ug VLPs) se
necesitaron para tener un 100% de efectividad.
Cultivos de células vegetales
Las técnicas de propagación de células vegetales comenzaron en 1950 cuando se
analizó el potencial de éstas para la síntesis de moléculas de bajo peso molecular.
Comercialmente están disponibles dos productos, la shikonina y el paclitaxel
(Taxol). Desde que se produjo la primera proteína recombinante en cultivos de
células vegetales se han seguido produciendo anticuerpos, enzimas, hormonas,
factores de crecimientos, entre otros. Sin embargo la producción de estos compuestos
se ha enfocado en unas pocas líneas de plantas, las más populares son los cultivares
derivados del tabaco, aunque se encuentran también algunos estudios en Arabidopsis
thaliana, Taxus cuspidata, Catharanthus roseus, arroz, soya y tomate (Hellwig,
Drossard et al. 2004).
Los cultivos de tejidos y raíces son un medio alternativo de ahorro de tiempo y
dinero, considerando que para obtener un antígeno producido por una planta se debe
seguir una serie de pasos como la siembra, cosecha, extracción de la proteína y
purificación si es necesaria. Además los procesos son independientes de condiciones
ambientales, estaciones y calidad del suelo (Tiwari, Verma et al. 2009) (Hellwig,
Drossard et al. 2004).
Las células de las plantas no albergan patógenos humanos ni producen endotoxinas.
Una ventaja adicional es que no hay riesgo de contaminación con micotoxinas,
herbicidas o pesticidas, sin contar el rápido crecimiento, mayores niveles de
expresión, y otras ventajas concernientes con el proceso de compatibilidad. Sin
embargo entre los desafíos que se presentan incluyen la formación de agregados, la
tendencia de las células a adherirse a las paredes del recipiente de fermentación,
deriva genética (variación somaclonal) y silenciamiento génico. Además de expresar
bajo nivel de proteína al compararlos con otros sistemas de expresión como el de
semillas (Hellwig, Drossard et al. 2004).
La producción continua y la fácil recuperación de proteínas provenientes de cultivos
celulares minimizan el tiempo y el costo del proceso y permiten una fácil
reproducibilidad (Tiwari, Verma et al. 2009).
Entre las desventajas están la dificultad para encontrar un promotor adecuado, la
inestabilidad de la proteína y el proceso de recolección (Hellwig, Drossard et al.
2004).
Expresión en semillas
Las semillas se muestran como ventajas útiles para la acumulación de proteínas en
un volumen relativamente pequeño y en un ambiente estable en el cual están
protegidas de la degradación (Karaman, Cunnick et al. 2012).
El pequeño tamaño de las semillas permite que la proteína recombinante llegue a una
concentración alta en relación a una pequeña biomasa. Algunas semillas tienen
ventajas específicas como la presencia de cuerpos oleosos como en el cártamo y la
colza. Como una ventaja adicional la proteína presente en la semilla normalmente no
interfiere con el crecimiento vegetativo de la planta. Las semillas aparecen como
complemento para la producción de proteínas farmacéuticas, anticuerpos
recombinantes y vacunas orales (Stoger, Ma et al. 2005).
Cuatro cereales –maíz, arroz, trigo y cebada- se han usado como sistemas de
producción basado en semillas. El maíz tiene el rendimiento de grano más alto, un
moderado contenido de proteína en la semilla y el intervalo generacional más corto,
consiguiendo la concentración más alta de proteína por hectárea. Una desventaja del
maíz es el hecho de que es una especie con polinización cruzada (Stoger, Ma et al.
2005).
Dos son las leguminosas que han sido usadas, al igual que algunos cereales para la
expresión de proteínas recombinantes, los guisantes y la soya. La ventaja de la soya
considerándolo un cultivo de alta producción es su alto contenido de proteína (40%).
Uno de los grandes problemas de la semilla de la soya es que su alto contenido de
aceite podría interferir con el proceso de aguas abajo (Stoger, Ma et al. 2005).
Los guisantes tienen un nivel de proteína parecido a la soya, sin embargo su
producción es cincuenta por ciento más cara lo cual es un limitante. El único
producto farmacéutico reportado es un anticuerpo de cadena sencilla (Stoger, Ma et
al. 2005).
El maíz es un sistema de expresión eucariota estable y de alto nivel de expresión y
producción comercial de proteínas recombinantes y antígenos. Recientemente la
comercialización de proteínas recombinantes (avidina y GUS) ha demostrado el
potencial de este sistema a gran escala. La bioencapsulación natural de proteínas en
el grano de maíz puede mejorar la sobrevivencia del antígeno en el intestino y
permitir la entrega del antígeno en las superficies de la mucosa.
El estudio de Lamphear, Streatfield et al. (2002), se investiga sobre el uso del grano
de maíz como un sistema adecuado para la elaboración de vacunas comestibles
contra la Escherichia coli enterotoxigenica (ETEC por sus siglas en inglés), causante
de diarrea aguda y el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). El maíz
transgénico con la toxina Lt-B de ETEC y la proteína S de TGEV fueron producidas
mediante el método de Agrobacterium tumefaciens. El grano de maíz obtenido de las
plantas transgénicas fue fraccionado en germen, sémola y salvado. Se inmunizaron
tanto a ratones como a cerdos. Los ratones fueron alimentados con germen
desgrasado y se midió suero anti Lt-B IgG e IgA. Los cerdos fueron alimentados con
el grano de maíz entero y se midieron anticuerpos anti TGEV y la protección en caso
de exposición directa al virus. Los resultados reportaron que el contenido de proteína
de Lt-B y TGEV-S eran de aproximadamente 0.8 y 0.1% de proteína soluble total,
respectivamente. Además se encontró proteína en todos los compartimentos del
grano de maíz, el antígeno Lt-B fue mayor en el germen y su contenido aumento
significativamente cuando estaba desgrasada. El antígeno Lt-B enriquecido en el
germen del grano de maíz, tras un proceso de molienda estándar, provocó respuesta
inmune en los ratones alimentados con el transgénico, permaneció estable al menos
un año cuando fue almacenado en condiciones de 4º-23º C. Mientras que el antígeno
de TGEV-S en el grano completo de maíz persistió durante el tiempo tanto en harina
como en semilla y en temperaturas de 4º y 10ºC, o a temperatura ambiente en
condiciones de almacenamiento y mostró en cerdos anticuerpos anti-TGEV
neutralizantes en el suero y protección en caso de exposición directa contra el virus
(Lamphear, Streatfield et al. 2002).
En otro estudio llevado a cabo por Moravec, Schmidt et al. (2007), la subunidad B de
la toxina termolábil de Escherichia coli (LTB) fue producida en semillas de soya
como una vacuna comestible. La expresión de LTB fue dirigida al retículo
endoplasmático de las células del parénquima de almacenamiento de las semillas.
Los embriones fueron transformados con un gen de LTB cuya expresión fue
específica a los cotiledones así como regulada por el promotor de soya glicina. Se
registró una acumulación del 2.4% del total de proteína.
El extracto de LTB de soya administrado a ratones de laboratorio con los cuales se
hizo el experimento presentó una inducción a respuesta inmune sistémica tanto para
IgG, IgA y de anticuerpos para IgA, sin embargo la respuesta con mayor eficiencia
obtenida fue el tratamiento que incluía administración parenteral y administración
por sonda como estrategia de inmunización. El suero de los ratones inmunizados
presentaba una respuesta parcial contra LT al tener contacto directo. El grano de soya
tiene un gran potencial en el campo de las vacunas provenientes de plantas debido a
su alto contenido de proteína, su gran valor nutricional y la variedad de productos
que se pueden sacar de ella. Se debe considerar que si se logra un método para la
producción de vacunas a base de soya, las ventajas serían numerosas por los
productos comercializados en la actualidad, por ejemplo la leche de soya, harinas,
formulas a base de soya, tofu, así como suplementos para animales (Moravec,
Schmidt et al. 2007).
Karaman, Cunnick et al. (2012) demostraron la expresión de la subunidad B de la
toxina del cólera (CT-B) en semillas de maíz. El mayor nivel de expresión
encontrado en la generación T1 fue de 0.0014% del total de proteína soluble,
mientras que en la T2 el valor se incrementó a 0.0197 % del total de proteína soluble.
Al alimentar ratones con el maíz transgénico se evaluaron IgG e IgA anti CT-B en
las muestras de suero y heces. Además un grupo de ratones fue alimentado con una
mezcla de maíz de CT-B y LT-B (subunidad B de la E. coli), los resultados
obtenidos de esta prueba mostraron que los niveles de anticuerpos fueron mayores a
las cantidades presentadas por CT-B solo. Estos resultados sugieren una acción
sinérgica usando CT-B y LT-B combinados, que en futuras investigaciones podrían
ser una idea para una vacuna eficaz contra ambos patógenos.
Otras vacunas
Malaria: proteínas de la superficie del merozoito MSP4 y MSP5 de
Plasmodium falciparum y MSP4/5 de Plasmodium yoelli.
Sarampión: usando el antígeno MV-H.
Diabetes: mediante la proteína pancreática ácido glutámico descarboxilasa
(GAD67).
Pasteurelosis neumónica en bovinos: por medio del antígeno leukotixina
(LKt) de Mannheima haemolytica A (Mishra, Gupta et al. 2008).
BENEFICIOS Y DESVENTAJAS
Uno de los principales beneficios que las vacunas comestibles aportan es la facilidad
de distribución y consumo. En los países en vías de desarrollo la posibilidad de
distribución de vacunas se dificulta debido a que las vacunas deben pasar por
procesos de “cadena de frío” desde el lugar de producción al sitio de distribución, sin
mencionar la dependencia de las inyecciones (Sala, Manuela Rigano et al. 2003)
(Pascual 2007).
Otra de las posibles ventajas de las vacunas comestibles es que comúnmente se
puede consumir con facilidad las distintas partes de las plantas como hojas, frutas o
semillas sin procesarlas.
Un obstáculo que las vacunas comestibles presentan es la necesidad de producir
inmunidad efectiva. Normalmente las vacunas aplicadas a superficies de la mucosa
en la ausencia de un adyuvante fallan al provocar una respuesta inmunogénica y
pueden inducir tolerancia. La modificación genética de los alimentos podría ser un
problema potencial y resultar en alergias a los alimentos y poner en peligro el
consumo de la comida no modificada en la dieta. El problema de las vacunas
transgénicas es la inducción a la tolerancia en vez de la inmunidad, esto puede
producirse con cualquier vacuna no administrada con un adyuvante (Pascual 2007).
Los resultados de las investigaciones han considerado algunos problemas de tipo
práctico y ético con el concepto de facilidad en el uso de vacunas comestibles que se
tenía en mente. Entre ellos destacan en primer lugar los problemas con el control de
calidad, la incapacidad de garantizar suficiente dosis en la vacuna para su eficacia.
En segundo lugar, la frecuencia en la administración física de este tipo de vacunas
tiene que ser regulada. Otro problema al que se enfrenta este desafío es el que la
vacuna tiene que ser reproducible y bajo supervisión para asegurar sus posibles
efectos. En la actualidad existen ya algunos productos registrados de acuerdo con las
buenas practicas de manufactura (BPM), incluso con ensayos clínicos (Rybicki
2010).
En el estudio llevado a cabo por Thanavala, Mahoney et al. (2005) donde se produjo
una vacuna contra la hepatitis B en patata se realizaron ensayos en humanos
mostrando un dato curioso, mientras con la vacunación vía parenteral se necesitaban
solamente 40 ug de HBsAg, se necesitan 3 dosis de 100 g de patata transgénica que
contenga una dosis de 1mg de HBsAG para mostrar resultados parcialmente
efectivos. Con el paso del tiempo se ha ido obteniendo resultados con mayores
niveles de expresión (Huang, LePore et al. 2008). En Rose, Lane et al. (1999) y
Gerber, Lane et al. (2001) al comparar entre dosis vía parenteral y oral de la vacuna
contra el HPV, se determinó que 10 ug de células que producían partículas similares
al virus del HPV con adyuvante eran necesarios para inmunizar a los ratones.
BIOSEGURIDAD/ ACEPTACIÓN DEL PÚBLICO
Una de las principales preocupaciones de las vacunas comestibles es la bioseguridad.
Sin embargo muchos estudios las han citado como seguras y funcionales. Existe
también preocupación sobre la tolerancia, una exposición repetida podría causar
inmunotolerancia o falta de respuesta inmune; sin embargo se ha demostrado que el
antígeno necesario para producir protección es generalmente más pequeño que la
cantidad necesaria para producir tolerancia (Han, Su et al. 2006).
Otra preocupación es la entrada de proteínas recombinantes producidas en plantas de
la cadena alimenticia. Sin embargo cabe recalcar que a pesar de que las vacunas
comestibles se expresaran en plantas de consumo masivo no serán consumidas como
parte de la dieta base diaria. Las vacunas comestibles deben aplicarse
apropiadamente.
Para evitar una contaminación se han producido ya algunas estrategias:
1. Establecimiento de machos estériles (genes suicidas, barreras de infertilidad,
apomixis).
2. El uso de tejido específico o promotores inducibles para prevenir efectos
adversos en el crecimiento y el desarrollo de la planta o del medio ambiente.
3. Utilización de cloroplastos por herencia materna para minimizar el flujo de
polen.
4. Establecer buenas practicas de manufactura (BPM) (Han, Su et al. 2006).
Existe también preocupación sobre las alergias, se conoce que la soya contiene
aproximadamente 15 proteínas que son reconocidas por los anticuerpos IgE de los
individuos alérgicos a la soya, por lo tanto, el potencial de esta vacuna de causar
alergia es grande, lo que se debe considerar al momento de distribuirla en la
población (Moravec, Schmidt et al. 2007).
Existen lugares en el mundo como el caso de Estados Unidos, donde hay especial
interés en el estudio y la elaboración de plantas como biofactorías para la producción
de vacunas contra bacterias y virus que atenten contra la bioseguridad del país o
bioterrorismo, entre los organismos de interés están el Bacillus anthracis, Yersinia
pestis y el virus de la viruela. En el estudio de estas vacunas se han desarrollado
investigaciones con ensayos en macacos y ratones obteniendo respuesta inmune
favorable (Rigano, Manna et al. 2009).
RENTABILIDAD ECONÓMICA
Las proteínas recombinantes expresadas en semillas de maíz pueden producirse en
cantidades que excedan los 2kg por acre por un bajo costo de centavos por
miligramo. La infraestructura existente para la cosecha del grano de maíz y su
procesamiento permite ventajas económicas para la producción (Lamphear,
Streatfield et al. 2002). Asumiendo un campo de 250 semillas por planta, se estima
que usando una línea elite de expresión de LTB, cerca de 1 kg de proteína LTB
puedes ser generada de 2000 plantas, una capacidad que es fácilmente acomodable
bajo normas de bioseguridad por ejemplo en invernaderos (Moravec, Schmidt et al.
2007).
Se ha demostrado que debido a la alta expresión de un antígeno en cloroplastos 1
acre de plantas transgénicas vía cloroplasto pueden producir hasta 360 millones de
dosis de una vacuna limpia, segura y funcional contra el ántrax.
Se ha estimado que solamente eliminando la cadena de frío se puede percibir una
ganancia de 300 millones de dólares por año, lo que proveería de vacunas a 10
millones de niños en el mundo (Pascual 2007).
Sin embargo, el futuro para las vacunas en humanos no es tan claro, mientras por un
lado existen muchos esfuerzos por producir antígenos en plantas para enfermedades
ya establecidas como HBV y HPV, la producción de vacunas convencionales para el
HBV es actualmente muy barata por toda la infraestructura y el sistema existente
incluido en el programa de inmunización. Por lo cual se podría decir que la industria
farmacéutica no le interesa diversificar su producción (Rybicki 2010).
ENSAYOS CLÍNICOS
El modelo de antígenos producidos por plantas ha sido estudiado ampliamente y
muchos de los resultados obtenidos muestran eficacia, la misma que ha sido
comprobada no solamente en modelos con ratones si no con animales superiores
como hurones o primates.
Los primeros ensayos clínicos en fase 1 aprobados por la USDA fueron realizados en
1997 en plantas transgénicas que desarrollaban el antígeno para el LTB donde se
utilizaron voluntarios humanos alimentados con tubérculos de papa, (Universidad del
Estado de Arizona en USA). Dentro de las vacunas derivadas de antígenos
producidos por plantas en fase I de ensayos clínicos están: curas para la diarrea,
gastroenteritis, hepatitis B, rabia, etc. Los primeros resultados obtenidos de esta
primera fase son positivos y muestras una inducción elevada en la respuesta inmune
de individuos sanos (Tiwari, Verma et al. 2009).
Unas pocas proteínas farmacéuticas derivadas de plantas han llegado a alcanzar la
fase II de ensayos clínicos, por ejemplo el anticuerpo CaroRX expresado en tabaco
transgénico usado contra las caries dentales (Plane Biotechnology Company). Otro
anticuerpo expresado en maíz transgénico Avicidin (Monsanto Protein Technology,
USA) para la protección de cáncer colorrectal fue retirado por efectos no específicos
del anticuerpo. La lipasa gástrica, una enzima producida por maíz transgénico y
usada para tratar fibrosis quística esta también en fase II en (Mersitem Therapeutics,
Francia). El factor intrínseco, usado contra la deficiencia de vitamina B12 y
producido en plantas transgénicas de A. thaliana ha sido llevado a fase II por
Cobento Biotechnology, Dinamarca.
En el año 2004 la tripsina bovina recombinante, nombre comercial TrypZean
desarrollado en plantas de maíz fue comercializado por ProdiGene, USA . El estado
y la evolución de productos derivados de proteínas recombinantes muestra que tienen
una potencial muy grande en lo referente a tecnología vegetal en la industria
farmacéutica y terapéutica (Tiwari, Verma et al. 2009).
Las investigaciones necesitan enfocar sus esfuerzos en la realización de estudios para
separar los antígenos recombinantes de los metabolitos secundarios potencialmente
dañinos, del mismo modo los costos de purificación en el caso de la utilización de
plantas como biorreactores (Rigano, Manna et al. 2009).
CONCLUSIONES
1. La tecnología en el campo de la vacunología ha evolucionado durante años,
de manera que en la actualidad se pueden usar plantas como biorreactores
para la producción rentable de antígenos como vacunas. Esta producción de
vacunas “comestibles” de bajo costo y fácil administración favorece
sobretodo a los programas de inmunización de países en vías de desarrollo
donde su correcta distribución se ve limitada por el uso de personal
capacitado, cadenas de frío y dificultad en la administración y transporte.
2. Los esfuerzos para la producción de vacunas en plantas se han centrado
principalmente en elevar la expresión del antígeno, ya que hasta ahora la
mayoría de genes insertados se expresan a niveles muy bajos. Las
investigaciones se enfocan en el uso adecuado de sistemas de expresión:
estable y transitoria, selección correcta del material, selección de promotores
eficaces, uso de adyuvantes.
3. Muchas plantas comestibles y no comestibles son empleadas para la
producción de antígenos: banana, patata, tomate, Arabidopsis thaliana. Se
han usado diferentes partes de la planta: hojas, tallos, raíces, frutos,
tubérculos y semillas. Las semillas con alto contenido proteico como maíz,
soya, arroz expresan cantidades de antígeno razonable, razón por la cual se
presentan como buenos candidatos para las futuras investigaciones. Plantas
como el tabaco han sido utilizadas con resultados prometedores, sin embargo
su uso se ha visto limitado debido a ciertos compuestos tóxicos.
4. Las semillas transgénicas que expresan un determinado antígeno pueden ser
almacenadas a temperatura ambiente por más de un año sin que éste pierda su
eficacia, mientras que otros tejidos de la planta como hojas o frutos necesitan,
bajo las mismas condiciones, procesos adicionales como extracción y
purificación de la proteína.
5. La expresión estable de los antígenos en las plantas debe ser regulada para
evitar el paso del transgén a otros cultivos con el fin de preservar la
diversidad génica. Se están realizando esfuerzos importantes en este tema
mediante el uso de la transformación genética vía cloroplasto, expresión
transitoria, propagación vegetativa y cultivos de células vegetales.
6. La administración de vacunas “comestibles” se ve limitada debido a que no
hay una estandarización en la dosis, ya que la concentración de antígeno varía
entre plantas de un mismo cultivo, frutos de una misma planta o entre
generación y generación. Una solución que se ha encontrado es la fabricación
de polvos o soluciones a partir de las plantas transgénicas.
7. En los estudios de inmunogenicidad es muy importante suministrar una
vacuna comestible junto a un adyuvante para estimular la respuesta del
sistema inmune y permitir una rápida absorción a través de las mucosas.
8. Los estudios de inmunogenicidad, antes de ser probados en humanos, se
realizan con animales en laboratorio. Esta metodología permite conseguir
información valiosa para investigaciones futuras y beneficia de modo
indirecto a la industria pecuaria, debido a que en la actualidad existen
productos eficaces provenientes de la ingeniería genética para inmunización
del ganado.
9. Las estrategias de producción y comercialización de vacunas “comestibles”
se enfocan en el desarrollo de nuevas estrategias para aumentar el
rendimiento del antígeno y facilitar su administración. Esto constituye un reto
tanto para los gobiernos, la industria y la comunidad científica.
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