obtenciÓn de la concentraciÓn Óptima de sustrato …
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ESTUDIAR PARA PREVERY PREVER PARA ACTUAR
Secretaría de Educación Pública
Instituto Tecnológico de Colima
OBTENCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE SUSTRATO PARA
PRODUCIÓN DE ÁCIDO KÓJICOCON ASPERGILLUS ORYZAE
VILLA DE ÁLVAREZ, COL., MARZO DE 2011
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DEINGENIERO BIOQUIMICO
PRESENTA GUILLERMO SILVA VALDEZ
DRA. ARGELIA JUAREZ ALCARAZASESOR
OPCIÓN XMEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL
5
INDICE
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...7
JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………8
OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS……………………………………. .8
CARACTERIZACIÓN DEL AREA DE TRABAJO……….………………………....9
PROBLEMAS A RESOLVER……………………………………………………….10
ALCANCES Y LIMITACIONES……………………………………………………..10
FUNDAMENTO TEÓRICO…………………………………………………………..11
Fermentación……………………………………………………………………….11
Producción de metabolito..……………………………………………………….11
Aplicaciones……………………………………………………………………….12
Ácido kójico………………………………………………………………………….12
Características físicas y químicas……………………………………………....13
Filtración…………………………………………………………………………….13
Cristalización…………………………………………………………………….....14
Secado………………………………………………………………………………14
Purificación del ácido kójico………………………………………………………15
PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS………………………………………………………………………..15
Cinética del ácido kójico…………………………………………………………15
Diferentes medios preparados para las cinéticas…………………………….15
Reactivos utilizados……………………………………………………………...18
6
Fuente de carbono……………………………………………………………….18
EQUIPOS DISPONIBLES EN EL LABORATORIO……………………………..19
PROCEDIMIENTO………………………………………………………………….22
Preparación del medio…………………………………………………………...23
Preparación del inóculo………………………………………………………….24
Cristalización del ácido kójico…………………………………………………...25
Esquemas de la cristalización del ácido kójico………………….....................26
Escáner comparativo del ácido kójico………………………………………….27
Formación de los cristales……………………………………………………….28
Lavado de los cristales…………………………………………………………...28
Balance de recuperación del ácido kójico……………………………………...29
Procedimiento de las actividades realizadas………………….……………....30
Medición en el espectrofotómetro en rayos UV……………………………...31
Medición en el espectrofotómetro en rayos visibles………………………...31
Preparación del cloruro férrico…………………………………………………..31
RESULTADOS …………………………………………………………………..…32
Graficas……………………………………………………………………………32
CONCLUSIONES…………………………………………………………………..40
RECOMENDACIONES………………………………………………………..…..41
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….…….42
7
INTRODUCIÓN
El ácido kójico es un metabolito secundario producido industrialmente por
fermentación, utilizando algunas de las especies de hongos, entre ellas las del
genero Aspergillus ssp y Penicillium ssp [1,2]. En 1907 Saito fue el que aisló por
primera vez el ácido kójico de una preparación de arroz con Aspergillus Oryzae,
luego Yabuta en 1913 le dio el nombre de kójico por proceder del arroz que en
japonés es “kóji” posteriormente él mismo en 1924 propuso la estructura como
5-hidroxi, 2-hidroximetil, 4- pirona [3]. Esta molécula es usada como analgésico,
precursor de saborizantes, como materia prima para la síntesis de plásticos,
antiinflamatorio [2,4].el ácido kójico es utilizado como un inhibidor estándar, en la
comparación de la efectividad de otros tipos de inhibidores de la tirosinasa. La
tirosinasa es la enzima responsable de la metalogénesis en mamíferos y del
oscurecimiento enzimático de frutas y hongos [5].en el tratamiento del melasma, el
ácido kójico ha demostrado su eficacia en más de un 60% de melasma aclarado,
basándose en evaluaciones clínicas [6].
Para la producción de una fermentación a gran escala es preciso mejorar cada
una de las etapas llevadas a cabo, desde la formulación del medio de cultivo hasta
los procesos posteriores a la fermentación. Es por ello que esta investigación fue
para optimizar la separación del ácido kójico del medio una vez terminada la
fermentación. La fermentación se lleva a cabo con el hongo Aspergillus oryzae es
de tipo aerobia lo cual demanda un suministro de oxigeno que está condicionado a
la aireacion-agitacion la cual se relaciona con los siguientes parámetros:
1.- El área interfacial liquido
2.- El tiempo e retención de la burbuja
3.- El grosor de la capa de líquido de la interface gas líquido [7].
8
JUSTIFICACIÓN
Uno de los puntos clave para el diseño del mejor medio para la más alta
concentración en una fermentación, en un proceso de F.BATCH para la
producción de ácido kójico es la cantidad de microorganismos. Los
microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una
amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes
para su desarrollo están el carbono, nitrógeno, bióxido de carbono e hidrogeno y el
oxigeno. A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta
los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de
de los microorganismos.
OBJETIVOS GENERAL Y ESPECIFICOS
OBJETIVO GENERAL
Obtener la concentración óptima de sustrato para producir el ácido kójico con el
hongo Aspergillus oryzae.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Estandarizar la cantidad del inóculo y del tanque semilla por métodos
espectrofotométricos.
2. Determinar la mejor fuente de carbono para el mayor rendimiento de la
producción de acido kójico.
3. Realizar el balance para la recuperación del ácido kójico.
9
CARACTERIZACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO
El área en el que se desarrollo el proyecto fue en las instalaciones de la empresa
medicina magistral de Colima, con domicilio en la calle Corregidora #57, en el
centro de la ciudad de Colima. Esta empresa se divide en dos ramas: venta de
productos de importación especializados en la dermatología así como el desarrollo
y elaboración de productos propios para el tratamiento de diversos padecimientos
en la piel, pretendiendo en el futuro innovar en la producción de materias primas
utilizadas en esta industria más específicamente el ácido kójico. El departamento
donde se desarrollo el proyecto es el de: Innovación y Diseño (Fig. 1); el cual se
encarga de la investigación básica para el desarrollo de nuevos productos y de la
investigación del proceso de producción del ácido kójico, dirigido por el
Dermatólogo Javier Pérez Gutiérrez.
Fig.1 Los análisis físico-químicos y biológicos fueron realizaron en el laboratorio de la
empresa.
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PROBLEMAS A RESOLVER
Determinar la mejor fuente de carbono para la mayor producción de ácido kójico.
Estandarizar el medio adecuado para la mayor producción del ácido kójico.
Establecer un método para la formulación de mejor recuperación del ácido kójico.
ALCANCES Y LIMITACIONES
ALCANCES
Se estandarizo el medio de mayor producción de ácido kójico.
Se presento un poster del trabajo realizado de esta residencia para la obtención
del ácido kójico por fermentación vía FED-BATCH con Aspergillus oryzae en el
congreso nacional e internacional de ingeniería bioquímica que se llevo a cabo en
Acapulco Guerrero durante el mes de marzo del 2010.
LIMITACIONES
No se puede hacer una propuesta de la cantidad de ácido kójico a nivel industrial
si no, hasta producirlo por medio de un escalamiento. Este estará supeditado al
volumen de producción y por ende a las dimensiones del biorreactor.
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FUNDAMENTO TEÓRICO
FERMENTACIÓN
El término fermentación se deriva del verbo latín, “fervere” (ebullir), el cual
describía la apariencia que se observaba en las frutas ó en las semillas cuando las
levaduras se alimentaban de ellas. Está apariencia se debía a la producción de
bióxido de carbono, debido al catabolismo anaeróbico de las azucares presentes
en las frutas y en las semillas. Sin embargo, el término ha llegado a adquirir
diversos significados, para los bioquímicos y para los microbiólogos industriales.
Desde el punto de vista bioquímico el catabolismo de las azucares es un proceso
oxidativo mediante el cual se producen nucleótidos piridinicos, los cuales deben
ser reoxidados para que el proceso continué; cuando se habla de condiciones
aeróbicas la reoxidación de los nucleótidos ocurre por la transferencia de
electrones, siendo el oxigeno el aceptor final; sin embargo cuando se habla de
condiciones anaeróbicas la oxidación de nucleótidos está relacionada con la
reducción de un compuesto orgánico, el cual generalmente es un producto
intermedio en la secuencia metabólica. Por otro lado los microbiólogos industriales
aplican el término de fermentación para describir cualquier proceso para la
producción de sustancias de interés, económico ó alimenticio, por medio del
cultivo de un microorganismo [7].
PRODUCCIÓN DE METABOLITO
Para hablar de la producción de metabolitos es conveniente entender las fases de
crecimiento de los microorganismos; una vez que se ha inoculado en un medio un
microorganismo especifico, existe un periodo durante el cual el microorganismo
parece no desarrollarse, a esta fase en la cual hay un proceso de adaptación al
medio se conoce como fase lag. Le sigue un periodo en donde se observa
crecimiento, y un incremento de células, el crecimiento es constante y este periodo
se conoce como fase logarítmica ó exponencial una vez que finaliza la fase
logarítmica viene una etapa en donde se mantiene un número aproximadamente
constante de células que se conoce como fase estacionaria, finalmente las células
entran en un periodo de muerte [7,8].
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APLICACIONES
Los microorganismos pueden ser usados para convertir un compuesto en uno que
se encuentra estructuralmente relacionado con un alto valor económico y de
interés industrial. La conversión de los productos se logra por una secuencia de
reacciones metabólicas catalizadas por diversas enzimas, entre las que se
encuentran de: hidrogenación, oxidación, hidroxilación, deshidratación y
condensación; debido a que son catalizadas biológicamente, son de alta
especificidad y de alto rendimiento. El uso de microorganismos, y por ende de las
fermentaciones tiene varias ventajas, sobre otros procesos como las síntesis
químicas directas en las que se utilizan reactivos muy específicos los cuales
generan diversos problemas, como son: Contaminación, el manejo de sustancias
peligrosas, el uso de metales pesados como catalizadores, etc. En otras palabras
la aplicación de las fermentaciones es muy variada y específica, debido a su
versatilidad y gran campo de aplicación; se ha convertido en una de las principales
operaciones unitarias en las industrias de la actualidad [8].
ÁCIDO KÓJICO
El ácido kójico es usado como analgésico y medicamento antiinflamatorio,
precursor de los potenciadores del sabor, productos del cuidado de la piel como
blanqueador y como agente protector de los rayos UV. El ácido kójico es
producido por Aspergillus ssp y penicillium ssp principalmente pertenecientes al
grupo Tamarii flavus- oryzae. Entre ellos, A. flavus, A. oryzae y A. parasiticus han
sido reportados de tener habilidad de producir grandes cantidades de ácido
kójico. Varios tipos de compuestos como la glucosa, sacarosa, acetato, etanol,
sorbitol, arabinosa y xilosa han sido usado como fuente de carbono en la
producción del ácido kójico. Es bien sabido que la glucosa es la mejor fuente de
carbono para la producción del ácido kójico debido a la similitud de la estructura
que del ácido kójico. Se ha sugerido que, durante la fermentación, el ácido kójico
es formado directamente a partir de la glucosa. Aunque el acetato y el etanol
13
pueden también usarse como fuente de carbono para la producción del ácido
kójico, sino que también aumenta la formación de aflotoxina [2,9]. En la Fig. 2
muestra la estructura del ácido kójico y en la Tabla 1 las características físico-
químicas.
Fig. 2.-Estructura química del ácido kójico
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS
Tabla 1.-Propiedades físicas del ácido kójico
Formula empírica C6H6O4
Peso molecular 142.12 gr/mol
Punto de fusión 152 oC
Solubilidad en agua 43.85 gr/lt
.
FILTRACIÓN
La filtración separa sólidos de un líquido, al pasarlos a través de un soporte sólido,
ó un medio de filtrado. Es un método directo para obtener en las etapas finales
cristales con características adecuadas al tipo de producto. Sin embargo, el
reducido tamaño de las partículas de interés y la facilidad de deformación de los
microorganismos hacen a la filtración de licores de fermentación y a otras mezclas
biológicas, difíciles de filtrar. Es necesario por esto el uso de coadyuvantes y
optimizado de los filtros, ya que sin uso los procesos pueden demandar más
tiempo y el entorpecimiento del proceso [8].
14
CRISTALIZACIÓN
La cristalización es un método ya establecido usado en la recuperación inicial de
ácidos orgánicos y amino ácidos, más ampliamente usado para la purificación final
de un diverso rango de compuestos. Consiste en la formación de partículas
sólidas de forma y tamaño definido de una fase líquida homogénea, es la forma
más antigua de purificación. El proceso inicia a partir de una solución concentrada,
homogénea y caliente próxima a su límite de saturación, la cual es enfriada
lentamente en un ambiente libre de contaminación hasta que unos pequeños
cristales aparecen. Los cristales son sólidos de alta pureza, lo que los hace
idóneos para la recuperación de productos que requiere altos estándares
químicos; usualmente antibióticos, sales orgánicas, ácidos orgánicos, etc. Es una
operación necesaria para todo producto químico que se presenta comercialmente
en forma de polvos o cristales [9].
SECADO
El secado de los microorganismos y sus productos es generalmente la última de
las operaciones unitarias efectuadas en los proceso de manufactura. Consiste en
la remoción final de agua de un material sensible al calor, asegurando que no
habrá una desnaturalización en las propiedades deseadas del producto; el secado
resulta viable debido a:
* Reducción en los costos de transportación
* El material es más fácil de manejar
* Puede ser almacenado de una manera más práctica
Previo al secado debe haber etapas en donde el exceso de agua sea removido
por métodos como la filtración, centrifugación con el objetivo de reducir los costos
de generación de calor [8].
15
PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO KÓJICO
E l proceso de purificación inicia con la remoción de los sólidos insolubles, en este
caso la biomasa. una vez completada la ó las filtraciones necesarias se pasa a la
etapa de aislamiento, en la que se emplean generalmente solventes en los que el
soluto de interés es soluble, una vez hecho el aislamiento se procede a la
concentración del producto, después que el producto se concentra con una pureza
adecuada a sus características, pasa a la etapa de purificación, esta puede ser por
cristalización, finalmente después de obtener un producto de adecuada pureza en
cristales se procede al secado y finalmente al embasado [8].
PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADAS
CINÉTICA PARA LA OBTENCIÓN DEL ÁCIDO KÓJICO
Se realizaron varias cinéticas de crecimiento, para definir el medio de cultivo que
se lograra obtener mejor rendimiento del ácido kójico y así, estar en condiciones
de llevar a cabo el escalamiento. En la Tabla 2 se describen los contenidos y
concentraciones de las ocho diferentes formulaciones, a las que les llamamos:
(M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7 Y M8).
MEDIOS PREPARADOS PARA REALIZAR LAS CINÉTICAS
Tabla 2 Muestra las diferentes formulaciones de los medios que fueron probados (M1,
M2, M3, M4, M5, M6, M7 Y M8).
M1
SACAROSA 100 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 2.5 gr/lt
MgSO4*7H2O 4 gr/lt
K2HPO4 2 gr/lt
INOCULO 35000 esp/ml
16
M2
GLUCOSA 100 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 2.5 gr/lt
MgSO4*7H2O 4 gr/lt
K2HPO4 2 gr/lt
INOCULO 35000 esp/ml
M3
SORBITOL 100 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 2.5 gr/lt
MgSO4*7H2O 4 gr/lt
K2HPO4 2 gr/lt
INOCULO 35000 esp/ml
M4
ALMIDON 100 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 2.5 gr/lt
MgSO4*7H2O 4 gr/lt
K2HPO4 2 gr/lt
INOCULO 35000 esp/ml
M 5
ALMIDON 75 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 2.5 gr/lt
MgSO4*7H2O 0.1 gr/lt
K2HPO4 0.05 gr/lt
[INOCULO] 35000 esp/ml
17
M 6
M 7
M 8
ALMIDON 75 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 5 gr/lt
MgSO4*7H2O 0.1 gr/lt
K2HPO4 0.05 gr/lt
[INOCULO] 3500 esp/ml
ALMIDON 75 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 5 gr/lt
MgSO4*7H2O 0.1 gr/lt
K2HPO4 0.05 gr/lt
[INOCULO] 35000 esp/ml
ALMIDON 75 gr/lt
EXTRACTO DE LEVADURA 5 gr/lt
MgSO4*7H2O 0.1gr/lt
K2HPO4 0.05 gr/lt
[INOCULO] 309600 esp/ml
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Fig. 3.-Hongo Aspergillus Oryzae tomada
Con microscopio de transmisión (1000 x)
Fig. 4.- Hongo Aspergillus oryzae [11]
REACTIVOS UTILIZADOS PARA LA PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS
Extracto de levadura.
Mg SO4*7H2O.
KH2PO4.
Cloruro férrico.
FUENTE DE CARBONO
Almidón de maíz.
Sacarosa.
Glucosa.
Sorbitol.
19
EQUIPOS DISPONIBLES EN EL LABORATORIO
En las figuras de la 5 a la 14 se muestra el equipo utilizado.
Fig. 5.-AUTOCLAVE
Fig. 6.- ESPECTROFOTOMETRO (MODELO JENWAY 6305)
Fig. 7.-CENTRIFUGA (MODELO LABNET Z 1OO A)
20
Fig. 8.- AGITADORA (MODELO LUMISTELL)
Fig. 9.-TERMOAGITADOR (MODELO IKA C-MAG HS 7)
Fig. 10.-BALANZA ANALITICA (MODELO AND HR-200)
21
Fig. 11.-ESTUFA (MODELO TERLAB)
Fig. 12.-MICROSCOPIOS
Fig. 13.-BOMBA DE VACIO (MODELO EVAR MOD-EV-40)
22
Fig. 14.-MICROPIPETAS (MODELO THERMO SCIENTIFIC DH4169-4500)
PROCEDIMIENTO
Proceso para la preparación del medio usando diferentes fuentes de
carbono
Primeramente se preparo 1 lt del medio en 5 matraces Erlenmeyer de 500 ml
agregándole 200 ml de agua destilada a cada uno. A demás se agregaron 20 gr
de fuente de carbono a los matraces con el agua destilada. Después se pusieron a
esterilizar los matraces que contienen el agua y la fuente de carbono a 121 oC,
15Lbf durante 15 minutos. De igual forma se preparó el extracto de levadura (2.5
gr/lt) y se puso a esterilizar a 121 oC, 15Lbf durante 15 minutos. También se
preparó MgSO4. 7H2O (0.625 g/25 ml) y se puso a esterilizar, a 121 OC, 15Lbf
durante 15 minutos. Posteriormente se preparó K2HPO4 (0.625 g/25 ml) y se
puso a esterilizar, a 121 OC, 15Lbf durante 15 minutos. Se esterilizó agua
destilada (50 ml) para preparar la concentración de esporas (35000 esp/ml). Una
vez esterilizado todo se le agregó a los matraces Erlenmeyer que contenían el
agua destilada junto con el almidón, el extracto de levadura, MgSO4. 7H2O,
K2HPO4 y el inoculo (esporas). Se colocaron en agitación a 200 RPM con un
movimiento rotatorio a temperatura ambiente en un rango de 25 a 30OC.
23
Posteriormente los días 7, 10 y 13 se alimentaron los medios con la fuente de
carbono para el proceso en FED-BATCH (previamente esterilizado).
NOTA.- Se preparó el medio por separado, porque si se hace junto se forman
sales y se precipitan las proteínas del extracto de levadura.
Proceso para la preparación del medio de cultivo con almidón como
fuente de carbono
En un primer momento se preparó 1.5 lts del M1, en 5 matraces Erlenmeyer de
250 ml agregándole 100 ml de agua destilada a cada uno, y 5 matraces
Erlenmeyer de 500 ml agregándole 200 ml de agua destilada a cada uno.
También se le agregó 7.5 gr de almidón a los matraces Erlenmeyer que contienen
100 ml de agua destilada, y 15 gr a los de 200 ml de agua destilada.
Posteriormente se pusieron a esterilizar los matraces Erlenmeyer con agua
destilada y el almidón juntos, a 121 OC, 15Lbf durante 15 min. De igual forma se
preparó extracto de levadura (2.5 g/l) y se puso a esterilizar, a 121 OC, 15Lbf
durante 15 min. Después se preparó MgSO4. 7H2O (.625 g/25 ml) y se puso a
esterilizar, a 121 OC, 15Lbf durante 15 min. También se preparó K2HPO4 (.625
g/25 ml) y se puso a esterilizar, a 121 OC, 15Lbf durante 15 min. A demás se
esterilizó agua destilada (50 ml) para preparar la concentración de esporas
(35000 esp/ml). Ya estando todo esterilizado se le agrego a los matraces
Erlenmeyer que contenían el agua destilada junto con el almidón, el extracto de
levadura, MgSO4. 7H2O, K2HPO4 y el inoculo (esporas). Una vez todo preparado
se colocó en agitación a 200 RPM con un movimiento rotatorio a temperatura
ambiente en un rango de 25 a 30OC. Finalmente los días 7 y 10 se alimentaron el
medio (Esterilizado).
NOTA.- Se prepararon los medios por separado, porque si se hace junto se
forman sales y se precipitan las proteínas del extracto de levadura.
24
PREPARACIÓN DEL INÓCULO
Se esterilizó agua destilada (50ml) en un vaso de precipitado en la autoclave a
una temperatura de 121oC, 15Lbf durante 15 min. Se retiró de la autoclave el
agua esterilizada y se dejó enfriar para agregarle las esporas. Después se agregó
una determinada concentración de esporas al vaso que contiene el agua estéril.
Posteriormente se tomó una muestra del inóculo y se leyó en el
espectrofotómetro. Previamente se hizo un barrido de esporas en el que consistió
en medir la absorbancia en el espectrofotómetro de 500 a 600 ƛ(nm) midiendo de
5 en 5. Lo cual se muestra la absorbancia máxima de 0.362 en 570 nm, (Fig.15).
Fig.15. Barrido de concentración de esporas para seleccionar la longitud de onda.
0.325
0.33
0.335
0.34
0.345
0.35
0.355
0.36
0.365
500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
Barrido de esporas
Abs
λ (nm)
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Con la finalidad de elegir el conteo de esporas en él y durante el proceso se procedió a realizar una curva de calibración, considerando la concentración contra la absorbancia (Fig.16)
Fig.16 Curva de calibración para calcular el número de esporas
Ecuación: [esporas]= (A-0.0153) / 0.0008= esp/ml.
CRISTALIZACION DEL ÁCIDO KÓJICO
Cuando se terminó el proceso de la fermentación (día 15), se procedió a sacar los
matraces Erlenmeyer con el medio de la agitación para la obtención del ácido
kójico, para esto se realizó de la siguiente forma:
Primeramente se filtró el medio de los matraces Erlenmeyer con una malla de 50
micras para separar la biomasa miceliar del ácido. Después se evaporó para que
la concentración quedara a 50 gr/lt. Posteriormente se dejó enfriar un poco y se le
agregó carbón activado para separar las impurezas del ácido. Se centrifugó para
clarificar por 5 minutos a 4000 rpm. También se filtró el ácido con papel filtro
Whatman del No 5(2.5 micras) recibiéndolo en un cristalizador para clarificarlo. Se
dejó cristalizar para posteriormente recoger el ácido (enfriándolo a 4oC). Una vez
cristalizado se lavó (con etanol al 70%). Después se recristalizó dos veces para
hacerlo puro (98%). El cristal que se obtuvo del lavado, se le agregó agua
destilada para diluir el cristal y se puso de nuevo a evaporar. De igual forma se
repiten los pasos desde que se le agrega el carbón activado hasta la segunda
y = 0.0008x + 0.0153R² = 0.9865
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 100 200 300 400
Ab
sorb
anci
aconteo de esporas ƛ570
esp/ml (e4)
26
recristalización. Después de la segunda recristalizada se metió a la estufa a 60oC
por 8 hrs. Y finalmente se obtuvo el ácido kójico. El siguiente esquema requiere el
flujo de trabajo realizado
ESQUEMAS QUE DESCRIBE LA OBTENCIÓN DE LA
CRISTALIZACION DEL ÁCIDO KÓJICO
27
En la Fig. 17 muestra un barrido de resonancia magnética del estándar y el
producto obtenido (ácido kójico) para compararlos.
Fig17.- Escan comparativo del acido kójico entre el estándar (SIGMA-ALDRICH) y el
producido en esta trabajo.
28
FORMACIÓN DE LOS CRISTALES
Ya que se filtro el ácido kójico recibiéndose en el cristalizador, se dejó cristalizar
bajando la temperatura o metiéndolo al refrigerador a 4o C aproximadamente 4
horas, dependiendo la cantidad, para que cristalice el ácido kójico (Fig. 18).
Fig. 18.- Obtención de cristales del ácido kójico
LAVADO DE LOS CRISTALES
El lavado de los cristales consistió en separar los cristales del cristalizador donde
se encuentra, y se colocaron los cristales obtenidos en un embudo con el papel
filtro Whatman del No 1 (11 micras) para filtrarse con una bomba de vacio (EVAR
MOD-EV-40), después se le agregó a los cristales etanol para quitar las impurezas
(Fig. 19).
Fig. 19.-Filtrado del ácido kójico
29
BALANCE DE LA RECUPERACIÓN DEL ÁCIDO KÓJICO
Esquema de flujo que muestra el trabajo realizado para la recepción del metabolito
30
El balance de recuperación de ácido kójico se obtuvo un total de 17.1% del ácido
kójico a partir del inicio del proceso.
PROCEDIMIENTOS DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
SISTEMÁTICAMENTE
Todos los días se tomaron muestras del medio en matraces (Erlenmeyer) de
500ml que se mantuvieron en agitación para obtener la concentración de ácido
kójico que se fue produciendo, por lo que se procedió de dos formas:
Con UV (268nm) y UV visible (500nm).
31
Medición de la muestra con UV:
Se tomó 100 µL del medio y se colocó en un matraz aforado de 100 mililitros,
posteriormente se toma del matraz una muestra y se colocó en una cubeta de
cuarzo para medir la absorbancia en el espectrofotómetro (Jenway 6305) a 268
nm (1:1000).
Medición de la muestra con UV visible:
Se tomó 100 µL del medio y 1militro del cloruro férrico en un matraz aforado de
100 mililitros. Enseguida se tomó una muestra y se colocó en una cubeta para
medir la absorbancia en el espectrofotómetro (Jenway 6305) a 500 nm. (1:1000)
NOTAS:
1.- Antes de medir en el espectrofotómetro se prendió 15 min antes.
2.- Se calibro con agua destilada para tomar estas muestras.
PREPARACION DEL CLORURO FERRICO AL 1%
Se pesó 0.1 gr de cloruro férrico y se puso en un matraz aforado de 10 mililitros
aforándose.
32
RESULTADOS
En las Figura 20 y 21 se muestra el crecimiento de la producción de ácido kójico
en diferentes fuentes de carbono con los medios M1, M2, M3, Y M4.
Fig.20 Se muestra el crecimiento de la producción de ácido kójico en diferentes
fuentes de carbono con el M1, M2, M3, Y M4, medidos con el método en UV.
Fig.21 se muestra el crecimiento de la producción de ácido kójico en diferentes
fuentes de carbono con el M1, M2, M3, Y M4, medidos con el método visible.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
sacarosa
glucosa
sorbitol
almidon
t (d)
[gr/
lt]
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
sacarosa
glucosa
sorbitol
almidon[gr/
lt]
t (d)
33
En la Fig. 22 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la
medición con el espectrofotómetro los dos rangos de UV. El color rojo, se mostró
cuando se puso la muestra en el rango de visible y azul la tomada con UV. Cabe
mencionar que estas muestras se tomaron del medio 5 en el proceso F. BATCH.
La muestra que se midió con UV alcanzo valores más altos (36.22 g/l), que
cuando se midió con visible (34.28 g/l).
Fig.22 Se muestra la relación que hay en la forma de medir el incremento del acido kójico por los dos métodos en un proceso FED-BATCH.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
268nm
500nm
[gr/
ml]
t (d)
34
En la fig. 23 Se muestra los resultados obtenidos con diferentes volúmenes a 200 rpm. Se obtuvo mayor concentración con el volumen de 100 ml (22.16 g/l), comparado con los volúmenes mayores, donde la concentración fue inferior. 300: 250: 200; y 150 ml y 11.17 g/l; 19.4 g/l, 21.04 g/l, 20.09 g/l respectivamente. Se muestra la concentración que se obtuvo con los diferentes volúmenes de medio (100, 150, 200, 250, y 300 ml) para tener las diferencias en matraces de 500 ml y con el M 7.
Fig. 23 Muestra la comparación de los diferentes resultados de acuerdo a
los volúmenes trabajados.
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12 14 16
100ml[gr/lt]
150ml[gr/lt]
200ml[gr/lt]
250ml[gr/lt]
300ml[gr/lt]
t (d)
[gr/
ml]
35
En la Fig. 24 se observa el proceso FED-BATCH y los resultados obtenidos en el proceso. También muestra el incremento de la producción de ácido kójico en diferentes concentraciones de esporas (3500, 35000 y 309600 esp/ml) tomadas en la forma visible con los medios M6, M7, y M8, en el proceso F. BATCH.
Fig. 24 Se muestra el incremento de la producción de ácido kójico, con el M6, M7 y
M 8 en el proceso F. BATCH.
En la Fig. 25 se observa el proceso BATCH y los resultados obtenidos en el
proceso. También muestra el incremento de la producción de ácido kójico en
diferentes concentraciones de esporas (3500, 35000 y 309600 esp/ml) tomadas en
la forma visible con los medios M6, M7, y M8, en el proceso BATCH.
Fig. 25 Se muestra el incremento de la producción de acido kójico, con el M6, M7
y M 8 en el proceso BATCH.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[gr/lt] 1
[gr/lt] 2
[gr/lt] 3
t (d)
[gr/
lt]
1= 3500 esp/ml2= 35000 esp/ml
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12 14
[gr/lt] 1
[gr/lt] 2
[gr/lt] 3
t (d)
[gr/
lt]
1= 3500esp/ml2= 35000esp/ml3=309600esp/ml
36
En la Fig. 26 se observa el proceso FED-BATCH y los resultados obtenidos en el proceso. También muestra el incremento de la producción de ácido kójico en diferentes concentraciones de esporas (3500, 35000 y 309600 esp/ml) tomadas en la forma UV con los medios M6, M7, y M8, en el proceso F. BATCH.
Fig.26. Se muestra el incremento de la producción de acido kójico, con el M6, M7 y M 8 en el proceso F. BATCH.
En la Fig. 27 se observa el proceso BATCH y los resultados obtenidos en el proceso. También muestra el incremento de la producción de ácido kójico en diferentes concentraciones de esporas (3500, 35000 y 309600 esp/ml) tomadas en la forma UV con los medios M6, M7, y M8, en el proceso BATCH.
Fig. 27 Se muestra el incremento de la producción de ácido kójico, con el M6, M7 y
M 8 en el proceso BATCH.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[gr/lt] 1
[gr/lt] 2
[gr/lt] 3
t (d)
[gr/
lt]
F.BATCH (vis) 1=3500 esp/ml2=35000 esp/ml3=309600 esp/ml
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14
[gr/lt] 1
[gr/lt] 2
[gr/lt] 3
t (d)
[gr/
lt]
1= 3500esp/ml2= 35000esp/ml3=309600esp/ml
37
En las Fig. 28 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la medición con el espectrofotómetro de los procesos (F. BATCH Y BATCH). El color rojo, se mostró el proceso F. BATCH y azul el proceso BATCH. Cabe mencionar que estas muestras se tomaron del M6. En el proceso F. BATCH alcanzo valores más altos (18.55 g/l) que en el proceso BATCH (10.88 g/l).
Fig. 28.- Se muestra el incremento de las concentraciones de ácido kójico con el M6 en los dos procesos.
En la Fig. 29 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la medición con el espectrofotómetro de los procesos (F. BATCH Y BATCH). El color rojo, se mostró el proceso F. BATCH y azul el proceso BATCH. Cabe mencionar que estas muestras se tomaron del M7. En el proceso F. BATCH alcanzo valores más altos (13.24 g/l) que en el proceso BATCH (11.93 g/l)
Fig. 29 Se muestra el incremento de las concentraciones de ácido kójico con el
M7 en los dos procesos.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16
F.BATCH
BATCH
t (d)
[gr/
lt]
3
3500 esp/ml
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14 16
F.BATCH
BATCH
[gr/
lt]
t (d)
d
35000 esp/ml
38
En la Fig. 30 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la medición con el espectrofotómetro de los procesos (F. BATCH Y BATCH). El color rojo, se mostró el proceso F. BATCH y azul el proceso BATCH. Cabe mencionar que estas muestras se tomaron del M8. En el proceso F. BATCH alcanzo valores más altos (12.86 g/l) que en el proceso BATCH (10.02 g/l).
Fig. 30 Se muestra el incremento de las concentraciones de ácido kójico
con el M8 en los dos procesos.
En la Figuras 31 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la medición con el espectrofotómetro de los procesos (F. BATCH Y BATCH). El color rojo, se mostró el proceso F. BATCH y azul el proceso BATCH. Cabe mencionar que estas muestras se tomaron del M5 por el método visible. En el proceso F. BATCH alcanzo valores más altos (34.28 g/l) que en el proceso BATCH (10 g/l).
Fig. 31 Se muestra el incremento de las concentraciones de ácido kójico con
el M5 por el método visible.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10 12 14 16
F.BATCH
BATCH
t (d)
[gr/
lt]
309600 esp/ml
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2 4 6 8 10 12 14 16
F.BATCH
BATCH
t (d)
[gr/
lt]
39
Fig. 32 Se muestra la diferencia de color que se manifiesta al tomar la medición
con el espectrofotómetro de los procesos (F. BATCH Y BATCH). El color rojo, se
mostró el proceso F. BATCH y azul el proceso BATCH. Cabe mencionar que estas
muestras se tomaron del M5 por el método UV. En el proceso F. BATCH alcanzo
valores más altos (36.22 g/l) que en el proceso BATCH (10.02 g/l).
Fig. 32 Se muestra el incremento de la concentración de ácido kójico con el M5
tomada por el método UV.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2 4 6 8 10 12 14 16
F.BATCH
BATCH
t (d)
[gr/
ml]
40
CONCLUSIONES
Se llegó a la conclusión que la mejor fuente de carbono para la mayor producción
de ácido kójico fue la del almidón, ya que se obtuvo una concentración de 31 gr/lt
muy por arriba de la fuente de sacarosa que fue la más cercana (20 gr/lt).
El medio de cultivo de menor concentración de esporas (3500/ml) junto con el
extracto de levadura de 2.5 gr/lt fue en el que mejor resultados se obtuvieron.
Debidos a que se obtuvo una concentración mayor (36 gr/lt) en el proceso de
fermentación modalidad F.BATCH que en la modalidad BATCH (10 gr/lt). Esta
diferencia, favoreció la recuperación del metabolito, ya que la concentración que
se obtuvo, estuvo muy cerca al punto de saturación del ácido kójico (43.85 gr/lt).
Por lo que, para su evaporación, solamente se transcurrió dos horas a 110oC.
Enseguida fue transportado al proceso de filtrado, clarificado y cristalizado. Esto
demostró que la fermentación en el proceso en F.BATCH fue mejor que en el
proceso BATCH, ya que en este solamente se obtuvo 10 gr/lt y con las mismas
condiciones.
41
RECOMENDACIONES
Se propone realizar balances de materia, para obtener mayor recuperación del
ácido kójico, ya que solamente se recuperó el 17.1% del total del ácido kójico que
se produjo. También se recomienda, realizar más cinéticas de crecimiento para
llegar a optimizar el medio de cultivo con mayor rendimiento y lograr obtener una
concentración de 50 gr/lt.
Por otro lado, es importante realizar los ensayos pertinentes de cinéticas de
crecimiento, no solo con las concentraciones adecuadas, sino también realizar
escalamientos con volúmenes mayores. Además, obtener los coeficientes de
transferencia de oxígeno de acuerdo a la concentración de sustrato, tamaño del
inóculo y factores físicos químicos a volúmenes mayores (10, 50 y 100 L) Esto es
inminente para el logro en la obtención de buenos rendimientos del producto
42
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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resuspended mycelia of Aspergillus flavus. Can J Microbiol 28:1340–1346.
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