Novedades en microbiología

Dra. Victoria MorenoMicrobióloga

Hospital del SalvadorREDSALUD Providencia

Objetivo y método

• Objetivo:• Evaluar el rendimiento de cinco métodos para probar susceptibilidad a fosfomicina

en comparación con el método de referencia en laboratorios de rutina.

• Métodos:• 10 laboratorios recolectaron 100 cepas productoras de BLEE (80 de Escherichia coli y

20 de Klebsiella pneumoniae) entre 2016-2017.• 1 aislado por especie/paciente de muestras de orina, sangre, tracto respiratorio.• Se estudiaron utilizando

• Etest (Biomerieux ®), MTS (Liofilchem®)y difusión con disco (Oxoid®) • Vitek2 (Biomerieux®), Phoenix (BD®)

• Todos los aislados se estudiaron para confirmar BLEE• Comparación con método de referencia: dilución en agar según guías ISO (0.25-128

mg/L + 25 mg/L G6P)

Interpretación de resultados

• Interpretación:

• Puntos de corte EUCAST

• Métodos por CIM: S ≤ 32 mg/L, R > 32 mg/L

• Difusión con discos: • S ≥ 24 mm, R < 24 mm

• Puntos de corte para K. pneumoniae no aplica en difusión con disco • Definición de puntos tentativos

Evaluación

• Concordancia esencial/categórica y discrepancias (EM, EMM)

• Se determinaron los puntos de corte epidemiológico (ECOFF) para cada especie por ECOFF finder.

• Total: 976 aislados

• E. coli: 775 (95.9% CIM ≤ 32 mg/L)

• K. pneumoniae: 201 (87.6% CIM ≤ 32 mg/L)

• BLEE confirmada: 947

Distribución de la CIM para E. coli

ECO

FF

EUC

AST

CLS

I

Resultados comparación métodosE. coli K. pneumoniae

Método Concordancia esencial

Método Concordancia esencial

Etest 91% Etest 86%

MTS 77% MTS 80%

Ptos corte tentativos : S ≥ 16 mm, R < 16 mm

96.0% 1.7% 22.7%

Habilidad de los métodos “CIM” para diferenciar WT de no-WT

EM: WT por método referencia y NO -WT por método estudiadoEMM: NO-WT por método de referencia y WT por método estudiado

Conclusión

• La actividad de fosfomicina contra E. coli BLEE es alta.

• A pesar de la alta concordancia categórica para todos los métodos en E. coli, NINGUNO de los métodos se desempeñó satisfactoriamente debido a la pobre detección de aislados RESISTENTES (Altas tasas de EMM)

• Basado en los puntos de corte actuales, difusión con disco es un método NO fidedigno para diferenciar poblaciones WT- noWT con EMM de 61.3% para E. coli.

Rapid Fosfomycin/E.coli NP test

• Fundamento: técnica basada en la hidrólisis de carbohidratos que detecta crecimiento bacteriano (o ausencia de crecimiento) en la presencia de una concentración definida de fosfomicina.

• Detección rápida de E. coli resistente a fosfomicina : 1 h 30 min

Materiales y métodos

• Aislados

• 100 E. coli de muestras clínicas

• 22 resistentes a fosfomicina• 14 aislados con R adquirida debido

a fosA3 gene

• 8 aislados con mecanismo de resistencia desconocido

• 78 aislados sensibles a fosfomicina

• Puntos de corte EUCAST

Materiales y métodos

• Solución stock de fosfomicina• Concentración 50 mg/ml• 1 mes a 4 ℃

• Rapid Fosfomycin NP solution • Medio de cultivo: MHB-CA al 2.5%• Indicador de Ph: rojo fenol 0.005%• D(+)- glucosa 1 %• Agua destilada• 1 semana 4 ℃ y 1 año a -20 ℃

• Concentración final fosfomicina: 40 ug/ml

Crecimiento de E. coli en glucosa

Resultados

Primera fila: RF NP + NaCl (pocillos no inoculados)Columnas 2 y 4: RF NP + FOSSegunda fila: Control (-) y Control (+)Tercera fila: Muestras testeadas N23 y Un 421

RF NP: rapid fosfomycin NP solutionFOS: fosfomycin

¿Cómo se lee?Control negativo y N23 crecen en ausencia de FOS (amarillo) y no crece en presencia de FOS (naranjo)Test (-) o S FOS.

Control positivo y el UN421 crece en presencia y ausencia de FOS (amarillo) Test (+) o R FOS

Resultados

• 78 aislados S: • 77 test negativo

• 1 test positivo (1 EM)

• 22 aislados R:• 22 test positivos

• S: 100%

• E: 98.7%

Conclusión

Ventajas

• Técnica amigable, rápida, costo-efectiva.

• Alta sensibilidad y especificidad

• Detecta resistencia independiente del mecanismo

• Útil considerando que uso de técnicas moleculares no es posible. (pérdida de mecanismos de transporte activos o mutaciones en el gen murA)

Limitaciones

• Interpretación de los cambios de color de manera visual

• No discrimina entre mecanismos de resistencia cromosomales o adquiridas

• Sólo para E. coli

Rapid ResaPolymyxin Acinetobacter/Pseudomonas NP test• Fundamento: su principio está basado en el hecho que células

metabólicamente activas reducen el azul Resazurin al producto rosado Resorufin.

• Detección rápida de Acinetobacter/Pseudomonas resistentes a colistin: 4 h

Método

• Cepas:• Total: 92 aislados

• 88 aislados clínicos (portación intestinal e infecciones clínicas) y 4 ambientales (suelo de Nigeria)• 43 A. baumannii (13 R colistin)

• 49 P. aeruginosa (10 R Colistin)

• Ninguno poseía el gen mcr-like (mcr-1 -5)

• Estudio susceptibilidad: • Microdilución en caldo, en triplicado

• Puntos de corte EUCAST: R > 2 mg/L y S ≤ 2 mg/L

Reactivos y soluciones

• Solución stock de Colistin sulfato

• Diluido en MHB-CA en tubos de vidrio

• Concentración 0.2 mg/ml

• Almacenado a 4 ℃

• 1 año a -20 ℃

• Solución para el test:

• Medio MH sin y con colistin sulfato (concentración 4.16 mg/L)

• Concentración final Colistin: 3.75 mg/L

¿Cómo leo los resultados?

Pocillos con NaCl: sin crecimiento (azules)Pocillos con bacteria SIN colistin (B1, C1, D1): azulpúrpura o rosado Pocillo con C(-) + COL (B2) : azul Pocillo con C(+) + COL (C2): azulpúrpura

Resultados

• 69 aislados A. baumannii y P. aeruginosa sensibles a colistin (MDC)

• Rango CIMs de colistin: <0.125 a 1 mg/L

• Todos excepto tres fueron identificadas como susceptibles por el Rapid ResaPolymyxin A/P NP test.

• S 100% E 97% (3 errores mayores pero ningún error muy mayor)

Especie Origen Tipo de aislado

Fenotipo CIM MDC colistin (mg/L)

Resultado test

Discrepancia

A. baumannii Nigeria Ambiental S 1 POSITIVO EM

P. aeruginosa Francia Clínico S 0.25 POSITIVO EM

P. aeruginosa Francia Clínico S 0.25 POSITIVO EM

Conclusión

• Test con excelente sensibilidad y especificidad

• Detección de resistencia en menos de 4 h

• Barato y fácil de implementar……

• Desventaja: no da valor de CIM, tamaño muestral

Primer reporte en Chile de colonización por Candida auris en un paciente procedente de

India

Caso

• Paciente de nacionalidad India y radicado en Chile hace 30 años.

• DM tipo II de larga data.

• Agosto 2018: signos de isquemia y necrosis del 4to ortejo pie izq. asociado a celulitis.

• 20.08.2018: amputado y completa 24 días de hospitalización por dificultad en el manejo de su DM.

• Octubre 2018: • Amputación del 3er y 5to ortejo pie

izq. con diagnóstico de pie diabético con complicaciones vasculares, sin signos de infección.

• 26.12.18 :• Ingresó a pabellón

• cultivos de tejido del lecho de amputación y de una úlcera plantar en relación a la base del 5to ortejo.

• Cultivo corriente (-) 48 horas de incubación.

• 31.12.18 se estudió una colonia blanca pequeña, tinción de Gram levaduras.

• 02.01.19 se procesó en equipo VITEK 2, actualizado con la versión 8.01, dando como resultado Candida auris con 99% de concordancia.

• Se envió a identificación por MALDI-TOF Microflex LT (Bruker Daltonics), dando como resultado Candida auris con un score de 1.66.

• 17.01.19 ISP confirmó la identificación mediante secuenciación genómica y reportó el antifungigrama por microdilución en caldo según CLSI

• Fluconazol CIM > 64 μg/ml, Anfotericina B CIM 1 μg/ml, Voriconazol e Itraconazol CIM 0.5 μg/ml y Caspofungina CIM 0.5 μg/ml.

Situación global

www.cdc.gov/fungal/candida-auris/recommendations.html

Cuadro clínico

Errores de identificación

• Las recomendaciones del CDC 2018:

• MALDI-TOF de Bruker Biotyper con la biblioteca actualizada Bruker FDA-approved MALDI Biotyper CA System library (Version Claim 4)

• VITEK (MALDI-TOF) MS IVD con la base de datos Saramis Version 3.2.

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Puntos de corte recomendadosClase Punto de corte

CIM tentativo (ug/mL)

Comentario

Fluconazol ≥ 32 CIM entre aislados testeados en CDC fue ≥ 256. con CIM ≥ 32 presentan gen Erg11

Voriconazol y otros azoles de 2da generación

N/A Aislados que son R a Fluconazol podrían responder a otros azoles

Anfotericina B ≥ 2 Análisis de C. auris en un modelo de infección en ratón indica que el punto de corte debe ser 1 o 1.5. Aislados con CIM de ≥ 2 deben ser considerados R

Anidulafungina ≥ 4 Basado en la distribución de CIMs de equinocandinas de aprox. 100 aislados de diversas localizaciones geográficas

Caspofungina ≥ 2

Micafungina ≥ 4

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Control y prevención de infección por C. auris

• Habitación individual con precauciones estandar y de contacto

• Enfasis en adherencia a la higiene de manos

• Limpieza y desinfección ambiental y equipos reutilizables con los productos recomendados (aseo diario y terminal)

• Comunicación entre centros si el paciente es trasladado

• Estudio de contactos para identificar nuevos casos o colonización por C. auris.

• Vigilancia de nuevos casos para detectar transmisión en curso.

Candida auris: a review of the literature. Clin Microbiol Rev 31:e00029-17https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-infection-control.html

Estudio de colonización

• Hisopado axilar e ingle y búsqueda en otros sitios con cultivos positivos anteriores (por ejemplo, orina y esputo).

• Sin antifúngicos activos contra C. auris en el momento de estas evaluaciones (esperar 1 semana)

• Espere al menos 48 horas después de la administración de un antiséptico tópico (por ejemplo, clorhexidina), antes de realizar cualquier prueba de colonización por C. auris.

• Hisopado (+): repetir 3 meses después

• Hisopado (-): repetir en 1 semana

Candida auris: a review of the literature. Clin Microbiol Rev 31:e00029-17https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-infection-control.html

Desinfección ambiental

• Amonio cuaternario NO es efectivo

• Productos LIST K: EPA's Registered Antimicrobial Products Effective against Clostridium difficile Spores

• Hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno

• Productos aprobados que disminuyen ≥ 4 log C. auris:• Oxivir Tb• Clorox healthcare hydrogen peroxide cleaner

disinfectant• Prime Sani-cloth wipe• Super Sani- cloth wipe

Candida auris: a review of the literature. Clin Microbiol Rev 31:e00029-17https://www.cdc.gov/fungal/candida-auris/c-auris-infection-control.html