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Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social
IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE LACTOBACILLUS SP. CON POTENCIAL PROBIÓTICO.
Dra. Maribel Jiménez Edeza
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NOMBRE DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y GENÉTICA
DE LACTOBACILLUS SP. CON POTENCIAL PROBIÓTICO
CICLO: 2021-2022-1A
MODALIDAD UNIDISCIPLINARIA
BRIGADISTA (S): CASAREZ VELAZQUEZ HEBERTH ALAN
ASESOR(A) DE PROYECTO: DRA. MARIBEL JIMÉNEZ EDEZA
Fecha de autorización 23/07/2021
Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social
IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE LACTOBACILLUS SP. CON POTENCIAL PROBIÓTICO.
Dra. Maribel Jiménez Edeza
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I. Título del proyecto de servicio social
Identificación morfológica y genética de Lactobacillus sp. con potencial
probiótico.
II. Antecedentes
El intestino humano es el hábitat natural de una población numerosa,
diversa y dinámica de microorganismos, principalmente bacterias, que se han
adaptado a la vida en las superficies de mucosas o en la luz del intestino. El
ecosistema microbiano del intestino incluye especies nativas que colonizan
permanentemente el tracto gastrointestinal (GI), se adquieren al nacer y durante
el primer año de vida; por otro lado, también incluye una serie variable de
microorganismos vivos que transitan temporalmente por el tubo digestivo
obtenidas a través de los alimentos (Guarner, 2007). La asociación entre el
hospedero humano y su microbiota asociada otorga a ambos una ventaja en el
ambiente, lo que permite el éxito de su sobrevivencia como organismos
simbiontes. Dada la diversidad de microorganismos presentes en el tracto GI, las
funciones primarias que puede desempeñar la microbiota intestinal (MI) incluyen
funciones de protección, metabólicas y tróficas (Icaza-Chávez, 2013; García-
Mazcorro y col., 2015).
La MI está modulada principalmente por una combinación de factores,
tales como la edad, la dieta, el parto, el uso de antibióticos, el estilo de vida, la
higiene y la genética del hospedero. Adicionalmente, factores dentro del modo de
parto, el tipo de lactancia y la edad gestacional generan importancia ya que
modulan la MI durante los primeros estadios de la vida; cuando la MI alcanza la
madurez es más estable, pero siguen existiendo factores que influyen en su
capacidad de sobrevivencia a condiciones inadecuadas de crecimiento
(Domínguez-Bello y col., 2010; Rothschild y col., 2018). La aparición y
diseminación de enfermedades infecciosas causadas por bacterias patógenas en
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poblaciones humanas es un problema en todo el mundo. Las enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA) se encuentran ampliamente extendidas y
constituyen un problema prioritario de salud pública, tanto en países
desarrollados como en aquellos en vías de desarrollo.
Estas enfermedades se caracterizan por producir síntomas como diarrea,
dolores abdominales, vómito, dolor de cabeza, fiebre, alteraciones neurológicas
y otros. Entre los principales enteropatógenos bacterianos están una gran
variedad de serotipos de Salmonella spp., incluyendo S. enterica serovar
Typhimurium y especies como Staphylococcus aureus (Sarrionandia y col., 2011,
Kadariya y col.,2014).
Los organismos de Salmonella spp. pueden aislarse de alimentos o agua
contaminada. Este género bacteriano ha sido considerado un patógeno de los
productos cárnicos y avícolas, y recientemente de productos frescos y
manufacturados. Por otra parte, Staphylococcus aureus se encuentra presente
en el aire, la leche, el agua potable, aguas residuales y, desde luego, la comida
o en el equipo donde los alimentos han sido elaborados (Nataro y col., 2011).
El tracto GI constantemente se encuentra expuesto a compuestos
oxidados. El hierro proveniente de la dieta no se absorbe en gran medida en el
intestino, y su conjunción con ciertas bacterias participa en reacciones de Haber-
Weiss y tipo Fenton generando peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo en la
superficie de la mucosa, comprometiendo la integridad epitelial. El hierro es un
factor de crecimiento importante para muchas bacterias intestinales, y el aumento
de este induce al crecimiento patogénico, volviendo más susceptible al
hospedero a enfermedades intestinales (Babbs, 1990; Ashrafian, 2003).
La composición de la MI tiene gran importancia médica ya que pueden
influir de forma beneficiosa o dañina sobre la salud del hospedero. En condiciones
normales el ecosistema intestinal está en equilibrio y los microorganismos
perjudiciales no ejercen su poder patógeno. Sin embargo, en determinadas
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situaciones, éstos pueden dar lugar a infecciones si se establecen en regiones
del cuerpo en las que no son residentes habituales o cuando su número se
incrementa de forma excesiva debido a perturbaciones del ecosistema intestinal
(Delgado, 2005; García-Mazcorro y col., 2015). La administración de probióticos
en cantidades adecuadas confiere un efecto beneficioso a la salud del hospedero.
Estas bacterias tienen numerosas influencias en el hospedero, ya sea en el
entorno luminal intestinal, en la función de la barrera epitelial y de la mucosa y en
el sistema inmunológico.
Existen algunas características deseables para la implementación de
bacterias probióticas, estas deben estar identificadas, carecer de factores de
virulencia, no producir metabolitos indeseables, adaptación a las condiciones de
la actividad diana, buena adherencia al epitelio del hospedero, capacidad
antioxidante, producción de sustancias antimicrobianas y ausencia de capacidad
de transmisión de resistencia a antibióticos. Aunque los probióticos no sean
colonizadores a largo plazo del tracto GI, sí es relevante que puedan mantenerse
funcionalmente activos en el intestino (Ng y col., 2009; Guarner y col., 2010;
Suárez, 2015 Plaza-Díaz y col., 2019).
Los probióticos de las heces de adultos humanos sanos y lactantes han
sido de al menos dos géneros: Lactobacillus y Bifidobacterium. La mayoría de las
especies de Lactobacillus son habitantes normales y no patógenos en el intestino
humano y su presencia es importante para el mantenimiento del ecosistema
microbiano intestinal. Se ha demostrado que el género Lactobacillus posee
actividad inhibitoria hacia la multiplicación de enteropatógenos y son altamente
competitivos en gran medida debido a su producción de varios compuestos
antimicrobianos (Vernedelli y col., 2009).
Tradicionalmente el estudio de la MI se ha abordado a través del cultivo
de los microorganismos y en su identificación mediante pruebas fenotípicas
clásicas: morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. El cultivo de la MI en medios
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selectivos y diferenciales es en apariencia el método más simple y directo, sin
embargo, no posee una alta fiabilidad debido a la existencia de bacterias no
cultivables. Se sabe que sólo una pequeña proporción de los microorganismos
del tracto GI se pueden cultivar in vitro. Esto se debe principalmente a la
incapacidad de simular con precisión las condiciones de vida de los
microorganismos en su hábitat natural. Entre las desventajas de las técnicas de
cultivo se encuentra la imposibilidad de asegurar que el comportamiento
fenotípico de un microorganismo en el laboratorio sea idéntico a su
comportamiento in vivo, por lo que, el uso de técnicas moleculares permite
caracterizar de manera más comprensiva a las comunidades microbianas en el
tracto GI (Delgado, 2005; Lagier y col., 2012; Dubourg y col., 2013).
Los métodos moleculares buscan la identificación de los organismos en
base a sus similitudes genéticas, en el gen que codifica para la subunidad 16S
del RNA ribosomal. Con la identificación del gen de referencia, las técnicas de
secuenciación masiva y las herramientas bioinformáticas para el tratamiento de
datos, se ha podido conseguir una información sobre el microbioma humano, con
un nivel de detalle sin precedente en cuanto a taxonomía y función de los
microorganismos, lo que ha supuesto una auténtica revolución no solo en su
conocimiento sino también en su implicación en la salud o de enfermedad del ser
humano (Baker y col., 2003; Guarner, 2011; Moya, 2017).
La identificación molecular y su potencial fenotípico son completamente
necesarias para determinar similitudes y capacidades de sobrevivencia propias
de las bacterias aisladas. La exploración de factores implicados como
patogenicidad, ruta de transmisión, estabilidad del agente, dosis infecciosa,
concentración y origen pueden proporcionar estrategias biotecnológicas para
que este microorganismo sea considerado como probiótico (CDC, 2002).
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III. Justificación del proyecto
El proyecto “Identificación morfológica y genética de Lactobacillus sp. con
potencial probiótico” se realiza con el fin de aplicar los conocimientos adquiridos
durante la licenciatura en ingeniería bioquímica, desde realizar la preparación del
material que será utilizado hasta lograr llevar a cabo el aislamiento de las
bacterias y su identificación tanto fenotípica como molecular para probar el
potencial de los lactobacillus como probióticos.
IV. Objetivos
- General
Evaluar consorcios bacterianos de Lactobacillus spp. provenientes de la
microbiota intestinal de seres humanos sanos a través del uso de técnicas
microscópicas y moleculares para establecer su uso como probióticos.
- Específicos
1. Identificar los procedimientos de laboratorio básicos en el área de
Microbiología Clínica.
2. Consultar las metodologías estándar para el análisis de muestras
clínicas de humanos.
3. Realizar una revisión bibliográfica acerca de los métodos de
identificación microbiana que están disponibles en el mercado o para
fines de investigación.
4. Hacer un análisis comparativo de las ventajas y desventajas del uso de
métodos de identificación de microorganismos.
5. Aislar cepas presuntivas de Lactobacillus sp. de la microbiota intestinal
de seres humanos sanos mediante técnicas de cultivo convencionales.
6. Identificar morfológica y genéticamente las cepas de Lactobacillus sp.
mediante observación microscópica, y amplificación y secuenciación
de la región 16S del gen ribosomal, respectivamente.
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V. Metas
La principal meta es que los brigadistas de Servicio Social identifiquen las
oportunidades de aplicación de los conocimientos adquiridos durante sus
estudios en la carrera de Químico Farmacéutico Biólogo, con lo que podrán
abordar su ámbito profesional con mejores elementos formativos. Esta propuesta
de investigación permitirá determinar el potencial probiótico de Lactobacillus spp.
aislado de la microbiota intestinal de seres humanos.
VI. Localización geográfica del proyecto
El proyecto se desarrollará en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad
de Ciencias Químico-Biológicas de la Universidad Autónoma de Sinaloa, con
dirección en Blvd. de las Américas y Av. Universitarios S/N Ciudad Universitaria,
80040, Culiacán, Sinaloa, México (Figura 1).
Figura 1. Localización geográfica del laboratorio.
VII. Actividades a realizar
1. Inducción al laboratorio
2. Preparación de material y esterilizado
3. Preparación de medios de cultivo
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4. Estandarización de sembrado en placa por cuadrante
5. Toma y procesamiento de muestras
6. Aislamiento de bacterias
7. Identificación fenotípica
8. Identificación molecular
VIII. Recursos
Tanto en los recursos económicos como recursos humanos, se contará con
la colaboración de la Dra. Maribel Jiménez Edeza, el prestador del servicio y
personal administrativo.
IX. Financiamiento
Este proyecto será solventado por los recursos aportados de la Facultad de
Ciencias Químico-Biológicas.
X. Metodología
Revisión bibliográfica
Los brigadistas de Servicio Social deberán realizar una revisión
bibliográfica exhaustiva acerca de los objetivos planteados. Para ello, utilizarán
como referencia las Normas Oficiales Mexicanas, así como las Normas
Internacionales establecidas por Organizaciones Regulatorias como la OMS,
FAO, entre otras.
Toma y procesado de muestras
Se llevarán a cabo entrevistas personales y una encuesta de hábitos
alimenticios. Los individuos por seleccionar deberán pertenecer a un grupo con
edad entre 18 y 28 años con hábitos alimenticios normales y sin historial de
tratamiento con antibióticos reciente. Se excluyeron los individuos con hábitos
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dietéticos especiales, incluidos vegetarianos y veganos o una alergia alimentaria
conocida, así como a las personas con antecedentes de tabaquismo en los
últimos 5 años, antecedentes de trastornos hemorrágicos, enfermedades
gastrointestinales, enfermedades cardiovasculares e inflamatorias del intestino
(colitis ulcerativa/de Crohn), síndrome del intestino irritable, hipertensión,
enfermedades cardiovasculares, individuos sometidos a cirugía gastrointestinal
en los últimos 2 años, y a atletas con entrenamiento físico intensivo. Una vez
cumplidos los criterios para la selección de individuos se les solicitará una
muestra de heces fecales, la cual será transportada en un contenedor con
temperatura controlada de 4ºC al Laboratorio y procesadas dentro de las 2 horas
siguientes a su deposición.
Aislamiento de bacterias
Para el aislamiento de bacterias a partir de heces se pesará 1 g de la
muestra en 9 mL de PBS 1X estéril (1:10 p/v) y se realizarán diluciones seriadas
(Rodríguez, 2009). Posteriormente se inocularán en agar de Man, Rogosa y
Sharpe (MRS) mediante la técnica de spot, se tomarán 10 de la muestra
homogeneizada de las diluciones seriadas y posteriormente se colocará sobre el
agar MRS hasta su absorción completa. Las cajas inoculadas se incubarán a 37°
C durante 24 h para llevar a cabo su conteo por goteo siguiendo la fórmula:
"UFC/mL=" ("No.de colonias por placa" )"(Factor de dilución)" /"mL de la muestra
sembrada"
Se seleccionarán las colonias pequeñas (2-5 mm) con aspecto circular,
ligera elevación, convexas y de borde entero. Posteriormente, se someterán a un
proceso de purificación mediante el estriado en agar MRS, y se incubarán a 37°
C durante 24 h. Todas las cepas serán conservadas a -80°C en el medio de
cultivo fresco correspondiente con un 50% de glicerol (Ramos-Izquierdo y col.,
2009).
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Identificación morfológica de las cepas aisladas
La identificación fenotípica de las cepas aisladas se realizará mediante el
sistema estandarizado API 50 CH (BIOMÉRIUX). Se tomarán en cuenta sólo
aquellas pruebas que se identifiquen con un 90% o más de probabilidad de
identificación. Las cepas aisladas se cultivarán en placas de agar MRS durante
48 h, se usará un hisopo estéril de algodón para recoger las colonias y
resuspenderlas en 2 mL de medio de suspensión. Posteriormente se tomarán
300 - 500 L de la suspensión en 5 mL de agua destilada estéril hasta la turbidez
equivalente a 3 en la escala de McFarland. Se tomará una alícuota de 0.6 - 1 mL
del medio de suspensión y se agregarán en 10 mL de medio 50 CH. Las cápsulas
de 50 CH se llenarán con la suspensión, para simular un ambiente anaeróbico se
colocarán unas gotas de aceite de parafina, posteriormente se taparán y se
incubarán a 37 ºC durante 48 h. Los resultados se analizarán usando el Índice de
Perfil Analítico (sistema API, BioMérieux).
Identificación molecular de las cepas aisladas
La identificación molecular se realizará amplificando el gen 16s ribosomal.
Para la extracción del DNA se usará el kit de tejido DNeasy de QIAGEN siguiendo
las instrucciones del fabricante y los primers universales dentro del dominio de
las bacterias ácido láctica. Los primers a utilizar serán. Forward: GCG GAT GGG
TGA GTA ACA C, Reverse: ACG GCT ACC TTG TTA GCA CTT. La amplificación
de la PCR se realizará en un termociclador (C100 Thermo Scientific, EEUU),
usando Taq polimerasa (Invitrogen) de la siguiente manera, desnaturalización
inicial a 95ºC por dos minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización de 94ºC
a 30 s, anillamiento a 52ºC, elongación 72ºC durante 45 s y una elongación final
para la Taq polimerasa de 5 minutos a 72ºC. Los productos se conservarán a
4ºC. La evidencia de los fragmentos de DNA amplificados se realizará en gel de
agarosa 1.5% p/v, aplicando 90 V por 5 minutos seguido de 70 V por 40 minutos,
los geles se visualizarán en un transiluminador. Los productos amplificados serán
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comparados con el patrón de pesos moleculares de 1Kb Plus DNA Ladder. Los
fragmentos de DNA se enviarán a secuenciar. Las secuencias se analizarán con
las secuencias homólogas más cercanas del GenBank utilizando el programa
BLAST.
XI. Supervisión y asesoría
La supervisión de este proyecto será de carácter operativo y descriptivo en el
laboratorio de Microbiología, y estará supervisado por la Dra. Maribel Jiménez
Edeza como asesora del servicio social con el objetivo de brindar al prestador de
servicio asesoría académica y aprobación de las funciones y actividades que se
realizaran por el prestador de servicio a lo largo de este estudio.
XII. Evaluación
La evaluación del desempeño del prestador de servicio social se realizará por
medio de reuniones vía zoom mensualmente con la asesora para la entrega de
un informe de los resultados obtenidos a lo largo de la revisión bibliográfica, así
como también reforzar los conocimientos adquiridos y resolver dudas, donde se
evaluará el estado actualizado de progreso y evolución del proyecto.
XIII. Resultados esperados
Con el proyecto antes mencionado se espera determinar las características
moleculares y fenotípicas que puedan presentar los lactobacillus y así obtener
información sobre el potencial que tienen los mismos como probióticos.
XIV. Fuentes
Bello, M. G., Knight, R., Gilbert, J. A., & Blaser, M. J. (2018). Preserving microbial
diversity. Science, 33-34.
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Guarner, F. (2007). Papel de la flora intestinal en la salud y en la enfermedad.
Nutrición hospitalaria, 14-19.
Icaza Chávez, M. E. (2013). Microbiota intestinal en la salud y la enfermedad.
Revista de gastroenterología de México, 240-248.
Kadariya, J., Smith, T. C., & Thapaliya, D. (2014). Staphylococcus aureus and
staphylococcal food-borne disease: an ongoing challenge in public health.
BioMed research international.
Rodríguez, H., Curiel, J. A., Landete, J. M., De las Rivas, B., De Felipe, F. L.,
Gómez Cordovés, C., & Muñoz, R. (2009). Food phenolics and lactic acid
bacteria. International journal of food microbiology, 79-90.
XV. Cronograma de actividades (descarga el anexo 2b)
OBJETIVO ESPECIFICO
ACTIVIDAD
META
AVANCE DE META % RESPONSABLE (S) MESES
1 2 3 4 5 6
1. Introducción al X X
Heberth Alan Casarez Velazquez
1. Identificar los
procedimientos de
laboratorio básicos
laboratorio 2. Preparación de material y esterilizado
X X
Heberth Alan Casarez Velazquez
3. Preparación de medios X
Heberth Alan Casarez Velazquez de cultivo
2. Consultar las
metodologías
4. Estandarización de
sembrado en placa por
cuadrante
Identificar las
oportunidades de
aplicación de los
X
Heberth Alan Casarez Velazquez
3. Realizar una 5. Toma y procesamiento conocimientos adquiridos X X
Heberth Alan Casarez Velazquez revisión bibliográfica de muestras durante los estudios de la
4. Hacer un análisis 6. Aislamiento de carrera de Ingeniería X X Heberth Alan Casarez Velazquez
comparativo bacterias Buioquímica
5. Aislar cepas
presuntivas de Lactobacillus sp.
7. Identificación
fenotípica
X
Heberth Alan Casarez Velazquez
6. Identificar las cepas
de Lactobacillus sp.
8. Identificación
molecular
X
Heberth Alan Casarez Velazquez
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XVI. Programa de actividades/carta descriptiva
Objetivo específico Actividades
1. Identificar los procedimientos de laboratorio básicos en el área de
Microbiología Clínica.
1. Inducción al laboratorio
2. Consultar las metodologías estándar para el análisis de muestras clínicas de
humanos.
2. Preparación de material y esterilizado
3. Realizar una revisión bibliográfica acerca de los métodos de identificación microbiana que están disponibles en el mercado o para
fines de investigación.
3. Preparación de medios de cultivo
4. Hacer un análisis comparativo de las
ventajas y desventajas del uso de métodos de identificación de microorganismos.
4. Estandarización de sembrado en placa por cuadrante
5. Aislar cepas presuntivas de Lactobacillus
sp. de la microbiota intestinal de seres humanos sanos mediante técnicas de
cultivo convencionales.
5. Toma y procesamiento de muestras
6. Identificar bioquímica y genéticamente
las cepas de Lactobacillus sp. mediante tiras reactivas API 50CH, y amplificación y
secuenciación de la región 16S del gen ribosomal, respectivamente.
6. Aislamiento de bacterias
7. Identificación fenotípica
8. Identificación molecular
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Dra. Maribel Jiménez Edeza
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Firmado
digitalmente por
Dra. Maribel
Jiménez Edeza
Fecha: 2021.07.23
17:49:38 -06'00'
Brigadista
XVII. Nombre y firma de responsables
Heberth Alan Casarez Velázquez
Asesor
DRA. MARIBEL JIMÉNEZ EDEZA