1

Resumen I: Nociones básicas de la Química Biológica. ANEXO: Sobre la Química Biológica. 3 Introducción a la Química Biológica. 7 La Teoría Celular. 9 Fundamentos de la Química Biológica: las biomoléculas y las complejas propiedades de los seres vivos. 11

1. Fundamentos celulares. 1.1 Características universales de las células: m.pl., cit., nucl. 13 1.2 Niveles de complejidad celular. 17 1.3 Dimensiones celulares y difusión. 19 1.4 Nutrición. 21 1.5 Células procariotas. 23 1.6 Orgánulos eucariotas. 27 1.7 Citoesqueleto: soporte y dinámica intracelular. 31 1.8 Monómeros, polímeros y complejos supramoleculares. 33 1.9 Macromoléculas: principal constituyente de las células. 35 1.10 Modelo ejemplo: Escherichia coli. 37

2. Fundamentos químicos.

2.1 Introducción. 39 2.2 Un segundo abordaje general a la biomoléculas. 40 2.3 Estructura tridimensional. 43

3. Fundamentos físicos. 3.1 Introducción. 47 3.2 Primera ley de la termodinámica: principio de conservación de la energía. 49 3.3 Segunda ley de la termodinámica: entropía. 51 3.4 Los organismos vivos existen en un estado estacionario dinámico y nunca están en

equilibrio con su entorno. 53 3.5 Los organismos obtienen su energía del flujo de electrones. 55 3.6 La energía es necesaria para generar orden (evitar la tendencia entrópica):

espontaneidad de una reacción química y acoplamiento energético. 57 3.7 Las enzimas catalizan la síntesis –frente a la inestabilidad termodinámica- y la

degradación –frente a la estabilidad cinética-. 61 3.8 Control global del metabolismo. 65

4. Fundamentos genéticos.

4.1 La continuidad genética reside en las moléculas de DNA. 67 4.2 La secuencia lineal de DNA codifica proteínas con estructuras tridimensionales. 69

5. Fundamentos evolutivos.

5.1 Los cambios en las instrucciones hereditarias hacen posible la evolución. 71 5.2 La evolución química de las biomoléculas. 73 5.3 La fuente de energía de las primeras células eran los combustibles inorgánicos. 75 5.4 La anatomía molecular revela relaciones evolutivas. 77 5.5 Genómica funcional: correspondencia entre genes y procesos celulares específicos. 79

6. Glosario I. 81

2

TÉCNICAS Y HERRAMIENTAS BIOQUÍMICAS. 83

1. Técnicas de purificación. 1.1 Purificación de las células y de sus partes: CITOMETRÍA DE FLUJO. 85 1.2 Purificación de las células y de sus partes: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR. 97

2. Fotometría.

2.1 Nociones básicas. 111 2.2 Procedimiento para cuantificar fotométricamente una sustancia. 113

3. Investigación en proteínas.

3.1 Consideraciones extra sobre purificación, cuantificación y determinación de la función de las proteínas 121 3.2 Nociones de Inmunoquímica. 129

3.3 Nociones de Electroforesis. 133

ESTRUCTURA Y CATÁLISIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES. 141

1. El agua. 1.1 Interacciones débiles en los sistemas acuosos. 143 1.2 Ionización del agua, de ácidos débiles y de bases débiles. 149 1.3 Tamponamiento contra cambios de pH en los sistemas biológicos. 155 1.4 El agua como reactivo. 157

“Los organismos son agrupaciones de materia inanimada, es cuando esta materia inanimada interactúa que surgen las cualidades extraordinarias de la vida.”

3

La Química Biológica Dr. Héctor Alfredo Molina. Revista Médica Universitaria. Vol 2. Nº1 – 2006. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo.

Es cortesía social, saludar a un conocido después de muchos años de no haberlo visto, con las palabras: “No has cambiado nada”. Secretamente observamos, que su piel está envejecida, las arrugas más profundas, el cabello más gris, etc. Pero en un sentido físico convencional, no está frecuentemente lejos de la verdad.

Durante su ausencia este conocido hombre, con la más simple de las herramientas, podría haber variado el curso de un río, construido 10 casas, haber dado vida a 50 niños y haber cambiado de cualquier manera el medio ambiente, tan profundamente que el menor observador, hubiera percibido estas transformaciones. Sin embargo, al final de esto, difícilmente podríamos advertir, más que un pequeño cambio en las dimensiones físicas o en la composición química del hombre propiamente dicho. Todo ello es obvio y trivial pero contiene en forma resumida, los dos grandes problemas que han sido la motivación intelectual preferente del saber y desarrollo de la Química Biológica. ¿Cómo es que el organismo vivo desarrolla la energía con la que puede manejar el medio ambiente para su provecho?, ¿y cómo se las arregla para que este gran flujo de energía, pase por él y sin embargo pueda mantener su propia forma?

Las respuestas las tiene la Química Biológica, que es la Ciencia que estudia la naturaleza y el comportamiento químico de las células, ya sean de origen animal, vegetal o humano.

Los términos de Química Biológica y Bioquímica son similares y se suelen usar indistintamente, pero hoy existe la tendencia a separar Bioquímica para la carrera universitaria y Química Biológica para la asignatura o especialidad de carreras afines: Bioquímica, Medicina, Agronomía, Odontología, Biología, etc. Es una ciencia joven, que empieza con la Química Orgánica y recoge conceptos de la Fisicoquímica. En última instancia todos los sistemas biológicos se comportan como un conjunto ordenado y complejo de reacciones químicas, que obedecen a sus leyes y sin duda se deben explicar en términos de esta Ciencia. Se discute pedagógicamente y a veces con razón que para el estudio integral de la Química Biológica se necesita de la Química y la Biología, y también se discute la separación de la Fisiología, la Biofísica y la Química Biológica, desde el punto de vista humano y actualmente más por “de modé”, que las mismas sean incluidas dentro de la Biología Molecular. Personalmente pienso que la Biología Molecular es una necesaria conjunción entre la Química Biológica y la Genética.

Vale aclarar que nada es independiente en nuestro organismo y sólo por razones didácticas, comenzaremos diciendo que la Química Biológica nace a comienzos del siglo XX, estableciéndose las primeras cátedras en Francia, Inglaterra y EEUU. Sin embargo, existe el antecedente de una Cátedra de Química Fisiológica en la Universidad de Tubingen (Alemania), en 1880 dictada por el Profesor Félix von Hoppe Séller. Y se suele citar como los pioneros de la Química Biológica a Chittenden, Mendel, Gie y Folin.

En 1906 aparecen el Journal of Biological Chemistry y el Biochemical Journal, las dos primeras revistas con artículos mayoritariamente de Química Biológica y que todavía persisten, siendo las de mayor jerarquía internacional. En la primera década del siglo XX se publicaban 10.000 trabajos por año y actualmente rondan los 5 millones por año.

En Europa y en EEUU la Química Biológica crece después de la Primera Guerra Mundial, no así en Iberoamérica donde la Química Biológica es prácticamente inexistente hasta 1925. Recién en los últimos 50 años ha experimentado un desarrollo explosivo, junto con otras ciencias. Se publican más trabajos en Química Biológica que en cualquiera otra área de Química (Inorgánica, Orgánica, Analítica o Físico Química).

ANEXO. Sobre la

Química Biológica

4

Intentaremos ordenar cuáles son los contenidos mínimos que marcaron el perfil de la Química Biológica. Abarca dos áreas perfectamente definidas: a) la parte estática o morfológica: básica o descriptiva; b) la parte dinámica o fisiológica: biológica propiamente dicha.

Diremos entonces que esta Ciencia estudia los glúcidos, lípidos, proteínas, nucleoproteínas y sus respectivos metabolismos; las enzimas, vitaminas y oligoelementos, hormonas, las inmunoglobulinas, las bases genéticas, el metabolismo pigmentario y la química tisular. Recordemos que el concepto de metabolismo es el balance entre la síntesis o anabolismo y la degradación o catabolismo.

Descubrimientos pioneros de la Química Biológica

En 1900, Braconet, francés, descubre y aísla el primer aminoácido: la Glicocola. Entre 1901 y 1950 se descubren los 20 aminoácidos fundamentales para el hombre. En 1904 Arrhenius, sueco, establece el concepto de electrolitos. En 1910 el alemán Kossel, describe los aminoácidos básicos y la albúmina. En 1922 se le concede el premio Nobel al alemán Meyeroff y al inglés Hill por sus estudios del metabolismo muscular y la bioenergética, demostrando la correlación entre la proporción de ácido láctico y el consumo de oxígeno y el desprendimiento de la temperatura.

Quizás mencionando los premios Nobel detallados, perfilaremos los principales avances para la humanidad vinculados con la Química Biológica: 1917: Banting (canadiense) y Mc Leod (escocés): Insulina y diabetes 1928: Windauss (alemán): Ácidos biliares y análogos 1929: Eijkman (holandés) y Hopking (inglés): Química de las vitaminas 1930: Landsteiner y Wiener (austriacos): Grupos sanguíneo y Rh 193l: Warburg (alemán): Cadena respiratoria 1933: Morgan (EEUU): Mapa genético 1934: Minot, Murphy y Whipple (EEUU): Vitaminas del complejo “B” 1936: Dale (inglés) y Loewi (alemán): Adrenalina y acetilcolina 1937: Szent (húngaro) y Hawort (inglés): Vitamina “C”, ácidos tricarboxílicos e hidratos de carbono 1938: Carrel (suizo) y Kuhn (austriaco): Química de las vitaminas 1939: Butenand (alemán): Hormonas esteroideas 1946: Muller (EEUU): Química genética y Summer (EEUU): Cristalización de la primera enzima (ureasa) 1947: Houssay (argentino): Metabolismo glucídico y Cori-Cori (checos): Glucólisis y glucogenólisis 1948: Tisselius (sueco): Estructura proteica y electroforesis 1953: Krebs y Lipman (alemanes): Ciclos de los ácidos tricarboxílicos, ciclo de la urea, estructura del ATP y Coenzima “A” 1959: Ochoa (español) y Kornberg (EEUU): Biosíntesis del DNA y RNA 1960: Burneo (australiano) y Medawra (brasileño): Bases de la inmunoquímica moderna. 1968: Khorana (hindú), Niremberg y Holley (EEUU): Código genético y bases de la biosíntesis proteica 1970: Leloir (argentino): Biosíntesis de nucleótidos y sacáridos 1974: De Duve (belga): Bioquímica de los lisosomas y peroxisomas, etapa crucial para el desarrollo de la biología molecular. Uno de los mejores investigadores del siglo pasado.

No hay que olvidarse de Watson, Crick y Chargaf con sus contribuciones a la Genética Molecular; Fisher y Sanger, sobre estructuras proteicas; Jacob y Monod, en la regulación metabólica, etc., etc.

Si nos referimos a nuestro país, es necesario decir que el crecimiento de la Química

5

Biológica es muy lento, un poco debido a la ideología de la población, a gobiernos autoritarios, al idioma, a falta de recursos y a otras razones. Un impulso importante de la Química Biológica, surge en 1919 al crearse la carrera de Bioquímica por iniciativa del Dr. Juan Sánchez, compañero de Houssay en la Carrera de Farmacia. El primer investigador “Full Time” de nuestro país y pionero de los estudios en áreas como el metabolismo de glúcidos y hormonas hipofisarias fue el Dr. Bernardo Houssay.

Son los doctores Marenzi y Dealefau los que echan la base de la Química Biológica no sólo en el campo básico sino en el clínico. Se agregan progresivamente Cardini, Stoppani, Paladini, Caputto, Pontis, Dellacha, Olavaria, Trucco, Brenner, etc. A ellos hay que agregar latinoamericanos como Niemeyer en Chile, Estable en Uruguay, Hurtado en Perú, Chagas en Brasil, Gaede en Venezuela, Laguna en México y Alvaro en Colombia.

Pero por una razón de afecto y de justicia quiero rescatar a Luis Federico Leloir, que nació en París el 6 de setiembre de 1906 y a los 6 años se naturalizó argentino, recibiéndose de médico en 1932 y de Químico en 1935 en la UNBA siendo un estrecho colaborador de Bernardo Houssay. Su tesis fue sobre glúcidos y suprarrenales, especializándose en Cambridge y en Columbia; sus primeros trabajos están relacionados con la oxidación del alcohol y de los ácidos grasos. En 1947 renunció a la Universidad por razones políticas. Fue por muchos años director del Instituto Campomar donde se formaron la mayor parte de los especialistas en Química Biológica. Recibe el premio Nobel (1970) por el descubrimiento de la Glucosa 1-6 difosfato, la galactoquinasa, el UDPG y cerca de 80 mononucléotidos que participan en la interconversión de glúcidos y en la biosíntesis de oligopolisacáridos, etc. Leloir murió el 2 de diciembre de 1987.

También algunas palabras para otro premio Nobel Argentino: César Milstein, de Bahía Blanca, nacido en 1927 y recibido de Químico y Bioquímico en 1957 en la UNBA especializado en Cambridge desde 1969 hasta su muerte (no hace muchos años), destacándose en evolución, genética molecular, enzimas e inmunología. En 1984 comparte el Premio Nobel con el danés Jerne y el alemán Koehler.

Los progresos actuales en Química Biológica son sustanciales, no sólo en cuanto a instrumentos altamente elaborados sino también en la perspectiva de la ciencia: automatizadores, computadoras, cromatógrafos, espectrométros, espectrógrafos, fluorómetros, enzimómetros, radiómetros, etc, etc. que permiten dosar polipéptidos, hormonas, vitaminas, micromoléculas en general y monitorear drogas por su recorrido metabólico. Es un verdadero crecimiento logarítmico que obliga a la Unión Internacional de Bioquímica y a otras similares a que se preocupen por uniformar la nomenclatura, los códigos, las unidades, los valores de referencia e incluso delimitar específicamente los alcances de la Química Biológica.

Hace algún tiempo el Prof. J. Ferrier, introdujo 2 términos: la epistemología o teoría del conocimiento y la agnotología, la teoría de la ignorancia. Se ha dejado morir este último, pero no deja de ser completamente cierto que tenemos más experiencias, por lo menos en Química Biológica, acerca de la ignorancia que acerca del conocimiento. Bibliografía 1. Michel Salomón. El futuro de la vida. Ed. Planeta, 1981 2. Informaciones Roemmers, 1960-1988 3. Sauna Anderson. Química Clínica. Ed. Interamericana, 1995

6

7

Introducción a la Química Biológica.

La química biológica o bioquímica estudia la composición química, la base química de los seres vivos.

Su premisa fundamental consiste en que todo ser vivo está formado por el mismo tipo de materia que el mundo inanimado:

principalmente carbono, y en menor medida por hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo, azufre y otros elementos minoritarios.

Todos estos elementos fundamentales conforman, a su vez, una gran diversidad de moléculas que pueden ser clasificadas en cuatro

grandes grupos: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

La bioquímica estudia todas estas biomoléculas: moléculas orgánicas sintetizadas por los seres vivos.

La bioquímica, ¿es una parte de la química?

A grandes rasgos, la química estudia dos clases de compuestos químicos: inorgánicos y orgánicos. Los compuestos orgánicos

también pueden ser clasificados en dos grandes grupos, según su origen: compuestos orgánicos naturales –originados en la

naturaleza- y compuestos orgánicos no naturales –no originados en la naturaleza; por ejemplo, los plásticos-.

Los compuestos orgánicos naturales también pueden ser clasificados en dos grupos: a) in-vivo y b) ex-vivo.

a) Los compuestos orgánicos naturales in-vivo, son producto de la actividad biológica. Están vinculados con los seres

vivos; son biosintetizados. En este grupo encontramos a las biomoléculas que estudia la bioquímica.

b) El grupo de los compuestos orgánicos naturales ex-vivo, es el de todas las moléculas que no son sintetizadas por los

seres vivos: pueden ser producto de los procesos geológicos o de los procesos atmosféricos. En este grupo podemos encontrar, por

ejemplo, a los compuestos vinculados con el petróleo que le incumben específicamente al campo de la petroquímica.

8

Desde la síntesis de Wöhler de la urea a partir del cianato de amonio (1828), un altísimo número de compuestos orgánicos ha sido

sintetizado químicamente. La síntesis orgánica es la construcción planificada de moléculas orgánicas naturales y no naturales

mediante reacciones químicas, en laboratorios o en la industria. Esta incluye fármacos, desodorantes, perfumes, detergentes,

jabones, fibras textiles sintéticas, materiales plásticos, polímeros en general, colorantes orgánicos, etcétera. Las moléculas

orgánicas artificiales vendrían a ser el producto de la síntesis orgánica, pese a que varios autores le llaman de esta manera a las

moléculas orgánicas no naturales.

La síntesis de compuestos orgánicos: Wöhler y el vitalismo.

Suele argumentarse que la química orgánica inició en 1828, con la síntesis de Wöhler de la urea, pero en verdad fue 4 años antes:

en 1824, Wöhler sintetizó ácido oxálico con un precursor inorgánico, el cianógeno.

Estos descubrimientos se opusieron a la predominante teoría del vitalismo, la cual enunciaba que la materia orgánica posee una

fuerza vital inherente a todas las cosas vivas. Aún así, el vitalismo persistió en figuras como Liebig y Pasteur; no fue hasta 1845,

cuando Kolbe sintetiza ácido acético a partir de disulfuro de carbono, haciendo que el vitalismo pierda un gran número de

simpatizantes.

Entonces, recapitulando…

La bioquímica estudia las biomoléculas y las reacciones químicas que estos compuestos sufren en los organismos vivos: el

metabolismo (μεταβολή, metabolé; ‘cambio’), que es la suma de –o el balance entre- anabolismo (síntesis) y catabolismo

(degradación).

Podemos entender a la bioquímica como una disciplina científica integradora, que aborda el estudio de las biomoléculas y los

biosistemas, integrando las leyes fisicoquímicas. Lo hace desde un punto de vista molecular y trata de entender y aplicar su

conocimiento a amplios sectores de la medicina, la agroalimentación, la biotecnología, la farmacología, etcétera.

Conceptos clave: bioquímica, química biológica, biología molecular, biomoléculas, compuestos químicos orgánicos naturales in-

vivo, metabolismo, biosistemas.

9

La Teoría Celular.

En 1665, en el texto Micrographia, el físico inglés Robert Hooke describe tejidos de distintos vegetales y propone el término

cellula (célula) para designar a las estructuras en forma de celdillas presentes en el corcho.

Mucho tiempo después de Hooke, los Naturphilosophen emprenderían la búsqueda de la unidad de las formas vivientes. El

alemán Richard Oken fue uno de ellos, y ya en 1805 intuye que los seres vivos están formados por células. Tendría que pasar medio

siglo más antes que esta idea pudiera sostenerse observacionalmente.

Después de las observaciones microscópicas de Hooke en el corcho, las celdillas descritas por él fueron confirmadas, entre

otros, por Malpighi en las plantas verdes. En 1831, Robert Brown, médico y botánico inglés, descubrió los corpúsculos que llamó

núcleos (diminutivo de nux, nuez). En 1835, Gabriel Valentin, de Berna, describió el nucléolo y un año después introdujo el término

parénquima para referirse a la sustancia situada entre el núcleo y la pared de la celdilla. El médico checo Jan Evangelista Purkinje

introdujo el término protoplasma en una conferencia, en 1839, publicada un año después. Ese mismo año apareció su publicación,

en polaco, sobre las fibras que llevan su nombre, descubiertas en el corazón bovino.

Todas estas observaciones no fueron más allá del aspecto puramente descriptivo. El primer paso en la generalización e

interpretación de las observaciones fue dado por el botánico Matthias Jacob Schleiden (1804-1881). En su trabajo Beiträge zur

Phytogenesis de 1838 (Contribuciones a la fitogénesis), sostuvo que todas las plantas estaban formadas de células y que éstas

correspondían a la unidad estructural del reino vegetal. Pero formulaba, además, una teoría acerca de la manera cómo se formaban

las células, a saber: a partir del citoblasto (léase núcleo) y éste, a su vez, se generaba por una especie de coagulación de la

substancia madre que llenaba la celdilla.

El segundo paso lo dio Theodor Schwann: extendió la doctrina de su amigo Schleiden al reino animal. Theodor Schwann,

médico, fisiólogo y zoólogo, nació en Neuss, cerca de Düsseldorf, en 1810, y murió en 1882. Hombre tímido, introspectivo y piadoso,

se educó en el Colegio Jesuíta de Colonia, estudió en las universidades de Bonn, Würzbug y Berlín. Fue uno de los tantos discípulos

de Johannes Müller.

Puede decirse que toda la obra productiva de Schwann es de su juventud, después de la formulación de la Theorie der Zellen

como capítulo de su obra de 1839, publicada a los 29 años de edad, Mikroskopische Untersuchungen über die Übereinstimmung in

der Struktur und Wachstum der Thiere und Pflanzen (Investigaciones microscópicas sobre la concordancia en estructura y

crecimiento de los animales y plantas), abandonó Alemania por una crisis personal, agravada por no haber podido encontrar un

puesto universitario, se fue a Lovaina y a Lieja, donde se dedicó a la docencia y no hizo ninguna otra contribución a la ciencia.

Pero de su juventud proceden numerosos aportes en los campos de la histología, fisiología y microbiología, entre otros:

descubrimiento de la vaina de los nervios, la cual lleva su nombre; descripción de la musculatura estriada del segmento proximal

del esófago, descubrimiento de la pepsina, demostración de la importancia de la bilis en la digestión, demostración experimental de

la dependencia funcional entre magnitud de la tensión del músculo en contracción y longitud; demostración de la putrefacción

como fenómeno dependiente de agentes vivos; descubrimiento de la naturaleza orgánica de las levaduras; demostración de la

fermentación como fenómeno causado por levaduras.

10

De manera similar al trabajo de Schleiden, el de Schwann no consistió simplemente en extender la concepción celular al reino

animal sino además, en formular un principio acerca de la generación de las células en los seres vivientes, de ahí la justificación de

teoría celular. El proceso ocurría así: en una masa informe, el citoblastema, se formaban primero los núcleos, luego, alrededor de

ellos, las celdillas, y todo eso, por una especie de cristalización, en todo caso, por un proceso gobernado por leyes físicas que rigen

la agregación de moléculas del citoblastema.

Schwann, como se ve, no era un Naturphilosoph, su teoría muestra un claramente un carácter reduccionista. Los pasos

siguientes en la concepción de la estructura celular de los seres vivos iban a ser dados por Remak, con el descubrimiento de la

división celular en 1852, y, pocos años después, por Rudolf Virchow (1855): omnis cellula ex cellula (toda célula proviene de otra

célula).

La demostración de la estructura celular en el sistema nervioso la iba a hacer Ramón y Cajal a comienzos del siglo XX en

contra de la idea del retículo difuso de Golgi. Ambos recibieron el Premio Nobel en 1906. La demostración de la estructura celular

del miocardio iba a demorar medio siglo más: que los discos intercalares representaban límites celulares requería del microscopio

electrónico.

La Teoría Celular puede sintetizarse en los cuatro principios siguientes:

1. Todas las cosas vivas están compuestas por una o más células.

2. La célula es la unidad fundamental de todos los organismos: los organismos más pequeños son células únicas, y

la unidad funcional de los organismos multicelulares es la célula.

3. Todas las células provienen de células preexistentes, y la continuidad se mantiene a través del material

genético.

4. La unidad de materia viva más pequeña es la célula.

El concepto actual general, que engloba los tres primeros principios de la teoría celular clásica, dice que

la célula es la unidad morfológica, fisiológica y de origen de todo ser vivo.

11

Fundamentos de la QB: las biomoléculas y las complejas propiedades de los seres vivos.

Las primeras formas de vida fueron microorganismos sencillos. Primero estuvieron dotados de la capacidad de extraer energía

de los compuestos químicos, después de la luz solar. Esta energía sirvió para sintetizar una amplia variedad de biomoléculas cada

vez más complejas.

Una de las preguntas fundamentales que se plantea la bioquímica, es la siguiente: ¿Cómo y por qué, específicamente, han

aparecido/evolucionado químicamente cada una de las biomoléculas que la bioquímica estudia? Otra pregunta válida sería ¿de

qué modo, las miles de diferentes moléculas inanimadas, interactuaron para dar origen a la vida y sus complejas propiedades?

Cuando las biomoléculas se aíslan y examinan individualmente, cumplen todas las leyes fisicoquímicas que describen el

comportamiento de la materia inanimada. Del mismo modo ocurre con todos los procesos que tienen lugar en los organismos vivos.

La bioquímica muestra el modo en que las colecciones de moléculas inanimadas que constituyen los organismos vivos, interactúan

para originar y perpetuar la vida, estando todas estas moléculas bajo las mismas leyes físicas y químicas que el resto del universo

inanimado.

Pero, los organismos poseen cualidades extraordinarias que los diferencian de otras agrupaciones de materia.

Las siguientes son las características distintivas de los organismos vivos:

Elevadas ‘complejidad química’ y ‘complejidad en la organización microscópica’: esto quiere decir que

todas las estructuras están formadas por miles de moléculas diferentes y, a su vez, que estas moléculas pueden ser muy

complejas. Por ejemplo, los polímeros; cada uno con su secuencia de subunidades –monómeros-, su estructura

tridimensional, su capacidad para interactuar con otras moléculas, etcétera.

Poseen funciones definidas para cada componente, y pueden regular las interacciones entre estos

componentes. Esto implica que existe una relación dinámica entre los componentes químicos de un organismo vivo: los

cambios en un componente producen cambios coordinados en otro componente, de modo que el conjunto de los

componentes tiene un carácter propio, más allá del carácter de cada una de sus partes individuales. Este conjunto lleva a

cabo un programa cuya finalidad es la reproducción y la perpetuación de dicho conjunto –y del programa mismo-: el

resultado es la vida.

Los componentes no son estáticos. Existe un flujo de materia y energía entre el organismo y el entorno, y como ya

fue dicho, existe una relación dinámica entre los componentes químicos.

Poseen sistemas para extraer, almacenar, transformar y consumir la materia y energía del entorno.

Esto permite a los organismos constituirse como tales, crecer y desarrollarse, construir y preservar sus estructuras, y

12

realizar un trabajo mecánico, químico, osmótico y eléctrico. El metabolismo intenta retrasar, en algún grado, la entropía

típica del universo. Se continúa en las páginas 21 a 22.

Poseen mecanismos para detectar y responder a los cambios y estímulos del entorno. Los procesos

químicos de los organismos se adaptan y ajustan al ambiente.

Están formados por células.

Pueden autorreplicarse y autoensamblarse. La reproducción biológica tiene lugar con fidelidad casi perfecta.

Evolucionan. Varían sus estrategias vitales heredadas, para sobrevivir en situaciones nuevas. La enorme diversidad de

formas de vida está relacionada en lo fundamental: la unidad fundamental de todos los organismos vivos puede observarse

a nivel molecular, en la similitud de secuencias génicas y de estructuras de proteínas.

La bioquímica describe en términos moleculares estas estructuras, sistemas y procesos químicos compartidos por los organismos.

Trata de explicar la vida en términos químicos unificadores, proporcionando ciertos principios de organización molecular que

subyacen en todas las formas de vida: la lógica molecular de la vida.

Los organismos son: agrupaciones de materia inanimada, es decir, de biomoléculas que, aisladas, cumplen con

todas las leyes de la fisicoquímica que describen el comportamiento del universo inanimado; pero cuya

interacción provoca las cualidades extraordinarias de la vida.

Conceptos clave: materia inanimada, universo inanimado, cualidades extraordinarias de los organismos.

Se continúa en las páginas 39 a 46.

13

1. Fundamentos celulares. 1.1) Características universales de las células.

MEMBRANA PLASMÁTICA.

La membrana plasmática (bicapa lipídica) define la periferia de la célula, separándola del medio externo. Es una

estructura laminar compuesta por lípidos anfipáticos –con cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica- y proteínas, que forman una

barrera hidrofóbica fina y flexible, pero resistente.

La elevada flexibilidad global de esta estructura es una consecuencia de la interacción no covalente entre subunidades de

lípidos y proteínas: esto permite que la célula cambie su forma y su tamaño.

La m.p. controla el paso de materiales entre la célula y su ambiente: como consecuencia del carácter hidrofóbico

de los lípidos, la membrana plasmática funciona como una barrera que impide la libre circulación de iones inorgánicos y de

compuestos cargados (polares): es selectivamente permeable para sustancias polares, permitiendo la circulación de oxígeno,

azúcares simples, agua y dióxido de carbono. De esta forma se mantiene estable el medio intracelular, regulando el paso de iones y

metabolitos, y manteniendo el potencial electroquímico (haciendo que el medio interno esté cargado negativamente).

Además de lípidos, la membrana también incluye proteínas de membrana:

1) proteínas de transporte, que permiten el paso de ciertos iones y moléculas,

2) proteínas receptoras, que reciben señales y las transmiten al interior de la célula,

3) enzimas de membrana, que son importantes en algunas reacciones.

La misma célula sintetiza los lípidos y las proteínas de membrana.

Las funciones de la membrana plasmática se pueden resumir en:

Transporte: intercambio de materia entre el interior celular y su ambiente externo. Puede ser llevado a cabo por

las proteínas de transporte anteriormente mencionadas, o por procesos de endocitosis y exocitosis: parte de

la membrana plasmática se invagina o evagina, recubriendo moléculas de gran tamaño para incorporarlas o

expulsarlas, respectivamente.

Reconocimiento y comunicación: llevados a cabo por las moléculas en la membrana, que actúan como

receptoras de sustancias.

El grosor total de la membrana plasmática suele rondar los 8-10 nm. Se puede observar con un microscopio electrónico de

transmisión, teniendo la forma de una doble línea delgada y continua. Por último, la interpretación actual de su organización

molecular consiste en el modelo de mosaico fluido modificado (mmfm).

14

Tanto en los procariotas como en los eucariotas: la membrana plasmática es una bicapa fosfolipídica, con una región

hidrofóbica central y zonas hidrofílicas superficiales, y presenta proteínas de membrana.

En procariotas, la membrana plasmática se ubica siempre por debajo de la pared celular. No posee colesterol ni otros

esteroides. Además, puede presentar prolongaciones hacia el interior de la célula. En eucariotas sí presenta colesterol y otros

esteroides.

15

CITOPLASMA.

El citoplasma es el volumen interno delimitado por la membrana plasmática. Está compuesto por el citosol y orgánulos en

suspensión.

Citosol: solución acuosa, matriz acuosa, gel acuoso. Es una disolución que posee una elevada concentración de diferentes

partículas en suspensión, cada una con su función específica. Estas partículas están tanto en eucariotas como en procariotas:

moléculas de RNA que codifican para enzimas;

enzimas codificadas por dicho RNA;

ribosomas: macromoléculas en las que tiene lugar la síntesis de proteínas. Los ribosomas procariotas difieren de los eucariotas.

En los ribosomas encaja el RNAm; los ribosomas le dan lectura y cada aminoácido encaja en un codón para dar una proteína.

unidades de aminoácidos y nucleótidos para ensamblar biomoléculas;

centenares de metabolitos: pequeñas moléculas orgánicas, que funcionan como intermediarias de rutas biosintéticas y

rutas degradativas (r.b. + r.d. = rutas metabólicas);

coenzimas: compuestos esenciales en muchas reacciones;

iones inorgánicos;

proteasomas: complejo proteico que degrada proteínas que ya no son necesarias para la célula.

Si se genera la ruptura suave de la membrana plasmática y centrifugamos el extracto celular a 150.000g durante 1 hora,

obtenemos dos fases: un sobrenadante y un pellet.

Sobrenadante: fracción homogénea que no precipita. Compuesta por citosol y partículas: es una disolución

concentrada de fracciones de membrana, proteínas, RNA, subunidades monoméricas, metabolitos e iones inorgánicos.

Pellet: fracción que sedimenta. Compuesta por partículas y orgánulos. Ribosomas, gránulos de almacenamiento,

mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, retículo endoplasmático.

16

NUCLEO y NUCLEOIDE.

El núcleo (en eucariotas) y el nucleoide (en procariotas; también llamado región nuclear o cuerpo nuclear) son el

1. sitio de almacenamiento y replicación del genoma –conjunto de genes, compuestos por DNA y proteínas asociadas al DNA-.

Además, el núcleo y el nucleoide:

2. Son los lugares en donde se llevan a cabo la transcripción: la síntesis de RNA

3. Regulan el ciclo celular, la división celular

4. Regulan la síntesis proteica

En procariotas (bacterias y arqueobacterias), el nucleoide no está separado del citoplasma por una membrana. En el nucleoide

no existen histonas.

En eucariotas el núcleo está bien definido, rodeado por una membrana doble: la envoltura nuclear. Esta envoltura consiste en

dos bicapas lipídicas atravesadas por numerosos poros nucleares y en continuidad con el retículo endoplasmático. En este caso, el

DNA está organizado en cromosomas, y existen histonas.

En base a esto –presencia o ausencia de envoltura nuclear- se separa al dominio Eucarya de los otros dos dominios: Archaea

y Bacteria. Estos tres dominios de la vida representan las tres ramas de la evolución a partir de un progenitor común. Los grupos

Bacteria y Archaea se pueden diferenciar en base a consideraciones bioquímicas y genéticas. Las pruebas de que se dispone sugieren

que estos dos grupos divergieron pronto. Eukarya, que incluye a todos los organismos eucarióticos, evolucionó a partir de la misma

rama que dio origen a las arqueas: los eucariotas están más estrechamente relacionados con las arqueas que con las bacterias.

Se continúa en las páginas 23 a 30.

Micrografía electrónica de Microfotografía electrónica del núcleo

nucleoide de E. Coli. de una célula eucariota.

17

1. Fundamentos celulares. 1.2) Niveles de complejidad celular.

En algunos organismos unicelulares (bacterias, algas verdeazuladas…) se observa el siguiente nivel de complejidad o tipo de

organización:

Colonia celular: grupo de células con características similares, que actúan en conjunto, pero que no constituyen una

unidad estructural mayor o una especie de tejido.

En organismos pluricelulares, se pueden encontrar los siguientes niveles de complejidad:

Tejidos: grupo de células que realizan una determinada función.

Ej., tejido epidérmico.

Órganos: grupos de células y tejidos que realizan una determinada función.

Ej., la hoja, compuesta por grupos de células y tejidos que realizan en conjunto una determinada función: la fotosíntesis.

Sistemas: grupos de células, tejidos y órganos, que están organizados para realizar una determinada función.

Ej., sistema vascular de las plantas superiores; sistema circulatorio de animales.

Se relaciona con las páginas 57.

18

19

1. Fundamentos celulares. 1.3) Dimensiones celulares y difusión.

Las células eucariotas tienen un volumen celular entre mil a un millón de veces superior al de bacterias.

Diámetro típico de células animales y vegetales: entre 5 y 100 micrómetros.

Muchos organismos unicelulares tienen un diámetro de tan sólo 1 a 2 micrómetros

y existen unicelulares procariotas considerablemente más pequeños.

El límite inferior probablemente esté definido por el número mínimo de biomoléculas necesarias. Por ejemplo: ciertas

bacterias tienen un diámetro de 300 nanómetros, y un solo ribosoma bacteriano tiene un diámetro de 20 nanómetros en su

dimensión más alargada. Un ribosoma ocuparía 1/15 del tamaño total de la célula, y siendo que este tipo de célula necesita una

determinada cantidad mínima de ribosomas para ser funcional, el tamaño total de la célula no podrá ser menor a un determinado

valor –por debajo del cual, la cantidad de ribosomas necesarios no entra en la célula-.

El límite superior del tamaño celular está probablemente definido por la velocidad de difusión de las moléculas disueltas en

sistemas acuosos. Al aumentar el tamaño de la célula, disminuye la relación superficie/volumen hasta llegar a un punto en el que

su metabolismo consume las moléculas que ingresaron al citoplasma a una velocidad superior a la del suministro mediante

difusión. Entonces, el metabolismo que requiere estas moléculas se hará imposible cuando el tamaño celular crezca por encima de

un determinado valor: el límite teórico superior del tamaño de la célula.

¿Qué es lo que limita las dimensiones

de una célula?

20

21

1. Fundamentos celulares. 1.4) Nutrición.

Los organismos pueden clasificarse en base a su fuente principal de energía y carbono, para su uso en la síntesis de

material celular.

Se pueden establecer dos amplias categorías en base a la fuente de energía: fotótrofos y quimiótrofos. Los fotótrofos

recolectan y utilizan la luz solar. Los quimiótrofos obtienen energía a partir de la oxidación de combustibles químicos: ¿qué quiere

decir esto? Que transfieren electrones desde estos combustibles hacia buenos aceptores electrónicos; que transfieren protones desde

estos combustibles hacia buenos aceptores de protones; que transfieren átomos de oxígeno hacia estos combustibles.

Los quimiótrofos, además, pueden ser litótrofos u organótrofos. Los litótrofos oxidan combustibles inorgánicos: transforman,

por ejemplo, el HS- (anión hidrogenosulfuro) a S (azufre elemental), el S a SO4= (anión sulfato), el NO2- (ión

nitrito) a NO3- (ión nitrato), o el Fe2+ (ión ferroso) a Fe3+ (ión férrico). Los organótrofos oxidan compuestos

orgánicos.

Por último, en base a la fuente de carbono, seres vivos pueden dividirse en autótrofos (aquellos que obtienen carbono del

CO2 y otras sustancias inorgánicas) y heterótrofos (los que obtienen carbono de nutrientes orgánicos).

Fotótrofos.

Quimiótrofos litótrofos.

Quimiótrofos organótrofos.

Existen fotótrofos autótrofos (plantas, cianobacterias), fotótrofos heterótrofos (bacterias púrpuras, bacterias verdes), y

quimiótrofos heterótrofos (mayoría de los procariotas, y todos los eucariotas no fotótrofos).

Se continúa en las páginas 47 a 66.

22

23

1. Fundamentos celulares. 1.5) Células procariotas.

Como vimos, los procariotas son organismos unicelulares sin núcleo diferenciado: poseen una región citoplasmática

denominada nucleoide, sin membrana o envoltura nuclear, y en donde se encuentra disperso su DNA.

Desde el punto de vista ecológico: papel fundamental como descomponedores. Degradan los restos orgánicos de otros

organismos muertos, transformándolos en materia inorgánica. Además, muchos de ellos fijan el N atmosférico.

Debido a su pequeño tamaño, el contacto con su entorno es inmediato: permanente influencia del entorno sobre su

metabolismo y desarrollo.

Envoltura celular bacteriana y arqueobacteriana.

El plan estructural general de la envoltura celular de bacterias comprende las siguientes capas:

1) membrana plasmática interna.

2) pared celular: capa intermedia de peptidoglucano.

3) membrana externa de protección;

Pero cada grupo bacteriano puede presentar características diferenciales. Por ejemplo, las bacterias no siempre presentan

membrana externa. Además, las arqueobacterias son un caso aparte: otros lípidos de membrana plasmática, otra composición de

pared celular, y nunca poseen membrana externa.

Bacterias gram-negativas: presentes las tres capas de la

envoltura celular.

Bacterias gram-positivas: no hay membrana externa, y la capa

de peptidoglucano es más gruesa.

Cianobacterias: son gram-negativas pero capa de peptidoglucano

más resistente.

Arqueas: no hay membrana externa. Capa externa de

pseudopeptidoglucano que confiere una gran rigidez.

Membrana plasmática interna de arquitectura similar a bacterias,

pero sus lípidos difieren.

24

Con respecto a la composición y localización de la pared celular, notemos que:

en bacterias está constituida por peptidoglucano, y puede ser una capa intermedia o externa de la envoltura celular,

en arqueobacterias está constituida por pseudopeptidoglucano y siempre es una capa externa de la envoltura celular

Y que, en todos los casos, rodea a la membrana plasmática interna.

La función de la pared celular es proporcionar integridad estructural: forma y rigidez, pese a que las haya más rígidas y más

flexibles. Su estructura es porosa y permite el paso de sustancias. Además, su grosor puede variar.

En base a la tinción de Gram existen dos categorías de envolturas celulares bacterianas: 1) gram-positivas y 2) gram-

negativas:

Las gram-positivas se tiñen de morado con el colorante cristal violeta usado en la tinción de Gram, ya que éste queda

atrapado en la gruesa capa de peptidoglucanos que rodea a la célula.

Las gram-negativas tienen una capa de peptidoglucano mucho más delgada, y es por esto que no retienen el colorante

cristal violeta. Por esto acaban teñidas de rojo con la safranina.

Estructura de las gram-positivas y gram-negativas.

25

Cápsula.

Aparece en algunos grupos. Se localiza superficialmente, por fuera de la envoltura celular. Está formada por polisacáridos o

polipéptidos. Confiere la propiedad de adherirse a otras células, o a sustratos inertes.

Membrana plasmática.

Sin colesterol y otros esteroides.

Citoplasma.

No está compartimentalizado. Presenta numerosos ribosomas agrupados, que forman polirribosomas o polisomas.

Flagelos.

Aparece en algunos grupos. Son extensiones largas y delgadas, constituidas por monómeros de flagelina (proteína globular).

Pili.

Aparece en algunos grupos. Permite la adhesión de ciertas bacterias a una fuente alimenticia.

DNA.

Poseen un solo cromosoma formado por una sola molécula circular de DNA asociada a proteínas no histónicas. Además poseen

plásmidos: material genético circular y autorreplicante.

26

27

1. Fundamentos celulares. 1.6) Orgánulos eucariotas.

A diferencia de las células procariotas, las células eucariotas poseen compartimentalización: orgánulos; estructuras

internas típicas.

Las estructuras rotuladas en rojo son exclusivas de células animales o vegetales.

Los microorganismos eucarióticos (protistas, hongos) tienen estructuras similares, pero pueden contener también orgánulos especializados no ilustrados aquí.

28

Vemos, entonces, que las células eucariotas están multicompartimentadas: confinan sus procesos en orgánulos específicos.

Esta multicompartimentalización consiste en un sistema de membranas internas que separan las funciones en compartimientos

diferenciados: orgánulos.

La estructura básica de la membrana plasmática se repite en las membranas que rodean al núcleo y a los distintos orgánulos

de la célula eucariótica.

Los orgánulos pueden dividirse en membranosos y no membranosos (ribosomas, centriolos, microtúbulos, filamentos…).

Dentro de las células también pueden haber inclusiones: elementos diversos que carecen de membrana; cristales, gránulos de

pigmento, lípidos, glucógeno y productos de desecho.

Una de las principales diferencias entre células animales y vegetales es la pared celular, completamente diferente a la de los

procariotas. Es una capa rígida que se localiza en el exterior de la membrana plasmática de las células vegetales. Está formada por

celulosa, pectina y lignina (polisacáridos). En hongos también hay pared celular, formada por quitina y otros polisacáridos.

NÚCLEO.

En mamíferos, diámetro promedio de aproximadamente 6 micrómetros. En la célula vegetal, entre 5 y 25 micrómetros (visible

con microscopio óptico). En las oósferas de Cycas y de coníferas, 0,6 milímetros (resulta visible a simple vista). En algunos hongos,

núcleos muy pequeños de 0,5 micrómetros.

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO.

Es una red interconectada de tubos aplanados y sáculos comunicados entre sí, de 40 a 50 nanómetros de espesor. El retículo

endoplasmático rugoso se encuentra unido a la membrana nuclear externa, y se prolonga en el retículo endoplasmático

liso.

El R.E.R. está relacionado con la síntesis proteica. Tiene apariencia rugosa debido a numerosos ribosomas adheridos a su

membrana: estos ribosomas suelen medir, aproximadamente, entre 20 y 30 nanómetros. El R.E.R. tiene sáculos más redondeados

que el liso, cuyo interior se conoce como ‘luz del retículo’ o ‘lumen’: allí caen las proteínas sintetizadas por los ribosomas.

El R.E.L. no tiene ribosomas, y participa del metabolismo de lípidos –como por ejemplo, algunos esteroides- y fármacos.

Además, ambos intervienen en el transporte intracelular mediante vesículas de tamaño muy variable, desde 25 a 500

nanómetros de diámetro.

APARATO DE GOLGI.

Consiste en un conjunto de sacos membranosos aplanados, rodeados por túbulos y vesículas. El A.G. recibe las vesículas del

retículo endoplasmático, para procesar su contenido. Este procesamiento consiste en la glicosilación de proteínas y la

glicosilación de lípidos. Además, el A.G. participa de la síntesis de polisacáridos.

Está dividido en cis-Golgi y trans-Golgi:

Compartimiento cis: proximal al retículo endoplasmático

Compartimiento o red trans: el más distal, del que emergen las vesículas con sus diversos destinos celulares

29

PEROXISOMAS.

Son orgánulos muy comunes, tanto en células animales como vegetales. Tienen forma de vesícula. Se forman de vesículas

procedentes del retículo endoplasmático. Contienen abundantes enzimas de tipo oxidasa y catalasa, que participan en:

Oxidaciones flavínicas generales

Beta-oxidación de los ácidos grados

Catabolismo de las purinas

Ciclo del glioxilato

LISOSOMAS. No se ha demostrado su existencia en células vegetales.

Orgánulos que albergan multitud de enzimas hidrolíticas: hidrolasas. Estas enzimas son capaces de catalizar la hidrólisis de

un enlace químico, es decir, de digerir proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos.

Son vesículas con una morfología muy variable, formadas por el aparato de Golgi.

VACUOLAS VEGETALES. Exclusivas de los representantes del mundo vegetal.

Inmersas en el citosol, están delimitadas por una membrana lipídica simple. Son numerosas y pequeñas en las células en

crecimiento, y escasas y grandes en células diferenciadas, ocupando aproximadamente el 90% del volumen celular.

Sus funciones son:

Facilitar el intercambio con el medio externo

Mantener la turgencia celular

La degradación y el reciclaje de macromoléculas: digestión celular

La acumulación de sustancias de reserva y de subproductos del metabolismo

MITOCONDRIAS.

En las mitocondrias se completa la oxidación de metabolitos: tienen lugar la glucólisis, el ciclo de Krebs y la beta-oxidación de

ácidos grasos, para obtener ATP. Tienen un diámetro aproximado de 1000 nanómetros = 1 micrómetro.

Tienen el mismo peso que los lisosomas, pero distinta densidad.

CITOESQUELETO.

Es un andamiaje que permite el mantenimiento de la forma y estructura celular. Constituye además un sistema dinámico que

interactúa con el resto de los componentes celulares generando un alto grado de orden interno: genera movilidad intracelular.

Está formado, principalmente, por microtúbulos, microfilamentos de actina y filamentos intermedios: proteínas que se

agrupan dando lugar a estructuras filamentosas, a una especie de retículo.

30

¿Cómo hace la bioquímica para estudiar los procesos confinados en estos orgánulos (procesos protagonizados

por biomoléculas)? Se pueden utilizar técnicas de PURIFICACIÓN/AISLAMIENTO problemas de detección de interacciones

moleculares

las biomoléculas no se comportan igual en

la célula que in vitro

Muchos estudios de la estructura y función celular requieren muestras de un tipo de orgánulo celular en particular. Sin

embargo, la mayoría de los tejidos contienen una mezcla de tipos de células, y la mayoría de las células están llenas de diversos

orgánulos. Más adelante se describirán algunas técnicas utilizadas para separar diferentes tipos de células, orgánulos y diferentes

tipos de biomoléculas: técnicas de purificación.

Con respecto a las técnicas de purificación, es necesario hacer una consideración más:

Los estudios in-vitro pueden no detectar interacciones importantes entre moléculas.

Las moléculas suelen estudiarse purificadas in-vitro (dentro de tubos de ensayo). Así, se evita la interferencia con otras

moléculas presentes en las células. Si el estudio es para entender un proceso biológico, esto impone ciertos límites: los

componentes eliminados mediante purificación pueden ser críticos para la función biológica o para la regulación de la actividad de

la molécula en estudio. Resumiendo: una molécula puede actuar de modo muy diferente en la célula que in vitro.

Uno de los retos de la bioquímica consiste en comprender cómo influyen la organización celular y las asociaciones

moleculares en la función de las biomoléculas: comprender la función tanto in-vivo como in-vitro.

Se continúa en las páginas 85 a 110.

31

1. Fundamentos celulares. 1.7) Citoesqueleto: soporte y dinámica intracelular.

El citoesqueleto es una trama tridimensional e interconectada de distintos tipos de filamentos proteicos; un sistema dinámico

no rígido que interactúa con el resto de los componentes celulares. Todos ellos proporcionan estructura y organización al

citoplasma y mantienen la forma de la célula. Existen tres clases principales de filamentos proteicos:

Microfilamentos de actina.

Microtúbulos.

Filamentos intermedios.

Todos estos filamentos proteicos están compuestos por subunidades proteicas simples asociadas de manera no covalente,

dando filamentos de grosor uniforme. Estos filamentos fluctúan constantemente entre su forma monomérica –cuando las

subunidades están sueltas- y su forma polimérica. Se desagregan para reagruparse en otro lugar y así se desplazan (durante

mitosis, citoquinesis, desplazamiento ameboide de célula, etcétera): no poseen localización celular permanente.

Los orgánulos se mueven a lo largo de estos filamentos, gracias a la energía de motores proteicos. El movimiento y la posición

de los orgánulos y de los elementos del citoesqueleto están sometidos a una estrecha regulación y en el transcurso de la vida de la

célula se producen importantes reorganizaciones finamente orquestadas, tales como la mitosis. Las interacciones entre

citoesqueleto y orgánulos también son reversibles, de tipo no covalente, y están sujetas a regulación por diversas señales intra y

extracelulares.

32

33

1. Fundamentos celulares. 1.8) Monómeros, polímeros y complejos supramoleculares.

Las proteínas, los polisacáridos y los ácidos nucleicos son diversos tipos de polímeros, por ende están formados por monómeros.

Los monómeros de las proteínas son los aminoácidos.

Los monómeros de los polisacáridos son los monosacáridos.

Los monómeros de los ácidos nucleicos son los nucleótidos. Es importante recordar que

base nitrogenada + pentosa + ion fosfato = nucleótido [ribonucleótidos en el RNA, desoxirribonucleótidos en el DNA].

base nitrogenada + pentosa = nucleósido

Los polímeros más cortos se suelen denominar oligómeros: dímeros, trímeros, tetrámeros, etcétera. Ej., la sacarosa, un dímero

formado por glucosa y fructuosa, dos monómeros.

Las siguientes son algunas biomoléculas importantes. Memorizarlas puede ser muy útil para entender mejor la Química Biológica:

Polímeros (en griego, muchas partes; muchos bloques; muchos segmentos): son moléculas formadas por la unión de otras moléculas más

pequeñas llamadas monómeros (en griego, una parte; un bloque). Estos monómeros o bloques deben ser moléculas de arquitectura

semejante o idéntica, uniéndose de manera lineal –es decir, al igual que vagones para formar un tren-: en cadena. Este es el motivo por el cual

los lípidos no suelen ser considerados polímeros: no están formados por monómeros concatenados linealmente (ver estructura de un lípido).

La secuencia de monómeros contiene la información necesaria para definir:

a) Estructura tridimensional

b) Función biológica

Entonces, los monómeros de un polímero pueden ser todos iguales, o diferir. La reacción por la cual es sintetizado un polímero a partir de sus

monómeros, es denominada polimerización. Existen diversos mecanismos biológicos de polimerización. Los polímeros pueden clasificarse

según estos mecanismos de polimerización, según su origen, según su composición química, según sus aplicaciones, según su comportamiento

al elevar la temperatura, etcétera.

34

Los polímeros pueden asociarse para formar complejos supramoleculares. Por ejemplo, la hemoglobina es un complejo

supramolecular en el que aproximadamente 600 aminoácidos se enlazan para formar 4 cadenas proteicas, las que también se

asocian y se pliegan para dar una estructura globular típica de aproximadamente 5,5 nanómetros de diámetro. Nótese que este

complejo supramolecular, la hemoglobina, está constituido entonces por cuatro polímeros proteicos asociados entre sí.

Las subunidades monoméricas de proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos se unen mediante enlaces covalentes. En los

complejos supramoleculares ocurre otra cosa: los polímeros constituyentes se mantienen unidos por interacciones no

covalentes, mucho más débiles. Entre las interacciones no covalentes podemos contar (4):

Enlaces por puente de hidrógeno: entre un átomo electronegativo y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a

otro átomo electronegativo,

Interacciones iónicas: a nivel de catión-anión, entre distintas moléculas cargadas, formando una unión electrostática,

Interacciones hidrofóbicas: entre lípidos, cadenas alquílicas y grupos apolares en disolución acuosa. No se atraen: se

agrupan o agregan porque así el sistema alcanza la máxima estabilidad termodinámica posible.

Interacciones de van der Waals (o fuerzas de dispersión de London): entre moléculas sin carga eléctrica neta,

debido a fenómenos de polarización temporal. Fuerzas muy débiles que se incrementan a mayor tamaño molecular.

Todas ellas poseen una energía considerablemente menor que la de los enlaces covalentes. Estas interacciones se describen más

adelante.

Los complejos supramoleculares son estables gracias al gran número de interacciones débiles que se establecen dentro de ellos, y

que son las responsables de sus estructuras únicas.

35

1. Fundamentos celulares. 1.9) Macromoléculas: principal constituyente de las células.

Las macromoléculas son polímeros de masa molecular superior a 5.000. Las macromoléculas pueden asociarse y formar

estructuras supramoleculares complejas, como los ribosomas.

Las proteínas son las biomoléculas más versátiles, y el catálogo de sus funciones resultaría muy largo: estructurales,

catalíticas, receptoras de señales, transportadoras, etcétera. La suma de todas las proteínas que funcionan en una célula se

denomina proteoma.

Los ácidos nucleicos almacenan y transmiten la información genética. Algunas moléculas de RNA desempeñan papeles

estructurales y catalíticos en complejos supramoleculares.

Los polisacáridos, polímeros de azúcares simples, tienen tres funciones principales: 1) almacén de combustibles energéticos,

2) papel estructural de las paredes celulares –plantas, bacterias, hongos… -, 3) elementos de reconocimiento extracelular:

oligosacáridos actúan como señales específicas cuando se presentan unidos a proteínas o lípidos de la superficie celular.

Los lípidos, derivados de hidrocarburos insolubles en agua, sirven como reserva de combustible rico en energía, componentes

estructurales de membranas, señales intracelulares y pigmentos.

Proteínas, polisacáridos y polinucleótidos tienen un gran número de subunidades monoméricas y, por lo tanto, grandes masas

moleculares:

Proteínas: entre 5000 y más de 1 millón.

Polisacáridos: del orden de millones en algunos como el almidón.

Polinucleótidos: hasta varios miles de millones.

Las moléculas de lípidos son mucho más pequeñas: su masa molecular suele estar entre 750 y 1500. No se consideran

macromoléculas. Pese a esto, pueden formar estructuras muy grandes por asociación no covalente. Ej.: membranas celulares.

La secuencia específica de subunidades monoméricas y su disposición en el espacio tridimensional determinan,

en gran medida, la función biológica particular las macromoléculas –genética, catalizadora, hormonal, etcétera-.

Cada monómero, por su parte, suele desempeñar más de una función en las células vivas. Ej.: los ocho nucleótidos

–ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos-, además de servir como subunidades de los ácidos nucleicos, actúan como moléculas

portadoras de energía. Los aminoácidos, además de subunidades proteicas, son precursores de hormonas,

neurotransmisores, pigmentos y muchas otras clases de biomoléculas.

36

37

1. Fundamentos celulares. Modelo ejemplo: Escherichia coli.

E. coli es un inquilino habitualmente inofensivo del tracto intestinal humano.

Estructura.

Tiene aproximadamente 2 micrómetros de longitud y menos de 1 micrómetro de diámetro. Contiene aproximadamente 15.000

ribosomas, de decenas a miles de copias de 1000 o más enzimas diferentes, aproximadamente 1000 compuestos orgánicos de masa

molecular inferior a 1000 (metabolitos y cofactores) y una variedad de iones inorgánicos.

En la siguiente tabla se muestran las principales clases de biomoléculas de E. coli.

E. Coli es gram-negativa: reacciona negativamente a la tinción de Gram envoltura

celular: membrana plasmática interna, capa intermedia de peptidoglucano y membrana

externa protectora.

Es un microorganismo anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su

cuerpo), no forma esporas, y es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.

38

39

2. Fundamentos químicos. 2.1) Introducción.

El objetivo de la bioquímica es explicar las estructuras y las funciones biológicas en términos químicos.

Durante el siglo XX, se observaron grandes similitudes químicas entre células muy diferentes –por ej., entre levaduras y células

musculares de animales-, lo que confirmó la universalidad de los procesos bioquímicos en seres vivos, idea claramente resumida en

la afirmación de Monod.

Esta universalidad de intermediarios y transformaciones químicas (teoría de la unidad bioquímica) es uno de los más sólidos

fundamentos de la noción actual de que todos los organismos comparten un origen evolutivo: en la práctica totalidad de las células

existe un conjunto de metabolitos y rutas metabólicas centrales que se han conservado a lo largo de la evolución.

Existe un conjunto casi universal de unos centenares de moléculas = desarrollados en células primitivas. de baja masa molecular (metabolitos) y de sus rutas bioquímicas, manifestación de la conservación evolutiva.

que aparecen en la práctica totalidad de los seres vivos.

Existen otras biomoléculas pequeñas que son específicas para cada tipo de células u organismos. Además, al conjunto de las

moléculas pequeñas de una célula determinada, se le llama metaboloma de la célula.

De los 90 elementos químicos presentes en la naturaleza, menos de 30 son esenciales para los seres vivos. La mayor parte de estos

elementos de la materia viva, tiene un número atómico relativamente bajo y sólo dos de ellos tiene un número atómico superior al

del selenio (34).

El hidrógeno, el oxígeno y el nitrógeno y el carbono (CHON) son los cuatro elementos más abundantes: en conjunto representan

más del 99% de la masa de la mayoría de las células. Son los elementos más ligeros capaces de formar uno, dos, tres y cuatro

enlaces covalentes, respectivamente. Además, los elementos más ligeros forman generalmente los enlaces más fuertes.

40

2. Fundamentos químicos. 2.2) Un segundo abordaje general a las biomoléculas.

Las biomoléculas son compuestos de carbono con una diversidad de grupos funcionales.

¿Por qué de carbono? El carbono puede formar enlaces simples con átomos de hidrógeno, enlaces tanto simples como dobles con

átomos de oxígeno o de nitrógeno, y enlaces simples, dobles y triples con otros átomos de carbono. Y como todos estos elementos

son ligeros, forman enlaces considerablemente fuertes.

Los enlaces simples carbono-carbono son de gran estabilidad, razón por la cual resultan trascendentes para la biología. Estos se

proyectan desde el núcleo a los cuatro vértices de un tetraedro, con un ángulo de 109,5º entre cada uno de ellos y una longitud

media de enlace de 0,154 nm. Existe libertad de rotación alrededor de enlaces simples a no ser que ambos átomos de carbono estén

unidos a grupos muy voluminosos o cargados, en cuyo caso la rotación puede estar restringida.

Un enlace doble carbono-carbono es más corto (aprox. 0,134 nm) y rígido, y no permite la rotación alrededor de su eje.

Los átomos de carbono enlazados covalentemente pueden formar cadenas lineales, ramificadas y estructuras cíclicas.

La versatilidad de enlace del carbono fue probablemente una de las principales causas de la selección de los compuestos de

carbono para formar parte de la maquinaria molecular de las células durante el origen y la evolución de los seres vivos: ningún otro

elemento puede formar moléculas con formas y tamaños tan diferentes o con tanta variedad de grupos funcionales.

41

Puede considerarse que la mayor parte de las biomoléculas son derivados de hidrocarburos, con átomos de hidrógeno

reemplazados por una amplia gama de grupos funcionales. Estos GFs confieren propiedades químicas y reactividad específicas para

dar lugar a las diferentes familias de compuestos orgánicos. Las biomoléculas pueden tener un único tipo de GF o varios GFs

diferentes, cada uno de ellos con propiedades químicas y reactividad propia. En este último caso, las moléculas son consideradas

polifuncionales.

La personalidad química de cada compuesto viene determinada por

la química de sus grupos funcionales y su disposición en el espacio tridimensional.

Los siguientes son algunos GFs. Sugiero memorizarlos, con el fin de facilitar el estudio de las biomoléculas:

42

43

2. Fundamentos químicos. 2.3) Estructura tridimensional.

En este último capítulo, vimos que la estructura del esqueleto carbono-carbono, el tipo de enlace covalente y los GFs de las

biomoléculas definen en gran medida su función. Otra característica de importancia crucial es la estereoquímica: disposición de

los átomos de una molécula en el espacio tridimensional.

Entre los compuestos de carbono existen muchas moléculas que son estereoisómeros: moléculas que contienen los mismos

enlaces químicos pero con diferente configuración (=estereoquímica = distribución espacial de sus átomos constituyentes). Es

decir, idéntica fórmula molecular pero diferente fórmula estructural.

Existen dos tipos de estereoisómeros:

La estereoselectividad es la formación preferente de un estereoisómero sobre todos los posibles: cuando un precursor

se convierte en varios estereoisómeros, pero no en partes iguales (por ej.: 60 % la forma trans-2-buteno, 40% la forma

cis-2-buteno).

Además, las interacciones entre biomoléculas son invariablemente estereoespecíficas: una biomolécula debe tener

determinada configuración para poder interactuar con otra biomolécula (una molécula no interactúa con cualquier

estereoisómero).

En la siguiente figura se muestran tres formas de ilustrar la estructura estereoquímica o configuración de una molécula

–específicamente, del aminoácido alanina-:

Isómeros geométricos (cis y trans).

Isómeros quirales: enantiómeros y

diasteroisómeros (aquí representado un par

de enantiómeros).

(a) Fórmula estructural en perspectiva (diagrama

en perspectiva). Las cuñas más sólidas (en negrita)

representan un enlace en el que el átomo se proyecta hacia

el exterior del plano del papel; hacia el lector. Las cuñas a

trazos (entre los carbonos) representan enlaces dirigidos

hacia la parte posterior respecto al plano del papel. Este

diagrama no es ambiguo, pero ángulos y distancias de

enlace se representan mejor en (b).

44

(b) Modelo de bolas y varillas. Se observan mejor los ángulos de enlaces y las longitudes relativas de enlaces. (c) Modelo

espacial. El radio de cada átomo es proporcional a su radio de van der Waals. Este modelo define mejor el espacio ocupado por la

molécula (así como el volumen del que quedan excluidos los átomos de otras moléculas).

Con respecto a la estereoselectividad: para que tuviera sentido, un estereoisómero no debería poder transformarse en otros

estereoisómeros. Esto es correcto. Los estereoisómeros no pueden interconvertirse espontáneamente: no se puede transformar un

estereoisómero en otro sin romper uno o más enlaces covalentes. ¿Cuál es la causa de esto? (Es decir, la causa de la existencia de los

estereoisómeros).

1) Los enlaces dobles, alrededor de los cuales no hay rotación, impidiendo que un estereoisómero se convierta

espontáneamente en otro. Entonces: para provocar la interconversión deberían romperse enlaces covalentes, y este

proceso consume mucha más energía que la energía cinética media de moléculas a temperatura fisiológica.

Como consecuencia de los enlaces dobles surgen los isómeros geométricos.

2) Los centros quirales. ¿Qué es esto? Para empezar, definamos imagen especular. La imagen especular es el reflejo

en un espejo de cualquier objeto. Si reflejamos un cubo en un espejo, tenemos un cubo original y un cubo especular.

Ahora, si hacemos rotar al cubo especular unos 180º, vemos que los dos cubos coinciden perfectamente. Probemos el

mismo ejercicio con una mano, y veremos que no sucede lo mismo: las imágenes especulares no coinciden –recordá girar

mentalmente la mano especular unos 180º-.

La mano derecha y la mano izquierda son imágenes especulares que no coinciden. Mirá tu mano derecha, después mirá la

izquierda. Notarás que no son superponibles, porque si tratás de acoplarlas una encima de la otra no encajan: los

pulgares quedan coincidiendo con los meniques. A esta propiedad se le llama quiralidad. ¡Tus manos son quirales!

Configuración de dos isómeros geométricos. En este caso, si el estereoisómero cis absorbe energía lumínica, es convertido en el

estereoisómero trans. Obsérvese que en los modelos de bolas y varillas de los retinales se omiten los átomos de hidrógeno.

45

La quiralidad es la propiedad de un objeto de no ser superponible con su imagen especular. Ahora vayamos a las

moléculas:

Un centro quiral o carbono asimétrico es un átomo de carbono tetraédrico con cuatro grupos sustituyentes

diferentes (ej.: A, B, C, H): ver imagen de la página anterior. Para una fórmula molecular que incluya un carbono

asimétrico, existen siempre dos fórmulas estructurales distintas: ver las dos moléculas de la imagen citada anteriormente,

que son imágenes especulares no coincidentes.

Es decir, cuando en un compuesto existe un centro quiral, este compuesto tiene dos estereoisómeros, que son imágenes

especulares no coincidentes. A estos dos estereoisómeros se les llama enantiómeros. Por más que hagamos girar a

cualquiera de los dos enantiómeros, jamás coincidirán con el otro (a menos que rompamos enlaces covalentes).

Lo contrario vendría a ser las moléculas aquirales, que son moléculas simétricas. Cuando tres grupos

sustituyentes son diferentes (es decir, hay dos sustituyentes iguales), solo es posible una configuración espacial y la

molécula es aquiral o simétrica. En este caso, la molécula puede superponerse a su imagen especular. Las moléculas

simétricas son imágenes especulares coincidentes, porque en verdad son la misma molécula (no hay estereoisómeros).

El otro tipo de estereoisómero quiral, son los diasteroisómeros. Como todo estereoisómero, los diasteroisómeros no

son superponibles, y su diferencia con los enantiómeros es que los diasteroisómeros no son imagen especular el uno del

otro.

Ver el siguiente gráfico.

46

En las células vivas se produce una sola forma quiral de una biomolécula gracias a que las enzimas que sintetizan esa molécula

son también, a su vez, moléculas quirales: las moléculas quirales de los organismos vivos se encuentran generalmente presentes en

sólo una de sus formas quirales.

Por último, vale aclarar que no debe confundirse el concepto de configuración con el de conformación. La conformación

molecular describe la disposición espacial de los grupos sustituyentes que tienen libertad para adoptar posiciones diferentes en el

espacio sin necesidad de romper enlaces, gracias a la libertad de rotación de los mismos. Es decir, dependiendo del grado de

rotación del enlace son posibles muchas conformaciones diferentes e interconvertibles. Por supuesto, no es posible aislar ninguna

de las dos formas conformacionales (confórmeros) puesto que son libremente interconvertibles.

CONVENCIÓN CLAVE PARA ESTEREOQUÍMICA: El sistema de nomenclatura RS es el más útil para compuestos con más de un

centro quiral. Se asigna una prioridad a cada uno de los grupos sustituyentes unidos a un carbono quiral. Prioridades:

OCH3 > OH> NH2 > COOH> CHO> CH2OH> CH3> H

Según este sistema, el grupo de prioridad más baja debe quedar en dirección opuesta a la del observador. Si la prioridad de los

otros tres grupos disminuye en sentido de las agujas del reloj, la configuración es R; si va en sentido inverso al de las agujas del

reloj, la configuración es S. De esta manera, cada carbono quiral es llamado S o R.

Otro sistema de nomenclatura es el D y L.

En el dibujo podemos observar cuatro moléculas diferentes con la misma fórmula molecular: cuatro

estereoisómeros. También se puede afirmar que hay dos pares de enantiómeros, y cuatro pares de

diasteroisómeros.

47

3. Fundamentos físicos. 3.1) Introducción.

Todo organismo debe producir trabajo para mantenerse vivo. A su vez, el trabajo requiere energía.

La energía es un tema central en la bioquímica. La síntesis continua de componentes celulares requiere trabajo químico; la

acumulación y retención de sales y componentes orgánicos en contra de un gradiente de concentración implica la realización de un

trabajo osmótico; la contracción muscular o el movimiento flagelar bacteriano representan un trabajo mecánico. ¿De dónde viene la

energía necesaria para los procesos que permiten que los organismos se mantengan vivos?

A lo largo de la evolución, las células desarrollaron mecanismos muy eficientes para acoplar energía obtenida de luz

solar o de combustibles con procesos celulares que requieren energía. La química biológica se plantea comprender estos

mecanismos de extracción, almacenamiento, conversión y consumo de energía en las células vivas. Para esto, es necesario conocer

los principios de la bioenergética: las transformaciones e intercambios de energía de las que dependen todos los organismos

vivos.

BIOLOGÍA y TERMODINÁMICA.

Las conversiones de la energía celular (la bioenergética) se pueden explicar con las leyes de la termodinámica. La

termodinámica emplea tres conceptos de gran importancia: sistema, entorno, universo.

Según la termodinámica, un sistema es todo aquello que está incluido en una región definida del espacio: la parte del universo que

es objeto de nuestro estudio. El entorno es el resto del universo. Universo= sistema + entorno.

Por ej., si hablamos de reacciones químicas en una solución, un sistema es el conjunto de reactivos, productos, el disolvente que los

contiene y la atmósfera circundante.

Un sistema puede ser abierto, cerrado o aislado. Un sistema abierto intercambia materia y energía con su entorno. Un sistema

cerrado no intercambia materia con su entorno. Un sistema aislado no intercambia ni materia ni energía con su entorno.

Los organismos son sistemas abiertos. Con respecto a la energía, como ya vimos, pueden extraerla de su entorno de dos maneras

diferentes:

a) captando combustibles químicos del entorno, para oxidarlos.

b) absorbiendo radiación solar, para sintetizar combustibles químicos y oxidarlos

48

En resumen, durante la oxidación de los combustibles químicos 1) disminuye la energía potencial de las complejas moléculas nutrientes, 2) liberando calor y generando productos metabólicos más simples, también liberados al entorno (aumento de la entropía del entorno), y 3) se usa la diferencia de energía para crear macromoléculas complejas para el organismo (aumento del orden/disminución de la entropía en el sistema). Gráfico a la derecha.

a) Los organismos extraen energía de su entorno (nutrientes o luz solar).

b) Disminuyen la energía potencial de los nutrientes (combustibles químicos)

c) Devuelven al entorno parte de la energía, en forma de calor.

d) Liberan algunos productos finales: moléculas menos organizadas que el combustible

original, aumentando la entropía del entorno.

e) Usan la diferencia de energía para sintetizar macromoléculas complejas (aumentando el

orden/disminuyendo el desorden en el sistema), y para producir trabajo.

Se puede decir que las células son transductores consumados de energía: mediante Transducciones Energéticas Metabólicas, son

capaces de interconvertir energía mecánica, química, osmótica y electromagnética con gran eficacia. Pero mientras que los transductores

mecánicos dependen de diferencias en la presión o en la temperatura para generar un flujo de calor y, gracias a este flujo, realizar trabajo,

todas las partes de un organismo vivo deben operar a unas condiciones prácticamente idénticas de presión y temperatura, por lo que el

flujo de calor deja de ser una fuente útil de energía.

De ello se desprende la noción de que las células son máquinas químicas que funcionan a temperatura constante.

Además, como vemos, los organismos captan materia y energía, y liberan materia y energía, consiguiendo de esta manera mantener un

orden interno y prolongar sus vidas. Al hacerlo, se cumplen las leyes de la termodinámica –particularmente, la primera y la segunda ley-.

49

3. Fundamentos físicos. 3.2) Primera ley de la termodinámica: principio de conservación de la energía.

Esta ley enuncia que la energía no se crea ni se destruye, sólo se transforma. Es decir que, en cualquier proceso físico o químico,

la cantidad total de energía del universo permanece constante, aunque su forma pueda variar: la energía se transforma.

¿Qué aplicación tiene este principio en biología? Cuando un organismo oxida carbohidratos, toma la energía almacenada en los

enlaces químicos y la transfiere/almacena en enlaces de otras moléculas: por ejemplo, en los enlaces de moléculas de ATP. En estas

reacciones químicas, la suma de la energía de los productos de la reacción y de la energía liberada en la reacción misma (del ATP

junto a otros productos de la reacción, y del calor, respectivamente), es igual a la energía inicial de las sustancias que reaccionaron

(carbohidratos y oxígeno, en este ejemplo). La energía se transformó: no se creó ni destruyó una sola porción de ella.

CALOR y TRABAJO.

Vale aclarar, el trabajo y el calor no son energías, son maneras en las cuales se transfiere la energía. El trabajo puede ser

mecánico, eléctrico, etc., y la cantidad de energía transferida depende en gran medida de la forma en que se lleve a cabo el proceso.

El calor es la transferencia de energía debido a que los sistemas se encuentran a distintas temperaturas: en el ejemplo biológico

del párrafo anterior, vemos que el calor es solamente transferencia de energía desde la molécula original de carbohidrato en plena

reacción, al entorno. Disipación de energía no reutilizable.

A continuación se trata con mayor detalle el concepto de calor.

Calor.

El calor es definido como la transferencia de energía a través de una frontera de un sistema debido a la diferencia de

temperatura entre el sistema y su entorno. Es una forma de transferencia de energía. El calor es energía en tránsito, por

ello es incorrecto decir “el calor de un cuerpo” al igual que decir “el trabajo de un cuerpo”. Es incorrecto hablar del calor

que posee un sistema. El calor Q no es una función de estado.

El “calor” al igual que el “trabajo” son modos de transferencia de energía, no formas de energía y no son funciones de

estado del sistema. Un sistema hace trabajo cuando causa movimiento frente a una fuerza opositora. El calor y el trabajo

son variables energéticas de transito convertibles entre sí. Una máquina de vapor es un ejemplo de una máquina

diseñada para convertir calor en trabajo. Por otra parte el giro de una rueda con paletas en un tanque de agua produce

calor por fricción: representa el proceso inverso, la conversión de trabajo en calor.

Cuando se transfiere calor a un cuerpo, y no hay cambio en la energía cinética o potencial del sistema, la temperatura

normalmente aumenta (una excepción a esto lo constituyen los cambios de fase o transición de fase que puede sufrir el

sistema, como al congelar o vaporizar el agua). La cantidad de energía térmica (denotada por Q) necesaria (i.e. que debe

ser transferida por calentamiento) para elevar la temperatura de un sistema es proporcional a la variación de temperatura

( ) y a la masa ( ) de la sustancia:

, donde es la capacidad térmica o calorífica de la sustancia, que se define como la energía

térmica que se necesita para aumentar un grado la temperatura de la sustancia. El calor específico ( ) es la capacidad

térmica por unidad de masa ( ):

50

La capacidad térmica es esencialmente una medida de la insensibilidad térmica que muestra una sustancia a la adición

de energía térmica. Cuanto más grande es la capacidad térmica, más energía debe ser añadida a una determinada masa

de material para causar un cambio particular de temperatura.

Históricamente se definió la unidad térmica de calor o caloría, como la cantidad de energía térmica necesaria para

elevar la temperatura de un gramo de agua en un grado Celsius (ºC) (o un kelvin, K; puesto que el grado Celsius y el

kelvin tienen el mismo tamaño). La kilocaloria es, entonces, la cantidad de energía térmica necesaria para aumentar la

temperatura de un kilogramo de agua en un grado Celsius.

Dado que hoy sabemos que el calor es una forma de transferencia de energía, no necesitamos ninguna unidad especial

para el calor que sea diferente de otras unidades de energía. Se define en la actualidad la caloría en función de la unidad

del SI de la energía, el Julio (J):

Según la definición original de caloría, el calor específico del agua es:

51

3. Fundamentos físicos. 3.3) Segunda ley de la termodinámica: entropía.

Esta ley enuncia que la cantidad de entropía del universo tiende a incrementarse en el tiempo. La entropía es el grado de

desorden de la materia y de la energía de un sistema, y es también la cantidad de energía no aprovechable de un sistema.

En la primera ley vimos que la energía se transforma. El segundo principio establece el sentido en el que se produce dicha

transformación: todo sistema posee estados de equilibrio, y cada estado de equilibrio tiene su propia cantidad de entropía;

cuando se tiene un sistema que pasa espontáneamente de un estado de equilibrio A, a otro B, la cantidad de entropía en el estado de

equilibrio B será la máxima posible, e inevitablemente mayor a la del estado de equilibrio A.

La inexorable tendencia

de todos los sistemas

es la desintegración

hacia el estado de menor energía.

En resumen: todos los procesos naturales tienden a ocurrir en una dirección tal que la entropía del universo (sistemas + entorno)

se incrementa. Aplicadas estas nociones a la biología, se puede decir que, por el contrario, el metabolismo es un mecanismo de

postergación de la entropía en los organismos.

Para mantener la organización de la cual depende la vida, los sistemas vivos deben tener un suministro constante de energía que

les permita superar la tendencia hacia el desorden creciente. El Sol es la fuente original de esta energía: todos los organismos vivos

derivan su energía, directa o indirectamente, de la luz solar. Claro, existen organismos no fotosintéticos, pero los combustibles

químicos que emplean para extraer energía son un producto de la fotosíntesis.

52

53

3. Fundamentos físicos. 3.4) Los organismos vivos existen en un estado estacionario dinámico y nunca están en equilibrio con su entorno.

Sistema en estado estacionario: se dice para el caso en que las propiedades del sistema no cambien con el tiempo, pero

igual existe un flujo de materia y/o energía.

Equilibrio termodinámico: se dice que un sistema se encuentra en equilibrio cuando las variables que describen su estado

no varían a lo largo del tiempo (velocidad de formación de productos es exactamente igual a la velocidad en que el producto se

convierte en reactivos). Si un sistema no está aislado –como un sistema biológico, por ejemplo-, el equilibrio se define en relación

con el entorno del sistema: es decir, si un sistema está en equilibrio con el entorno, las variables del sistema y del entorno deben

tomar los mismos valores.

Ejemplo en torno a la cuestión de que los organismos son sistemas en estado estacionario dinámico: pese a que la

población de moléculas de un organismo está lejos de ser estática –porque continuamente se sintetizan y degradan moléculas,

macromoléculas y complejos supramoleculares mediante el constante flujo de masa y energía a través del sistema-, existe una

relativa constancia en la composición molecular (tipo de moléculas y concentraciones respectivas) de los organismos. Sólo

cuando la velocidad de síntesis –o ingestión- compensa la velocidad de degradación –o consumo-, se produce un estado

estacionario dinámico.

El estado estacionario dinámico de los sistemas biológicos es la causa de su homeostasis:

Con respecto al equilibrio termodinámico: los organismos nunca están en equilibrio con su entorno. La composición y el

valor de las variables termodinámicas (como la temperatura) de un organismo vivo, difieren de la composición y del valor de las

variables termodinámicas del entorno: iones y moléculas, por ejemplo, difieren en cuanto a tipo y concentración de los presentes en

su entorno. Sólo mediante un gasto continuo de energía pueden los organismos establecer y mantener sus constituyentes a

concentraciones diferentes de las del entorno. Y sólo cuando el organismo muere, inicia su degradación entrópica hacia el equilibrio

con su entorno.

54

Mantenerse en este estado estacionario dinámico (mantener la homeostasis) y fuera del equilibrio con el entorno requiere

aporte constante de energía. Cuando la célula ya no es capaz de generar energía, muere, abandona el estado estacionario, e

inicia su degradación hacia el equilibrio con su entorno.

Entonces, tanto la composición química como el valor de las variables termodinámicas de un sistema biológico

se mantienen relativamente constantes a) pese al flujo de materia y energía, y

b) pese a que las propiedades del entorno sean diferentes y, además, cambien constantemente.

55

3. Fundamentos físicos. 3.5) Los organismos obtienen su energía del flujo de electrones.

Cuando la energía de la luz descompone moléculas de agua durante la fotosíntesis, se liberan electrones que reducen

moléculas de CO2 para dar como producto una molécula de azúcar (glucosa/almidón/sacarosa) y seis de oxígeno:

Tanto los organismos fotosintéticos como los no fotosintéticos obtienen energía de la oxidación de los productos de la

fotosíntesis: al oxidar esas moléculas, transportan sus electrones hasta el O2 para formar agua y dióxido de carbono, y mediante

este flujo de electrones provocar una reacción que produce moléculas de ATP (la unidad energética de la célula).

De este modo, los autótrofos y los heterótrofos participan del ciclo global del O2 y del CO2, gobernado en última instancia por

la luz solar: esto los convierte en dos grandes grupos interdependientes.

Prácticamente todas las transducciones energéticas metabólicas de las células pueden entenderse como un flujo de

electrones desde una molécula a otra, “cuesta abajo” desde potenciales electroquímicos superiores a potenciales electroquímicos

inferiores (como en un circuito eléctrico alimentado por una batería eléctrica).

A estas reacciones que implican un flujo de electrones se les llama reacciones de reducción-oxidación (redox): un

reactivo se oxida (pierde electrones) y otro se reduce (gana electrones).

Oxidante: sustancia que oxida a otra, por lo tanto se reduce y contiene un elemento cuyo número de

oxidación disminuye.

Reductor: sustancia que reduce a otra, por lo tanto se oxida y contiene un elemento cuyo número de

oxidación aumenta.

Seguro que todo esto te recuerda a las reacciones ácido-base. El paralelismo entre los pares conjugados ácido-base (según la

teoría de Brönsted-Lowry) y los pares redox se ve claramente en el cuadro siguiente:

56

En base a lo leído hasta este momento, podemos enunciar otros tres principios de la lógica molecular de la vida:

A continuación se desarrollan con mayor profundidad algunos de los fundamentos termodinámicos de la bioenergética.

Termodinámica y vida: https://www.youtube.com/watch?v=HZGJ_ovMyDY

57

3. Fundamentos físicos. 3.6) La energía es necesaria para generar orden (evitar la tendencia entrópica): espontaneidad de una reacción química y acoplamiento energético.

Los sistemas biológicos deben tener un suministro constante de energía

que les permita superar la tendencia hacia el desorden creciente: el metabolismo es un mecanismo de postergación de la entropía.

El DNA, el RNA y las proteínas son macromoléculas informativas: la secuencia precisa de subunidades monoméricas contiene

información de la misma manera que las letras de esta frase. Son moléculas con un elevado grado de orden interno/complejidad

biológica. Este elevado grado de orden interno/complejidad biológica tiene un costo energético: debe invertirse energía en

a) la formación de enlaces covalentes entre los monómeros

b) el ordenamiento de los monómeros en su secuencia correcta

Ni la formación de los enlaces covalentes ni el ordenamiento en secuencia de todos estos monómeros ocurren espontáneamente:

eso iría en contra de la segunda ley de la termodinámica, ya que una porción del universo estaría disminuyendo su entropía de

manera espontánea.

Para la formación de los enlaces y el ordenamiento de los monómeros, se requiere un trabajo celular que tiene un costo

energético. A su vez, a mayor cantidad de monómeros por ordenar, se necesitan más energía y más trabajo, y el producto final

poseerá mayor orden interno/complejidad.

Pero, ¿qué determina que una reacción sea espontánea o no espontánea, requiriendo este último caso un trabajo celular con costo

energético?

58

ESPONTANEIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA: ENERGÍA LIBRE DE GIBBS.

En una reacción química, se ve favorecido el sentido de la reacción en el que hay:

a) Una disminución de la entalpía (H). Es decir, se ve favorecido el sentido exotérmico: liberación de energía

calorífica relacionada con el número y el tipo de enlaces químicos.

b) Un aumento de la entropía (S). Es decir, se ve favorecido el sentido en el que aumenta el desorden interno.

De ambos factores, ΔH y ΔS, dependerá que una reacción química sea espontánea o no espontánea. Ambos factores pueden ir en

el mismo sentido o estar contrapuestos, teniendo tres posibles situaciones distintas:

1) Tanto ΔH como ΔS favorables (el primero negativo, el segundo positivo): la reacción será espontánea a cualquier

temperatura.

2) Tanto ΔH como ΔS desfavorables (el primero positivo, el segundo negativo): la reacción será no espontánea a

cualquier temperatura.

3) Una de las dos variables favorable, la otra desfavorable: el resultado final depende de la magnitud de ambos

(es decir, de cuál de estas dos fuerzas impulsoras contrapuestas tiene mayor peso en el resultado final), así como de la

temperatura.

Existe una relación matemática entre la entalpía y la entropía, dependiente de la temperatura, que nos sirve para predecir la

espontaneidad o no espontaneidad de una reacción química: la Energía Libre de Gibbs (energía libre, entalpía libre, o G).

La relación matemática está dada por la expresión siguiente:

G = H – TS

El sentido de la espontaneidad en una reacción química, puede determinarse considerando las variaciones de estos factores entre

reactivos y productos, siempre y cuando la reacción sea a temperatura constante (se calcula en grados Kelvin):

ΔG (variación de la Energía Libre) = ΔH – TΔS

Donde el factor de entalpía, ΔH, es la energía total del sistema, y el factor TΔS es la energía no aprovechable de dicha energía

total, es decir, energía que el sistema no puede utilizar para realizar un trabajo. Por esto, la Energía Libre de Gibbs es la

cantidad de energía aprovechable, transformable en trabajo. Es el factor determinante de la espontaneidad de una reacción química,

ya que representa la energía efectivamente disponible en procesos realizados a presión y temperatura constante.

Si la suma del contenido de Energía Libre de los productos de la reacción química es menor que la suma del contenido

de los reactivos, la reacción libera Energía Libre de Gibbs: ocurre espontáneamente. Es decir, un proceso tiende a

ocurrir espontáneamente sólo si ∆G es negativa.

Reacción exergónica libera energía G reacción espontánea {incremento de la entropía}.

59

Por el contrario, una reacción química cuyo producto posee mayor contenido de Energía Libre que los reactivos, posee

un ∆G positivo: la reacción debe captar Energía Libre, porque la energía no puede crearse de la nada. Estas reacciones

no ocurren espontáneamente. Son reacciones desfavorables termodinámicamente.

Reacción endergónica capta energía G Reacción no espontánea {disminución de la entropía}.

Las moléculas más ordenadas y complejas, las menos entrópicas, poseen un elevado contenido de Energía Libre, lo que además

las hace más inestables. Este es el caso de los polímeros: moléculas con un elevado grado de orden y complejidad, poseen un

contenido de Energía Libre mayor que el de sus reactivos. Por eso no se forman espontáneamente.

ACOPLAMIENTO ENERGÉTICO.

Una reacción acoplada es un conjunto de reacciones exergónicas que, a través de un intermediario compartido, ‘empujan’ a

una reacción endergónica –la que por sí misma, espontáneamente, no podría ocurrir-.

Esto debe ocurrir de modo que el proceso sea globalmente exergónico: la suma de todas estas variaciones de energía libre (de

todos los ΔG), debe ser negativa. La entropía siempre triunfa.

Es decir que, para llevar a cabo reacciones termodinámicamente desfavorables –reacciones endergónicas que requieren ir en

contra de la entropía-, la célula deberá provocar otras reacciones exergónicas: reacciones acopladas.

La reacción exergónica que generalmente le proporciona energía libre de Gibbs a una reacción endergónica, es la ruptura de

enlaces fosfoanhídrido entre grupos fosforilo, tales como los que se encuentran en el ATP (adenosina trifosfato), el GTP

(guanosina trifosfato), el CTP (citidina trifosfato) y el UTP (uridina trifosfato) hidrólisis del ATP (GTP, CTP o UTP).

60

La siguiente figura (un diagrama de coordenada de reacción) ilustra el acoplamiento energético de dos reacciones

biológicas: la hidrólisis del ATP (altamente exergónica) y la conversión de glucosa en glucosa 6-fosfato (endergónica), el primer

paso en la ruta de oxidación de la glucosa.

Las dos reacciones que se muestran, comparten un intermediario común: el ion fosfato (fosfato inorgánico), que se consume en la

reacción 1 y se produce en la reacción 2. Las reacciones pueden, por lo tanto, acoplarse omitiendo el intermediario común de los

dos lados de la ecuación.

Vemos, entonces, que el acoplamiento energético conecta a las reacciones biológicas, endergónicas y exergónicas, a través de un

intermediario compartido.

Ideas clave:

1) Reacciones endergónicas facilitadas por el acoplamiento energético reacciones exergónicas que proporcionan

la energía necesaria.

2) Reacción endergónica genera productos de menor entropía Generación y mantenimiento de orden Menor entropía

equivale a mayor energía libre de Gibbs que la de los reactivos Mayor energía, mayor orden = mayor inestabilidad.

3) Segunda ley de la termodinámica: las reacciones químicas espontáneas (exergónicas) hacen que la entropía del universo

aumente.

4) Los sistemas biológicos siempre dependen de nuevas reacciones endergónicas para evitar ser presa de la entropía:

sin reacciones endergónicas, no es posible la vida.

La reacción 1 da lugar a un producto con una energía superior a la de

los dos reactivos. En la reacción 2, la ruptura exergónica del ATP –o

hidrólisis del ATP- tiene una variación de energía libre grande y

negativa. Puesto que la reacción 3 representa la suma de las otras dos, y

es exergónica, se considera que la reacción global es espontánea.

61

3. Fundamentos físicos. 3.7) Las enzimas catalizan la síntesis –frente a la inestabilidad termodinámica- y la degradación –frente estabilidad cinética-.

Hasta ahora hemos tratado la estabilidad e inestabilidad termodinámica de las macromoléculas biológicas:

Las moléculas con mayor estabilidad termodinámica son las de mayor cantidad de entropía,

es decir, las que poseen menor contenido de Energía Libre de Gibbs; menor orden interno.

La estabilidad termodinámica está relacionada con el contenido de Energía Libre de Gibbs, el grado de orden interno, y la

tendencia de todas las cosas a caer en un estado más entrópico: si una molécula es termodinámicamente inestable, se descompone a

una forma más estable termodinámicamente –más entrópica-.

Todas las macromoléculas biológicas

son más inestables termodinámicamente que sus subunidades monoméricas.

La estabilidad cinética, por otra parte, está relacionada con la velocidad a la que una sustancia se transforma en otra: la

velocidad a la que estas macromoléculas se degradan a formas más estables termodinámicamente –más entrópicas-.

Pese a que las macromoléculas biológicas son termodinámicamente inestables, se las considera cinéticamente estables: su

degradación no catalizada ocurre tan lentamente en la escala de tiempo aplicable a los organismos –en un margen de años y no de

segundos-, que se puede decir que son moléculas estables.

¿Cómo hacen los organismos para sintetizar macromoléculas de elevada inestabilidad termodinámica (para subsistir en base a

reacciones endergónicas)? Es decir, ¿cómo hacen para acoplar energéticamente a las reacciones biológicas?

¿Y cómo hacen los organismos para degradar macromoléculas a velocidades mucho mayores a las determinadas por su

estabilidad cinética?

¿Cómo es que el metabolismo funciona aparentemente en contra de la estabilidad termodinámica y de la estabilidad cinética?

Todas las reacciones químicas celulares tienen lugar a una velocidad significativa gracias a la presencia de

biocatalizadores: proteínas denominadas enzimas. Los biocatalizadores provocan un gran incremento en la velocidad de las

reacciones químicas.

En cualquier reacción –sea de síntesis o de degradación-, debe superarse una barrera energética denominada barrera de

activación para que dicha reacción ocurra. Esta barrera de activación es un estado de transición entre reactivos y productos,

en el que existe una distorsión de los enlaces existentes. El estado de transición posee mayor Energía Libre que los reactivos y los

productos. El punto más alto en el diagrama de coordenadas de reacción es la barrera de activación/estado de transición.

La diferencia de energía entre el estado de transición y el estado fundamental de un reactivo se denomina energía de

activación.

62

La energía de activación necesaria para sobrepasar la barrera de activación podría obtenerse calentando la mezcla de reacción,

incrementando así la energía cinética de las moléculas, la frecuencia a la que colisionan y la probabilidad con que reaccionarán. No

obstante, esta posibilidad no puede contemplarse en las células vivas, que generalmente mantienen constante la temperatura: la

mayoría de los componentes celulares (proteínas, membranas) se inactivan a temperaturas de tan sólo unos pocos grados por

encima de la temperatura interna normal del organismo.

En lugar de ello, las enzimas aceleran las reacciones:

a) Aprovechando los efectos de la fijación: los reactivos se unen a la superficie de la enzima, cercanos entre sí y con

una orientación estereoespecífica que favorezca la reacción entre ellos. Así, las enzimas proporcionan un ‘entorno

confortable’ y se incrementa en varios órdenes de magnitud (potencias de diez) la probabilidad de colisiones productivas

entre los reactivos –en relación al proceso no catalizado-.

b) Reduciendo la energía de activación: en el proceso de unión entre enzima y reactivos, estos últimos sufren

cambios en la forma que los distorsionan hacia el estado de transición, y la unión entre la enzima y el estado de

transición es exergónica –libera energía- reduciendo todo esto la energía de activación de la reacción.

La relación entre la energía de activación y la velocidad de reacción es exponencial: una pequeña disminución en la Ea da

como resultado un gran incremento en la velocidad de reacción. Las reacciones catalizadas por enzimas tienen lugar, generalmente,

a velocidades entre 10^10 y 10^14 veces más rápidas que las no catalizadas.

Los catalizadores metabólicos son proteínas, salvo contadas excepciones: en pocos casos, las moléculas de RNA tienen papeles

catalíticos. Por lo general, cada proteína enzimática cataliza una reacción específica, y cada reacción celular está catalizada por una

enzima diferente. Por ende, en cada célula son necesarias miles de enzimas diferentes. Además, las enzimas no se consumen en el

proceso: una enzima puede actuar de modo repetido en la conversión de moléculas de A en B.

La multiplicidad de enzimas, su especificidad (capacidad para discriminar entre diferentes reactivos, denominados sustratos)

y su susceptibilidad a la regulación, confieren a las células la capacidad de disminuir selectivamente las barreras de activación. Esto

es crucial para la regulación efectiva de los procesos celulares: las enzimas determinan de qué modo se canalizan la materia y la

energía en las actividades celulares.

63

64

RUTAS METABÓLICAS.

Las miles de reacciones químicas catalizadas por enzimas en el interior de las células se encuentran organizadas en

secuencias: reacciones consecutivas denominadas rutas, en las que el producto de una reacción pasa a ser el reactivo de la

siguiente.

Rutas catabólicas (degradativas): degradan nutrientes orgánicos transformándolos en productos

finales simples, con el fin de extraer energía química y convertirla en una forma útil para la célula. Estas formas útiles son el ATP, el GTP, el CTP, el UTP y los transportadores de electrones reducidos NADH (nicotinamida adenina dinucleótido) y NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato). El NADH y NADPH son cofactores transportadores de electrones. Captan electrones en reacciones oxidativas y pueden donarlos en una gran variedad de reacciones biosintéticas de reducción: en procesos que generan ATP y en otros pasos reductores de vías biosintéticas.

Rutas anabólicas (biosintéticas): rutas que parten de pequeñas moléculas precursoras, a las que aportan energía, convirtiéndolas en moléculas progresivamente mayores y más complejas (proteínas, ácidos nucleicos, etcétera).

El metabolismo celular es esta compleja red de reacciones catalizadas por enzimas. El ATP, el GTP, el CTP y el UTP

(ribonucleósidos trifosfatos) son el principal nexo de unión entre los componentes anabólicos y catabólicos de esta red.

65

3. Fundamentos físicos. 3.8) Control global del metabolismo.

El metabolismo está regulado para conseguir equilibrio y economía.

Las células no sólo sintetizan miles de moléculas diferentes –de glúcidos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos-, también son

capaces de hacerlo en las proporciones precisas que requiere cada situación: esto se consigue mediante la regulación de las

enzimas clave de cada ruta metabólica.

Cuando se regulan las enzimas clave de una ruta metabólica, cada molécula precursora se sintetiza en la cantidad adecuada a

las necesidades reales de la célula. Esta regulación puede efectuarse regulando la actividad enzimática o regulando la

síntesis de enzimas.

Ejemplo: la ruta de E. coli que conduce a la síntesis del aminoácido isoleucina a partir del precursor treonina. Esta ruta está

constituida por cinco reacciones consecutivas, catalizadas por cinco enzimas diferentes (por ende, incluye cinco precursores). La

isoleucina –producto final de la ruta- inhibe la actividad de la primera enzima de la ruta, cuyo sustrato es la treonina. Si una

célula comienza a producir más isoleucina de la necesaria, la isoleucina se acumula y acaba por inhibir la actividad catalítica de la

primera enzima de la ruta, frenando inmediatamente la producción de isoleucina: inhibición por retroalimentación:

retroalimentación negativa.

El concepto de ruta discreta constituye una simplificación: en la célula, miles de intermediarios metabólicos forman parte

de más de una ruta. El metabolismo se representa mejor como una red de rutas interconectadas e interdependientes. En

esta ruta, la variación de la concentración de cualquier metabolito da inicio a un efecto en cadena que influye en el flujo de

materiales a través de otras rutas. Por ende, la inhibición de la actividad enzimática de una ruta metabólica puede afectar

integralmente a otras rutas metabólicas diferentes.

Por último, las células también regulan la síntesis de sus propios catalizadores: regulación de la síntesis de enzimas.

Así, una célula puede detener la síntesis de una enzima necesaria para producir un compuesto dado, en el caso de que dicho

compuesto se halle en el medio. Estas propiedades de autoajuste y autorregulación permiten a las células mantenerse en un estado

estacionario dinámico a pesar de las fluctuaciones ambientales.

La expresión de los genes y la regulación de la síntesis de las enzimas son otros niveles de control metabólico. Todos ellos

deben ser tenidos en cuenta a la hora de describir el control global del metabolismo.

66

67

4. Fundamentos genéticos. 4.1) La continuidad genética reside en las moléculas de DNA.

El DNA es un polímero orgánico largo y delgado, una secuencia lineal de nucleótidos –más exactamente, de

desoxirribonucleótidos- unidos covalentemente, que incluye mensajes genéticos codificados: las instrucciones para formar

todos los demás componentes celulares. Además, el DNA actúa de molde para la producción de moléculas idénticas de DNA que

serán distribuidas a la progenie.

La perpetuación de una especie biológica a través de la progenie exige que su información genética se mantenga estable, se

exprese de forma precisa en forma de productos génicos, y se reproduzca con un mínimo de errores: la corrección y efectividad en

el almacenaje, la expresión y la reproducción del mensaje genético define a las especies individuales y asegura su

continuidad.

Cada polímero lineal de DNA, denominado hebra o cadena, está formado por una secuencia precisa de cuatro tipos de

desoxirribonucleótidos distintos: desoxiadenilato (A, formado por la base nitrogenada adenina), desoxiguanilato (G, formado

por la base nitrogenada guanina), desoxicitidilato (C, formado por la base nitrogenada citosina) y desoxitimidilato (T,

formada por la base nitrogenada timina), unidos covalentemente entre sí (enlaces covalentes especiales denominados enlaces

fosfodiéster). Es en esta secuencia lineal (monodimensional) y precisa de subunidades desoxirribonucleotídicas que se encuentra

codificada la información genética.

A su vez, cada uno de los desoxirribonucleótidos de una cadena se asocia muy específicamente con otro desoxirribonucleótido

complementario de una segunda cadena: A+T; G+C. Estas asociaciones son no covalentes, consistiendo en puentes de hidrógeno.

Como consecuencia de este aparejamiento entre todos los pares de desoxirribonucleótidos complementarios, la secuencia de

desoxirribonucleótidos de una cadena es complementaria con la secuencia de la cadena opuesta. Las dos cadenas poliméricas

complementarias, unidas por muchos puentes de hidrógeno, acaban enrollándose una sobre la otra y forman una molécula de

DNA: la doble hélice de DNA.

Antes de producirse la división celular, en la replicación del DNA: las dos cadenas de DNA se separan y entonces cada una

actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto da lugar a dos moléculas de doble hélice idénticas entre

sí e idénticas a la molécula de doble hélice original –cada una de ellas conformada por una cadena original y una cadena nueva-;

dos moléculas de doble hélice producto de la replicación, una para cada célula hija.

Si una cadena resultara dañada, la continuidad de la información queda asegurada por la información presente en la cadena

complementaria, que actuará de molde para la reparación de la lesión.

Vemos, entonces, que la replicación y la reparación del DNA siempre se llevan a cabo sobre una de las cadenas lineales,

que actúa a modo de molde.

68

69

4. Fundamentos genéticos. 4.2) La secuencia lineal de DNA codifica proteínas con estructuras tridimensionales.

Si bien la información genética está codificada en la secuencia lineal (monodimensional) y precisa de subunidades

desoxirribonucleotídicas, la expresión de esta información da como resultado una célula tridimensional. La transición entre una y

tres dimensiones ocurre en dos fases:

1) La secuencia lineal de desoxirribonucleótidos de una cadena de DNA codifica, a través del RNA, la producción de una

secuencia lineal correspondiente de aminoácidos: una proteína.

2) La secuencia lineal de aminoácidos se pliega adoptando una estructura tridimensional particular, determinada por

la misma secuencia, y estabilizada principalmente por interacciones no covalentes. El proceso de plegamiento recibe

asistencia de proteínas chaperonas: conjunto de proteínas presentes en todas las células que ayudan al plegamiento

de otras proteínas recién formadas. Las proteínas chaperonas son asistentes del proceso de plegamiento: lo catalizan

impidiendo vías incorrectas de plegamiento.

La adopción de una estructura tridimensional precisa, o conformación nativa, es crucial para la función de la proteína.

Además, una vez que la proteína adopta su conformación nativa, puede asociarse de modo no covalente con otras macromoléculas:

con ácidos nucleicos, lípidos, otras proteínas. Estas asociaciones entre macromoléculas resultan en complejos supramoleculares

–tales como cromosomas, ribosomas, membranas-. Muchas macromoléculas se asocian –autoensamblan- de esta manera porque

poseen sitios de unión específicos y de alta afinidad.

Para alcanzar su estado nativo, las proteínas necesitan además un entorno adecuado (de pH, fuerza iónica, concentración de

iones metálicos, etcétera) que favorezca el plegamiento y el autoensamblaje: el proceso depende de las condiciones ambientales.

Por todo esto puede decirse que la secuencia lineal de DNA (unidimensional) no es capaz de dictar la formación de una célula

por sí sola.

70

71

5. Fundamentos evolutivos. 5.1) Los cambios en las instrucciones hereditarias hacen posible la evolución.

El alto grado de similitud entre las secuencias génicas y las vías metabólicas de organismos de todos los phyla es un

robusto argumento a favor de la hipótesis de que todos los organismos modernos descienden de un progenitor evolutivo común a

través de una larga serie de pequeños cambios: mutaciones que confirieron, en cada caso, ventajas selectivas en nichos ecológicos

concretos.

A pesar de estas grandes similitudes en las instrucciones hereditarias y de la fidelidad casi perfecta de la replicación y la

reparación genéticas, ciertos errores que producen variaciones en la secuencia de desoxirribonucleótidos del DNA –errores

llamados mutaciones- pueden cambiar las instrucciones hereditarias para alguno de los componentes celulares.

Para que estas mutaciones sean transmitidas a la progenie: a) deben ocurrir en las células reproductoras, y b) dicho

organismo mutante debe ser capaz de dejar progenie. En el caso que ocurra, las mutaciones suelen ser de todas maneras dañinas e

incluso letales para el nuevo organismo (por ej., síntesis de enzimas defectuosas incapaces de catalizar una reacción metabólica

esencial).

Sin embargo, ocasionalmente, una mutación puede dar lugar a un organismo mejor preparado para sobrevivir a su entorno.

De esta manera, el organismo mutante y su progenie podrían verse favorecidos por sobre el organismo no mutante (de tipo

silvestre: wild type), y a veces incluso prosperar mientras que el wild type perece: supervivencia del mejor adaptado en

condiciones de presión selectiva.

Sea como sea, esto último puede no ocurrir en la transición de una generación a la siguiente, sino más bien en lapsos

prolongados: una replicación defectuosa introduce una segunda copia de un gen entero en el cromosoma, las mutaciones sobre la

copia superflua no serían nocivas, y poco a poco se iría produciendo un nuevo gen con una nueva función en base a esta segunda

copia, al mismo que se retienen la copia original y su consecuente función original.

Esta cadena de sucesos –duplicación génica y mutaciones sobre la copia superflua- puede, por ejemplo, generar actividades

enzimáticas nuevas: una versión de la enzima original, alterada de modo que puede unirse a un nuevo sustrato.

De esta manera, miles de millones de años de errores de replicación y reparación, variación genética y selección adaptativa

han conducido al refinamiento de los sistemas celulares, volviéndolos más capaces para obtener el máximo provecho de las

propiedades físicas y químicas de los materiales crudos del entorno.

72

73

5. Fundamentos evolutivos. 5.2) La evolución química de las biomoléculas.

Hipótesis del origen abiótico de las biomoléculas orgánicas: Los primeros compuestos orgánicos, entre los que se

incluyen algunas biomoléculas básicas como aminoácidos y glúcidos, se habrían creado como consecuencia de la acción de

poderosas fuerzas atmosféricas –radiación ultravioleta, relámpagos, erupciones volcánicas- sobre

a) los gases existentes en la atmósfera prebiótica (NH3, N2, CH4, CO, CO2, H2O, H2…), y sobre

b) los compuestos inorgánicos disueltos en respiraderos hidrotérmicos (chimeneas térmicas) de los fondos oceánicos.

Experimentos refinados han demostrado que muchos de los componentes químicos de las células vivas, entre ellos

polipéptidos y moléculas parecidas al RNA, se pueden formar en estas condiciones.

Con respecto a los polímeros de RNA, pueden actuar tanto como depositarios de la información genética que especifica

la estructura de las enzimas, como a su vez ser catalizadores en ciertas reacciones biológicas –entre ellas, pueden catalizar su

propio proceso de formación-. Gracias a esta doble capacidad, es posible que el RNA jugara un papel crucial en la evolución

prebiótica: los primeros genes y catalizadores podrían haber sido moléculas de RNA o precursores relacionados, antecediendo al

DNA y a las proteínas.

De acuerdo con la hipótesis del mundo del RNA, una de las primeras etapas de la evolución biológica habría sido la

formación al azar, en la sopa primordial, de moléculas cortas de RNA con segmentos al azar. Llegado el momento, una molécula de

RNA habría estado capacitada para catalizar la formación de otras moléculas de RNA con la misma secuencia: aparición de una

molécula de RNA autorreplicante y autoperpetuante. Es presumible que la fidelidad de la reproducción fuese mucho menos que

perfecta, de modo que el proceso generaría variantes de la molécula de RNA, algunas más eficientes en su autorreplicación. En la

competencia por la utilización de los nucleótidos, las secuencias más eficientes saldrían favorecidas, y las menos eficientes

desaparecerían del medio.

A continuación, algunas de estas moléculas de RNA autorreplicante se habrían vuelto capaces de catalizar la condensación de

aminoácidos en forma de péptidos específicos. Seguido a esto, un aumento de la importancia de los péptidos en la replicación del

RNA: acaban volviéndose capaces de potenciar las capacidades autorreplicativas del RNA, y el conjunto RNA-péptido podría haber

sufrido variaciones secuenciales que generarían moléculas aún más eficientes (coevolución de RNA y proteínas).

Ya desarrollado un sistema primitivo de traducción con RNA genómico y catalizadores de RNA-proteína, el RNA genómico

habría empezado a copiarse en forma de DNA. Las moléculas de DNA con secuencias complementarias a las del RNA autorreplicante

acaban por reemplazar a estas últimas en la función de conservar la información genética –el DNA es más estable, mejor depositario

de la información hereditaria-, y las moléculas de RNA siguen su curso evolutivo para especializarse aún más en la síntesis de

proteínas. Las proteínas, por su parte, acabaron especializándose como catalizadores versátiles.

Así, la división de funciones entre el DNA (almacenamiento de la información genética) y las proteínas (catálisis) se habría

producido en una etapa considerablemente más tardía a la de la aparición del RNA, que cumplía la función de primer gen y primer

catalizador.

74

75

5. Fundamentos evolutivos. 5.3) La fuente de energía de las primeras células eran los combustibles inorgánicos.

Las primeras células aparecieron en una atmósfera reductora (no había oxígeno, y era fuertemente donante de electrones).

Probablemente obtuvieran energía de combustibles inorgánicos tales como el sulfuro ferroso y el carbonato ferroso, ambos

muy abundantes en la tierra primitiva.

La reacción anterior proporciona la energía suficiente para promover la síntesis de ATP y compuestos similares.

Posteriormente, estos organismos unicelulares primitivos fueron adquiriendo gradualmente la capacidad de sintetizar, con esta

energía, una cantidad creciente de sus propias moléculas precursoras –para ser gradualmente menos dependientes de fuentes

externas-.

Un acontecimiento evolutivo muy significativo fue el desarrollo de pigmentos capaces de capturar la energía de la luz solar, y

usarla en la reducción o fijación del CO2 para producir compuestos orgánicos más complejos: la fotosíntesis. Es probable que el

donador de electrones original para estos procesos fotosintéticos fuera el H2S, que genera azufre elemental o sulfato como

productos secundarios. Posteriormente, otras células desarrollaron la capacidad enzimática de utilizar H2O como donador de

electrones en las reacciones fotosintéticas, lo que implicaba la liberación a la atmósfera de O2 como producto de desecho. Las

cianobacterias son descendientes modernos de estos primitivos productores fotosintéticos de oxígeno.

Las células primitivas de los primeros estadios de la evolución biológica eran anaeróbicas. Los quimiótrofos anaeróbicos

podían oxidar compuestos orgánicos a CO2 sin la necesidad de transferir electrones al O2, sino a aceptores tales como el sulfato,

dando H2S como producto. Pero a causa de la actividad de las bacterias fotosintéticas, la atmósfera fue enriquecida

progresivamente con oxígeno molecular, un poderoso oxidante y un veneno mortal para los organismos anaeróbicos. Respondiendo

a la presión evolutiva de lo que Lynn Margulis y Dorion Sagan han llamado el holocausto del oxígeno, algunos linajes de

microorganismos dieron lugar a los aerobios, que obtenían su energía mediante el transporte de electrones desde moléculas de

combustible hacia el O2. Esta transferencia de electrones se caracteriza por desprender mucha energía, razón por la cual los

aeróbicos se impusieron sobre los anaeróbicos.

76

77

5. Fundamentos evolutivos. 5.4) La anatomía molecular revela relaciones evolutivas.

Con el creciente y enormemente rico repertorio de datos sobre la anatomía molecular de las células es posible analizar las

relaciones evolutivas y refinar la teoría de la evolución.

Ej.: En base a las secuencias de genomas es posible llevar a cabo comparaciones detalladas y cuantitativas entre especies.

Hasta ahora, la filogenia molecular derivada de las secuencias génicas es consistente con la filogenia clásica basada en estructuras

macroscópicas, y en muchos casos más precisa.

La unidad de la vida a nivel molecular es evidente a pesar de la continua divergencia de los organismos a nivel anatómico: las

estructuras y los mecanismos moleculares son marcadamente similares. Es a nivel de las secuencias donde estas similitudes se

aprecian mejor:

Cuando dos genes comparten secuencias muy similares, se dice que sus secuencias son homólogas y que las proteínas que

codifican son homólogas.

Si una misma especie contiene dos genes homólogos, estos dos genes y sus productos proteicos se denominan parálogos. Se

piensa que los genes parálogos han aparecido por duplicación génica seguida de cambios graduales en las secuencias de cada una

de las dos copias. Generalmente, las proteínas parálogas son similares no únicamente en secuencia sino también en estructura

tridimensional, aunque es habitual que hayan adquirido funciones diferentes a lo largo de su evolución.

Dos genes –o proteínas- homólogos de especies diferentes se denominan ortólogos. Los ortólogos suelen tener la misma

función en ambos organismos. Cuando se encuentra que una secuencia génica recién secuenciada es altamente ortóloga con un gen

de otra especie, se supone que el gen codifica una proteína con la misma función en las dos especies. De este modo, resulta posible

deducir la función de los productos génicos a partir de la secuencia genómica, sin necesidad de caracterización bioquímica del

producto génico.

Un genoma anotado contiene, además de la secuencia del DNA, una descripción de la función probable de cada producto

génico, deducida a partir de comparaciones con otras secuencias genómicas con funciones proteicas establecidas. Así, pueden

identificarse las rutas –conjuntos de enzimas- codificadas en un genoma, y esto permite deducir directamente las capacidades

metabólicas de un organismo.

Las diferencias secuenciales (variabilidad secuencial) entre genes homólogos pueden utilizarse para medir el grado

de divergencia evolutiva que presentan dos especies, es decir, el tiempo transcurrido desde que su precursor evolutivo común

dio lugar a dos líneas con diferente camino evolutivo. A mayor cantidad de diferencias secuenciales, mayor tiempo transcurrido

desde la divergencia. Estas distancias evolutivas entre especies pueden representarse en un árbol evolutivo.

A lo largo de la evolución van apareciendo nuevas estructuras, procesos o mecanismos reguladores que reflejan los cambios

en los genomas. El genoma de un eucariota simple tal como la levadura debería poseer genes relacionados con la formación de la

membrana nuclear, no presentes en los procariotas. A su vez, este gen es ortólogo en la totalidad de los eucariotas, pudiendo

encontrare algún grado de divergencia evolutiva.

78

79

5. Fundamentos evolutivos. 5.5) Genómica funcional: correspondencia entre genes y procesos celulares específicos.

Secuenciado el genoma y asignadas las funciones a cada uno de los genes, estos genes pueden agruparse de acuerdo con los

procesos en los que intervienen (síntesis del DNA, síntesis proteica, síntesis de ATP) y deducir qué fracción del genoma está

dedicada a cada una de las actividades celulares.

Ej.: En los genomas de E. coli, A. thaliana y H. sapiens, el mayor conjunto de genes es el de función desconocida: estos

conjuntos representan más del 40% en cada una de esas tres especies. Los transportadores de iones y pequeñas moléculas a través

de las membranas plasmáticas también suponen una importante proporción de genes: el 10% de los ~4.400 genes de E. coli; el

~8% de los ~32.000 genes de A. thaliana; el ~4% de los ~29.000 genes de H. sapiens. Los genes que codifican el RNA y las

proteínas necesarias para la síntesis proteica representan entre el 3% y el 4% del genoma de E. coli, pero en las células más

complejas de A. thaliana son necesarios más genes para dirigir a las proteínas a su localización celular final que para la propia

síntesis proteica (aproximadamente el 6% y el 2% del genoma, respectivamente).

En general, cuanto más complejo es el organismo, mayor es la proporción de su genoma implicada en la regulación de

procesos celulares, y menor la proporción dedicada a los procesos básicos –como la generación de ATP y la síntesis de proteínas-.

80

81

6. Glosario I. Entalpía (H): contenido calórico de un sistema. Variación de entalpía (deltaH): para una reacción es aproximadamente igual a la diferencia entre la energía utilizada para romper unos enlaces y la energía ganada en la formación de otros nuevos. Energía de enlace: energía requerida para romper un enlace. Reacción endotérmica: reacción química que absorbe calor (deltaH positiva). Reacción exotérmica: reacción química que desprende calor (deltaH negativa). Entropía (S): cantidad de desorden de un sistema. Equilibrio: estado de un sistema en el que no se produce más variación neta; los reactivos se convierten en productos a la misma velocidad que los productos en reactivos. La energía libre se encuentra en un mínimo. Energía libre (G): componente de la energía total de un sistema que puede realizar trabajo a temperatura y presión constantes. Variación de energía libre (deltaG): cantidad de energía libre desprendida (deltaG negativa) o absorbida (deltaG positiva) en una reacción a temperatura y presión constantes. Variación de energía libre estándar (deltaGestándar): variación de energía libre de una reacción que tiene lugar en condiciones estándar: temperatura 298 K; presión 1 atm (o 101,3 kPa); todos los solutos a concentración 1M. DeltaG’estandar denota la variación de energía libre estándar a pH 7,0 en agua 55,5M. Reacción endergónica: reacción química que consume energía libre (para la cual deltaG es positiva). Reacción exergónica: reacción química que transcurre con la liberación de energía libre (para la cual deltaG es negativa). Energía de activación: también llamada ‘energía libre de activación’. Cantidad de energía (en julios) necesaria para convertir todas las moléculas en 1 mol de una sustancia reaccionante desde el basal al estado de transición. Catálisis: la aceleración de la tasa de una reacción química mediante una sustancia, llamada catalizador. Enzima (catalizador): biomolécula –proteína o RNA- que cataliza una reacción química específica, y no es modificado por la reacción –permanece inalterado-, lo que lo diferencia de un reactivo-. Un error común es creer que la reacción no se daría sin la presencia del catalizador; un catalizador solamente acelera una reacción termodinámicamente favorable. Un catalizador no puede hacer que ocurra una reacción termodinámicamente desfavorable: no afecta al equilibrio de la reacción catalizada, sólo aumenta la velocidad de reacción proporcionando una ruta de reacción con una energía de activación inferior. Es lo contrario a un inhibidor: sustancia que desactiva una catálisis. Reacciones acopladas: dos reacciones químicas que tienen un intermediario común y, por lo tanto, un medio de transferencia de energía de una a otra. Metabolismo: conjunto completo de transformaciones catalizadas por enzimas, de moléculas orgánicas en las células vivas; suma del anabolismo y catabolismo.

82

Catabolismo: fase del metabolismo intermediario relativa a la degradación de moléculas de nutrientes que producen energía. Anabolismo: fase del metabolismo intermediario que se ocupa de la biosíntesis dependiente de energía de los componentes celulares a partir de precursores más pequeños. Metabolismo basal: velocidad de consumo de oxígeno por el cuerpo de un animal en completo reposo, y mucho tiempo después de una comida. Metabolismo intermediario: en las células, las reacciones catalizadas enzimáticamente que extraen energía química a partir de moléculas nutrientes, utilizándola para sintetizar y unir componentes celulares. Metabolismo secundario: rutas que conducen a productos especializados que no se encuentran en todas las células vivas. Metabolito: intermediario químico en las reacciones del metabolismo catalizadas por enzimas. Metaboloma: conjunto completo de metabolitos de pequeño tamaño (intermediarios metabólicos, señales, metabolitos secundarios) presentes en una célula o tejidos determinados en condiciones específicas. Genoma: toda la información genética en forma codificada contenida en una célula o virus. Mutación: cambio heredable en la secuencia nucleotídica de un cromosoma. Estereoisómeros: compuestos que tienen la misma composición y el mismo orden de conexiones atómicas, pero diferentes ordenamientos moleculares. Configuración: ordenamiento espacial de una molécula orgánica, que le viene dado por la presencia de (1) dobles enlaces alrededor de los cuales no existe libertad de giro, o (2) centros quirales, alrededor de los cuales los grupos sustituyentes están dispuestos en una secuencia específica. Los isómeros configuracionales no se pueden interconvertir sin la ruptura de uno o más enlaces covalentes. Compuesto quiral: compuesto que contiene un centro asimétrico (átomo quiral o centro quiral), por lo que puede existir en dos formas especulares no superponibles (enantiómeros). Centro quiral: átomo con sustituyentes dispuestos de manera que la molécula no se puede superponer con su imagen especular. Conformación: ordenamiento espacial de grupos sustituyentes que tienen libertad para adoptar posiciones diferentes en el espacio, sin ruptura de enlaces debido a la libertad de rotación de enlace. Conformación nativa (estado nativo): conformación biológicamente activa de una macromolécula, es decir, su estructura tridimensional precisa, determinada por la secuencia de subunidades monoméricas y estabilizada por interacciones no covalentes.

83

TÉCNICAS Y HERRAMIENTAS BIOQUÍMICAS

84

85

1. Técnicas de Purificación. 1.1) Purificación de las células y de sus partes: CITOMETRÍA DE FLUJO.

La citometría (medición celular) es el análisis de las características de las células, ya sea mediante inspección al microscopio,

como midiendo de manera automatizada las propiedades de las células.

La citometría de flujo es, en cambio, una técnica biofísica específica de análisis celular. Está basada en el uso de luz láser

para el recuento y la clasificación de células. Esta clasificación de las células puede ser, por ejemplo, según sus características

morfológicas o según la presencia de biomarcadores.

¿Por qué se usa la citometría de flujo? Si bien algunos tipos celulares difieren en densidad lo suficiente como para ser

separados de acuerdo a esta propiedad física (por ejemplo, los leucocitos y los eritrocitos tienen densidades muy distintas debido a

que los eritrocitos carecen de núcleo: por eso, estos tipos celulares pueden ser separados por centrifugación en equilibrio de

densidad –otro tipo de purificación que trataré más adelante-), la mayoría de los tipos celulares no pueden ser diferenciados con

tanta facilidad. Por eso, para separarlos, pueden usarse otras técnicas biofísicas como la citometría de flujo.

La citometría de flujo identifica diferentes tipos celulares mediante la medición de la luz que dispersan y la fluorescencia

que emiten a medida que fluyen a través de un rayo láser. Así, se pueden diferenciar diferentes tipos de células en una mezcla, y

hacer un recuento de la cantidad de células en la suspensión.

Entonces: es una técnica de análisis celular biofísico

en la que se miden las características de dispersión de luz y emisión fluorescente de células

conforme pasan a través de un rayo de luz.

Para el análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse suspendidas en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las

células interactúan con éste, causando dispersión de la luz. Las células pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar

a alcanzar velocidades cercanas a 100.000 células por segundo).

Específicamente: las células suspendidas en el fluido atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un

delgado rayo de luz láser. La luz transmitida y dispersada por el pasaje de las células a través del tubo, se recoge por medio de unos

dispositivos de detección, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamaño y complejidad de células.

Basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células: parámetro

denominado Forward Scatter. Se trata de luz dispersada hacia adelante, a 0 gados.

Al medir la reflexión de la luz de manera lateral, se evalúa la granularidad o la complejidad celular (estructura interna,

complejidad citoplasmática): parámetro denominado Side Scatter. En este caso, la luz es dispersada a 90 grados del eje del haz

lumínico.

La técnica también permite el análisis multiparamétrico simultáneo de otras características físicas y químicas, evaluando

en promedio más de dos mil partículas por segundo.

La citometría de flujo es una técnica rutinaria para el diagnóstico y seguimiento de muchas enfermedades, tales como

leucemias, granulomatosis crónica, y SIDA. Sus usos han ido desde el contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario,

La citometría de flujo hace un recuento y

clasifica distintos tipos de células.

86

análisis de médula ósea, estudios de cinética celular, estudios de subpoblaciones linfocitarias, tipaje tisular, estimulación

linfocitaria, diagnóstico/pronóstico de procesos neoplásicos, monitorizar tratamiento en oncología, hasta para diagnóstico

bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos, cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

Tiene, además, muchas otras aplicaciones en investigación básica, práctica y ensayos clínicos. Por ejemplo, una variante

común de esta técnica es la separación de partículas según sus propiedades físicas, que puede emplearse para purificar poblaciones

de interés.

Analysis of a marine sample of photosyntetic picoplankton by flow cytometry

showing three different populations (Prochlorococcus, Synechococcus and picoeukaryotes).

Análisis de una muestra de agua marina conteniendo picoplancton fotosintético por medio de

citometría de flujo mostrando tres poblaciones diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus, y picoeucariotas).

Daniel Vaulot, CNRS, Station Biologique de Roscoff.

Flow Cytometry Animation: https://www.youtube.com/watch?v=2P7YsJ0Zkio

87

FACS: un instrumento basado en la citometría de flujo.

Si la suspensión celular se coloca en presencia de anticuerpos monoclonales (mAB) marcados con moléculas fluorescentes, se

puede determinar qué células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Es decir, los

anticuerpos específicos, marcados, se unen a los antígenos de células diana y (emiten fluorescencia) ayudan a dar información

respecto a las características específicas de dichas células. Además, sigue siendo posible medir la dispersión lumínica.

El uso de distintas moléculas fluorescentes –distintos colores de fluorescencia- permite analizar la presencia de varios

marcadores de manera simultánea. Esto tiene grandes aplicaciones en medicina (hematología, inmunología de tumores y

quimioterapia, genética, selección de esperma en IVF, etcétera).

Si el análisis incluye esta detección de fluorescencia, hablamos estrictamente de citofluorímetros de flujo (conocidos

como FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorter: Clasificador Celular Activado por Fluorescencia). Es decir, el FACS es un instrumento

basado en la citometría de flujo, que puede seleccionar una célula a partir de cientos de otras.

Ejemplo: si un anticuerpo específico para una cierta molécula –antígeno- de la superficie celular está unido a este

colorante fluorescente, cualquier célula que tenga ese antígeno fijará el anticuerpo y luego podrá ser separada cuando fluorezca en

el FACS. Una vez separado este tipo celular, puede cultivarse.

Ejemplo: el procedimiento FACS se utiliza para purificar diferentes tipos de glóbulos blancos, cada uno de los cuales

lleva en su superficie una o más moléculas distintivas. Se unen los anticuerpos monoclonales específicos para esa o esas proteínas.

Por ejemplo, sólo las células T del sistema inmune tienen tanto la proteína CD3 como la Thy 1,2 en su superficie. Marcar estas

proteínas de superficie nos permite aislar células T con facilidad, separarlas de otros tipos de células sanguíneas o células del bazo.

88

El FACS puede, entonces, hacer mediciones simultáneas de luz dispersada (lo que permite inferir, por ejemplo, el tamaño

celular) y de cantidad de fluorescencia emitida, por ejemplo, por un colorante unido a DNA o RNA, para determinar la cantidad de

ácido nucleico o ribonucleico que contiene la célula.

En una variación del uso de la citofluorimetría de flujo, pequeñas esferas o cuentas magnéticas son recubiertas con

anticuerpos monoclonales específicos para una proteína de superficie. Sólo las células con estas proteínas se pegarán a las esferas.

Las células podrán recuperarse de la preparación mediante adhesión a pequeños magnetos en los lados del tubo de ensayo.

Fluorescence Animation: https://www.youtube.com/watch?v=pFtO0xxJL9s

Fluorescence-activated cell sorting (FACS): https://www.youtube.com/watch?v=TDRhCWaYRsg&spfreload=1

89

Introducción a la citometría de flujo.

Historia y principios.

El primer citómetro de flujo, basado en el principio Coulter, fue descrito en 1953 por Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler

inventa el precursor de los citómetros de flujo actuales, es decir, de los usados para separar células.

El primer dispositivo de citometría de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) es desarrollado en 1968 por Wolfgang

Göhde, Universidad de Münster. Es comercializado por primera vez en los años 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec,

encargada del desarrollo y producción a través de Phywe AG en Göttingen. En aquel momento, los métodos de absorción

electromagnética tenían el respaldo de la comunidad científica por sobre los métodos fluorescentes. Poco después comienza el

desarrollo comercial de los citómetros de flujo, incluyendo el citofluorógrafo (1971) de la empresa Bio/Physics Systems Inc., el PAS

8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el

Epics de la Coulter Corporation en el ‘77/’78.

El nombre original de la citometría de flujo era citofotometría de pulso (Impulszytophotometrie). Recién en la 5ta

Conferencia sobre Citometría Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en Pensacola, Florida en 1976, se

acordó utilizar el nombre de citometría de flujo, término que ganó popularidad rápidamente.

Como puede verse, la técnica de la CMF fue desarrollada en la década de los años sesenta como un avance importante en

investigación de la biología celular.

Un CMF es un aparato capaz de medir componentes y propiedades celulares (partículas biológicas) que fluyen en

suspensión. Es necesario disponer de una suspensión de células o partículas individuales. Como vimos, las células o partículas

también pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes que se excitan con una fuente luminosa de alta energía.

La suspensión celular convenientemente procesada y teñida, se inyecta en la cámara de flujo del citómetro, que está

hidrodinámicamente enfocada para que las células pasen individualmente, una detrás de la otra, a través de un punto en el que

estas interactúan físicamente con un haz de luz monocromática, dispersando la luz en todas direcciones.

La excitación de los fluorócromos ocurre en el punto de interacción de la célula con el haz lumínico, dando como

resultado la emisión de una luz de longitud de onda superior a la incidente. Esta luz es recogida entonces a 90 grados, siendo

dirigida mediante espejos dicroicos adecuados a detectores fotomultiplicadores. Las señales eléctricas analógicas son convertidas en

señales digitales y son procesadas por un ordenador, con el fin de generar histogramas correlacionados con los parámetros

deseados y efectuar el análisis de los mismos.

Ventajas de CMF frente a otros métodos que emplean fluorócromos: elevada sensibilidad y sensibilidad de análisis,

posibilidad de realizar mediciones simultáneas sobre una sola célula, y separación celular en sorters (desarrollado posteriormente).

Desventajas y limitaciones: costes de instrumentación e incapacidad de visualizar las células que estamos analizando.

Procedimiento.

Un rayo de luz monocromático, usualmente de luz láser, es dirigido hacia un finísimo chorro de líquido

hidrodinámicamente enfocado. Se colocan una serie de detectores en el punto en el que el chorro de líquido atraviesa el rayo de

luz. Uno se coloca en línea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de Dispersión

Frontal). Otros varios, angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de

Dispersión Lateral). Además, se colocan uno o más detectores de fluorescencia.

ANEXO. Introduciéndonos un

poco más en la CMF.

90

Cada una de las partículas suspendidas –con un tamaño de entre 0,2 a 150 micrómetros- que atraviesan el rayo de luz,

lo dispersan, y las sustancias químicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partículas son excitadas hasta emitir

luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinación de luz dispersada y fluorescencia es

recogida por los detectores, y por medio de un análisis en la fluctuación de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es

posible derivar varios tipos de información acerca de la estructura física y química de cada partícula individual.

El detector frontal o FSC brinda información acerca del volumen de la partícula, mientras que los detectores laterales o

SSC brindan información acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del núcleo celular, la cantidad y tipo

de gránulos citoplasmáticos o la rugosidad de la membrana plasmática). Esto es debido a que los componentes internos de las

células dispersan la luz.

Algunos de los citómetros de flujo presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y

utilizan tan sólo la información de luz dispersada para las mediciones. Otros citómetros de flujo son capaces de generar gráficos de

los datos obtenidos de la fluorescencia de las células, luz dispersada y luz transmitida.

Esquema de disposición de elementos en un citómetro de flujo. Una fuente emisora de luz monocromática, usualmente un haz de

luz láser (A) envía un rayo que es colimado (L1) y enfocado (L2) por medio de lentes sobre la cámara de flujo laminar (C), luego de

atravesar la cámara el rayo de luz directa es detenido por una pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente

(L3) sobre un fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersión frontal (FSC). La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia

se enfocan por medio de una lente sobre un espejo dicroico (M) que refleja la mayor parte de la luz de igual longitud de onda a la

producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e incide sobre un detector. Esto constituye el sistema de detección de dispersión

lateral (SSC). La luz que no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda diferente a la emitida, lo atraviesa

e incide sobre un filtro interferencial (F2) que puede ser ajustado para una determinada longitud de onda, discriminando así entre

diferentes fluoróforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), esto constituye el detector lateral de

fluorescencia (SFL).

91

Un citómetro de flujo es, en cierta forma, similar a un microscopio; salvo que, en vez de producir imágenes de las

células, los citómetros de flujo ofrecen una cuantificación automática de altísima calidad de una serie de parámetros.

Un CMF tiene cinco componentes principales:

La celda de flujo laminar, donde el líquido circulando en régimen de flujo laminar acarrea y pone en línea a las células de modo

que pasen a través del rayo de luz de a una y en fila.

Un sistema de medición, los más comúnmente utilizados son la medición de la impedancia o conductividad (principio Coulter) y

los sistemas ópticos.

Un sistema de iluminación formado ya sea por lámparas de alta luminosidad (de mercurio, xenón) láseres de alta potencia

refrigerados por agua (de argón, de criptón, de tinturas), láseres de baja potencia refrigerados por aire (de argón λ 488 nm), láser

rojo de helio-neón (λ 633 nm), verde de helio-neón, ultravioleta de helio-cadmio; láseres de diodo de baja potencia (azul, verde,

rojo, violeta).

Un detector y un conversor de señales ADC (análogo a digital), los cuales registran la señal producida (sea FSC, SSC, SFL) y la

convierten en una señal eléctrica que puede ser procesada por un computador.

Un sistema de amplificación, lineal o logarítmico.

Un ordenador para el análisis de las señales.

El proceso de recolección de datos es conocido como adquisición. La adquisición es mediada por un software presente

en el ordenador físicamente conectado al CMF. Este software es capaz de ajustar varios parámetros de la medición, tales como

voltaje, compensación, etcétera, para cada una de las muestras analizadas. Además se encarga de asistir a la presentación inicial de

información de la muestra mientras se realiza la adquisición de los datos para asegurar que los parámetros han sido correctamente

ajustados.

Los instrumentos modernos en general poseen múltiples láseres y detectores. El récord actual para un instrumento

comercial es de cuatro láseres y 18 detectores de fluorescencia. Al aumentar el número de láseres y detectores, es posible aumentar

la cantidad de anticuerpos fluorescentes marcadores, y se hace posible identificar con mayor precisión la población de interés a

través de sus marcadores fenotípicos. Algunos instrumentos pueden, incluso, tomar fotografías digitales de cada célula, permitiendo

analizar si la señal fluorescente se produce dentro de ella o en su superficie.

92

93

Citómetros de flujo sorters.

Los conocidos como citómetros de flujo separadores o sorters también pueden purificar poblaciones con

determinadas características (por ejemplo, pueden separar los linfocitos T CD4+ de los CD8+) a medida que fluyen por uno o más

mecanismos detectores. La separación resulta en distintas fracciones finales, a la vez que los mecanismos detectores realizan un

conteo del número de células presentes en la muestra.

Es decir, la aplicación general de los sorters es

la separación de subpoblaciones definidas, por análisis citométrico.

Tiene menor potencia que otras técnicas de separación masiva (como la centrifugación) pero, de igual manera que en los

casos anteriores, realiza separaciones que las técnicas de separación masiva no consiguen.

Existen, además, diferentes tipos de citómetros de flujo sorters:

Sorters neumáticos: emplean jeringas, energía acústica, etcétera, para desviar

el flujo líquido durante algunos milisegundos y, con éste, la célula seleccionada.

Son sistemas cerrados: seguros en cuando a contaminación y evaporación.

Relativamente simples, baratos, adaptables.

En contraposición, su velocidad es muy baja.

Sorters de deflexión electrostática: el primero fue descrito por Fulwyler

(1965). Bonner (1972) fue el primero en aplicar el sorter en función de señales

fluorescentes.

El transductor para la formación de gotas es un cristal piezoeléctrico acoplado

al vibrador: la energía que se usa es muy baja y no causa daño celular. El pro-

ceso de la ruptura del flujo es función de la velocidad de oscilación y del diáme-

tro del orificio del sorter. Debe existir un dispositivo para visualizar la formación

de las gotas (cámara estroboscópica), compensación de carga de las gotas,

detector de coincidencias y abortador de sorter.

Son complejos. Necesitan de un gran soporte tecnológico e informático.

Funcionan de modo similar a impresoras de chorro de tinta.

Son los más empleados.

Sorters de alta velocidad: pueden reducir de 5 a 8 veces el tiempo necesario de sorter. Un sorter

convencional produce 20-40.000 gotas/segundo, y procesa alrededor de 2-3.000 partículas/segundo. Los

sorters de alta velocidad producen 200.000 gotas/segundo, y se pueden procesar 16.000 partículas cada

segundo. Esto produce un descenso en la eficiencia.

94

El aumento de la velocidad se consigue disminuyendo el diámetro del orificio del sorter, aumentando la

frecuencia de vibración (220 Hz) y la velocidad del flujo (50 metros/segundo). Esta situación, en las cámaras

de flujo convencionales, conduciría a la pérdida del flujo laminar. Pero en este tipo de sorter, el flujo laminar

se mantiene con diseños especiales de las cámaras, y con trayectos de alineamiento e interacción luz-célula

muy cortos.

Hay funciones especiales de sorter, como el sorter indexado. Una alternativa al sorter por citometría convencional es la separación

magnética.

95

BIBLIOGRAFÍA.

No se utilizó el Principios de Bioquímica de Lehninger.

1. Biología Celular y Molecular. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, Darnell. 5ta edición.

http://books.google.com.ar/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA181&lpg=PA181&dq=fraccionamiento+celular&source=bl&ots=

tEMjemr-Yq&sig=uo81VAYsAvKqStvouUkctZqaz4A&hl=es-

419&sa=X&ei=F4WEVI6CEOO1sQTYjYKQCQ&ved=0CDUQ6AEwBTgK#v=onepage&q=fraccionamiento%20celular&f=false

2. Servicio de citometría de flujo. Universitat de Lleida.

http://web.udl.es/dept/medicina/sedaicmf/sedai/intro.htm

3. Citometría de flujo y sórter. Centro Pfizer, Universidad de Granada, Junta de Andalucía de Genómica e Investigación

Oncológica.

http://www.genyo.es/content/unidad-citometria

4. Wikipedia, por supuesto. La mayor red de conocimiento open-source.

96

97

1. Técnicas de Purificación. 1.2) Purificación de las células y de sus partes: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR.

En lo que constituyó un importante avance bioquímico, Albert Claude, Christian de Duve y George Palade desarrollaron

el método de fraccionamiento celular de tejidos: un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener

fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular.

Es decir, su objetivo es la purificación –la separación individualizada, el aislamiento - de orgánulos citosólicos,

fracciones de membrana, complejos multiproteicos y otras biomoléculas, en función de sus propiedades biofísicas.

Mediante el fraccionamiento celular,

se consiguen conjuntos homogéneos de orgánulos o biomoléculas

a partir de una población heterogénea de células.

El paso inicial en la purificación de estructuras subcelulares es romper la membrana plasmática y, si está presente, la

pared celular. Posteriormente, la suspensión puede filtrarse. Al final, se procede a centrifugar para purificar. A continuación

desarrollo estas tres etapas, siendo las más importantes la primera y la tercera:

98

I. DISGREGACIÓN, RUPTURA u HOMOGENEIZACIÓN.

La homogeneización es el acto de disgregar los tejidos en las células que los componen, y luego realizar la lisis de las células

(disrupción celular): romper las envolturas celulares para que los orgánulos emerjan.

La homogeneización rompe la membrana plasmática pero respeta la integridad de la mayoría de los orgánulos y biomoléculas.

La homogeneización da como resultado un lisado celular o tisular (denominado ‘homogenado’): una mezcla de todos los

constituyentes celulares. Estos constituyentes podrán ser separados en fracciones mediante centrifugación.

Los tejidos deben prepararse para la homogeneización. Primero, deben ser suspendidos en un medio apropiado.

Este medio debe ser una solución de un pH y un contenido salino adecuados: una solución salina buffereada.

Para regular el pH se usa un buffer (solución tampón, solución amortiguadora, solución

reguladora). Un buffer es la mezcla de un ácido débil y su base conjugada, es decir, sales hidrolíticamente

activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades

relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes.

Esto es importante, ya que un leve cambio en la concentración de hidrogeniones (H+) en la célula puede

producir un paro en la actividad enzimática: los organismos vivos soportan muy mal las variaciones del pH,

aunque se trate tan solo de unas décimas de unidad; por ello han desarrollado sistemas tampón o buffer que

mantienen el pH constante, mediante mecanismos homeostáticos (de intercambio de materia y energía con el

entorno). Las variaciones del pH afectan a la estabilidad de las proteínas y, en concreto, a la actividad catalítica

de las enzimas, pues en función del pH se pueden generar cargas eléctricas que modifiquen la actividad

biológica.

Cada sistema buffer tiene su propio rango efectivo de pH, el cuál dependerá de la constante de equilibrio del

ácido o de la base que se emplee. Esta constante de equilibrio es un valor que nos dice hacia dónde se

desplaza el equilibrio en una reacción, y su empleo es fundamental en la química biológica, razón por la cual

será tratada con más detalle posteriormente.

El medio debe ser una solución con un contenido salino adecuado: un medio isotónico con respecto al

interior celular, es decir, con una concentración de solutos igual a la existente en el interior de la célula. Así

se mantienen las condiciones osmóticas y se evita que los orgánulos se contraigan o estallen.

Un medio isotónico debe tener una presión osmótica similar a la de los orgánulos, equilibrando o balanceando

la difusión de agua hacia afuera y hacia el interior de los orgánulos, que se hincharían o romperían en una

disolución de menor osmolaridad. Un medio isotónico, entonces, previene efectos osmóticos y, en este caso,

preserva la integridad estructural de los orgánulos.

99

Para esto suele usarse sacarosa isotónica (0,25 M). El medio de sacarosa tiene una presión osmótica muy similar a la de

los orgánulos, equilibrando la difusión de agua hacia fuera y hacia el interior de estos. Pero la sacarosa interfiere con ciertos

ensayos enzimáticos: puede ser reemplazada por manitol, sorbitol (polialcoholes de idéntica fórmula molecular pero diferente

fórmula estructural) o por una combinación de sales similares en composición a las que se encuentran en el interior de la célula.

El diisopropilfluorofosfato (DFP) es un inhibidor irreversible de las serín-proteasas. Este tipo de enzima, la serín-proteasa,

hidroliza el enlace fósforo-flúor del DFP, pero el residuo de fosfato se mantiene unido a la enzima en su centro activo, inactivándola.

Si se quiere determinar la actividad de enzimas que necesitan mantener sus grupos sulfhidrilos en estado reducido, deben

agregarse 2-mercaptoetanol (BME, 2BME, βME, ME) o ditiotreitol (TDT) al medio de homogeneización. Debe tomarse en cuenta,

de todas formas, que algunas proteínas son desnaturalizadas por el βME y el TDT, ya que reducen puentes disulfuro, afectando a la

estructura terciaria y a la estructura cuaternaria de la proteína.

Por último, para propósitos particulares a veces se reemplaza la solución salina

por un medio acuoso orgánico. Ej., si la intención es la purificación de núcleos, se

usa citrato en el medio: capacidad para inactivar desoxirribonucleasas, enzimas

que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster del DNA-.

Efecto de la osmolaridad extracelular sobre el movimiento del agua a través de una membrana plasmática. Cuando una célula en equilibrio osmótico con el medio (esto es, un medio isotónico) (a) se transfiere a un medio hipertónico (b) o hipotónico (c), el agua fluye a través de la membrana plasmática en la dirección que tiende a igualar la osmolaridad dentro y fuera de la célula.

100

Ya preparados los tejidos en un medio adecuado, se procede a homogeneizar: disrupción tisular y disrupción celular

(romper la envoltura celular). La homogeneización debe ser controlada de manera de no distorsionar ninguna organela subcelular

de interés, ni desnaturalizar ninguna biomolécula de interés. Para esto, los métodos deben ser moderados: no se deben utilizar

métodos vigorosos de homogeneización.

Existe una gran variedad de métodos diferentes para homogeneizar, pudiendo ser clasificados en:

a) métodos mecánicos y b) métodos químicos.

a) Algunos métodos mecánicos de homogeneización son moler, picar, triturar, congelar y descongelar, generar cambios de

presión, generar choque osmótico, sonicación, agitación de alta velocidad o en presencia de metal o de perlas de vidrio, etcétera.

La sonicación consiste en aplicar ultrasonidos (sonidos de muy alta frecuencia) a la suspensión celular. La intensa agitación

producida destruye las membranas celulares: dependiendo de la frecuencia, la intensidad y la energía, se pueden destruir

estructuras subcelulares, complejos proteicos… Se realiza en frío, para evitar el sobrecalentamiento de las muestras, lo que podría

provocar la desnaturalización de las proteínas.

Respecto al choque osmótico (shock osmótico), el agua fluye dentro de las células cuando se las coloca en una solución

hipotónica: el flujo osmótico provoca la hinchazón de las células, lo que debilita la membrana plasmática y facilita su ruptura.

También es posible fragmentar la membrana plasmática mediante equipos especiales de homogeneización; algunos de ellos

fuerzan a las células a través de un espacio muy estrecho, generando la ruptura de la membrana.

Los siguientes son algunos instrumentos que pueden usarse para realizar la homogeneización mecánica:

o Mortero con mazo (herramienta estándar).

o Batidoras o trituradoras, también empleados en la cocina.

o Prensa de French.

o Homogeneizadores: rompen la membrana con un émbolo rotatorio operado en forma manual o eléctrica. Existen dispositivos en los que

está calibrada la separación émbolo/pared del tubo para producir homogenado con un tamaño de partícula determinado. Por ej.,

homogeneizador Potter-Elvehjem, de uso frecuente ya que es relativamente suave, y con una luz entre émbolo y vidrio de entre 0,05 y 0,5mm.

Otros homogeneizadores: Potter; Dunce; Ten Broeck; homogeneizador de aspas (ej., el polytron).

El siguiente cuadro ofrece una visión de conjunto de algunos de estos instrumentos, su fundamento teórico y el tipo de

materiales sobre los que consiguen mayor eficacia:

* aspiraciones en vacío. Es un efecto hidrodinámico que se produce cuando el agua o cualquier otro fluido en este líquido para a gran velocidad

por una arista afilada, produciéndose una descompresión del fluido.

101

b) Métodos químicos: detergentes que solubilizan las membranas celulares, como el SDS (dodecilsulfato sódico, o NaDS)

o el Triton-X, así como algunas enzimas digestivas (ej., lisozima, colagenasa, tripsina, hialuronidasa), alteran la membrana celular

de tal modo que el contenido puede fluir hacia afuera.

El método elegido depende del tipo de experimento y del tipo de muestra (cultivo bacteriano, tejido de mamífero…).

La homogeneización produce una mezcla de componentes celulares suspendidos, que se denomina homogenado. De este

homogenado se podrán recuperar, posteriormente, los orgánulos o las biomoléculas de interés.

La homogeneización de la célula y la dilución del citosol provocan despolimerización de los microfilamentos de actina y de

los microtúbulos, liberándose sus subunidades monoméricas. De este modo, otros procedimientos pueden ser utilizados para

estudiar estos importantes constituyentes.

La homogeneización involucra la desorganización de un sistema biológico, y puede introducir in vitro nuevos estados

morfológicos y metabólicos llamados artefactos. Para evitar o minimizar esto, es necesario una buena elección del tejido, del

medio de homogeneización y del método de disrupción celular.

II. FILTRACIÓN.

Este paso se emplea en algunos tipos de células. Se pueden usar tejidos porosos para filtrar, y así eliminar el tejido conjuntivo u

otros elementos indeseables. Dependiendo de la naturaleza del contaminante, esto puede ser tan simple como verter el homogenado

a través de gasa, o más complejo.

102

Quelación.

Un agente quelante (quelante, secuestrante o antagonista) es una sustancia que forma

complejos con iones inorgánicos. A estos complejos se los conoce como quelatos.

Al proceso de formación de un quelato se le conoce como quelación o quelatación.

Una de las funciones de los quelantes es evitar la toxicidad de estos iones en los seres vivos.

Se diseñan para competir con los iones por los grupos reactivos fisiológicos, e incrementar

su excreción.

Ej.: El EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) tiene una fuerte afinidad por los cationes calcio,

lo que da por resultado una disminución de sus concentraciones. El EDTA y el EGTA pueden agregarse

para remover cationes bivalentes como Mg^2+ y Ca^2+.

Entre los quelantes naturales cuentan la clorofila, el glutatión, varias enzimas, vitaminas…

103

III. CENTRIFUGACION y PURIFICACIÓN.

En primer lugar deben considerarse y estudiarse los principios de la centrifugación y los usos de las técnicas de

centrifugación para separar orgánulos y biomoléculas. El principio de la centrifugación es el aumento de la velocidad de

precipitación o sedimentación de los orgánulos subcelulares, por la aplicación de una fuerza centrífuga: se usa el aumento de la

fuerza de gravedad para precipitar componentes celulares.

Es decir que las técnicas de fraccionamiento por centrifugación se basan en el comportamiento de las partículas en un

campo centrífugo aplicado, y asumen que dicho comportamiento está relacionado con los parámetros de las moléculas bajo

investigación, tales como masa molecular relativa, forma y densidad.

Consiste en un conjunto de métodos y técnicas para separar y purificar diversos orgánulos y biomoléculas, que

difieren en tamaño, forma y densidad: esta diferencia fundamental les hace experimentar la sedimentación a diferentes velocidades.

Para una dada partícula, la velocidad de sedimentación es proporcional a la fuerza aplicada, por lo tanto las partículas sedimentan

más rápido cuando la fuerza aplicada es más grande que la fuerza gravitacional de la Tierra. Las partículas son suspendidas en un

medio específico, en tubos o botellas, y son colocadas en un rotor, el cual es posicionado en el centro de la centrífuga. Las

partículas que difieren en densidad, tamaño y forma pueden ser separadas porque sedimentan a diferentes velocidades en un campo

centrífugo.

Es útil para obtener, por ejemplo, fracciones de membrana o complejos multiproteicos (citoesqueleto de

actina, microtúbulos, poros nucleares, etcétera).

Las partículas de mayor tamaño o densidad se acumulan en el fondo. Se forman entonces dos fracciones:

sobrenadante (supernatant), fracción homogénea que no ha sedimentado; y pellet (sedimento), que queda adherido al fondo del

tubo. Si deseo fraccionar cualquiera de estas dos fases, la extraigo y la vuelvo a centrifugar.

Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La

fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF, o fuerza G) en unidades de g (gravedad). La RCF

es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y distancia de partículas desde el eje de rotación.

Conociendo esta distancia (d) y la velocidad de centrifugación (rpm), se puede determinar el RCF en la ecuación:

RCF = 1,19 x 10^(-5) x (rpm) x 2d, donde d se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera

del tubo de centrífuga. Las centrífugas, semejantes a las del lavarropas de 350 revoluciones por minuto (3 metros diámetro) pueden

disponerse a baja velocidad (procariotas, células, núcleos, etc.) o a mayor velocidad. Usan rotores basculantes (como los de

una presa).

Dependiendo de la densidad del medio voy a conseguir mayor o menor pronunciación del efecto centrífugo. También se

puede someter a las muestras a diferentes márgenes de aceleración: las centrífugas suelen correr a aprox. 3.000g, las

supercentrífugas van desde 2.000 a 20.000 g, y las ultracentrífugas, que emplean un intenso vacío, van desde los 15.000 a 600.000g.

Es importante mencionar que la fricción puede sobrecalentar la muestra.

Los orgánulos tienen diferentes densidades: cantidad de materia por unidad de volumen.

104

En una centrífuga, el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos:

Rotor basculante: los tubos se colocan en una cestilla perpendicular al eje de giro. El rotor se mueve. +velocidad.

Rotor de ángulo fijo: se colocan en orificios en el interior de rotores macizos. Es inmóvil.

Rotores verticales.

Los parámetros a tener presentes son:

Volumen de la solución a centrifugar. Predetermina el tipo de tubos y rotor.

Naturaleza química de la solución. Determina la naturaleza del tubo.

Diferencia entre la densidad de la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentran. Cuanto mayor

sea esa diferencia, antes (menos tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando la diferencia es muy pequeña

se pueden usar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Según el propósito, las técnicas de centrifugación son de dos tipos:

La centrifugación preparativa se emplea para separar, aislar y purificar células enteras, orgánulos subcelulares,

membrana plasmática, polisomas, ribosomas, cromatina, ácidos nucleicos, lipoproteínas, virus, etc., para ser empleados

en subsiguientes investigaciones.

Las técnicas de centrifugación analítica, por otra parte, son desarrolladas principalmente para estudiar las

propiedades de las partículas que sedimentan, tales como el coeficiente de sedimentación o su masa molecular. En

general, requieren menores cantidades de material que la centrifugación preparativa. Las partículas se observan mediante

un sistema óptico durante la centrifugación: los tubos de centrífuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y

ultravioleta. Se suele usar un rotor basculante.

Según la forma en que se centrifuga, se puede hablar de:

105

Centrifugación diferencial (varias centrifugaciones, velocidad creciente).

En la centrifugación diferencial se aumenta secuencialmente la velocidad de centrifugación y, por ende, la fuerza

centrífuga, resultando en una separación secuencial de orgánulos de acuerdo a su tamaño y densidad. Se obtienen solamente dos

fracciones: sobrenadante y pellet.

Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poca fuerza) sedimentan las partículas mayores y/o más densas. Los

componentes de mayor tamaño migran más rápidamente al fondo y forman este sedimento. Cuando el sobrenadante de la primera

centrifugación es expuesto de nuevo a condiciones de mayores tiempos y mayores fuerzas de aceleración, sedimentan de nuevo las

partículas más densas de las presentes… y así sucesivamente. Las partículas en suspensión deben diferir en densidad de la del

medio.

Esta técnica generalmente usa rotor angular, y la separación es principalmente en función del tamaño de partícula,

aunque influye el coeficiente de sedimentación s, que depende de la masa (tamaño x densidad) y de la forma.

1ra centrifugación (1.000G, 10 minutos): células enteras, núcleos, citoesqueleto, membranas plasmáticas. [PRECENTRIFUGACIÓN]

2da centrifugación (20.000G, 20 minutos): cloroplastos, mitocondrias, peroxisomas, lisosomas.

3ra centrifugación (80.000G, 1 hora): microsomas (fragmentos de RE RoL), vesículas pequeñas.

4ta centrifugación (150.000G, 3 horas): ribosomas, virus, grandes macromoléculas. Sobrenadante con proteínas. [ULTRACENTRIFUGACIÓN]

Al final de cada etapa, el pellet y el sobrenadante son separados y el pellet es lavado algunas veces por resuspensión en el

medio de homogeneización, seguido de una recentrifugación bajo las mismas condiciones. El sobrenadante que resulta de cada

etapa es el material con el que se efectúa la centrifugación de la etapa siguiente.

Cabe aclarar que los pellets no son puros, sino que están enriquecidos en una determinada fracción. En el tiempo

requerido para la sedimentación completa de las partículas pesadas, algunas de las partículas livianas o de tamaño medio también

pueden sedimentar y así contaminar la fracción. Es por eso que, para obtener fracciones altamente enriquecidas, son necesarias

etapas posteriores de centrifugación.

Sea como sea, la C.D. permite obtener un fraccionamiento inicial grosero del contenido citoplasmático, que puede purificarse

con más precisión mediante una centrifugación isopícnica (“igual densidad”).

Esquema de la centrifugación diferencial, para separar los

diferentes orgánulos obtenidos mediante fraccionamiento celular.

106

Centrifugación isopícnica (en gradiente de densidad, hasta el equilibrio de sedimentación).

En la centrifugación isopícnica, los orgánulos de densidad de flotación diferente (resultado de las diferentes relaciones

entre cantidad de lípidos y proteínas en cada clase de orgánulo) se separan por centrifugación a través de una columna de

disolvente que contiene un gradiente de densidad. El tiempo de centrifugación es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 días) como

para que se alcance el equilibrio de sedimentación.

El proceso es como sigue: se llena un tubo de centrífuga con una disolución, la densidad de la cual aumenta desde la

superficie hasta el fondo; para producir este gradiente de densidad se disuelve un soluto como sacarosa a diferentes

concentraciones, y se lo somete a velocidades de centrifugación muy altas (ultracentrifugación).

Cuando se deposita la mezcla de partículas –orgánulos y biomoléculas- sobre este gradiente de densidad, y se centrifuga el

tubo a alta velocidad, los orgánulos individuales sedimentan hasta que su densidad de flotación corresponde exactamente con la del

gradiente. Por supuesto, para conseguir esto se usan gradientes continuos que cubren todo el intervalo de densidades de los

componentes de la muestra. Además, en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente más denso.

De esta forma, independientemente del tiempo de centrifugación, las partículas nunca sedimentarán en el fondo. Al final, puede

recogerse cada capa por separado.

Además de mayor resolución, lo interesante de esta técnica es que separa a los componentes de la muestra exclusivamente

según su densidad, y que los sitúa en la posición del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia (isopícnica:

de igual densidad).

Esta técnica usa rotor basculante, y la separación es en función de la densidad de partícula. El gradiente evita la

mezcla por convección/difusión: bandas bien separadas. El tiempo de centrifugación es lo suficientemente largo como para que se

alcance el equilibrio.

Centrifugación en gradiente de densidad (isopícnica).

107

Mediante el fraccionamiento subcelular se descubrió que los lisosomas contienen enzimas degradativas; que las mitocondrias

contienen enzimas oxidativas; que los cloroplastos contienen pigmentos fotosintéticos. El aislamiento de un orgánulo enriquecido

con determinada enzima suele ser el primer paso en la purificación de dicha enzima.

Debido a que el hígado de rata contiene gran cantidad de un tipo único de células, este tejido se ha utilizado en muchos

estudios clásicos de orgánulos celulares. Obviamente, a causa de las amplias variaciones entre tejidos de distinto origen, en cuanto a

la fragilidad de los distintos orgánulos y en cuanto a la resistencia de las células y tejidos a la disrupción, la homogeneización de

los diferentes tipos celulares presenta problemas específicos que pueden ser resueltos ajustando las distintas variables a los

distintos tejidos. Sin embargo, los mismos principios de homogeneización y aislamiento se aplican a casi todas las células y tejidos,

pudiendo usarse modificaciones de estas técnicas de fraccionamiento para separar y purificar cualquier componente deseado.

Al final, el procedimiento de aislamiento ideal deberá rendir altas concentraciones de los componentes deseados con su

estructura y función inalterada.

108

El grado de pureza de las fracciones obtenidas por cualquiera de estos métodos, puede verificarse mediante

a) Microscopía electrónica de transferencia –verificación morfológica-,

b) Marcadores enzimáticos, o

c) Métodos inmunoquímicos –con agentes intercalantes, colorantes o anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas-.

La verificación del grado de pureza mediante métodos inmunoquímicos

se continúa en las páginas 129 a 132.

Además, pueden obtenerse grados máximos de pureza de orgánulos y macromoléculas mediante métodos inmunoquímicos de

separación como la cromatografía de afinidad. La cromatografía será estudiada más adelante. Trabajo de laboratorio. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DE C.D.

1. Se homogeneízan 20 g de hígado en 100 ml de buffer fosfato (NaH2PO4–NaHPO4 0,1M pH: 7.4). Esta solución constituye el

homogenado total (HT). Medir volumen exacto y reservar una alícuota de 10 ml para determinación de proteínas.

2. El resto, repartirlo en 6 tubos Sorwall, y centrifugar en centrífuga Sorwall refrigerada de acuerdo al esquema de las fotocopias

(página 6). Es decir: centrifugar los 6 tubos a 4.000 rpm, durante 10 minutos. Retirar fracción nuclear (FN), y guardar para

determinación de proteínas. Centrifugar sobrenadante postnuclear (SPN) a 15.000 rpm durante 15 minutos. Retirar fracción

mitocondrial (FM), y guardar para determinación de proteínas. Guardar también el sobrenadante postmitocondrial (SPMit)

para determinación de proteínas.

3. Resuspender en buffer de homogeneización a los precipitados correspondientes a las fracciones nucleares y mitocondriales,

empleando un homogeneizador de vidrio. Deben agregarse los siguientes volúmenes:

-fracción nuclear: 6 ml

-fracción mitocondrial: 5 ml

Medir el volumen de cada fracción y anotarlo en la tabla correspondiente. De estas soluciones se tomarán las alícuotas

correspondientes para la cuantificación de proteínas. La cuantificación de proteínas será explicada en la siguiente sección.

109

Tipos de centrífugas y usos.

a) Centrífugas pequeñas

b) Centrífugas refrigeradas de gran capacidad

c) Centrífugas refrigeradas de alta velocidad

Ultracentrífugas de dos tipos:

d) Preparativas y

e) Analíticas

a) Se emplean para colectar pequeñas cantidades de material que sedimentan rápidamente (levaduras, eritrocitos, etc.). En

general, alcanzan una velocidad máxima de 4.000-6.000 rev./min., con una fuerza centrífuga de 3.000 a 7.000 g. Algunas son

diseñadas para alcanzar velocidades de 8.000 a 13.000 rev./min. y 10.000g: estas incorporan un sistema de refrigeración para

mantener los rotores fríos. Pueden ser empleadas para sedimentar muestras de sangre, sinaptosomas, etc.

b) Desarrollan un máximo de velocidad de 6.000 rev./min. con una fuerza centrífuga de 6.500 g- Las cámaras que contienen los

rotores son refrigeradas y permiten emplear rotores de ángulo fijo como móviles (basculantes). Permiten colectar sustancias

que sedimentan rápidamente como eritrocitos, precipitados voluminosos, células de levadura, núcleos, cloroplastos, etc.

c) Estos instrumentos emplean rotores que permiten desarrollar velocidades de 25.000 rev./min., generando fuerzas centrífugas

de 60.000 g. Son empleadas para colectar microorganismos, desechos celulares, orgánulos celulares, etc. No sirven para

precipitar virus u organelas más pequeñas como ribosomas.

d) Pueden alcanzar velocidades de 80.000 rev./min., produciendo fuerzas centrífugas de 600.000 g. La cámara del rotor es

refrigerada y se le hace vacío para minimizar la alta temperatura generada por la excesiva velocidad. Pueden emplearse para

separar macromoléculas unidas a ligandos, fracciones de lipoproteínas plasmáticas, etc.

e) Pueden operar a velocidades de 70.000 rev./min., produciendo fuerzas centrífugas de 500.000 g. Son similares a las anteriores,

pero adicionan un sistema óptico que permite observar el material que va sedimentando.

110

Bibliografía.

Además del Principios de Bioquímica de Lehninger, 5ta edición, se usó:

1. Biología Celular y Molecular. Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott, Zipursky, Darnell. 5ta edición.

http://books.google.com.ar/books?id=YdyMSxY2LjMC&pg=PA181&lpg=PA181&dq=fraccionamiento+celular&source=bl&ots=

tEMjemr-Yq&sig=uo81VAYsAvKqStvouUkctZqaz4A&hl=es-

419&sa=X&ei=F4WEVI6CEOO1sQTYjYKQCQ&ved=0CDUQ6AEwBTgK#v=onepage&q=fraccionamiento%20celular&f=false

2. Fraccionamiento celular. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregman.

http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm

3. Wikipedia, por supuesto. La mayor red de conocimiento open-source.

111

2. Fotometría. 2.1) Nociones básicas.

La luz blanca está compuesta por todos los colores del espectro visible (380 nm–780 nm). Cuando un haz de luz blanca

atraviesa una solución coloreada, parte de la luz es absorbida selectivamente por la sustancia, y el resto se transmite a través de

dicha solución. El color de la sustancia es el color de la luz transmitida.

Si medimos la cantidad de luz absorbida por la sustancia (por ejemplo, por una proteína), podemos cuantificar a dicha

sustancia en solución. A mayor absorción de luz, mayor concentración de la sustancia.

Absorbancia (Densidad Óptica): cantidad de luz absorbida por un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.

Transmitancia: cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.

La fotometría se basa en dos leyes fundamentales:

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad

disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta.

Ley de Beer: cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye

exponencialmente a medida que aumenta la concentración de la sustancia absorbente en el medio.

Estas dos leyes se combinan en la Ley de Beer-Lambert, que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material

atravesado. El enunciado de la Ley de Beer-Lambert es el siguiente: ‘La absorción de luz a una determinada longitud de onda es

dependiente de la concentración del material absorbente y de la longitud del camino que debe atravesar la luz a través del medio

absorbente’. Es decir, que la absorbancia de una muestra a una determinada longitud de onda depende de la cantidad de especie

absorbente con lººa que se encuentra la luz al pasar por la muestra.

112

io: intensidad de luz incidente. i: intensidad de luz transmitida. c: concentración de la sustancia. l: longitud del camino que atraviesa la luz (espesor de capa). ε: coeficiente de extinción molar (Do de una solución 1M de la sustancia en una celda de 1cm^2 de espesor). Expresión que, si se utiliza una cubeta de espesor constante, resulta DO = cte x c

En estas condiciones, la Ley de Beer-Lambert indica que hay una relación lineal entre DO y la concentración, siempre que se

tengan en cuenta los siguientes factores:

a) Que la luz sea paralela y monocromática

b) Que el medio sea homogéneo

c) Que la absorción del solvente sea despreciable

d) Que no haya asociación entre las moléculas del solvente y del soluto

Esta ley tiene algunas excepciones: generalmente, cuando se tienen concentraciones muy elevadas

o muy bajas, la absorción deja de ser proporcional.

Representando gráficamente una serie de absorbancias o densidades ópticas (Abs=DO) a una longitud de onda dada, en

función de la cantidad de sustancia (C), la obtención de una función lineal verifica el cumplimiento de la Ley de Lambert y

Beer, como se observa en el gráfico anterior.

En el caso de que la recta se transforme en una curva, no se verifica la ley de Lambert y Beer –en la zona en que la recta se

curva, no se cumple la ley-.

Para medir la densidad óptica se usa un dispositivo denominado colorímetro. Actualmente se usan los colorímetros

fotoeléctricos, como los fotómetros de filtro y los espectrofotómetros. En general los aparatos constan de:

1. Fuente de luz: lámpara con filamento de tungsteno para emitir luz de 300 a 700 nm.

2. Filtro o monocromador: un sistema de aislamiento espectral que permite seleccionar una banda de longitud de onda

lo suficientemente estrecha como para obtener una luz más o menos monocromática-. En el fotocolorímetro este sistema

está dado por un filtro –gelatina entre dos paneles de vidrio- y en el espectrofotómetro, por un monocromador de prisma

o red de difracción acoplado a una ranura ajustable.

3. Colimador: para obtener un haz de luz dirigido. Es decir, para que la luz sea paralela.

4. Muestra: colocada en un tubo calibrado o cubeta de un espesor determinado. Aquí se coloca la solución cuya densidad

óptica se debe determinar. Debe colocarse siempre de la misma manera para evitar cometer errores debido a las

imperfecciones de las cubetas.

5. Dispositivo fotoeléctrico: es una célula fotoeléctrica que transforma la luz transmitida en corriente eléctrica, la cual

se registra por medio de un galvanómetro calibrado para que la lectura del mismo de directamente la densidad óptica.

Un espectrofotómetro es un dispositivo que tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través

de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos

funciones: 1) Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra, e 2) indicar qué cantidad de esta sustancia

está presente en la muestra.

113

2. Fotometría. 2.2) Procedimiento para cuantificar fotométricamente una sustancia.

La cuantificación fotométrica sólo puede realizarse en soluciones coloreadas. Si la solución no es coloreada, se debe

provocar que algún grupo funcional presente en la molécula a dosar reaccione con un reactivo determinado, para que se produzca

una sustancia coloreada: métodos derivados colorimétricos y fluorimétricos

Para realizar la cuantificación, es necesario tener una a) solución standard (patrón o testigo) y una b) solución

blanco.

a) La solución standard posee la sustancia a cuantificar (analito) a una concentración perfectamente conocida, y es

obtenida a partir de una droga pura. Utilizar un colorímetro fotoeléctrico sobre la solución standard nos permite definir

la absorbancia del analito a la concentración ya conocida (AT : absorbancia de los testigos). Este dato nos servirá como

patrón para las posteriores cuantificaciones experimentales: nos permite valorar las concentraciones incógnita (CD)

en otras soluciones mediante una regla de tres simple, habiendo medido las absorbancias (AD).

CT: concentración de los testigos AT: absorbancia de los testigos.

AD: absorbancia de la sustancia en la sol. incógnita CT: concentración de la sustancia en la sol. incógnita.

b) La solución blanco contiene todos los reactivos que se utilizarán en la cuantificación (NaOH, reactivos…), menos el

analito de interés (la sustancia a cuantificar). El blanco sirve para calibrar el colorímetro a 0 de absorbancia o 100% de

transmitancia. Esto nos permite eliminar posibles errores de medición causados por impurezas o por reactivos

coloreados. Tanto las impurezas como los reactivos coloreados producen absorciones que interfieren en la lectura

correcta.

El procedimiento de cuantificación fotométrica se realiza 1. tomando varias alícuotas de una solución standard, determinando

las absorbancias de cada una de ellas, y plasmando los datos en una curva standard, curva patrón o curva de calibrado: se

grafican las AT en función de las CT (en umoles, miligramos, etc.) del analito.

2. Luego se mide la AD de la extracto a analizar –solución incógnita-. Se entra a la curva patrón con esta absorbancia. En base

a este dato, se determina la concentración incógnita del analito (CT) en el extracto. Este último paso se realiza con cada una de las

alícuotas del material a analizar.

Ver ej. en las fotocopias siguientes.

Antes de medir la densidad óptica de la incógnita se debe seleccionar la longitud de onda adecuada –colocando el filtro o

monocromador correspondiente, o accionando el selector- y ajustar el aparato de manera que la densidad óptica del blanco sea cero

(100% de transmitancia). Si no se realiza la calibración, la solución blanco puede emplearse de otros modos:

Si la densidad óptica de la incógnita diera un valor muy elevado –o muy bajo-, se debe elegir una alícuota más pequeña –o

más grande- de manera que la lectura entre en el rango lineal del método (parte recta de la curva standard). Por este motivo se

suelen pipetear dos o más alícuotas de la incógnita, y se eligen aquellas que cumplen con este requisito.

114

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

115

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas.

El antiguo método de Kjeldahl se basa en la determinación del nitrógeno total de la muestra: las proteínas son digeridas en

un medio ácido, y el nitrógeno total es determinado por titulación (método también denominado valoración o análisis

volumétrico). La titulación es un método de análisis químico cuantitativo que consiste en hacer reaccionar una solución estándar de

un reactivo titulador con una solución de analito de concentración desconocida –en este caso, el nitrógeno proteico-: de esta

manera, se puede determinar la cantidad exacta de titulador y analito que se han consumido cuando se alcanza el punto final de la

reacción.

Otros métodos se basan principalmente en:

a) La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el rango de UV,

b) La capacidad de las proteínas para formar derivados químicos,

c) La capacidad de las proteínas para unir ciertos colorantes.

El uso del método adecuado depende de cinco criterios:

1. La cantidad total de proteína presente en la muestra,

2. La concentración de la proteína,

3. La especificidad del método,

4. La presencia de otras sustancias que pudieran interferir,

5. La facilidad y reproducibilidad del método.

En el caso particular de la cuantificación de proteínas mediante métodos de absorción, se determina la absorbancia de las

soluciones de proteína en la región de la radiación ultravioleta (UV). Los enlaces peptídicos absorben a 205-210 nm, mientras que

los triptófanos y tirosinas lo hacen a 280 nm. Los coeficientes de extinción varían de acuerdo a la proteína: así, el ε a 280 nm

para la albúmina de suero bovino es igual a 6.3, mientras que para la inmunoglobulina de ratón es igual a 13.8. Aunado a este

problema, muchas sustancias no proteicas absorben fuertemente en la región del ultravioleta, produciendo grandes interferencias.

Este es el caso de los ácidos nucleicos.

116

Métodos derivados colorimétricos: BIURET. Cu (II) = Cu2+

El color natural de las proteínas, en ausencia de cobre, puede ser enteramente atribuido al contenido de tirosinas y triptófano.

Pero en presencia de cobre, el tratamiento alcalino de las proteínas resulta en un incremento de 3 a 15 veces en el desarrollo de

color. La reacción con cobre toma de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, pero el calentamiento a 100ºC o el aumento en la

concentración de álcali acelera la reacción con cobre en solución alcalina. Se requiere muy poco cobre para obtener un color final

completo.

El método de Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu (II) y los grupos NH de los enlaces

peptídicos, en medio alcalino. Un Cu (II) se acompleja con cuatro NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional

a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica para proteínas, de manera que pocas sustancias

interfieren (muestra pocas interferencias).

Esta reacción se da en aquellas sustancias que poseen grupos carbamínicos –CO–NH unidos entre sí, ya sea

directamente o a través de C o N.

La unión del cobre II con los cuatro enlaces peptídicos se presenta en la forma mostrada a

la derecha.

La sensibilidad del método es muy baja (1.000 a 10.000 microgramos; orden de los mg)

y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados

(por ej.: en suero).

Si la concentración de proteínas es menor a los 1.000 microgramos, la reacción ocurre igual,

pero la coloración no aparece.

117

Métodos derivados colorimétricos: LOWRY.

Es mucho más sensible y específica que la determinación por absorción en el ultravioleta a 280 nm, así como fácil de adaptar

a análisis en pequeña escala. También es más sensible que el Biuret, pero más tedioso de realizar. Puede detectar cantidades de

entre 1 y 100 micrómetros de proteínas (cantidades del orden de 0,1 mg). Sin embargo, la cantidad de color producido varía con

diferentes proteínas y en algunos casos el color no es estrictamente proporcional a la concentración.

Se basa en la reacción de las proteínas con Cu (II) en medio alcalino, y en el uso del reactivo de Folin-Ciocalteau

(reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico, llamado así porque contiene fosfomolibdato y fosfowolframato) que reacciona sobre grupos

fenólicos (mayoritariamente tirosina en proteínas): el reactivo de Folin es reducido por el complejo proteína-cobre.

Las proteínas son tratadas con Cu (II) en medio alcalino, como en el método de Biuret, lo que potencia el color. Cuando el

reactivo Folin es adicionado a la proteína tratada con buffer a pH 10 se obtiene un color máximo debido a la reducción del

reactivo Folin por el complejo proteína-cobre, produciendo un cambio en la absorbancia que puede ser monitoreado a 750

nm, con un rango de sensibilidad de 1-2 microgramos. Para lecturas a 660 nm, el rango de sensibilidad es de 2-30 microgramos.

Para lecturas a 500 nm, el rango de sensibilidad es de 25-100 microgramos. En todos los casos se usa una curva estándar para

calcular la concentración.

Con respecto a las interferencias, reactivos como el ácido úrico, la guanina

y la xantina reaccionan con el reactivo Folin.

La guanina, por ej., produce 50% más color que la proteína.

La mayoría de los fenoles, excepto los nitrofenoles, reducen al reactivo: también

interfieren aumentando el color.

El reactivo Folin muestra muchas interferencias con detergentes no iónicos,

sulfato amónico, etc.

118

Métodos derivados colorimétricos: BRADFORD.

Este método involucra la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 –o Serva Blue- a las proteínas,

provocando un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm.

Este método es sensible (1-15 microgramos), simple, muy reproducible, rápido, puede ser empleado para procesar un gran

número de muestras, es adaptable a la automatización, es barato, y pocas sustancias interfieren en su determinación.

Entre las sustancias que interfieren están a) los detergentes y b) las soluciones básicas: buffers altamente alcalinos presentan

interferencia, pero esto puede ser contrarrestado corriendo blancos apropiados-.

El colorante Azul Brillante de Coomassie G-250, en solución ácida, presenta dos formas coloreadas: azul y rojo. El color

rojo pasa a azul cuando el colorante se une a la proteína. La formación del complejo colorante-proteína toma aproximadamente 2

minutos y permanece estable por 1 hora, por lo que el procedimiento es muy rápido y el tiempo para el ensayo no es limitante.

El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción, lo que hace al ensayo aproximadamente cuatro veces

más sensible que el ensayo de Lowry.

119

Métodos derivados colorimétricos: BCA.

La determinación de proteínas por BCA es un método altamente sensible, además del método que muestra menos

interferencias. Este ensayo muestra menos variación de una proteína a otra, es sencillo y rápido.

Este método combina la reacción de las proteínas con Cu2+ en un medio alcalino (produciendo Cu1+) con un reactivo para la

detección de Cu1+ altamente selectivo y sensitivo: el ácido bicinconínico (BCA). El ácido bicinconínico, en la forma de su sal de

sodio soluble en agua, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones cuprosos (Cu1+), en medio

alcalino.

La cuantificación por BCA combina la reacción de Biuret (reacción de la proteína con Cu2+ en un medio alcalino para producir

Cu1+) con la reacción entre el BCA y el Cu1+. El producto de la reacción presenta un color púrpura, generado por la interacción de

dos moléculas de BCA con un ión Cu1+, unión muy estable y soluble en agua. Esto último permite la cuantificación

espectrofotométrica de proteínas en solución acuosa.

El producto de la reacción exhibe una fuerte absorbancia a 562 nm, con un rango de sensibilidad de 0.5-10 microgramos. Para

el cálculo de la concentración debe usarse curva estándar.

Con respecto a las interferencias, este ensayo está tamponado a un pH óptimo de 11.25. Cualquier reactivo en la muestra

que disminuya el pH de la formulación a menos de 11 o lo eleve a más de 11.5 puede afectar la sensibilidad o reproducibilidad del

ensayo. En muchos casos, ajustar el pH de la muestra a 11 antes de realizar la determinación puede evitar variaciones.

Muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos: ausencia de interferencias en concentraciones

relativamente altas (1%) de detergentes iónicos y no iónicos.

120

En conclusión… El mejor método para la determinación de proteínas dependerá de varios factores relacionados con la muestra a

analizar. La sensibilidad del método es muy importante cuando la cantidad total de la muestra es limitada, o bien cuando la

concentración de proteína es muy baja. La especificidad del método es importante cuando se analizan muestras de diferente

naturaleza, es decir, la respuesta del método no presentará grandes variaciones dependiendo del tipo de proteína presente. De otra

manera sería necesario realizar varias curvas estándar, una para cada tipo de proteína a cuantificar. Las interferencias al método

son importantes cuando se trata de muestras no muy puras, obtenidas de medios complejos, conteniendo concentraciones elevadas

de otros compuestos o a condiciones de pH o fuerza iónica especiales.

¿Qué necesito, entonces, para cuantificar una determinada

sustancia por un método colorimétrico? Además de la solución con

la sustancia a cuantificar, necesito:

1. Una solución patrón (estándar).

2. Una curva de calibrado.

3. Un blanco de reactivos.

Con respecto a la curva de calibrado –que no es una curva, sino una

función lineal-, se realiza con concentraciones crecientes de la

solución patrón: se miden las absorbancias, se tabula y grafica.

Notar que, obviamente, la curva patrón no se inicia en el cero del eje

de coordenadas. El punto de inicio de cada curva patrón es denominado P.

Los métodos más sensibles son aquellos cuyo P es más cercano a cero.

Restando la absorbancia del blanco a la absorbancia total del ensayo, obtengo la absorbancia de la sustancia a cuantificar,

la ubico en la curva de calibrado y así determino su concentración respectiva.

Con respecto a los resultados del análisis, se utilice el método de cuantificación que se utilice, al final de la determinación de

las absorbancias y, en base a estas, del contenido proteico en mg de proteína por alícuota, se suelen establecer

a) El contenido proteico en mg de proteína totales

b) La relación mg proteínas/g tejido

c) El % de contribución de dicha cantidad de proteína al total del peso de tejido

d) El % de recuperación

Las ecuaciones para calcular el % de contribución y el % de recuperación, se encuentran al final de las siguientes

fotocopias.

121

3. Investigación en proteínas. 3.1) Consideraciones extra sobre purificación, cuantificación y determinación de la función de las proteínas.

Una de las finalidades primordiales de la bioquímica es determinar de qué manera la secuencia de aminoácidos especifica la

conformación –y por ende, la función- de las proteínas. Para determinar esto, cada proteína en particular debe ser sometida a

numerosos tipos de estudios. Los estudios que suelen realizarse, a grandes rasgos, son:

1. PURIFICAR. En el estudio de las proteínas, el primer paso suele ser su purificación. Las proteínas se pueden separar

entre sí en base a sus propiedades físicas: tamaño, densidad, carga, capacidad de unión, solubilidad, etcétera. La purificación de las

proteínas es un primer paso esencial para el conocimiento de su función: nunca desperdicies pensamientos puros en una proteína

impura.

Se puede separar a las moléculas en base a su relación entre masa y carga, usando la técnica MALDI-TOF de

espectrometría de masas. Así, de la leche se obtienen caseína, lactoglobulina, lactalbúmina… También se puede localizar

proteínas in vivo, medir sus cantidades y explicar sus contextos fisiológicos: empleando anticuerpos monoclonales, que sirven

para reconocer proteínas específicas.

Se pueden utilizar diversas técnicas de purificación. La precipitación salina hace que, como el nombre indica, las

proteínas precipiten en presencia de alguna sal en especial. El sulfato de amonio 0,8M (sulfato amónico) precipita el

fibrinógeno, una proteína de la coagulación sanguínea. El sulfato de amonio 2,4M precipita la albúmina del suero.

Con posterior diálisis es posible eliminar la sal: separa proteínas de moléculas pequeñas. Para esto se necesita una membrana

semipermeable (membrana porosa de celulosa, saco de diálisis…). Moléculas con dimensiones significativamente mayores que el

diámetro del poro se retienen dentro, el resto se transforma en dializado.

La cromatografía de filtración por gel –también llamada cromatografía de exclusión molecular- separa en

función del tamaño molecular. Implica a la muestra en una columna rellena de un gel cuya matriz consta de un gran número de

esferas porosas microscópicas de un polímero insoluble altamente hidratado: dextrano, agarosa, poliacrilamida, sephadex,

sepharosa, biogel. Las moléculas más grandes fluyen más rápidamente a través de esta columna y salen antes, porque a causa de su

tamaño no son atrapadas por las esferas –no penetran en las esferas-.

La cromatografía de intercambio iónico separa en base a la carga iónica, carga neta. Las proteínas cargadas

positivamente (catiónicas) se pueden separar en columnas de carboximetil-celulosa (CM-celulosa, o CMC) cargadas negativamente.

Las proteínas aniónicas se pueden separar por cromatografía en columnas de dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa, o DEAEC)

cargadas positivamente.

La cromatografía de afinidad se aprovecha de la afinidad de muchas proteínas por grupos químicos específicos. Ej.: La

proteína globular vegetal concanavalina A (Con A) posee afinidad hacia residuos de glucosa unidos covalentemente. Se separa, al

mismo tiempo, si se añade una disolución concentrada de glucosa. Es un buen sistema para aislar factores de transcripción,

proteínas que regulan la expresión génica…

La HPLC (high-pressure liquid chromatography, o cromatografía líquida de alta presión) es una versión mejorada de las

técnicas de columna expuestas aquí.

122

Existen consideraciones previas que deben tomarse en cuenta a la hora de aislar una proteína específica de una mezcla compleja de proteínas.

En primer lugar, debe realizarse un ensayo que determine si está presente o no una proteína.

Ej.: consideremos la enzima lactato deshidrogenasa, un actor importante en la generación energética anaeróbica de

lactato a partir de glucosa, y en la síntesis de glucosa a partir de lactato. Veamos, específicamente, la reacción que cataliza esta

importante enzima:

El NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina) se distingue del resto de los componentes de la reacción por su capacidad

para absorber luz a 340 nm. Entonces, si agrego lactato a una muestra que tenga lactato deshidrogenasa, se formarán piruvato y

NADH, que expuesto a 340 nm actuará como absorbente y confirmará la presencia de la enzima.

Puedo inclusive seguir el progreso de la reacción observando cuánta luz absorbe la mezcla de reacción por unidad de tiempo,

por ejemplo, cada un minuto: mido el incremento de la actividad enzimática. Sea como sea, confirmada la presencia de la molécula

–en este caso, la enzima lactato deshidrogenasa- ya es posible purificarla.

Pero, concluyendo: necesito purificar para conocer la función. Pero para purificar, debo hacer un análisis o ensayo de

reconocimiento, y para hacer un ensayo de reconocimiento generalmente necesito antes conocer la función.

Además de identificar a una proteína, para establecer un esquema de purificación funcional necesito conocer la cantidad de la

proteína presente en la mezcla que se ensaya.

123

Previo a todo esto, las proteínas deben ser liberadas de la célula.

Elegidos el ensayo y la fuente de proteína, hay que fraccionar célula y precisar qué fracción está enriquecida con dicha

biomolécula. Se forma homogenado por ruptura de la membrana celular, la centrifugación da lugar a precipitados de material

pesado en el fondo del tubo –pellets-, y a sobrenadantes por encima.

La centrifugación diferencial produce varias fracciones de densidad decreciente: la secuencia de pellets es de densidad

decreciente. Cada una de estas fracciones integra cientos de proteínas distintas, que se ensayan posteriormente para obtener la

actividad que se purifica. Normalmente, al ensayar las fracciones para detectar la proteína, se acaba por encontrar una fracción

especialmente enriquecida. Esto permite determinar, además, la densidad de la proteína.

2. ESTABLECER LA FUNCIÓN PROTEICA. El segundo paso suele consistir en el empleo de diversos métodos para determinar

la secuencia específica de aminoácidos (estructura primaria). También pueden estudiarse las relaciones evolutivas entre

proteínas de diferentes organismos.

Además, se pueden emplear técnicas que proporcionen datos y descripción de la estructura terciaria: la verdadera unidad

funcional, el determinante clave de la función de una proteína. Entre las principales técnicas para averiguar la estructura

tridimensional de una proteína, cuentan la cristalografía de rayos X y la NMR (espectroscopía de resonancia magnética

nuclear).

Se pueden usar varios métodos diferentes para determinar la secuencia específica de aminoácidos de una proteína: métodos

de secuenciación proteica. Uno de estos métodos es la degradación de Edman. Permite obtener información valiosa sobre

la función de una proteína y su historia evolutiva.

La degradación de Edman etiqueta al residuo amino terminal de una proteína, y lo separa del péptido sin afectar a los

enlaces peptídicos entre el resto de los aminoácidos. El método va separando un residuo amino terminal tras otro, secuencialmente,

en varias ‘vueltas’.

1. El marcaje –etiquetado- del aminoácido N-terminal se realiza con fenilisotiocianato (PITC), en medio alcalino.

2. Realizado el marcaje, se realiza una hidrólisis entre el aminoácido N-terminal marcado y el adyacente –el siguiente

aminoácido en la secuencia-. La hidrólisis se realiza en medio ácido, y el resto del péptido queda intacto.

3. Una vez liberado el aminoácido N-terminal, se realiza su identificación por HPLC.

4. Se inicia una nueva vuelta, repitiéndose la totalidad del proceso.

Cuando el fenilisotiocianato reacciona con el grupo amino terminal no cargado del péptido, forma un derivado de

feniltiocarbanilo. Posteriormente, se libera este derivado cíclico del aminoácido terminal bajo condiciones ácidas suaves, lo que

deja un péptido intacto acortado en un aminoácido. El compuesto cíclico que se libera es un aminoácido de feniltiohidantoína

(PTH–aminoácido), que se puede identificar por procedimientos cromatográficos –por ejemplo, HPLC-.

124

No es posible secuenciar péptidos cuyo extremo N-terminal se encuentre bloqueado: grupo amino acetilado, formilado, etc.

Alrededor del 50% de las proteínas tienen el extremo amino bloqueado, bien por su naturaleza o por su preparación.

Otra limitación de la degradación de Edman es que el rendimiento no es del 100%, por lo tanto, cuando ya se llevan hechos

muchos ciclos (más de 50 aminoácidos analizados) se obtienen errores: secuenciación eficaz hasta 50 aa. De todas maneras, pese a

que Edman no sea 100% efectivo, facilita el análisis fragmentando a las proteínas en péptidos más pequeños.

Otro método empleado para marcar y separar el aminoácido N-terminal de una proteína es usar el reactivo cloruro de

dabsilo. La desventaja de la degradación mediante el cloruro de dabsilo es que no puede usarse repetidamente: la proteína se

hidroliza completamente, perdiéndose la secuencia de aminoácidos (no se pueden hacer varias vueltas, como con Edman).

125

Existen otros métodos de ruptura específica de enlaces peptídicos: por medios químicos o enzimáticos. El bromuro de

cianógeno (CNBr) corta la cadena polipeptídica por el lado carboxílico de los residuos de metionina. Con tripsina, una enzima

proteolítica del jugo pancreático, también se consigue una ruptura altamente específica: ruptura específica en arginina o lisina.

La digestión enzimática es importante porque no existen técnicas químicas confiables para el secuenciamiento de

aminoácidos que corran desde el extremo C-terminal. La degradación de Edman, por ejemplo, separa residuos N-terminales.

Pero, por otra parte, existen varias enzimas que rompen péptidos en el residuo C-terminal: se las denomina

carboxipeptidasas. Así, se hace posible separar residuos C-terminales.

La enzima carboxipeptidasa A es una de ellas. Hidroliza el último enlace peptídico: la ruptura es específicamente en el lado

amino del aminoácido C-terminal (salvo para arginina, lisina o prolina). El resultado: la reacción libera el aminoácido C-terminal.

126

Una técnica química confiable para la identificación de un residuo C-terminal es la hidrazinólisis. Un péptido es tratado con

la hidrazina (NH2-NH2) a alta temperatura (90ºC) por un largo período de tiempo (20-100 hr). Este tratamiento rompe todos los

enlaces peptídicos, produciendo derivados de hidrazina con todos los aminoácidos (aminoacil hidrazidos, o hidracidas)

excepto con el residuo C-terminal.

El residuo C-terminal se puede identificar cromatográficamente comparado con los estándares del aminoácido. Debido al alto

porcentaje de reacciones laterales inducidas por la hidrazina, esta técnica se utiliza solamente en los péptidos resistentes a la

carboxipeptidasa.

Existen otros métodos para hidrolizar un péptido en sus aminoácidos constituyentes: ej. Calentándolo en HCl a 110ºC, durante

24 horas. Luego, los diferentes aminoácidos de este hidrolizado peptídico se pueden separar e identificar por cromatografía de

intercambio iónico en una resina intercambiadora de cationes a base de poliestireno sulfonado (como la Dowex-50).

Con respecto a la detección y cuantificación de aminoácidos, es frecuente el uso de ninhidrina (hidrato de

tricetohidrindeno). La ninhidrina reacciona con los aminoácidos, provocando su desaminación oxidativa –ruptura del grupo

amino-: esto causa la degradación de cada aminoácido en amoníaco, anhídrido carbónico y un aldehído. La ninhidrina, por su parte,

queda reducida en forma de hidrindantina.

La hidrindantina reacciona, luego, con otra molécula de ninhidrina y con el amoníaco. El producto es un compuesto de

adición doble que presenta una coloración que varía de azul a violeta intenso, pasando por rojizo: el púrpura de Ruhemann. Si

el aminoácido es prolina, da en cambio una coloración amarillenta.

La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2-NH2)

también dan positivo al ensayo de la ninhidrina, aunque sin liberar CO2. En aquellos casos en los que da negativa la prueba de

Biuret, y positivo para ensayo de ninhidrina y presencia de CO2, no hay proteínas pero sí AAC libres.

127

La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar

concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su

presencia en cromatogramas.

La presencia de aldehídos resultantes de la degradación de los AAC

modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado: esto sirve para

identificar el tipo de aminoácido.

El púrpura de Ruhemann presenta su máxima absorbancia a 570 nm,

excepto para prolina, hidroxiprolina e histidina.

Vemos entonces que el ensayo de la ninhidrina es un método colorimétrico que sirve para detectar, identificar y cuantificar

–esto último mediante absorbancia a 570 nm- los aminoácidos. La formación de color se toma como resultado positivo e indica

presencia de aminoácidos; el no desarrollo de color es indicativo de que no están presentes (determinación cualitativa de

AACs). Bajo ciertas condiciones, la variación de color puede servir para identificar el tipo de aminoácido que está presente.

Algunos reactivos alternativos a la ninhidrina son la fluorescamina, el orto-ftalaldehído (OPA), etc. La fluorescamina

es un reactivo no fluorescente que también detecta y se une a aminas primarias, aminoácidos y proteínas, dando productos

altamente fluorescentes.

128

Algunos otros compuestos químicos que se usan para el marcaje colorimétrico y la detección de alfa aminoácidos:

Por último, aclarar que la mayor parte de estos métodos serán considerados posteriormente con mucho más detalle.

129

3. Investigación en proteínas. 3.2) Nociones de Inmunoquímica.

Los métodos inmunológicos van de la mano con la purificación de proteínas, su localización celular y su cuantificación. Son

métodos muy útiles debido a la exquisita especificidad de los anticuerpos por sus proteínas diana: los anticuerpos marcados

favorecen esta utilidad.

Anticuerpos contra proteínas específicas.

También conocidos como inmunoglobulinas (Ig), los anticuerpos son proteínas sintetizadas por un animal en respuesta a la

presencia de sustancias ajenas: antígenos (Ag). Los Ig tienen alta afinidad por Ag que provocan su síntesis. Un anticuerpo reconoce

y se une, específicamente, a una porción del antígeno: el epítopo o determinante antigénico.

Para obtener anticuerpos que reconozcan a una proteína determinada, suele inyectarse dicha proteína a un conejo a lo largo

de un intervalo de aproximadamente tres semanas. Esto estimula la reproducción de las células que producen anticuerpos que

reconocen a la sustancia extraña. Se extrae sangre del conejo inmunizado, y se la centrifuga para separar células sanguíneas del

suero –denominado antisuero-. El antisuero contiene anticuerpos contra todos los antígenos a los que ha estado expuesto el

conejo.

Anticuerpos policlonales.

Las células B producen anticuerpos policlonales: muchos anticuerpos distintos, pero secretados en contra de un mismo

antígeno. Cada anticuerpo policlonal es una mezcla heterogénea de inmunoglobulinas, cada una de éstas capaz de reconocer un

rasgo diferente de la superficie del mismo antígeno: reconocen diferentes epítopos del antígeno.

Métodos para preparar anticuerpos monoclonales.

Lo que intensificó la capacidad de los abordajes inmunológicos fue trabajar con células que produjeran un único anticuerpo, o

anticuerpo monoclonal: el problema es que éstas, aisladas, mueren rápidamente.

Existen líneas celulares inmortales, derivadas de un tipo de cáncer, el mieloma múltiple, que producen anticuerpos

monoclonales. Son poco útiles para inmunología.

Cesar Milstein y Georges Köhler, descubrieron que podían obtenerse grandes cantidades de anticuerpo homogéneo de casi

cualquier especificidad deseada, por medio de la fusión de una célula productora de anticuerpo de corta vida con una célula de

mieloma.

Se inyecta antígeno a ratón, se extrae el bazo, mezcla de células plasmáticas se fusionan in vitro con células de mieloma. Las

células hibridoma resultantes, producen indefinidamente un anticuerpo homogéneo. La fusión se realiza en polietilenglicol.

Verificación del grado de pureza de la Fracción Nuclear.

Se comprueba mediante tinción con, generalmente, agentes intercalantes: compuestos que se insertan entre las bases de

una molécula de DNA, interrumpiendo la alineación y el emparejamiento de las bases nitrogenadas de las cadenas complementarias.

Algunos ejemplos de AI que tiñen el DNA: colorantes de acridina, bromuro de etidio, SYBR Green, ioduro de propidio, DAPI.

130

El bromuro de etidio (BrEt) fluoresce al unirse al DNA. Cuando se expone esta sustancia a luz

ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de haberse

unido a una cadena de ADN.

Como la mayor parte de los compuestos fluorescentes, es una sustancia aromática.

La mayor parte de la molécula es una estructura tricíclica con dos grupos amino-benceno, uno a

cada lado del compuesto cíclico central.

Como el bromuro de etidio se intercala en el DNA, tiene un poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno o

teratógeno. También induce citotoxicidad. Actualmente existen otros compuestos que cumplen con la función del bromuro de etidio

pero que no tienen efecto mutagénico, como el SYBR Green.

El SYBR Green hace lo mismo que el bromuro de etidio, pero es menos tóxico y hasta 100 veces más sensible en técnicas

como la electroforesis. No es un agente intercalante, ya que no se inserta en el espacio entre dos pares de bases, sino que se asocia a

la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. El complejo resultante ADN-SYBR Green presenta el pico de

absorción en λ = 498 nm y el de emisión en λ = 522 nm (correspondiente a la zona verde del espectro, de ahí su nombre).

El DAPI (o 4',6-diamino-2-fenilindol) es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones del DNA

enriquecidas en adenina y timina. Es utilizado ampliamente en microscopía de fluorescencia. El compuesto es capaz de pasar a

través de las membranas celulares, por lo que se lo emplea para teñir células vivas tanto como células fijadas –pese a que la

eficiencia disminuye in vivo-.

Cuando el DAPI se une a DNA bicatenario, su máximo de absorbancia es a 358 nm (UV) y su

máximo de emisión es a 461 nm (azul). Por esto, en microscopía de fluorescencia, DAPI es

excitado con luz ultravioleta para después ser detectado a través de un filtro azul/cian.

El DAPI también puede unirse a RNA, y aunque su pico de emisión sea bastante amplio, no

es tan fluorescente: su emisión se desplaza hacia 500 nm cuando se une al RNA.

Otro uso del DAPI es para marcaje de cultivos celulares con la finalidad de detectar el DNA contaminado con micoplasmas o

virus: detecta micoplasmas y virus dentro de las células. Las partículas de micoplasmas o virus marcadas con DAPI son más fáciles

de detectar en un medio de cultivo.

La tinción de DNA mediante agentes intercalantes permite ubicar células por sus núcleos, estudiar la mitosis, el ciclo celular,

cariogramas, apoptosis…

Otra técnica para ubicar genes o secuencias particulares de DNA es la hibridación in situ con sondas fluorescentes

(FISH: Fluorescence In Situ Hybridization). Esta técnica prescinde de los agentes intercalantes: en su lugar emplea sondas

fluorescentes específicas para los genes o secuencias que se desea ubicar.

Pueden usarse sondas fluorescentes de DNA –o, raramente, de RNA- para detectar o cuantificar genes o secuencias

nucleotídicas específicas, y para localizarlas en cromosomas específicos o en núcleos en interfase. La sonda está marcada con un

fluoróforo: cumarina, fluoresceínas, rodaminas, cianinas, u otros compuestos no fluorescentes como la biotina o el hapteno (ej.:

131

digoxigenina, dinitrofenol) capaces a su vez de unirse posteriormente a una segunda molécula marcada con un fluoróforo, como la

avidina en el caso de la biotina, o a un anticuerpo específico, en el caso del hapteno.

Verificación del grado de pureza de otros componentes celulares.

Se puede verificar inmunoquímicamente el grado de pureza de las proteínas constituyentes del citoesqueleto: utilizando

anticuerpos específicos marcados con un fluoróforo, o empleando faloidina –también marcada con un fluoróforo- para

identificar microfilamentos de actina (la faloidina es una micotoxina producida por el hongo Amanita phalloides).

De la misma manera, puede verificarse el grado de pureza de los orgánulos: se pueden emplear colorantes específicos que se

unen a ellos, o anticuerpos dirigidos contra proteínas que se encuentran en determinados compartimientos celulares.

132

133

3. Investigación en proteínas. 3.3) Nociones de Electroforesis.

Con los métodos colorimétricos, que son cuantitativos, puedo determinar la cantidad total de proteínas que tengo.

La electroforesis, en cambio, es un método cualitativo: me permite separar, identificar y seleccionar un tipo particular de

molécula. La técnica se emplea sobre proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos…

El término electroforesis describe la migración de partículas ionizadas y con una carga eléctrica neta, bajo la influencia de un

campo eléctrico. Es decir: es una técnica que separa a las moléculas en base a su movilidad en un campo eléctrico, dependiendo

esta movilidad del tamaño y de la carga eléctrica de la molécula.

Muchas moléculas biológicas, como los aminoácidos, proteínas, nucleótidos o ácidos nucleicos, poseen grupos ionizables y,

por lo tanto, a un determinado valor de pH, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, ya sea

como cationes (+) o como aniones (–). Es decir: a cierto pH, toman determinada carga eléctrica.

Cuando se aplica un campo eléctrico, estas moléculas cargadas experimentan una fuerza de atracción hacia el cátodo (polo

negativo) o hacia el ánodo (polo positivo) dependiendo de la naturaleza de su carga neta. Así, si se deja transcurrir un cierto

tiempo, las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el cátodo y aquellas cargadas negativamente se desplazarán

hacia el ánodo.

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales:

a) Fricción: las moléculas sufren fricción con el solvente en el cual se encuentran disueltas. Esta fricción dificultará su

movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que

genera una fuerza que se opone al movimiento.

b) Difusión: tendencia de las moléculas a moverse en forma aleatoria –movimiento browniano- debido a que poseen

energía cinética propia. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura: a mayor temperatura, mayor

difusión.

La suma de estas tres fuerzas –atracción electrostática hacia el polo de carga opuesta, fricción, difusión- provoca que las

moléculas no migren de una manera homogénea, sino en función de su carga, tamaño y forma.

Para reducir el movimiento de las moléculas por efecto de la difusión –el movimiento browniano-, se emplea un medio que

oponga más resistencia a dicho movimiento: un medio que disminuya la energía cinética de las moléculas. Un medio de soporte

ideal para conseguir esto, es un gel. El gel consiste en un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de

agua y forma un tamiz molecular que dificulta el movimiento de los solutos.

Consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta. La presencia del gel tiene una consecuencia

adicional, ya que aquellas moléculas de mayor tamaño hallarán mayor resistencia al avanzar a través de los poros del gel que

aquellas moléculas pequeñas. Por lo tanto, la fricción que se observa durante el movimiento electroforético en un gel, depende de la

masa y la forma de la molécula, en adición a su carga eléctrica.

134

Cuando el uso de la técnica es el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos, utiliza como soporte un gel,

habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para

separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable

y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos.

La poliacrilamida es el medio de soporte más efectivo para la electroforesis de proteínas.

La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y bajas cantidades de bis-acrilamida

(N,N'-metilén-bis-acrilamida, un agente polimerizante), en una reacción iniciada por la base tetrametiletiléndiamina

(TEMED) y el persulfato de amonio (amoniopersulfato).

El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de

poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede

ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.

Según la concentración de los monómeros del gel –en este caso, concentración porcentual de

acrilamida-, los poros van a ser más grandes o más chicos:

Mayor concentración Menor poro.

El tamaño del poro del gel también depende del porcentaje de entrecruzamiento de la acrilamida. A mayor entrecruzamiento,

menor tamaño de poro.

El tamaño del poro se puede variar, entonces, cambiando las concentraciones tanto de acrilamida como de bisacrilamida.

Porcentajes bajos de acrilamida (3%) dan poros grandes y son útiles para la electroforesis de proteínas o ácidos nucleicos.

Porcentajes mayores se utilizan para SDS electroforesis, donde se necesita un menor tamaño de poro.

La separación de las moléculas dentro del gel está determinada por el tamaño relativo del poro. Sea como sea, así adquiere

relevancia el tamaño de las moléculas a correr en la malla del gel –en esta red tridimensional de fibras cruzadas-.

Las moléculas pequeñas y/o con mayores cargas negativas se moverán mejor –más rápidamente- hacia el ánodo. Al final

de la corrida electroforética, habrán avanzado más.

Las moléculas de mayor tamaño y/o cargas menos negativas, quedarán cerca del lugar de partida.

Las moléculas de carga nula, por otra parte, no sufren migración. El pH al cual un polianfólito tiene carga neta cero se le

denomina su Punto Isoeléctrico (PI).

Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis),

probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente SDS (sodio dodecil sulfato, o

duodecilsulfato de sodio, o dodecilsulfato sódico): modalidad SDS-PAGE. La modalidad SDS-PAGE se usa tanto para

analizar mezclas de proteínas, como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia.

En la modalidad SDS-PAGE, la separación de proteínas se realiza en un medio desnaturalizante. Usamos β-mercaptoetanol

(reduce el pH y reduce los puentes disulfuro) y el detergente aniónico SDS (rompe enlaces no covalentes, causando la pérdida de la

conformación nativa, y se liga y mantiene a las proteínas en este estado desnaturalizado con una serie de cargas negativas que

aporta) para mantener a las proteínas en su estado desnaturalizado.

135

La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g

SDS/g proteína. Los complejos proteína/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastón, donde la cadena proteica es distendida y

solubilizada por el detergente.

El detergente SDS incorpora cargas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína: todas las proteínas

acaban teniendo la misma carga, que está determinada exclusivamente por el SDS. Dado que la relación final carga/masa queda

constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente

con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa.

Se deduce de lo anterior que esta técnica permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína, comparando su movilidad

electroforética con la de proteínas de PM conocido. Estas determinaciones poseen un margen de error de ∼10%.

La determinación del PM de proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando se analizan cadenas proteicas individuales y

lineales, o aminoácidos, en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica

para su interacción con el SDS. Bajo estas condiciones, la migración de las moléculas obedece fundamentalmente a su PM.

Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol), los enlaces disulfuro intra- e

inter-catenarios son disociados, la estructura cuaternaria se pierde y los complejos supramoleculares se desarticulan –dejando

libres a las cadenas peptídicas individuales de las que estaban constituidos-. También se pierden la estructura terciaria y secundaria

de las proteínas.

La movilidad electroforética relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un gráfico con

estándares de PM conocido, se obtiene una línea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se

calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestión, entre la distancia recorrida por el colorante azul de

bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). Ejemplo:

Al graficar estos datos en papel semilogarítmico (x=Rf, y=Log PM) se observa la relación mencionada.

El PM estimado para la proteína incógnita es de 16.200 daltons, interpolando mediante una regresión lineal en los puntos

adecuados.

136

Antes de la siembra en el gel, las muestras deben ser hervidas 5 minutos en un buffer muestra que contiene los mismos

compuestos agregados al gel: beta mercaptoetanol y SDS. Esto genera y mantiene la desnaturalización de las proteínas.

Durante la corrida electroforética, deberá considerarse que si la proteína estaba compuesta por varias cadenas peptídicas,

estas se separan y el PM total se divide.

Si el complejo supramolecular estaba formado por dos cadenas proteicas idénticas, a éstas se les llama homodiméricas.

Obviamente, estas dos cadenas proteicas poseerán el mismo PM, y migrarán de idéntico modo.

Si las cadenas proteicas no son iguales, poseen diferente PM y migrarán de distinta manera: en la corrida electroforética en

SDS-PAGE se comportarán de diferente manera, aparecerán separadas, pese a que pertenecían al mismo complejo supramolecular.

El buffer muestra, además de β-met y SDS, también contiene:

a) Un indicador –en general, azul de bromofenol- que permite monitorear la corrida, y

b) sacarosa o glicerol, que le da la densidad necesaria al buffer, permitiendo que la muestra en el buffer de corrida

quede en el fondo de la calle de siembra del gel: la muestra queda depositada, sin dispersarse.

Luego de colocar el gel principal de poliacrilamida en el lugar que corresponde, se coloca encima un segundo gel, llamado

stacking o upper gel, que está formado con acrilamida al 4%. Su función será concentrar a las proteínas en bandas gruesas antes

de entrar al gel principal. Cuando conectamos la corriente, todas las especies iónicas comenzarán a migrar. Los complejos proteína-

SDS cargados negativamente se moverán hacia el ánodo. Las proteínas se separarán debido a las propiedades del gel principal:

cuanto más chica sea la proteína, más fácilmente pasará por los poros del gel.

El colorante, al ser la molécula más pequeña, es el que más fácilmente pasa por el poro del gel, e indica por lo tanto el frente

de corrida. Cuando llega al final del gel, se desconecta la corriente, se retira el gel, y se lo colorea con una solución de teñido:

usualmente Coomassie Blue. Luego del proceso de desteñido, sólo las proteínas quedan coloreadas y se vuelven visibles.

La SDS-PAGE también se usa como protocolo de purificación para determinar la pureza de una muestra. Una proteína pura

dará una única banda. Si la proteína tiene 2 subunidades diferentes, veremos 2 bandas que corresponden a cada una de ellas.

137

Geles en condiciones nativas.

La corrida electroforética puede realizarse en condiciones no desnaturalizantes, es decir, empleando un buffer sin SDS. Esto es

útil para el caso particular de evaluar enzimas en base a su actividad biológica: las enzimas son separadas según sus distintas

movilidades electroforéticas y, finalmente, se puede identificar a la enzima de interés incubando al gel con una solución del sustrato

de dicha enzima. De esta manera, aparecerá un producto coloreado en el sitio de la enzima.

Geles en gradiente de acrilamida.

Son geles en los que la concentración de poliacrilamida varía uniformemente desde el inicio del mismo (5% acrilamida)

hasta el final (25% acrilamida).

Este tipo de corrida tiene dos ventajas: nos permite separar un rango mayor de masas moleculares relativas de las proteínas y,

por otro lado, podremos resolver proteínas con pesos moleculares muy similares. Las proteínas más grandes no avanzan desde el

comienzo de la corrida, y el resto se va tamizando más específicamente.

Isoelectroenfoque.

Esta técnica separa proteínas de acuerdo a su PI (punto isoeléctrico). Recordemos que, en el PI, la proteína no se moverá si se

la somete a un campo eléctrico.

Si se coloca una mezcla de proteínas en un gradiente de pH, cada molécula se situará en aquel punto del gradiente en donde

el pH sea igual a su PI. El gradiente de pH es generado por una mezcla de polianfólitos que cuando son sometidos a un campo

eléctrico comienzan a migrar, y dada su propia capacidad de tamponación, se establece gradualmente este gradiente de pH.

138

Detección, estimación y recuperación de proteínas en los geles.

Análisis cualitativo.

Uno de los métodos de tinción de proteínas más comúnmente utilizados es el del indicador Coomassie Blue Brilliant R-

250 (CBB). La tinción se realiza utilizando una solución al 0.1% de CBB en metanol: agua: ácido acético glacial. La mezcla metanol-

ácido actúa como desnaturalizante, precipitando o fijando la proteína en el gel.

Otro método es el de tinción con plata. Los iones Ag+ se reducen sobre la proteína a Ag metálica, dando una banda gris en

el sitio. Esta técnica es 100 veces más sensible que la de CBB.

Análisis cuantitativo.

El análisis cuantitativo implica medir las cantidades relativas de las distintas proteínas que se encontraban presentes en una

muestra, utilizándose para ello un escáner densitométrico.

El fundamento de la técnica es el siguiente: el gel teñido se coloca dentro del aparato, se lo ilumina con luz láser, y se

determina la luz transmitida. Se realiza una representación gráfica de la absorbancia (áreas de picos de absorbancia) en función de

la distancia de migración. Para obtener los datos de cantidad de proteína se pueden calcular las áreas de cada pico.

Otro método, más barato, se realiza cortando las bandas proteicas teñidas del gel, eluyéndolas por agitación en una solución

de piridina (50%) durante 12 horas, y midiendo espectrofotométricamente la cantidad de color liberado.

Western blotting.

La técnica PAGE permite fraccionar o separar proteínas de una mezcla, facilitando su análisis posterior. Para ello se deben

transferir las proteínas separadas, desde el gel hacia un papel de nitrocelulosa. La transferencia se realiza por capilaridad o

aplicando electricidad.

Éste método se conoce como blotting de proteínas o western blotting, y al papel de nitrocelulosa con las proteínas

transferidas se le conoce como blot.

Luego de transferidas las proteínas, se incuba el blot con una solución proteica (seroalbúmina bovina 10% o leche

descremada 1%) para bloquear sitios de ligando hidrofóbicos que queden en el papel de nitrocelulosa.

Posteriormente, se incuba con una solución de anticuerpo (AC primario) dirigido contra la proteína de interés. Para

revelar la banda se utiliza un segundo anticuerpo (AC secundario) marcado con una enzima o isótopo radiactivo, que

permita la visualización en el blot de la proteína buscada.

139

Equipamiento necesario para realizar una electroforesis.

El equipamiento necesario consiste básicamente en:

1. Una fuente de poder.

2. Una unidad de electroforesis.

Las unidades de electroforesis están disponibles para correr geles de forma vertical u horizontal. El sistema vertical se utiliza

para separar proteínas en geles de poliacrilamida. El gel se forma entre dos placas de vidrio que están unidas con broches pero

están separadas por espaciadores de plástico. Las dimensiones de los geles son usualmente de 12 por 14 cm y de 1-2 mm de espesor.

En la parte superior del gel se coloca un peine de plástico que será removido luego de la polimerización, para dar un espacio

fijo para colocar o sembrar las muestras. Cuando se ensambla el aparato, el buffer en la parte inferior del aparato rodea a las placas

de vidrio. Este buffer es esencial para mantener un constante estado de ionización de las moléculas que serán separadas. Cualquier

variación en el pH alterará la carga total y por lo tanto la movilidad de las moléculas.

Cuando aplicamos una diferencia de potencial (voltaje), las moléculas con diferente carga eléctrica neta se separarán debido a

sus diferentes movidas electroforéticas. El campo eléctrico se desconecta antes que las moléculas de la muestra lleguen a los

electrodos, separándolas así correctamente.

Para revelar las muestras separadas, podemos utilizar una solución con colorante adecuado, o por autorradiografía, si la

muestra estaba marcada radiactivamente.

Otros soportes: papel y capa fina de celulosa o sílica.

Uno de los primeros soportes utilizados, en estos días se usan menos frecuentemente. Eran útiles para la separación y análisis

de moléculas pequeñas, como aminoácidos, péptidos o hidratos de carbono, pero ahora se prefiere separarlos por técnicas más

sensibles: ej. HPLC. Con este soporte, la separación de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos es muy pobre.

Otros soportes: geles de agarosa.

La agarosa es un polisacárido lineal (PM 12000) formado a partir de subunidades repetidas de agarobiosa, que comprende

unidades alternantes de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. Este polisacárido se utiliza en concentraciones del 1 al 3%.

Los geles se forman suspendiendo agarosa seca en un buffer acuoso que se calienta a ebullición hasta obtener una mezcla

transparente. Se deja luego solidificar hasta formar un gel rígido a temperatura ambiente. Las propiedades gelificantes se deben a la

formación de puentes hidrógeno tanto intra como intermoleculares entre las largas cadenas de agarosa. El tamaño de poro en el gel

se controla con la concentración inicial de agarosa: poros grandes se obtienen en bajas concentraciones y poros chicos de altas

concentraciones de polisacárido. Los geles de poros grandes son útiles para la separación de macromoléculas como proteínas y

ácidos nucleicos.

Los geles de agarosa se utilizan en técnicas inmunoquímicas como la inmunoelectroforesis o para separar DNA o RNA.

140

Compuestos empleados en la electroforesis.

141

ESTRUCTURA Y CATÁLISIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES CELULARES.

Esta sección comienza ilustrando la estructura y la función de la molécula de agua, porque sus propiedades afectan a la

estructura y a la función de todos los demás constituyentes celulares.

Luego, para cada clase de molécula orgánica:

1) Se explica la estructura covalente de sus subunidades monoméricas

–o de sus constituyentes más simples: caso lípidos-.

2) Se describen las estructuras de las macromoléculas y complejos supramoleculares derivados de ellas

–o las estructuras moleculares derivadas de la agregación de aquellos constituyentes más simples: caso lípidos-.

Las macromoléculas poliméricas de los sistemas vivos son entidades químicas muy ordenadas, con secuencias específicas de

subunidades monoméricas, lo que da lugar a estructuras y funciones concretas. En base a esto, pueden enunciarse tres principios

interrelacionados:

1) la estructura única de cada macromolécula determina su función,

2) las interacciones no covalentes juegan un papel crítico en la estructura y, por lo tanto, en la función de las

macromoléculas

3) las subunidades monoméricas de las macromoléculas poliméricas están dispuestas según secuencias específicas, lo que

representa una forma de información de la que depende el estado vivo ordenado

La relación entre estructura y función es especialmente evidente en las proteínas, que muestran una extraordinaria diversidad

de funciones. Pero del mismo modo se pueden entender las funciones especiales de los polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos:

como la consecuencia directa de su estructura química.

A medida que pasemos de unidades monoméricas a polímeros cada vez mayores, el énfasis se desplaza desde los enlaces

covalentes a las interacciones no covalentes. Los enlaces covalentes imponen restricciones sobre la forma adoptada por una

biomolécula, tanto a nivel monomérico como macromolecular. Las numerosas interacciones no covalentes, sin embargo, determinan

la conformación nativa estable de las moléculas grandes –las estabilizan- a la vez que permiten la flexibilidad necesaria para

su función biológica.

142

Como veremos, las interacciones no covalentes son esenciales para que las enzimas manifiesten su poder catalítico, para

la interacción específica de los pares de bases complementarios en ácidos nucleicos, y para el ordenamiento y las propiedades de los

lípidos en las membranas.

Con respecto al principio de que ‘las secuencias de unidades monoméricas son ricas en información’, resulta obvio en la

discusión sobre los ácidos nucleicos. Pero a) las proteínas y b) algunos oligosacáridos también son moléculas ricas en información:

a) La secuencia de aminoácidos es una forma de información que dirige el plegamiento de la proteína hacia su estructura

tridimensional única, determinando su función.

b) Algunos oligosacáridos también tienen estructuras tridimensionales únicas, producto de su secuencia específica de

subunidades monoméricas, que pueden ser reconocidas por otras macromoléculas.

En el último capítulo de la sección, se describe la manera en que los sistemas de señalización específicos regulan las

actividades de las biomoléculas dentro de una célula, dentro de un órgano y entre órganos, para mantener a un organismo en

homeostasis. Recordemos que:

143

1. El agua. 1.1) Interacciones débiles en los sistemas acuosos.

Los puentes de hidrógeno entre moléculas adyacentes de agua proporcionan fuerzas de cohesión interna

que determinan las propiedades de dicho líquido. Como resultado de estas interacciones débiles en los sistemas acuosos:

El agua es líquida a temperatura ambiente. El agua tiene un punto de fusión, un punto de ebullición y un calor de vaporización más elevados que

la mayoría de los disolventes comunes. Se ve favorecido el extremo ordenamiento de las moléculas, típico del agua cristalina (hielo). Las biomoléculas polares se disuelven fácilmente en agua, porque pueden reemplazar las interacciones

agua-agua por interacciones agua-soluto energéticamente más favorables. Por el contrario, las biomoléculas apolares interfieren con las interacciones agua-agua pero no son capaces

de formar interacciones agua-soluto. En consecuencia, las moléculas apolares son muy poco solubles en agua. En soluciones acuosas, las moléculas apolares tienden a agruparse entre sí.

Los puentes de hidrógeno, las interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas e interacciones de van der

Waals, son interacciones individualmente débiles; pero colectivamente tienen una influencia muy significativa sobre la estructura tridimensional de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos de membrana.

Las propiedades extraordinarias del agua son consecuencia de los enlaces de hidrógeno. En una molécula de agua, cada átomo de hidrógeno comparte un par electrónico con el átomo de oxígeno

central. El núcleo de oxígeno atrae electrones más fuertemente que el núcleo de cada hidrógeno, porque el oxígeno es más electronegativo. Por lo tanto, el H y el O comparten los electrones de forma desigual: los electrones se sitúan en los alrededores del átomo de oxígeno con mayor frecuencia. El resultado de esto es la formación de un dipolo eléctrico en la molécula del agua: cada hidrógeno es portador de una carga positiva parcial (∂+) y el átomo de oxígeno es portador de una carga negativa parcial igual a la suma de las dos cargas positivas parciales (2∂–).

Como resultado de lo anterior, existe una atracción electrostática entre el átomo de oxígeno de una

molécula de agua y el hidrógeno de otra. A esta atracción, que no se da necesariamente entre moléculas de agua, se le denomina puente de hidrógeno.

La energía de disociación de enlace (E.D.E., o energía requerida para romper un enlace) de un puente de

hidrógeno en el agua líquida, es de aproximadamente 23 kJ/mol. A su vez, el puente de hidrógeno tiene un 10% de carácter covalente y un 90% de carácter electrostático.

La E.D.E. de un enlace covalente O–H en el agua, es de 470 kJ/mol. La E.D.E. de un enlace covalente C–C, es de 348 kJ/mol.

144

A temperatura ambiente, la energía térmica de una solución acuosa es del mismo orden de magnitud que la necesaria para romper los puentes de hidrógeno. El tiempo de vida de cada puente de hidrógeno es de entre 1 y 20 picosegundos (1ps = 10^–12 s), y al romperse un puente de hidrógeno, se forma otro en algún lugar de la solución en el lapso de 0,1 ps.

Se ha aplicado el término flickering clusters (agrupamientos fluctuantes) a las agrupaciones de corta duración de moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno en fase líquida.

El ordenamiento casi tetraédrico de los orbitales alrededor de los átomos de oxígeno permite que, en el

agua líquida a temperatura ambiente, cada molécula de agua forme puentes de hidrógeno con un promedio de otras 3,4 moléculas.

Por el contrario, en el hielo, cada molécula está fija en el espacio y forma puentes de hidrógeno con otras 4 moléculas de agua, creando una red cristalina regular. Este retículo cristalino es menos denso que el agua líquida, y por eso flota en el agua líquida.

Dado que el ∆H –la variación de entalpía relacionada con la ruptura y formación de enlaces- es positivo para

la fusión y evaporización, es el aumento de la entropía (∆S) lo que provee el empujón energético e impulsa estas transformaciones: el ∆S hace que ∆G sea negativa. Vapor de agua más entrópico que el hielo.

El agua forma puentes de hidrógeno con los solutos polares. Los puentes de hidrógeno se forman fácilmente entre:

Un átomo electronegativo: normalmente oxígeno o nitrógeno con un par de electrones no

enlazantes aceptor de hidrógeno. Y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a otro átomo electronegativo dador de

hidrógeno. El enlace C–H es débilmente polar, debido a que el carbono es ligeramente más electronegativo que el

hidrógeno. El hidrógeno covalentemente unido al carbono no participa en la formación de puentes. Una molécula polar posee una separación de sus cargas eléctricas en diferentes regiones. Las biomoléculas polares se disuelven fácilmente en el agua. Esto ocurre debido al efecto estabilizador de

los puentes de hidrógeno que se forman entre los grupos polares (ej. grupos hidroxilo, oxígeno carbonílico) de dicha biomolécula y las moléculas polares de agua

Entonces Si una molécula puede formar puentes de hidrógeno con el agua, es soluble en agua. Este es el caso de los azúcares, alcoholes, aldehídos, cetonas y compuestos que contienen enlaces N–H.

Los puentes de hidrógeno alcanzan una fuerza máxima cuando el átomo de hidrógeno y los dos átomos que

lo comparten se encuentran en línea recta: átomo aceptor alineado con el átomo dador. Por esto se dice que los puentes de hidrógeno tienen un carácter altamente direccional.

Los puentes de hidrógeno son capaces de mantener un ordenamiento geométrico específico: le confieren estructuras tridimensionales muy precisas a las macromoléculas.

145

El agua interactúa electrostáticamente con los solutos cargados. El agua disuelve sales como el NaCl mediante la hidratación y estabilización de los iones Na+ y Cl-. La hidratación actúa debilitando las interacciones electrostáticas entre ellos y contrarrestando su tendencia

a asociarse en una red cristalina. La estabilización consiste en que estos iones son más estables asociados al agua que completamente

disasociados en la solución. Lo mismo ocurre con las biomoléculas cargadas: compuestos con grupos funcionales tales como los ácidos

carboxílicos ionizados (–COO-), las aminas protonadas (–NH3), los ésteres y anhídridos fosfóricos. El agua disuelve fácilmente este tipo de compuestos reemplazando puentes de hidrógeno soluto-soluto por otros puentes soluto-agua.

La entropía aumenta cuando se disuelve una sustancia cristalina. Este incremento de entropía que se

produce en el sistema es el principal responsable de la facilidad con la que se disuelven en agua las sales: la disolución tiene lugar con una variación favorable en la energía libre de Gibbs.

Los gases apolares se disuelven mal en agua. Los gases biológicamente importantes –como el CO2, el O2 y el N2- son apolares. La naturaleza apolar de

estos gases, y la disminución de entropía cuando se introducen en la disolución acuosa, hacen que sean muy poco solubles en agua.

Proteínas transportadoras hidrosolubles (hemoglobina, mioglobina) facilitan el transporte de O2. El CO2 forma ácido carbónico (H2CO3) en disolución acuosa, que es transportado en forma de ion

bicarbonato (HCO3-), ya sea en forma libre soluble en agua (aprox. 100g/L a 25ºC) o unido a hemoglobina.

Los compuestos apolares fuerzan cambios energéticamente desfavorables en la estructura del agua. La disolución en agua de compuestos hidrofóbicos, da lugar a un descenso significativo de la entropía. Es

decir: agregar un soluto apolar a un solvente polar causa una reducción de entropía en el sistema. ¿Por qué? En la vecindad del soluto apolar, las moléculas de agua están restringidas en sus orientaciones posibles:

forman una capa o jaula de moléculas ordenadas. Es este orden de las moléculas de agua lo que reduce la entropía del sistema.

Como consecuencia de esta variación desfavorable de la entropía, los grupos apolares se agrupan o

agregan: disminuyen así la superficie apolar que obliga al ordenamiento, y el sistema alcanza la máxima estabilidad termodinámica posible. Las fuerzas que mantienen unidas a estas regiones apolares son otro tipo de interacción débil: las interacciones hidrofóbicas.

Las interacciones hidrofóbicas no consisten en ninguna atracción intrínseca entre las partes apolares. Los

grupos apolares no se atraen, solamente se mantienen unidos para minimizar la capa ordenada de agua, estableciendo un estado de mayor entropía. Este fenómeno se da tanto en las moléculas completamente apolares como en los compuestos anfipáticos.

146

Los compuestos anfipáticos son moléculas que contienen regiones polares (o cargadas) y regiones apolares. Cuando se mezcla un compuesto anfipático con agua, la región polar hidrofílica interactúa favorablemente con el disolvente, pero la región apolar hidrofóbica tiende a evitar el contacto con el agua: el contacto provoca esta disminución en la entropía del sistema. Las moléculas anfipáticas en disolución ac. se organizan en micelas: agregados o agrupaciones que ‘secuestran’ a los grupos hidrofóbicos lejos del agua, minimizando aún más la capa ordenada de H2O y aumentando aún más la entropía. Sólo las partes más polares interactúan con el agua. Estos agregados o micelas pueden contener cientos o miles de moléculas.

Muchas moléculas son anfipáticas: proteínas, pigmentos, algunas vitaminas, esteroles y los fosfolípidos de las membranas. Las estructuras formadas por estas moléculas anfipáticas se estabilizan mediante interacciones hidrofóbicas entre las regiones apolares.

Las interacciones hidrofóbicas entre lípidos, y entre lípidos y proteínas, pueden

determinar estructuras como las de las membranas biológicas.

Las interacciones hidrofóbicas entre aminoácidos apolares, estabilizan las estructuras tridimensionales de las proteínas.

Los solutos polares también producen cierto ordenamiento de las moléculas de agua, pero el efecto es

mucho menos significativo que con los solutos apolares. La liberación de agua ordenada, a su vez, puede “empujar” termodinámicamente la formación de un

complejo enzima-sustrato. Es decir, que parte de la fuerza que impulsa la unión de un sustrato polar a la superficie polar complementaria de una enzima, es la variación favorable de entropía.

Cuando la enzima y el sustrato están separados, fuerzan a las moléculas circundantes de agua a formar una

capa ordenada. La unión de enzima y sustrato mediante interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno e interacciones iónicas, ‘secuestra’ o minimiza parte de las superficies que producen el ordenamiento de H2O: libera parte del agua ordenada, lo que genera un consecuente aumento en la entropía del sistema, empujando termodinámicamente la formación del complejo.

Interacciones de van der Waals. Las interacciones de van der Waals son atracciones interatómicas débiles. ¿En qué consisten? Cuando dos átomos no cargados se encuentran muy cerca, las nubes electrónicas que los rodean se

influyen. Variaciones al azar en las posiciones de los electrones alrededor de un núcleo pueden crear un dipolo eléctrico transitorio en un átomo, que induce un dipolo eléctrico transitorio opuesto en otro átomo cercano. Los dos dipolos se atraen débilmente, con lo que los núcleos se acercan más.

(La atracción de los núcleos no está esquematizada en la imagen).

Micela

147

A medida que los dos núcleos se acercan entre sí, sus nubes electrónicas empiezan a repelerse. En el punto determinado en que la atracción de van der Waals equilibra exactamente esta fuerza repulsiva, se dice que los núcleos se encuentran en contacto de van der Waals.

Además, cada átomo posee un radio de van der Waals, medida de lo que este átomo permitirá acercarse a

otro: los radios de van der Waals describen las dimensiones espaciales de los átomos. Cuando dos átomos se unen covalentemente, los radios atómicos en el punto de enlace son menores que

los radios de van der Waals, porque el par de electrones compartido acerca los dos átomos.

Las interacciones débiles son cruciales para la estructura y función de las macromoléculas. Las interacciones no covalentes que hemos descrito –puentes de hidrógeno, interacciones iónicas,

hidrofóbicas y de van der Waals- son débiles, pero el efecto acumulativo de muchas interacciones de este tipo puede ser muy significativo.

Las interacciones hidrofóbicas son sustancialmente reforzadas por un disolvente de polaridad elevada

(una disolución salina concentrada, por ejemplo). La fuerza de los puentes de hidrógeno depende del grado de alineamiento de los átomos unidos. La fuerza de las interacciones iónicas depende de la polaridad del disolvente. Estos enlaces débiles se forman y rompen continuamente. a) La formación contribuye a un descenso neto de la energía libre del sistema. b) La disociación de dos biomoléculas asociadas de forma no covalente mediante múltiples interacciones

débiles, requiere que todas estas interacciones se destruyan al mismo tiempo. Dado que las interacciones fluctúan al azar, tal destrucción simultánea es muy poco probable.

La estructura más estable (nativa) de la mayoría de las macromoléculas, es aquella en la que se maximizan

las posibilidades de uniones débiles. El plegamiento de una cadena polipeptídica o polinucleotídica en su forma tridimensional viene

determinado por este principio. La unión de antígenos a anticuerpos específicos depende de los efectos acumulativos de muchas

interacciones débiles. La energía liberada cuando una enzima y su sustrato se unen de manera no covalente, es la fuente

principal del poder catalítico de la enzima. La unión de una hormona o un neurotransmisor a su receptor celular proteico es el resultado de

interacciones débiles. Una consecuencia del gran tamaño de las enzimas y de los receptores es que sus grandes superficies

proporcionan muchas oportunidades para el establecimiento de interacciones débiles.

148

Los solutos afectan a las propiedades coligativas de las disoluciones acuosas. Existen cuatro (4) propiedades coligativas –ligadas-: presión de vapor, punto de ebullición, punto de fusión

y presión osmótica. Los solutos de cualquier naturaleza alteran las propiedades coligativas del agua disolvente al disminuir la

concentración efectiva de agua: la concentración de agua es menor en las disoluciones que en el agua pura. El efecto de la concentración de soluto sobre las propiedades coligativas del agua es independiente de las

propiedades químicas del soluto. Depende únicamente del número de partículas de soluto (moléculas, iones) en una determinada cantidad de agua.

Las moléculas de agua tienden a trasladarse de una región de elevada concentración de agua a una de

concentración inferior. Si dos disoluciones acuosas diferentes están separadas por una membrana semipermeable, las moléculas de agua que difunden de la región de alta concentración de agua hacia la región de menor concentración de agua producen presión osmótica (Π).

La presión osmótica es la fuerza necesaria para oponerse al movimiento del agua. Más específicamente,

puede definirse como la presión que se debe aplicar a una solución para detener el flujo neto de disolvente a través de una membrana semipermeable.

La osmolaridad de una disolución, por otra parte, es la cantidad de partículas de un soluto en la disolución.

Más específicamente, es el producto de la concentración molar del soluto y el factor de van’t Hoff (el grado de disociación de ese soluto en especies iónicas).

La osmosis puede definirse como el movimiento de agua a través de una membrana semipermeable,

impulsado por diferencias en la presión osmótica.

149

1. El agua. 1.2) Ionización del agua, de ácidos débiles y de bases débiles.

Como vimos, gran parte de las propiedades del agua como disolvente se puedan explicar en función de la

molécula de H2O sin carga. Pese a esto, también deben tomarse en cuenta: La débil tendencia del agua a ionizarse reversiblemente en iones hidrógeno (H+) y en iones hidroxilo (OH-), y La ionización de ácidos y bases débiles disueltos en agua,

El agua pura está ligeramente ionizada. Pese a esto, en disolución no existen los protones libres. Los

protones son inmediatamente hidratados a iones hidronio (H3O+). La hidratación de los protones disociados es virtualmente instantánea gracias a los puentes de hidrógeno entre las moléculas de agua.

Ningún protón individual se mueve muy lejos a través del volumen de la disolución, pero una serie de saltos

de protones entre moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno produce el movimiento neto de un protón a una gran distancia en un tiempo notablemente corto.

Como resultado de la elevada movilidad neta del H+, las reacciones ácido-base en disolución acuosa son, en

general, excepcionalmente rápidas. El salto de protones también desempeña un papel en las reacciones biológicas de transferencia de electrones.

150

Un salto de protones es una sucesión de liberaciones e hidrataciones, a corta distancia, de protones. El salto de protones ocurre a lo largo de una serie de moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno. El resultado del salto de protones: un protón posee un movimiento neto a gran velocidad y a una gran distancia.

El salto de protones explica la elevada movilidad iónica de los H+ comparada con otros cationes monovalentes como el Na+ o el K+.

El principio de ‘saltos de protones’ o ‘conducción del protón’ en el agua se conoce hace 200 años, y se le

denomina mecanismo Grotthuss. Está basado en la asunción de que no es un solo protón específico moviéndose de una molécula a otra, sino que el salto de un protón en la ruta de puentes de hidrógeno provoca el salto del siguiente protón de la ruta y, por ende, la escisión de un enlace covalente O-H por cada salto.

Es decir: un protón se acopla a una molécula de agua, y esto causa que otro protón deje dicha molécula y se

asocie a una segunda molécula de agua en algún otro lugar. Las moléculas de agua ‘danzan’ unas alrededor de otras hasta que consiguen un estatus energéticamente

favorable. Solo entonces un protón saltará a lo largo de la carretera de puentes de hidrógeno hacia otra molécula. Como resultado, hay una formación temporal de moléculas de agua protonadas –con tres protones-.

Cuantificación del grado de ionización. Es necesaria una manera de expresar el grado de ionización del agua (y otras sustancias) en términos

cuantitativos. El grado de ionización de cualquier sustancia está dado por su posición del equilibrio, denominada constante de equilibrio, Keq.

La posición del equilibrio o constante de equilibrio es un valor –en función de la concentración de reactivos (A y B) y de productos (C y D) en el equilibrio termodinámico- tal que, cuando los productos son iónicos, representa una medida del grado de ionización en el equilibrio.

La constante de equilibrio es fija y característica para cada reacción química a una temperatura dada. Define

la composición de la mezcla final en el equilibrio, independientemente de las cantidades iniciales de reactivos y productos.

De modo inverso, podemos calcular la constante de equilibrio de una reacción dada a una temperatura determinada si se conocen las concentraciones en el equilibrio de todos los reactivos y productos.

Sea como sea, la constante de equilibrio es una expresión de la tendencia de una reacción química a llegar a

su final. Cuando Keq posee un valor elevado, la reacción tiene lugar hasta que los reactivos se han convertido casi completamente en productos. Si los productos son iónicos, se puede decir que la sustancia posee un elevado grado de ionización en términos cuantitativos.

Recordemos la relación entre la energía libre de Gibbs y la constante de equilibrio: ∆G es una medida de la

distancia de un sistema a su posición de equilibrio. Cuando una reacción ha alcanzado el equilibrio, no persiste ninguna fuerza que la induzca a ir en una dirección u otra, y no puede realizar trabajo ∆G=0.

En base a lo anterior: Keq >> 1, la variación de la energía libre de Gibbs es grande y negativa. Reacción tiende a producirse. Keq << 1, la variación de la energía libre de Gibbs es grande y positiva. Reacción no tiende a producirse.

151

La ionización del agua se expresa mediante un Kw. El grado de ionización del agua en el equilibrio es pequeño (a 25ºC, sólo dos moléculas de cada 10^9 están

ionizadas en un momento dado). La Keq para la ionización reversible del agua es A 25ºC, la concentración del agua pura es de 55,5M. Si reemplazamos esta concentración por el

denominador de Keq, y despejamos, obtenemos la nueva expresión: (55,5M).(Keq) = [H+].[OH-] = Kw… en donde Kw es el denominado producto iónico del agua a 25ºC,

El valor de Keq, determinado experimentalmente mediante conductividad eléctrica, es Keq = 1,8x10^(–16) M.

En base al valor de Keq a 25ºC Kw= 1,0x10^(–14) M².

Por esto, el producto [H+].[OH-] en disoluciones acuosas a 25ºC es siempre 1x10^(–14) M². Cuando existen concentraciones exactamente iguales de H+ y OH-, tal como sucede en el agua pura, se dice que la solución está a pH neutro [H+] = [OH-] = 10^(–7) M.

Entonces, siempre que la concentración de H+ sea superior, la de OH- será inferior, y viceversa: el producto de

ambos factores debe resultar siempre en Kw. Además, podemos calcular cualquiera de los dos factores si conocemos el otro factor.

El producto iónico del agua, Kw, es la base teórica de la escala de pH. La escala de pH constituye una forma

conveniente de designar la concentración de iones hidronio –y, por consiguiente, de iones hidroxilo- en cualquier solución acuosa entre 1M de H+ y 1M de OH- pH= log (1/[H+])… en donde p denota “logaritmo negativo de”.

La escala de pH es logarítmica, no aritmética. Si el pH de dos soluciones difiere 1 unidad de pH significa que

una de ellas tiene una concentración de H+ diez veces superior a la de la otra. El pH se puede medir, aproximadamente, utilizando diversos colorantes indicadores: fenolftaleína, rojo fenol,

tornasol. Experimentan cambios de color cuando se disocia un protón de la molécula de colorante. Determinaciones más precisas del pH se hacen con un electrodo de vidrio selectivamente sensible a la

concentración de protones, pero insensible al Na+, K+ y otros cationes: un pHmetro o peachímetro.

Los ácidos y bases débiles tienen constantes de disociación características. Los ácidos clorhídrico (HCl), sulfúrico (H2SO4), carbónico (H2CO3), fosfórico (H3PO4), nítrico (HNO3) y el

grupo carboxilo de la glicina son ácidos fuertes: están completamente ionizados en soluciones acuosas (Keq elevadas). El NaOH y KOH son bases fuertes: también están completamente ionizados.

Mientras más fuerte un ácido o base mayor cantidad de reactivo se ioniza en productos. De mayor interés para la bioquímica es el comportamiento de los ácidos y bases débiles: aquellos que no

están completamente ionizados al disolverse en agua. Son frecuentes en los sistemas biológicos, y juegan papeles importantes en el metabolismo y su regulación.

Es importante recordar que: los ácidos son dadores de protones, las bases son aceptores de protones. Un

dador de H+ y su correspondiente aceptor conforman un par ácido-base conjugados. Cuanto más fuerte sea el ácido, mayor será su tendencia a perder su protón. La tendencia de cualquier ácido (HA) a perder un protón y

152

formar su base conjugada (A-) se define mediante una constante de equilibrio denominada constante de disociación Keq = Ka

El ácido acético (CH3COOH), un dador de protones, y el anión acetato (CH3COO–), el correspondiente

aceptor de protones, constituyen un par ácido-base conjugados. El ácido acético es un ácido relativamente débil Ka = 1,74 x 10^(–5) M. Otros ácidos relativamente débiles son el ión amonio (NH4+), el ión bicarbonato (HCO3-) producto del ácido

carbónico, el dihidrógeno fosfato (H2PO4-) y el monohidrógeno fosfato (HPO4 2-) productos ambos del ácido fosfórico, y el grupo amino de la glicina.

Los valores de pKa también son relevantes: el pKa es una expresión análoga a la del pH. pKa = log (1/Ka) = –log Ka… Cuanto más fuerte es el ácido, mayor es su Ka. Cuanto mayor es el Ka, menor es el pKa.

Las curvas de titulación proporcionan el pKa de los ácidos débiles. La titulación (o análisis volumétrico) se puede utilizar para determinar la cantidad de un ácido en una

solución dada. A la solución del ácido se añade una solución de una base fuerte, normalmente hidróxido sódico, de

concentración conocida. La base fuerte se añade en pequeñas porciones, hasta que se ha consumido (neutralizado) el ácido, según se determina mediante un colorante indicador o un peachímetro (pH=7, final de la titulación). En base a la concentración y al volumen de base fuerte añadida, se puede calcular la concentración de ácido en la solución original.

Una curva de titulación es una gráfica del pH (ordenadas) frente a la cantidad de base fuerte añadida

(abscisas). Esta cantidad de base fuerte añadida se expresa como la fracción –0.1, 0.2 … 0.9, 1.0- de la cantidad de base necesaria para neutralizar completamente al ácido (1.0= neutralización completa). La curva de titulación muestra el pKa del ácido.

153

¿Cómo se realiza la titulación? El pH de la mezcla se mide después de cada adición de base fuerte a la solución de ácido (se añade 1/10 de la cantidad de base fuerte necesaria para neutralizar la solución de ácido débil por cada adición).

Este valor de pH se representa frente a la fracción añadida de cantidad total de base fuerte requerida para convertir todo el ácido en su forma desprotonada. Los puntos obtenidos dan la curva de titulación. En el punto medio de la titulación (base 0.5) las concentraciones del dador de protones y del aceptor de protones son iguales (concentraciones iguales de ácido-base conjugada), y el pH es numéricamente igual al pKa del ácido.

De esto se puede deducir que el pKa de un ácido débil es el valor del pH de punto medio, en el cual la

concentración de dicho ácido es igual a la concentración de su base conjugada. La explicación y demostración matemática de esto están dadas por la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

El rasgo más importante de la curva de titulación de un ácido débil es que muestra la zona útil de capacidad tamponante: región de relación entre [ácido débil] y [base conjugada] en la que el pH varía mínimamente a causa de la adición de más base fuerte. Esta región útil de capacidad tamponante se encuentra, generalmente, entre el 10% (0.1) y el 90% (0.9) de la titulación del ácido débil. Además, la región útil de capacidad tamponante se extiende alrededor de 1 unidad de pH a cada lado del pH de punto medio (pKa) de la curva de titulación de un ácido débil.

El tamponamiento es el resultado de dos equilibrios de reacción reversibles que tienen lugar en una

disolución de concentraciones casi iguales de dador de protones y de su aceptor de protones conjugado. Siempre que se añade OH– o H+ a un tampón, el resultado es un pequeño cambio en el cociente de las concentraciones relativas del ácido débil y de su anión y, por lo tanto, un pequeño cambio de pH.

El pKa expresa la fuerza relativa de un ácido o base débiles, en escala logarítmica: Los ácidos más fuertes alcanzan la igualdad de concentración con su base conjugada a un pH más bajo

(pKa más bajo; región de tamponamiento más baja).

Las bases más fuertes alcanzan la igualdad de concentración con su ácido conjugado a un pH más alto (pKa más alto; región de tamponamiento más alta).

154

155

1. El agua. 1.3) Tamponamiento contra cambios de pH en los sistemas biológicos.

Casi todos los procesos biológicos son dependientes del pH: un pequeño cambio en el pH produce un gran

cambio en la velocidad del proceso. Esto es cierto también para aquellas reacciones en las que no existe un papel aparente para los iones H+.

Las enzimas que catalizan las reacciones celulares, y muchas moléculas sobre las que actúan, contienen

grupos ionizables con valores de pKa característicos. Ej. Los grupos amino y carboxilo protonados de los aminoácidos y el grupo fosfato de los nucleótidos,

funcionan como ácidos débiles: su estado iónico depende del pH del medio que los rodea. Y es importante recordar que las interacciones iónicas se cuentan entre las fuerzas que estabilizan una molécula proteica y permiten que una enzima reconozca y se fije a su sustrato.

Por esto, las células y organismos mantienen un pH citosólico específico y constante: mantiene a las

biomoléculas en su estado iónico óptimo, normalmente cerca de pH 7. En los organismos multicelulares, pH de los fluidos extracelulares estrechamente regulado.

El pH se mantiene constante gracias a los tampones biológicos: mezclas de ácidos débiles y sus bases

conjugadas. El tamponamiento biológico se ilustra mediante los sistemas tampón del fosfato y el carbonato en el hombre.

Los tampones son mezclas de ácidos débiles y sus bases conjugadas. Los tampones son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su pH cuando se añaden pequeñas

cantidades de ácido (H+) o base (OH-). Un sistema tampón consiste en una mezcla de igual concentración de un ácido débil (dador de protones) y

su base conjugada aceptor de protones). La región útil de capacidad tamponante (o margen de tamponamiento) es una zona relativamente plana

que se extiende alrededor de 1 unidad de pH a cada lado del pH de punto medio (pKa) de la curva de titulación de un ácido débil.

En esta región tamponante, existen aprox. las mismas concentraciones del par ácido débil-base conjugada, y una cantidad de H+ o OH- añadida al sistema tiene un efecto mucho menor sobre el pH que la misma cantidad añadida fuera del margen de tamponamiento.

Exactamente en el punto medio de la región tamponante (pKa) el poder tamponante del sistema es máximo: se produce el mínimo cambio de pH cuando se adiciona OH+ o H+. Este cambio de pH es muy pequeño si lo comparamos con el cambio de pH que se produciría si se añadiese la misma cantidad de OH- o H+ al agua pura o a una disolución de la sal de un ácido fuerte y una base fuerte, tal como NaCl, que no tiene capacidad tamponante.

Cada par conjugado ácido-base tiene una zona característica de pH en la que es un tampón eficaz. El par

dihidrógeno fosfato/monohidrógeno fosfato tiene un pKa= 6,86… sistema tampón eficiente entre aproximadamente pH 5,9 y pH 7,9.

El par ion amonio/amoníaco con un pKa=9,25… sistema tampón eficiente entre aprox. pH 8,3 y pH 10,3.

156

Los ácidos o bases débiles tamponan células y tejidos contra cambios de pH. Los fluidos intracelular y extracelular de los organismos poseen un pH característico y prácticamente

constante. Los sistemas tampón proporcionan la primera línea de defensa del organismo contra los cambios del pH interno.

Ej.: la cadena lateral de la histidina tiene un pKa= 6. Las proteínas que contienen residuos de histidina pueden tamponar aprox. entre pH 5 y pH 7.

Ej.: El ATP también posee grupos ionizables que pueden contribuir al poder tamponante del citoplasma. Algunos orgánulos altamente especializados y compartimientos extracelulares contienen elevadas

concentraciones de compuestos que contribuyen a la capacidad tamponante: los ácidos orgánicos tamponan las vacuolas de las células vegetales; el amoníaco tampona la orina.

Dos tampones biológicos especialmente importantes, que mantienen el pH fisiológico, son:

Sistema tampón del fosfato Sistema tampón del bicarbonato

El sistema tampón del fosfato presenta su efectividad máxima a un pH próximo a su pKa de 6,86. Tiende a

resistir cambios de pH en el intervalo entre 5,9 y 7,9: tampón efectivo en los fluidos biológicos (en mamíferos, por ejemplo, pH de fluidos extracelulares y mayoría de compartimientos citoplasmáticos en el intervalo de 6,9 y 7,4.

El plasma sanguíneo (pH 7,4) está tamponado en parte por el sistema del bicarbonato: ácido carbónico

como dador de protones, ión bicarbonato como aceptor de protones. La actividad catalítica de las enzimas es especialmente sensible a los cambios de pH. Las enzimas tienen un

máximo de actividad catalítica a un pH característico: pH óptimo. A ambos lados del pH óptimo, la actividad catalítica desciende a menudo de forma abrupta: se producen grandes diferencias en la velocidad de las reacciones cruciales catalizadas enzimáticamente.

157

1. El agua. 1.4) El agua como reactivo.

El agua no es sólo un disolvente: puede participar directamente en las reacciones químicas de las células

vivas. Estas reacciones son de dos tipos:

Reacción de hidrólisis: una molécula de agua se divide y sus átomos pasan a formar parte de otra especie química. La hidrólisis de una molécula orgánica causa la ruptura de un enlace covalente para formar dos moléculas orgánicas con grupos funcionales que incluyen los átomos del agua (se adicionan los elementos del agua).

Reacción de condensación: es la reacción inversa a la hidrólisis. Dos moléculas orgánicas –o partes de una misma molécula, en el caso que la condensación sea intramolecular- se combinan mediante un enlace covalente, eliminando los elementos del agua en dicha posición, acompañando la reacción con formación de agua (se eliminan los elementos del agua).

Las reacciones de hidrólisis, catalizadas por enzimas denominadas hidrolasas, son casi siempre exergónicas.

La formación de polímeros celulares a partir de sus subunidades es mediante reacciones de condensación: endergónicas. Las células salvan este obstáculo termodinámico mediante el acoplamiento de reacciones endergónicas de condensación con procesos exergónicos como la ruptura del enlace anhídrido del ATP.

158

El “agua metabólica”, formada a partir de alimento y grasas almacenadas, es suficiente para permitir que algunos animales que viven en hábitats muy secos sobrevivan sin beber agua durante largos períodos de tiempo.

Además, el agua interviene en procesos bioquímicos mediante reacciones de oxidación-reducción: En la formación de HCO3– a partir de CO2 y H2O, reacción catalizada por la enzima carbónico anhidrasa, el

agua no es tan solo un sustrato. El agua actúa en un proceso de transferencia de protones, formando una red de moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno a través de las que se produce un salto de protones.

Las plantas y algas verdes utilizan la energía de la luz solar para romper el agua en el proceso de la

fotosíntesis. En esta reacción, un aceptor de electrones –que varía según el tipo de organismo fotosintético- reacciona con el agua, que actúa como dador de electrones.

El alto calor específico del agua, además, es útil para las células y organismos porque permite que el agua

actúe como un “tampón térmico”, permitiendo que la temperatura de un organismo permanezca relativamente constante cuando varía la temperatura del aire o se genera calor como subproducto del metabolismo.

El alto grado de cohesión interna del agua líquida, debido a los puentes de hidrógeno, es aprovechado por

las plantas como medio para transportar nutrientes disueltos desde las raíces a las hojas durante el proceso de la transpiración.

Muchas de las propiedades físicas y biológicas de las macromoléculas celulares, especialmente de las

proteínas y los ácidos nucleicos, provienen de sus interacciones con moléculas de agua del medio circundante.