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FACULTAD DE MEDICINA Grupo Inmunovirología

Universidad de Antioquia: Carrera 51D No. 62 – 29

Conmutador: 2196000 – Fax:2630253 Nit: 890980040-8 Apartado: 1226 Correo electrónico: [email protected] http://medicina.udea.edu.co. Medellín, Colombia

Correo del grupo: [email protected] Teléfono: 219 64 82 Ubicación: Calle 62 #52-59, torre 2, piso 5, lab. 532

Informe final

Proyecto "Cuantificación de la actividad antiviral in vitro de compuestos

naturales sobre el SARS-COV-2"

Fecha de presentación: 21 de agosto del 2020

1. ANTECEDENTES

La empresa PIDEKA SAS envió 2 compuestos al laboratorio del Grupo

Inmunovirología de la Universidad de Antioquia, denominados: EX001-27M20 y

EX002-27M20 (Fotografia 1). Los compuestos fueron usados para determinar el

potencial antiviral contra el Virus SARS-CoV-2, aislado en la Universidad de

Antioquia.

2. METODOLOGÍA.

Materiales y reactivos

Se analizó la actividad antiviral de los compuestos enviados y se utilizó el virus

SARS-COV-2 aislado en el Grupo Inmunovirología de la UdeA en la línea celular

VERO E6. Las células VERO E6 se mantuvieron en medio de cultivo DMEM,

suplementado con SFB (Suero fetal bovino) al 5%, en una atmósfera de CO2 al 5%

y a una temperatura de 37ºC. El título del virus SARS-COV-2 aislado en el

laboratorio se determinó mediante la técnica de plaqueo y TCID50 (del inglés,

Tissue Culture Infectious Doses 50) en células VERO E6, siguiendo un protocolo

descrito previamente en la literatura (1) *. El título obtenido fue de 4.2x106 UFP

(unidades formadoras de placa) /mL.

*1. Fan H.H., et al., Repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019 in a

2019-novel coronavirus (2019-nCoV) related coronavirus model. Chin. Med. J. 2020;6. doi:

10.1097/CM9.0000000000000797.

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Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad (CTX) se determinó mediante el ensayo de MTT, el cual se basa en

la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol

realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto de

color azul (formazán), permitiendo determinar la funcionalidad mitocondrial de las

células tratadas. Este método ha sido ampliamente usado para medir la

supervivencia, la proliferación celular y actividad antiviral; de esta manera, la

cantidad de formazán es directamente proporcional a la viabilidad celular (2).

Inicialmente, las células se sembraron a una densidad de 1x105 células/pozo en una

placa de 96 pozos en 200 µL de DMEM con 10% de FBS y se cultivaron durante 24

horas a 37°C con 5% de CO2. Luego, las células se trataron con diferentes

concentraciones del compuesto por triplicado. Cuarenta y ocho horas después del

tratamiento, se retiró el sobrenadante y se adicionó la solución de MTT (0.5 mg/mL).

Después de 2h de incubación se adicionaron 130 µL/pozo de DMSO. Las placas se

dejaron en agitación durante 15 minutos y finalmente se leyeron en un

espectrofotómetro a 550nm. Se incluyeron además controles sin tratamiento, en los

cuales la viabilidad celular se asumió como del 100%. Cada condición experimental

se evaluó por triplicado en 2 experimentos independientes (n=6). Para los ensayos

antivirales se evaluaron las concentraciones de los compuestos que mostraron

menos del 20% de citotoxicidad.

2. Shen L., et al. High-throughput screening and identification of potent broad-spectrum inhibitors of

coronaviruses. J. Virol. 2019;93(12).







Ensayo de Actividad antiviral

Las células VERO E6 fueron sembradas en platos de 96 pozos, a una densidad de

1x105 células/pozo en 100uL/pozo de DMEM, 2% de SFB, 5% de CO2 y 37ºC, 24h

antes de ser usadas en este experimento. El día del ensayo, diluciones no

citotóxicas de cada compuesto fueron adicionadas a las células VERO E6, en

réplicas de 3 pozos, por 1 hora. Luego de este tiempo, el compuesto fue retirado y

las células fueron infectadas con el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1 por 1h.

Después de este tiempo, el remanente de virus que no logró ingresar a las células

fue retirado y reemplazado por medio de cultivo fresco y nuevas diluciones de cada

compuesto. Las células fueron cultivadas por 48h, al cabo de este tiempo, un

ensayo de MTT, descrito arriba, fue realizado para determinar la actividad antiviral.

Para este experimento se realizaron los siguientes controles: controles negativos

(células+DMEM) y controles positivos (células+DMEM+virus).

Para calcular la actividad antiviral se utilizó la siguiente fórmula:

% AAV= 100 x [(A-B) / (C-B)]

Donde A corresponde a la DO de las células infectadas y tratadas con el compuesto,

B a la DO de células infectadas sin tratamiento con los compuestos (control positivo

de infección) y C a la DO de células no infectadas (control negativo de infección).

Adicionalmente, la dilución más alta en la que se observó actividad antiviral

comparando células infectadas y tratadas con el compuesto vs células infectadas

sin tratamiento con los compuestos, y en la cual la citotoxicidad del desinfectante

fuera menor al 20%, fueron usadas para determinar el título del virus en un ensayo

de plaqueo.







El ensayo de plaqueo, es una técnica considerada como gold standard para

determinar el título viral; por lo tanto, es la técnica de elección para determinar de

manera eficiente la reducción en el título viral y por tanto la actividad antiviral en

este tipo de experimentos.

Finalmente, los análisis estadísticos para todos los ensayos muestran la media con

la respectiva desviación estándar en cada dilución. Se realizaron pruebas

estadísticas paramétricas o no paramétricas, para encontrar diferencias entre las

condiciones de cada experimento. Un valor de p<0.05 fue considerado

estadísticamente significativo.

3. RESULTADOS

Los compuestos enviados al laboratorio del Grupo Inmunovirología presentaron una

consistencia difícil de homogenizar y mezclar con el medio acuoso; sin embargo, se

utilizaron todas las medidas y protocolos necesarios para asegurar la menor

variabilidad posible durante el procesamiento de los compuestos.

El estudio comenzó con la evaluación de la citotoxicidad de los compuestos,

haciendo diluciones en base 2, como lo sugirió el solicitante; sin embargo, los

compuestos fueron demasiado citotóxicos, mostrando valores superiores al 80% de

citotoxicidad. Por lo tanto, se procedió a realizar los ensayos de citotoxicidad con

dilución en base 10; los resultados se muestran a continuación.

Respecto al ensayo de viabilidad celular con el compuesto EX001-27M20, en la

figura 1 se puede observar que las diluciones 10-1 y 10-2, resultaron altamente

citotóxicas, con una viabilidad celular media del 15% y 12%, respectivamente.

Mientras que las diluciones iguales o superiores a 10-3 mostraron una viabilidad

celular media del 100%; por lo tanto, esta y diluciones posteriores, fueron







seleccionadas para realizar los ensayos antivirales del compuesto EX001-27M20

(Figura 1).

El ensayo de viabilidad celular realizado con el compuesto EX002-27M20, mostró

que las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 fueron altamente citotóxicas con valores de

viabilidad celular media de 21%, 8% y 6%, respectivamente. Mientras que las

diluciones iguales o superiores a 10-4 alcanzaron niveles de viabilidad celular media

del 100%, lo que significa que dichas diluciones poseen muy baja o nula

citotoxicidad (Figura 1). Por lo tanto, las diluciones no citotóxicas que se pueden

evaluar para determinar la actividad antiviral del compuesto EX002-27M20, son las

diluciones iguales o superiores a 10-4.

Respecto al ensayo de actividad antiviral medido por MTT, usando el virus SARS-

CoV-2 con una MOI de 0.1, se puede observar en la figura 2 que el compuesto

EX001 en la dilución 10-3 alcanzó una actividad antiviral media de 10,7%, las demás

diluciones mostraron poca o nula actividad antiviral; además se observó una

diferencia estadísticamente significativa entre estas diluciones y el control positivo

de inhibición de la replicación viral usado en este experimento, la Cloroquina, la cual

mostró una inhibición media del 73% (Figura 2).

A partir del sobrenadante de la dilución 10-3 del compuesto EX001, obtenido en el

ensayo de actividad antiviral, se determinó el título del virus por ensayo de plaqueo.

Se puede observar que el título viral en presencia del tratamiento con el compuesto

fue en promedio de 3,25x105 UFP/mL, mientras que, en el control de virus sin

tratamiento, el título viral fue en promedio de 4,25x105 UFP/mL, lo que significa una







inhibición del 25.3% de las partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2 por el

compuesto EX001 (Figura 3).

El ensayo de actividad antiviral medido por MTT del compuesto EX002 mostró que

la dilución 10-4 alcanzó una actividad antiviral, con una media del 32,2%, las demás

diluciones del compuesto EX002 no mostraron actividad antiviral significativa; se

observó diferencia estadísticamente significativa entre estas diluciones y el control

positivo de inhibición, la Cloroquina, la cual mostró una inhibición media del 73%

(Figura 4).

A partir del sobrenadante de la dilución 10-4 obtenido en el ensayo de actividad

antiviral, se determinó el título del virus por ensayo de plaqueo. Se puede observar

que el título viral en presencia del compuesto EX002 fue en promedio de 2,25x105

UFP/mL, mientras que, en el control de virus sin tratamiento, el título viral fue en

promedio de 6x105 UFP/mL, lo que significa una inhibición del 62,5% de las

partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2 (Figura 5).

4. CONCLUSION

Podemos concluir que los compuestos EX001 inhibe el 32,2% de las partículas

virales infecciosas de SARS-CoV-2; mientras que el EX002, inhibe el 62,5% de las

partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2.







Fotografía 1.

Compuestos enviados al laboratorio del Grupo Inmunovirología de la Universidad

de Antioquia.







Figura 1.

Ensayo de viabilidad celular medido por MTT, en el que se muestra el porcentaje de

células vivas, después del tratamiento con las diferentes concentraciones de los

compuestos y posterior a 48h de cultivo celular. La gráfica muestra la media de cada

medición y la desviación estándar. Se realizaron 2 experimentos con 4 réplicas cada

uno.

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

0

25

50

75

100

125

Dilución de los compuestos

% d

e v

iab

ilid

ad

celu

lar

Citotoxicidad de los compuestos en células VERO E6

Ext001

Ext002







10-3

10-4

10-5

10-6

CLQ

-20

0

20

40

60

80

100

% A

cti

vid

ad

An

tiv

iral

Actividad antiviral del compuesto Ex001 durante

la infección con el virus SARS-CoV-2

Diluciones del compuesto Ex001

Figura 2

Porcentaje de actividad antiviral calculada a partir del ensayo MTT de viabilidad

celular. La gráfica muestra el porcentaje de actividad antiviral del compuesto EX001

en las diferentes diluciones cuando se usó el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1.

La gráfica muestra la media de cada medición y la desviación estándar. Se

realizaron 2 experimentos con 4 réplicas cada uno. CLQ: Cloroquina, control positivo

de inhibición de la replicación viral.







Figura 3.

Ensayo de plaqueo en el cual se muestran las placas formadas por el SARS-CoV-

2 obtenido del sobrenadante del control de virus sin tratamiento y del tratamiento

con el compuesto EX001, del ensayo antiviral. Se observan las diluciones desde 10-

1 hasta 10-4. El resultado se expresa en unidades formadoras de placa (UFP)/mL.







10-4

10-5

10-6

10-7

CLQ

-20

0

20

40

60

80

100

% A

cti

vid

ad

An

tiv

iral

Actividad antiviral del compuesto Ex002 durante

la infección con el virus SARS-CoV-2

Diluciones del compuesto Ex002

Figura 4.

Porcentaje de actividad antiviral calculada a partir del ensayo MTT de viabilidad

celular. La gráfica muestra el porcentaje de AAV del compuesto EX002 en las

diferentes diluciones cuando se usó el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1. La

gráfica muestra la media de cada medición y la desviación estándar. Se realizaron

2 experimentos con 4 réplicas cada uno. CLQ: Cloroquina, control positivo de

inhibición de la replicación viral.







Figura 5.

Ensayo de plaqueo en el cual se muestran las placas formadas por el SARS-CoV-

2 obtenido del sobrenadante del control de virus sin tratamiento y del tratamiento

con el compuesto EX002, del ensayo antiviral. Se observan las condiciones sin diluir

y las diluciones desde 10-1 hasta 10-4. El resultado se expresa en unidades

formadoras de placa (UFP)/mL. CC: control de células sin infectar.







Informe elaborado y revisado por: Wildeman Zapata Builes. Investigador Asociado.

Informe revisado por: Juan Carlos Hernández López. Investigador Asociado.

Informe revisado por: María Teresa Rugeles López. Coordinadora del Grupo

Inmunovirología.

Datos de contacto: Grupo Inmunovirología. Universidad de Antioquia. Calle 62 # 52-

59, torre 2, laboratorio 532. Medellín. Colombia. Tel: 2196482. E-mail:

[email protected].




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