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NERVA-MECANISMO DE ADQUISICIÓN DE HIERRO MINERAL

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NERVA-MECANISMO

DE ADQUISICIÓN DE HIERRO MINERAL

1. NERVA-MECANISMO DE ADQUISICIÓN DE HIERRO MINERAL

1.1. Niveles de Hierro en el Cuerpo Humano

1.2. El Hierro en la Sangre

2. ASIMILACIÓN DE HIERRO MINERAL POR EL TORRENTE SANGUINEO

2.1. Hipótesis

2.2. Información

2.2.1. Introducción

2.2.2. Sistemas de los organismos superiores para limitar la concentración de

hierro libre

2.2.2.1. Las transferrinas

2.2.2.2. La ferritina

2.2.2.3. El grupo hemo

2.2.3. Mecanismos bacterianos de captación de hierro

2.2.3.1. Captación directa a de hierro

3. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

3.1. Determinación del contenido de hierro en el polvo de pirita

3.2. Determinación de ferritina, transferrina y hierro en muestras sanguíneas

3.2.1. Método turbidimétrico para la determinación de ferritina

3.2.2. Test inmunoturbidimétrico en suero

3.2.3. Prueba fotométrica colorimétrica para el hierro con factor aclarante de

lípidos (LCF)


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1. NERVA-MECANISMO DE ADQUISICIÓN DE HIERRO MINERAL

La Neisseria meningitidis, es una β proteobacteria, que causa meningitis bacteriana, una

infección del líquido cerebroespinal y las membranas de la médula espinal, con una alta

movilidad y transmisión y virulencia difícil de predecir, y por tanto de prevenir.

La práctica médica habitual asocia la transmisión de la enfermedad a contactos

personales en el espacio de un metro de la garganta del portador donde el microorganismo es

viable o activo. Sin embargo, la dificultad encontrada en limitar su contagio aplicando rutinas

de tratamiento al entorno cercano al afectado, y la diseminación espacial del microorganismo

y la enfermedad en los sujetos y en el ámbito geográfico, nos hacen cuestionar esta hipótesis

en busca de soluciones al problema de la transmisión de la enfermedad.

Efectivamente, la distribución en la tierra de la meningitis alcanza a todos los ámbitos

del planeta, algunas epidemias como la del África Subsahariana de una lado a otro del

continente, hacen difícil de creer en un único mecanismo de transmisión “persona a persona”.

Las epidemias de meningitis ocurren en zonas ambientalmente especiales, Molesworth et al

presentan evidencia de que la relación entre el medio ambiente y la localización de las

epidemias es cuantificable y proponer un modelo de predicción de áreas de riesgo para

epidemias de meningitis basado en variables ambientales (0).

En 1987 Caugant et al (1) demuestran la expansión intercontinental de Neisseria

Meningitidis (clones del complejo ET-S) en los brotes de la enfermedad de meningitis de

aquella temperada en Europa, Sudáfrica, Latinoamérica y EE.UU. Se describen brotes en el

Ártico (2) y en lugares tan aislados que obligan a plantear diversos medios de transmisión

para alcanzar tan diferentes localizaciones.

Pero es que en el mismo sujeto, se refieren las típicas invasiones de Neisseria

Meningitidis en el tramo intranasal (3) (4) y (5), y en todas las demás aberturas del cuerpo

humano…, oídos (6), vagina y ano (7), lo que sugiere una movilidad más allá de la referida

comúnmente.

La clasificación de seguridad del Center of Diseases Control de los Estados Unidos,

(CDC), para los trabajadores de laboratorio de análisis microbiológicos, establece un Nivel 2

para su correcto manejo, correspondiente a la alta virulencia de la Neisseria meningitidis, y a

su limitada movilidad, limitada, pero no nula movilidad (8).


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Relacionados con la movilidad de la Neisseria meningitidis están los crecientes

problemas en la aviación civil transoceánica, vuelos de larga duración (9) y de los sistemas de

ventilación forzada y el polvo que generan (10). Esto lleva a estudiar la dispersión de la

bacteria en aerosoles (10) con todo tipo de otras especies microbiológicas, ligadas a partículas

de polvo de toda clase. El papel del polvo en la aparición de brotes epidémicos en el África

Subsahariana es especialmente interesante debido a la relación del aumento del mismo en las

sequías de los años 70 y 80 (del pasado siglo XX) y los brotes de la epidemia (0).

Griffis (11) estudia en un modelo epidemiológico “la lenta, silenciosa, fecal-oral,

transmisión de la meningitis…”, para concluir que la transmisión por aerosol del

meningococo determina la magnitud de una epidemia…

Neisseria meningitidis y gonorrhoeae han desarrollado un mecanismo perfectamente

adaptado a su vida dentro del organismo humano. Ambas especies pueden colonizar a su

huésped, sus mucosas, sin generar ninguna manifestación clínica detectable, convirtiéndose en

portadores, y permaneciendo así dentro de la población. Cuando se desarrolla la infección

pueden sobrevivir a las respuestas inflamatorias del anfitrión (12).

A los estudios citados se le suman los que demuestran que el número de portadores de la

bacteria que no han desarrollado la enfermedad, no tiene relación estadística alguna con el

número de afectados y la morbilidad en los brotes de la enfermedad (13). Can et al. (14)

“muestran en el análisis de un brote en una escuela primaria en Londres que una prolongada

secuencia de casos de infección meningocócica puede ocurrir con una tasas bajas de

transmisión y de portadores, en una población sin pérdida desproporcionada de inmunidad

específica” (cita textual traducida), sugiriendo un episodio de colonización prolongada, con

una transmisión infrecuente del organismo niño a niño en la escuela. Todavía más complicado

de resolver, y sorprendente, es la verificación realizada por Kyungcheol Ti et al. (15) de que

la reducción de la flora normal de la cavidad nasofaríngea por el tratamiento con antibióticos

no afecta a la colonización de la misma por la Neisseria meningitidis.

En los brotes de meningitis relacionados en el norte de Grecia a principios del siglo

XXI, (16) se observa que el número de portadores en la población autóctona es grande, que la

relación de los mismos no aumenta debido a los fuertes flujos migratorios de los países

vecinos, y que no hay entre ellos crecimiento de portadores de las cepas responsables del

incremento de los afectados en la zona por la enfermedad.

Todo este conocimiento nos obliga a estudiar otras vías de transmisión de la

enfermedad, además de las ya citadas de persona a persona.


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Para ello lo primero que hacemos es estudiar las características de estos

microorganismos, su microbiología, bioquímica, sus nichos ecológicos, en definitiva su modo

de vida para así CONOCERLOS, de acuerdo a la descripción de Microbiology, Prescott,

Harley, Klein (17).

De acuerdo a la descripción de Microbiology Prescott, Harley, Klein, (17) las Beta

Proteobacteria:

1. Se solapan metabólicamente con las α-proteobacteria, pero suelen usar sustancias que

provienen de la descomposición de materia orgánica en zonas anaerobias.

2. Considerable diversidad metabólica, dependiendo de los diferentes órdenes a los que

pertenezcan los microorganismos.

3. Orden Neisseriales.

a. Los miembros de este orden son no móviles, aerobios, cocos gram-negativos,

que en general aparecen en parejas con las paredes adyacentes rebajadas.

b. Pueden tener cápsulas y pilosidades.

c. Son quimiorganotróficos, oxidasas positivos, y casi siempre catalasas

positivos.

La Neisseria gonorrheae, causa la sífilis y la Neisseria meningitidis es uno de los

agentes causantes de la meningitis.

Puede deducirse que las Neisserias se adhieren a superficies bien irrigadas de sangre y

húmedas, y en las mucosas que protegen los accesos exteriores al cuerpo humano, vagina,

nariz y faringe. Ya hemos visto que también entran por oído (6) y ano (7). Se describen

meningitis en primates, pero no en otras especies animales (18).

La respiración aerobia de la Neisseria, y su posibilidad de alimentarse con materia

orgánica en descomposición anaerobia nos lleva a estudiar sus mecanismos de respiración

ligados a los equilibrios óxido-reducción de diferentes especies químicas presentes en el

medio.

Aparecen desde hace tiempo estudios de aumento de afectados por meningitis ligados a

aumentos de cantidad de hierro en el medio, tanto debido a bacterias (19) como a hongos (20).

El equilibrio redox del Fe permite la “respiración” aerobia de las Neisserias en zonas

anaerobias o de poco oxígeno y así el desarrollo de la enfermedad ligado al metabolismo del

hierro.


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La descripción de la dependencia de la Neisseria Meningitidis respecto del hierro es

conocida desde hace años (21), (22), (23). A su vez también se describe profundamente el

aumento de la virulencia en diferentes cepas y una mayor capacidad de infección de las

mismas relacionado con mayores cantidades de hierro en el medio (22), (24), (25).

Por ello los huéspedes desarrollan un completo sistema de contención del hierro frente

a la invasión (18) microbiana, posicionando proteínas de una gran capacidad de enlace con el

metal, para secuestrarlos en sitios estratégicos para impedir dicha invasión:

a. Disminuyendo los niveles de hierro en los fluidos corporales (sangre), tejidos

enfermos y células invadidas.

b. Sintetizando inmunoglobulinas para conseguir la adquisición de antígenos de los

microbios.

Los mecanismos bioquímicos responsables de la adquisición de hierro y de la virulencia

y capacidad de infección están siendo descritos en trabajos recientes (26), (27) y (28).

Pero la especial virulencia de esta enfermedad, y la dificultad de desentrañar los

mecanismos de su transmisión están ligados a una microbiología absolutamente adaptada de

la Neisseria meningitidis, a la invasión de su huésped y a protegerse de su sistema inmunitario

(12).

Dos características diferenciales de la Neisseria meningitidis son claramente esenciales

para la invasión del huésped:

a. La composición del polisacárido capsular de la membrana que permite su

supervivencia en fluidos extracelulares y

b. Tipo IV Pili (TFP), que son estructuras multiméricas esenciales para la adhesión de

las bacterias capsuladas virulantes a las células del huésped (29) en un mecanismo

de modificaciones cito esqueléticas con formación de profusiones asociadas con la

entrada de la Neisseria meningitidis dentro de las células endoteliales (30), (31)

Esta capacidad de modificación superficial ofrece un mecanismo adaptativo formidable

para modular el tropismo de los tejidos, la superación de las respuestas inmunes del huésped,

y la supervivencia en un ambiente cambiante y hostil en la célula invadida (12) (31).


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Cada fibra de Pili se compone de una pequeña subunidad de proteína de pili (pil E) (32)

que es ensamblada dentro una estructura α helicoidal para formar el citado pili (33). Además

de los pilis se describen otros dispositivos que favorecen la adherencia de la Neisseria a las

células del anfitrión (12), (29).

Los mecanismos de reconocimiento de las células a invadir por los pilis están ligados a

una proteína de la membrana celular del huésped, la CD46, envuelta en la regulación de la

activación de su sistema complementario de defensa frente a infecciones. Es un paso crítico

en el establecimiento de la enfermedad en el huésped, promoviendo el paso a las meninges de

las bacterias invasoras (34).

Para estudiar la influencia del hierro en la meningitis, la Neisseria, la virulencia de las

cepas y la infección, seguiremos el siguiente esquema:

1. Química del hierro. Niveles del hierro en el cuerpo humano.

2. El hierro en la sangre

2.1. Desde el hierro libre al hierro ligado a proteínas de la sangre.

3. Adquisición de hierro en el huésped por Microorganismos.

3.1. Mecanismos de adquisición por Neisseria meningitidis

4. Relación de los niveles en Neisseria meningitidis, desarrollo de la enfermedad de

adquisición de hierro mineral (partículas de calcineros de pirita) en la sangre.

5. ¿Cómo resolver el puzzle de la interacción Neisseria meningitidis-células del huésped?

5.1. Interfase mineral/microorganismo.

5.2. La situación en Nerva

6. Propuesta del Nerva Mecanismo

7. Trabajo experimental. Confirmación del Nerva Mecanismo

7.1. Material y métodos

7.2. Resultados y discusión

7.3. Conclusiones

8. Transmisión de la enfermedad en Nerva

8.1. Ruta principal

8.2. Factores de riesgo directo relacionados con el hierro. Atmósfera, agua, suelo.

8.3. Factores de riesgo añadido. Afección al sistema respiratorio.


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9. Organismos causantes de meningitis.

9.1. Bacterias

9.1.1. Neisseria meningitidis. Principales serogrupos

9.2. Vírus

9.3. Otros

9.3.1. Meningitis amebiana. Neigleria fowleri.

10. Consecuencias. Propuestas de Actuación

10.1. Actuaciones Sanitarias

10.1.1. Nivel General

10.1.2. Actuaciones en Nerva

10.2. Actuaciones Ambientales

10.2.1. Nivel General

10.2.2. Actuaciones en Nerva

10.2.2.1. Comunidad Autónoma

10.2.2.2. Local

10.2.2.3. Familiar

10.2.2.4. Personal

10.3. Actuaciones de I+D y Universidad

10.3.1. Ingeniería de la Sanidad Ambiental.

1.1. NIVELES DE HIERRO EN EL CUERPO HUMANO

El hierro tiene dos formas oxidadas: Fe2+ y Fe3+, además de la capacidad de formar

compuestos complejos, en una configuración octahédrica, con 6 moléculas que actúan como

ligandos. Las proteínas de la sangre transferrín, ferritinas, etc, son estructuras de este tipo de

complejos de hierro.

Los cationes Fe2+ y Fe3+ precipitan como hidróxidos en medio básico, mientras a pH

ácidos estarían disueltos, Fe2+ y Fe3+ como hierro libre. La rápida oxidación de Fe2+ a Fe3+ en

ambientes aerobios, hace que su existencia sea mayor en ambientes reductores. Por otra parte

el Fe3+ tiene tendencia a precipitar como hidróxido en medios no ácidos.


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Estas dos consideraciones llevan a que en nuestro entorno cercano, aerobio y a pH

próximo a la neutralidad, el hierro aparece como Fe(OH)3 que al estar precipitado , no es de

fácil acceso para los organismos vivos que lo necesitan, aunque en pequeñas cantidades. Así

se han desarrollado microorganismos de todo tipo que consiguen la energía en los equilibrios

redox del hierro, y lo hacen biodisponible introduciéndolo en la materia viva.

El cuerpo humano contiene entre 3 y 5 gramos de hierro, (en las mujeres un poco menos

cantidad en general), y de estos, dos terceras partes en células rojas del sistema circulatorio,

como hemoglobina y un 15-25% se almacena como ferritina y homosiderina. El hierro

restante va en los músculos como mioglobina (8%) en los citocromos y en enzimas que lo

llevan como hierro complejado en su molécula.

El hierro presente en el transferrín de la sangre solo asciende a 3 mg, pero el

intercambio diario a su través es diez veces mayor. El papel del transferrín es fundamental en

la distribución del hierro en el organismo humano, por su capacidad de tomar/dejar hierro del

entorno (35).

1.2. EL HIERRO EN LA SANGRE

El equilibrio del hierro es tan sutil que su transporte en el cuerpo humano a través de la

sangre está totalmente regulado, para evitar mínimas cantidades de falta o exceso, ambas

situaciones con dramáticos efectos en el sujeto.

El control de los niveles de hierro en sangre se realiza por diferentes proteínas, que lo

complejan a partir del hierro libre, tanto para la realización de sus funciones celulares, como

para dificultar su acceso a potenciales microorganismos invasores.


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La entrada de hierro en las células, puede esquematizarse así (36):

PROTEINAS DE HIERRO EN LA SANGRE:

TRANSFERRIN: (o transferrina) (37)

El hígado segrega una proteína, la betaglobulina, apotransferrina, que tiene una elevada

afinidad por el Fe3+, con el que forma el hierro-transferrín, la transferrina.

Las transferrinas varían desde la serotransferrina, que se encuentra en el plasma

sanguíneo, la lactotransferrina, que se encuentra en la mayoría de los fluidos extracelulares,

como la leche, lágrimas, saliva, o fluidos gastrointestinales, a la ovatransferrina, presente en

huevos.

Las transferrinas llevan a cabo diferentes funciones, mientras la serotransferrina

transporta el hierro por la sangre, la ovotransferrina y la lactotransferrina son complejantes del

hierro, por lo que actúan como agentes antimicrobianos al disminuir su disponibilidad.

En la web TRANSFERRINS (38) se encuentra una descripción de las moléculas,

configuraciones, secuencias y diferentes tipos que aparecen en distintas especies vivas.

Fe

En la Dieta

En Sangre

TRANSFERRINA

FERRITINA

Otras FERROPROTEINAS (incluyendo Grupo

Hemo)

FUENTES POTENCIALES DE HIERRO PARA PATÓGENOS


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FERRITINA (37)

Se encarga del almacenamiento del hierro en el interior de las células, de manera que se

encuentre disponible cuando el metabolismo celular lo necesite. En su acopio evita la

posibilidad, ligada al Fe3+ en el medio, de formación de radicales libres en el medio.

Se han encontrado funciones de las ferritinas distintas de las conocidas de acumulación,

y así aparecen en organismos unicelulares, y en células pobres en hierro como las secretoras

de insulina. Posiblemente sean reguladoras de la síntesis de proteínas, y en insectos y

moluscos pueden funcionar como moléculas trasportadoras de hierro. También se ha descrito

su papel en la regulación de la proliferación celular (35).

EL GRUPO HEMO (36)

Las hemoproteínas portan la mayor cantidad de hierro en el organismo:

• Hemoglobina, la más importante, encargada del transporte del oxígeno, puede llegar a

tener hasta el 65% del hierro total del cuerpo humano.

• Los citocromos. Se encuentran en las mitocondrias y en el retículo endoplasmático,

participan en las reacciones redox, de transferencia de energía.

• Las catalasas y peroxidasas. Son las enzimas encargadas de la protección celular frente

a oxidantes enérgicos, como el peróxido de hidrógeno, formador de radicales libres,

tóxicos para la mayoría de las células.

MECANISMOS DE ADQUISIÓN/CESIÓN DE HIERRO POR TRANSFERRÍN

La capacidad demostrada del transferrín para adquirir/ceder hierro al medio, le confiere

un papel clave en la relación huésped-microorganismo invasor, tanto por la posibilidad de

retirarle el hierro, adquiriéndolo del medio conjuntamente con un anión de carbonato, a pH

neutro, y por su capacidad para cederlo al medio a pH ácido, y así hacerlo biodisponible al

invasor.

El transferrín humano (serum-transferrín) presenta una estructura con dos dominios

bilobulares, en una doble conformación abierta/cerrada (38). Los lóbulos están unidos por un

enlace peptídico, y se subdividen en dos dominios del mismo tamaño.


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El equilibrio de adquisición/cesión de hierro donde cada transferrín puede complejar

dos moléculas de Fe3+ puede esquematizarse así:

Apo-Trf (Apotransferrín) + Fe3+ ↔ Fe3+.Trf (Hierro.transferrín)

(Sin hierro) (Nolotransferrin)

Conformación abierta Conformación cerrada

La orientación de los lóbulos, dominios y los ejes de rotación son diferentes para

cada tipo de transferrín. En los tres tipos de transferrín la estructura se estabiliza por enlaces

disulfuro, de los que hasta ahora se dispone de información limitada, pero parecen ser

fundamentales en la estabilidad del complejo de hierro.

Para cargar el Fe3+ al apotransferrín se utiliza un quelato férrico, usualmente nitrilo

acetato férrico, NTA.Fe3+

Apo.Trf + NTA.Fe3+ ↔ Trf.Fe3+.NTA

que en presencia de exceso de bicarbonato, el NTA es reemplazado por CO3= , en un

equilibrio reversible, que facilita el paso de hierro del medio al trasferrín y viceversa.

Trf.Fe3+.NTA + CO3= ↔ Trf.Fe3+.CO3

= + NTA

Minzani et al (39) demuestra que la estructura conformacional abierta del

apotransferrín y un intermedio de hierro-absorbido son similares, y casi indistinguibles.

Después de la entrada del CO3=, aparece un estado intermedio inestable, abierto,

Trf.Fe3+CO3=, para acabar cerrándose a una estructura estable Trf.Fe3+CO3

=. Hirose (38)

concluye que es el intermedio con el hierro absorbido el paso central que permite el equilibrio

de entrada/salida del metal a la proteína.

Baker et al. (40) concluye que existe una serie de ligandos muy favorables para

complejar Fe3+ con la inclusión de un anión externo, con la contrapartida de ofrecer la

posibilidad de comenzar los procesos de cesión al medio, confirmando los primeros estudios

de Aisen et al (41)


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La influencia del pH en estas reacciones ofrece las claves de la entrada del hierro

en la sangre, facilitando el salto de la Neisseria Meningitidis a su interior, al hacerlo

biodisponible para los microorganismos patógenos, dando lugar a la infección consiguiente

(34).

Lee el al. (42) demuestran la evidencia de que por cada Fe3+ que entra en el

Apotransferrín se pierden tres H+.

ApoTrf + Fe3+ ↔ Fe.Trf + 3H+

Luego el equilibrio está desplazado hacia la salida del hierro en medio ácido, y hacia su

entrada en el apotransferrín en medios menos ácidos. De acuerdo a Hirose (38) tiene su

óptimo a pHs en el entorno de la neutralidad, pH=7. Aunque puede variar si el anión de

cambio es diferente al carbonato (43). Egan et al (44) refieren la recogida de hierro en el

endosoma de la célula a pH = 5.5.


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2. ASIMILACIÓN DE HIERRO MINERAL POR EL TORRENTE SANGUINEO

2.1. HIPÓTESIS

El polvo de pirita ambiental, cuya composición mayoritaria es FeS2, penetra por las

vías, respiratorias fijándose la porción inhalable en la garganta.

A pH ligeramente ácido, la garganta se irrita dejando al descubierto capilares

sanguíneos donde el material particulado (10-2.5µ) queda fuertemente adherido.

Se establece una interfase sólido-líquida que facilita la disolución del material

particulado por parte del torrente sanguíneo. En esta disolución el hierro de la pirita

experimenta un aumento de su estado de oxidación quedando disponible para su captación

por determinadas proteínas sanguíneas (transferrina, grupo hemo, ferritina).

Así mismo el hierro esta biodisponible para la captación bacteriana, como es el caso de

la Neisseria.

Las condiciones óptimas para el desarrollo de este tipo de bacterias son: pH

ligeramente ácidos, temperaturas altas, zonas húmedas y medios con alto contenido en hierro

y manganeso.

Fe Fe 2+2+ / / Fe Fe 3+3+

SOSO 2222 SOSO 3 3 HH 22SOSO 44

BB . . NeisseriaNeisseria

RANGO VARIACION PHRANGO VARIACION PH

PH PH 4/54/5

PH PH 6/76/7

Fe Fe transferr ina transferr ina Complejo Complejo FeFe --TransTrans

B. NEISSERIAB. NEISSERIA B. B. NEISSERIANEISSERIA


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2.2. INFORMACIÓN

2.2.1. Introducción

Los cationes metálicos como el Fe 2+, Zn 2+, Cu 2+, Mn 2+, Co 2+ 0 Cd 2+, son

oligoelementos esenciales para el crecimiento de todos los organismos. Muchos de ellos

participan como cofactores en procesos enzimáticos o forman parte de estructuras anatómicas

celulares. Sin embargo, una elevada concentración de estos elementos puede tener efectos

deletéreos o incluso letales sobre las células, ya sea por inhibición de ciertos procesos

metabólicos (como por ejemplo la respiración anaeróbica) o por acumulación de radicales

libres generados en los procesos de reducción en los que participan. Por ello es fundamental

que las células no sobrepasen la concentración intracelular a partir de la cual un determinado

catión metálico resulta ser tóxico. Con esta finalidad, los organismos han ido desarrollando

mecanismos específicos de captación así como sistemas de excreción. Obviamente, todos

estos procesos deben estar perfectamente coordinados entre sí, y con las condiciones del

entorno, por lo que, no sólo implican proteínas que realizan funciones concretas, sino también

reguladores que controlan la expresión de éstas según las necesidades celulares.

Por otra parte, y desde la óptica de los organismos superiores, la necesidad de la

adquisición de dichos cationes por parte de los microorganismos puede ser utilizada como

mecanismo de defensa inespecífico frente al desarrollo de procesos infectivos.

Nos centraremos en tres de estos elementos esenciales: el hierro, el zinc y el manganeso,

que son, en este orden y hasta el momento, los más estudiados y de los que se dispone más

información sobre los sistemas relacionados con su transporte, acumulación y regulación.

2.2.2. Sistemas de los organismos superiores para limitar la concentración de

hierro libre

De todos los cationes metálicos mencionados, es con toda seguridad el metabolismo del

hierro el que más se conoce, tanto en lo que hace referencia a sus aspectos bioquímicos, como

a su transporte y almacenamiento.


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De hecho, el hierro es el elemento más controlado dentro del huésped, prácticamente no

se halla en forma libre, gracias a la existencia de una serie de moléculas encargadas de

retenerlo, tanto para facilitar sus diferentes funciones celulares en el organismo como para

dificultar que los microorganismos dispongan de él.

La cantidad de hierro total presente en el organismo se encuentra mayoritariamente

formando parte del grupo hemo, dando lugar a hemoproteínas como la hemoglobina (que

representaría un (65% del hierro total), la mioglobina (que representaría un 4%) diversos

compuestos que controlarían los procesos de oxidación intracelular alrededor del 0.1% se

encontraría en forma de transferrina en el plasma sanguíneo y del orden del 15 al 30% se

hallaría almacenado en forma, principalmente, de ferritina o a veces también como

hemosiderina, en las células reticuloendoteliales y en los hepatocitos.

A continuación se describirán brevemente las principales características de dichas

proteínas.

2.2.2.1. Las transferrinas

Los organismos superiores incorporan el hierro a través de la dieta. Este elemento se

absorbe a su paso por el intestino delgado. Básicamente, el hígado secreta, en la bilis,

cantidades moderadas de una globulina beta denominada apotransferrina que presenta una

elevada afinidad por este ión.

La combinación de ambos da lugar a la transferrina, que es reconocida por receptores

específicos de las células de la mucosa intestinal, siendo trasvasada al torrente sanguíneo.

Las transferrinas son un grupo ubicuo de proteínas, presentes en todos los vertebrados, y

que presentan como característica esencial una elevada afinidad por Fe 3+ .Existen distintas

variantes, todas con estructura análoga, como por ejemplo la serotransferrina (que se

encuentra en el plasma), la lactoferrina lactotransferrina (que se halla en la mayoría de los

fluidos extracelulares como la leche, las lágrimas, saliva o fluidos gastrointestinales) o la

ovotransferrina o conalbúmina (presente en los huevos) Las diversas transferrinas pueden

llevar a cabo diferentes funciones. Así, mientras la serotranferrina se encarga básicamente del

transporte de Fe3+ vía plasma,la ovotransferrina y la lactotransferrina son quelantes de hierro

actuando al disminuir la disponibilidad de hierro libre, como agentes antimicrobianos. La cesión del hierro por parte de las transferrinas es un proceso dependiente de pH

y de la presencia de receptores específicos.


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Sin embargo, la característica más destacable de este grupo de proteínas es que, a

pesar de presentar una gran afinidad por el hierro, prácticamente nunca se encuentran

saturadas por este metal. De hecho, en las moléculas de transferrina tan solo un tercio de los

posibles puntos de unión a Fe 3+ de las transferrinas que circulan por sangre está ocupado.

Esta característica permite que, si existe un aumento repentino de la concentración de hierro

libre en el medio, éste pueda ser captado rápidamente, manteniéndose así siempre una

concentración de hierro libre muy escasa. Este mecanismo de secuestro juega un papel

importante dentro de los mecanismos de defensa del huésped frente a posibles infecciones. De

hecho, se sabe que el suministro de hierro a pacientes con infecciones puede empeorar su

patología. De acuerdo con ello, estudios recientes han demostrado que la inoculación de

hierro exógeno, potencia las infecciones experimentales de mieroorganismos como

Aeromonas spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Escherichia col¡, Klebsiella spp.,

Salmonella spp., Listeria spp., Neisseria spp., Pasteurella spp., Pseudomonas spp.,

Staphylocoocus spp., Vibrio, spp., Yérsinia spp., Mycobacterium avium y Mycobacterium

tuberculosis (De Voss et al. (1999), Achenbach et al. (1997)

2.2.2.2. La ferritina

La ferritina se encarga del almacenamiento del hierro e, igual que pasaba con la

transferrina, es una proteína presente en muchos organismos (animales, plantas, hongos y

bacterias). La ferritina almacena hierro en el interior de las células, de forma que éste se

encuentra disponible, en forma soluble, para usarse cuando el metabolismo celular lo requiera.

Pero además la ferritina también tiene un efecto protector sobre las células, pues almacena el

hierro en una forma inocua evitando que tome partido en reacciones que podrían dar lugar a la

formación de radicales libres.

2.2.2.3. El grupo hemo

La mayor cantidad del hierro presente en el organismo está asociado al grupo prostético

hemo, que forma parte de las denominadas hemoproteínas. Entre ellas se encuentran:

La hemoglobina, que es la más importante y abundante de todas ellas.

Encargada del transporte de oxígeno, y puede llegar a contener un 65% del hierro total del organismo.


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Los citocromos (citocromo c oxidasa, b/b6, b5, c554, f, cd, etc.), que se encuentran en las mitocondrias y en el retículo endoplasmático, y que participan en las reacciones de transferencia de electrones.

Las catalasas y peroxidasas, que son enzimas encargadas de la protección

celular frente a las especies químicas potencialmente dañinas generadas en las reacciones de oxidación en las que participa, entre otros sustratos, el peróxido de hidrógeno.

Desde un punto de vista químico, el grupo hemo forma parte del conjunto de

compuestos que recibe el nombre de porfirinas.


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2.2.3. Mecanismos bacterianos de captación de hierro

A pH neutro la concentración de Fe 3+ viene marcada por que la concentración de

Fe 3+ en solución sea extremadamente baja. Se estima que la concentración mínima de

hierro para el crecimiento bacteriano, óptimo es de, en general, 1 mM . Por lo tanto, la

escasa disponibilidad de hierro hace que este elemento actúe como factor limitante para

el desarrollo de la mayoría de microorganismos. Debido a su importancia en el

metabolismo, los microorganismos han desarrollado una serie de mecanismos para la

captación eficiente de dicho metal. En especial los microorganismos patógenos, ya que

para ellos, la escasez de hierro en el medio se ve acentuada por la presencia, como

hemos citado anteriormente, de proteínas específicas sintetizadas por el huésped

encargadas de la adquisición, transporte y almacenamiento de dicho elemento. De esta

forma se establece una competencia entre los mecanismos del patógeno y los del

huésped.

2.2.3.1. Captación directa a de hierro

Algunos microorganismos anaeróbicos, como Clostridium perfrigens, son capaces

de captar hierro creando a su alrededor un mieroambiente de pH más ácido. En este

ambiente reductor, se favorece la aparición de especies químicas más solubles,

formadas por Fe2+ además de facilitar la liberación de este metal por parte de proteínas

del huésped como la transferrina o la lactoferrina (Neilands 1995).

3. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

3.1. Determinación del contenido de hierro en el polvo de pirita

Las muestras recepcionadas en laboratorio procedían de la cantera próxima fueron

sometidas a análisis cualitativo y cuantitativo con el fin de identificar la presencia de

hierro y la concentración del mismo.


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Análisis cualitativo.

Tomamos 0.025g de polvo de pirita que fue previamente triturado hasta un

tamaño del orden 10-0.25µ. Se procedió a la disolución de la muestra en presencia de

ác. Sulfúrico concentrado. Con ello se oxidó el hierro de la pirita a ión férrico. Para la

identificación del ión férrico empleamos el ensayo del tiocianato potásico, que forma

un complejo rojo (que se asemeja al vino tinto) con dicho ión.

Análisis cuantitativo.

Partimos de dos muestras diferentes de polvo de pirita, una de aspecto anaranjado

y otra marrón-rojizo. Se prepararon muestras de 0.025g de cada una de ellas por

triplicado, que fueron tratadas con 11µL de ácido sulfúrico concentrado. Llevándose

finalmente hasta un volumen 50 µL. Empleamos un espectrofotómetro UV-V para la

determinación de la concentración de hierro en las muestras.

Para ello se preparo patrones de concentración 1, 5, 15, 25, 30 ppm a partir de una

disolución de hierro comercial en ácido nítrico hexahidratado. Para la formación de

complejo se añadió 1 µL de KSCN concentrado.

3.2. Determinación de ferritina, transferrina y hierro en muestras sanguíneas

3.2.1. Método turbidimétrico para la determinación de ferritina

Principio del método

El método está basado en la reacción de la ferritina de la muestra con unas

párticulas de látex a las que se ha ligado anticuerpos anti-ferritina. LA determinación es

turbidimétrica y puede ser medida en un analizador gracias a la relación entre la

absorbancia y concentración permite una calibración con un rango de medición entre 0

y 500µg/l.


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Procedimiento.

Se tomaron las muestras y se separaron en distinto viales para adecuar cada una a

unas condiciones determinadas:

• Muestra de suero sanguíneo con heparina. • Muestra de suero sanguíneo con heparina y pirita • Muestra de suero sanguíneo con heparina, pirita y ácido sulfúrico. • Heparina y pirita.

Esta última como referencia ya que en algunos casos se ha podido constatar la

absorbancia del anticoagulante del reactivo.

Se preparó un blanco con 300µL de patrón y 200µL de reactivo látex, un Standard

con 300µL de tampón 200µL de látex y 60µL de Standard y las muestras de forma

idéntica al Standard.

Tras su incubación en un baño termostatizado a 37ºC se midieron en el

espectrofotómetro.

3.2.2. Test inmunoturbidimétrico en suero

Principio del método.

La transferrina presente en la muestra reacciona específicamente con un anti-

transferrina humano. La turbidez surgida debido a la formación de un inmunocomplejo

antígeno-anticuerpo se mide a 340nm, siendo proporcional a la concentración de

transferían en la muestra.

Procedimiento





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Se preparo un blanco con 800µL de reactivo, un standard con 800µL de reactivo

y 5µL de stándard y de forma idéntica al standard se trataron las muestras.

Tras su incubación durante 10minutos en un baño termostático se lee la

absorbancia a 340nm.

3.2.3. Prueba fotométrica colorimétrica para el hierro con factor aclarante de

lípidos (LCF)

Principio del método

El Fe3+ reacciona con el cromazurol B y cetitrilmetilbromuro de amonio (CTMA)

para formar un complejo ternario coloreado con una máxima absorbancia a 623nm. La

intensidad del color producido es directamente proporcional a la concentración de hierro

en la muestra.

La prueba también puede ser usada en la combinación con el equipo TIBC para

determinar la capacidad total de fijación de hierro.

Procedimiento






Se preparo un blanco con 50µL de agua destilada y 1000µL de RGT, y Standard

con 50µL de STD y 1000µL de agua destilada y de forma idéntica al standard se

trataron las muestras.


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Tras la lectura de las absorbancias se procedió al cálculo de concentración según

la siguiente fórmula:

Resultados

Los resultados no fueron concluyentes debido a la formación de coagulaos en las

muestras, que dieron unas mediciones erróneas y a la falta de muestras.

ΔAmuestra

ΔASTD C = 100*


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