Índex › rcs_gene › treballs_recerca › 2013-2014-04-1-tr.pdfels éssers vius però que no...

ÍNDEX 1. INTRODUCCIÓ ........................................................................................................................... 3

1.1 La contaminació ambiental .................................................................................................. 4

1.2 La toxicologia ambiental ...................................................................................................... 4

1.3 Els xenobiòtics ...................................................................................................................... 5

1.4 Els disruptors endocrins....................................................................................................... 5

1.5 El sistema hormonal o endocrí ........................................................................................... 6

2. BISFENOL A (BPA) .................................................................................................................... 7

3.EL PEIX ZEBRA ........................................................................................................................... 8

3.1 A la natura .............................................................................................................................. 8

Hàbitat ....................................................................................................................................... 8

Aparença ................................................................................................................................... 8

Alimentació ............................................................................................................................... 9

Comportament ......................................................................................................................... 9

Cicle vital ................................................................................................................................... 9

3.2 Al laboratori .......................................................................................................................... 11

Temperatura ........................................................................................................................... 11

Aquaris .................................................................................................................................... 11

Alimentació ............................................................................................................................. 11

Cicle de llum .......................................................................................................................... 12

D’on provenen? ...................................................................................................................... 12

3.3 Organisme model ................................................................................................................ 12

4. EXPERIMENTACIÓ .................................................................................................................. 13

4.1 Postes ................................................................................................................................... 13

4.2 Càlcul de les dissolucions ................................................................................................. 14

4.3 Exposicions .......................................................................................................................... 16

5. RESULTATS .............................................................................................................................. 17

5.1 Observació al microscopi òptic a 3 hpf ............................................................................ 18

5.2 Resultats a 24 hpf ............................................................................................................... 18

Observacions al microscopi òptic ....................................................................................... 18

Taula de mortalitat ................................................................................................................. 20

Taula resum ............................................................................................................................ 21

Gràfic de mortalitat ................................................................................................................ 21

Taula de puntuació general de morfologia (GMS) a 24 hpf ............................................ 22

5.3 Resultats a 48 hpf ............................................................................................................... 24


Taula de mortalitat ................................................................................................................. 25

Taula resum ............................................................................................................................ 26


Taula de puntuació general de morfologia (GMS) a 48 hpf ............................................ 27

5.4 Resultats a 120 hpf ............................................................................................................. 28


Taula de mortalitat ................................................................................................................ 29

Taula resum ............................................................................................................................ 30


5.5 Gràfic de variació de mortalitat de 24 a 120 hpf ............................................................ 31

6. CONCLUSIONS ........................................................................................................................ 32

7. EXPRESSIÓ DEL GEN CYP19A1B ...................................................................................... 33

7.1 Aïllament del RNA .............................................................................................................. 34

7.2 Nanodrop.............................................................................................................................. 35

Resultats Nanodrop............................................................................................................... 36

7.3 PCR en temps real o PCR quantitativa (qRT-PCR) ...................................................... 37

8. CONCLUSIONS ........................................................................................................................ 42

9. CONCLUSIONS GENERALS ................................................................................................. 42

10. VALORACIÓ FINAL ............................................................................................................... 44

Agraïments ................................................................................................................................. 45

11. Bibliografia i webgrafia ........................................................................................................... 46

3

1. INTRODUCCIÓ

En aquest treball m'he plantejat aprofundir en determinats aspectes dels efectes que pot

causar en els éssers vius la contaminació ambiental i alimentària i com es poden estudiar.

Per fer-ho, he contactat amb un grup d'investigadors del Departament de Toxicologia

Ambiental de l'Institut de Diagnosi Ambiental i Estudis de l'Aigua (IDAEA) dirigit pel Dr.

Benjamí Piña, investigador del CSIC, que m'ha facilitat la possibilitat d'incorporar-me

durant unes setmanes al seu laboratori per col·laborar en una de les seves línies de

recerca.

L’objectiu del treball es basa en determinar els efectes tòxics d'un compost molt utilitzat

en la indústria, el Bisfenol A, tant a nivell de l'organisme com de l'expressió dels seus

gens. Aquest compost sintètic és utilitzat per fabricar plàstics i resines i, sobretot, està

present en envasos, amb la qual cosa es troba en contacte directe amb els aliments que

posteriorment els éssers humans ingerim. Per tant, el Bisfenol A podria passar al nostre

organisme a través de l’alimentació i afectar al correcte desenvolupament de les

persones. El risc del BPA per la salut és un tema polèmic. S’han realitzat estudis en

humans i en diferents models animals, però no s’ha arribat a la conclusió de si és nociu

per a la salut.

Per dur a terme l’experimentació i saber si el Bisfenol A produeix efectes adversos, el

model animal utilitzat ha estat el peix zebra (Danio rerio) pels molts avantatges que

ofereix en els estudis de toxicitat.

Els problemes que ens vam plantejar i les hipòtesis de les quals vam partir eren:

- El BPA és un compost tòxic que afecta els éssers vius?

- El BPA causa diversos efectes adversos en els éssers vius

- El BPA és capaç d’activar o inhibir l’expressió de gens que estiguin sota el

control del receptor d’estrògens?

- És possible que el BPA sigui capaç d’alterar el correcte funcionament o

expressió de gens i proteïnes que afectin diferents processos de l’organisme

encara que en determinades concentracions del tòxic no causi efectes

morfològics evidents durant les primeres etapes del desenvolupament que

comprometin la viabilitat de l’embrió.

4

(Fig. 1) Microscopi NIKON SMZ 1500 acoblat

a una càmera digital i a un ordinador.

Per investigar com afectava el BPA als embrions de peix zebra, vaig seguir la

metodologia següent:

- Preparar les postes per obtenir embrions de peix zebra.

- Exposar els embrions al tòxic i observar els efectes morfològics periòdicament.

- Extreure RNA de les larves i determinar els efectes del BPA en l’expressió de

gens amb una tècnica anomenada PCR.

Les fotografies que es mostren en aquest

treball van ser realitzades per mi durant el

període en el qual vaig estar investigant en el

laboratori. Les imatges on es mostren els

diferents estadis dels embrions i els diversos

efectes morfològics van ser fetes amb un

microscopi NIKON SMZ 1500 acoblat a una

càmera digital i a un ordinador per visualitzar i

processar les imatges.

Abans de centrar-nos directament en el tòxic utilitzat en aquest treball i els diversos

efectes que pot causar, vull fer una breu introducció general a diferents termes

relacionats amb la contaminació ambiental i els tòxics presents a la natura que són

capaços de produir alteracions en els éssers vius.

1.1 La contaminació ambiental

La contaminació ambiental és un dels principals problemes que afecta el medi ambient.

Es pot definir com qualsevol agent físic, químic o biològic, o una combinació d'aquests

que, pel lloc on es troba o per la seva forma i/o concentració, resulta nociu per la salut, la

seguretat o el benestar dels éssers vius i dels ecosistemes.

1.2 La toxicologia ambiental

La toxicologia ambiental és la ciència que estudia els efectes adversos causats per

l'exposició als contaminants que es troben al medi ambient a tots els nivells: cel·lular,

5

tissular, orgànic, individual, d'espècie, comunitat i ecosistema. Estudia també els seus

mecanismes d'acció, metabolisme i detoxificació.

1.3 Els xenobiòtics

Els xenobiòtics (del grec xeno = estrany i bio = vida) són compostos que podem trobar en

els éssers vius però que no formen part de la seva bioquímica normal, sinó que la seva

estructura química a la natura és poc freqüent o inexistent, donat que han estat

sintetitzats per l'activitat humana. La majoria han aparegut al medi ambient durant els

darrers 100 anys.

Tenen la capacitat de produir alteracions en les vies metabòliques, ja sigui de manera

immediata o bé a mig o llarg termini. Es poden trobar tant a l’aire, l’aigua o el sòl, així com

retinguts a l’interior dels éssers vius quan aquests no són fàcils d’eliminar, donant lloc al

fenomen de bioacumulació.

Els mecanismes mitjançant els quals els xenobiòtics causen danys al organismes són

múltiples i se solen combinar entre sí. Aquests varien segons les propietats

fisicoquímiques dels contaminants i de la seva via d’entrada que determinen amb quines

molècules pròpies de l’organisme poden interaccionar.

1.4 Els disruptors endocrins

Molts xenobiòtics són disruptors endocrins, substàncies químiques capaces d'alterar

l'equilibri hormonal. Un xenobiòtic pot actuar com a disruptor endocrí per diversos

mecanismes:

- Mimetitzant l'acció de les hormones, per exemple, els que actuen com estrògens,

que s’anomenen estrògens ambientals (DDT, PCBs, Bisfenol A).

- Antagonitzant l'acció de les hormones (tenen efectes oposats a l'hormona).

- Alterant el patró de síntesi i metabolisme de determinades hormones.

- Modulant els nivells dels receptors d'hormones.

Els disruptors endocrins causen efectes adversos sobre els animals, com per exemple:

- Nivells hormonals en sang anormals.

- Reducció de la fertilitat.

- Càncer d’òrgans reproductors masculins i femenins.

6

- Feminització dels mascles.

- Masculinització de les femelles.

- Alteracions de la densitat i l’estructura òssia.

1.5 El sistema hormonal o endocrí

L’activitat dels diferents òrgans dels animals vertebrats està coordinada per dos sistemes,

el nerviós i l’endocrí. Aquest últim controla els processos lents, com el metabolisme, el

creixement i la reproducció.

Les glàndules endocrines són òrgans que reben senyals de les cèl·lules nervioses o

d’altres glàndules quan es generen diferents estímuls. Aquestes glàndules secreten les

hormones, que actuen com a missatgers químics específicament sobre determinades

cèl·lules que posseeixen els receptors específics per les mateixes, conegudes com

cèl·lules diana.

Les hormones regulen nombroses activitats vitals, incloent el metabolisme, la reproducció

i el desenvolupament embrionari i fetal. Són molècules molt efectives que actuen a dosis

molt baixes, presenten diferents mecanismes d'actuació i comprenen un gran nombre de

substàncies amb estructures químiques molt diferents. Una alteració de la quantitat o el

moment en què actuen durant el desenvolupament embrionari pot causar efectes greus

en la descendència.

Tots els animals vertebrats tenim les mateixes glàndules endocrines i secretem hormones

similars per controlar les diverses funcions de l’organisme.

7

(Fig. 2) Estructura molecular del Bisfenol A

2. BISFENOL A (BPA)

El Bisfenol A (BPA o 2,2-bis-(4-hidroxifenil)propà) és un compost sintètic, soluble en

dissolvents orgànics i poc soluble en aigua, molt utilitzat en la indústria per fabricar plàstic

policarbonat i resines epoxi.

El plàstic policarbonat, rígid i transparent, està present en lents per ulleres, equip mèdic,

ampolles de plàstic, biberons, mòbils, ordinadors, electrodomèstics i automòbils.

Les resines epoxi són utilitzades per adhesius, empastaments dentals i recipients i

envasos destinats a contenir aliments i begudes per al consum humà. També s'utilitzen

com aglutinants, plastificants i enduridors de productes plàstics i es fan servir com a

resines per a laques, pintures i coles i són un producte intermedi en la fabricació de

fungicides, antioxidants i tints.

Com he mencionat anteriorment, el BPA és un

disruptor endocrí, una substància química que,

en determinades dosis, pot interferir amb el

sistema endocrí o hormonal, bloquejant l’acció

de les hormones o disminuint-ne els nivells. La

seva capacitat de mimetització dels estrògens

(hormones sexuals femenines) és coneguda des de fa més de 80 anys i els seus efectes

sobre la fertilitat i la reproducció han estat objecte de nombrosos estudis científics.

Diversos estudis han determinat que el BPA és una substància tòxica per la salut i, per

això, el 2011 la Comissió Europea va prohibir-ne la utilització en la fabricació de biberons

de policarbonat. Es va prohibir també la comercialització i importació a la Unió Europea

de materials fabricats amb BPA destinats a entrar en contacte amb aliments.

S’ha demostrat que l’efecte dels disruptors endocrins com el BPA és més intens i

rellevant en les primeres etapes del desenvolupament, amb concentracions necessàries

inferiors a les requerides en adults per provocar efectes perjudicials.

8

3.EL PEIX ZEBRA

El peix zebra (Danio rerio) és un peix tropical que

pertany a la família dels ciprínids, peixos vertebrats

que viuen a l’aigua dolça i sovint són criats com a

animals d’aquari.

3.1 A la natura

Hàbitat

És nadiu de l’Índia, concretament de la zona del Ganges. Sol habitar els rius de l’Àsia

Central, tot i que també se’l pot trobar a rius de Nepal, Bangla Desh, Pakistan i Myanmar.

Ha estat introduït a Colòmbia, Japó, Estats Units i Austràlia. Generalment viu en aigües

tranquil·les, poc profundes i relativament clares que solen estar envoltades de vegetació,

com estanys, llacs o camps d’arròs.

Aparença

És una espècie de mida petita. Els adults mesuren entre 3 i 5 cm de longitud. Tenen una

forma allargada, en forma de fus, i als laterals presenten entre 5 i 9 bandes horitzontals

de color blavós. Rep el nom de “peix zebra” a causa d’aquest aspecte ratllat.

Els mascles tenen forma de torpede i el color de fons és daurat. Les femelles són més

arrodonides i el color de fons és platejat. La zona ventral és de color blanquinós i rosat.

Regne Animalia

Filum Chordata

Classe Actinopterygii

Ordre Cypriniformes

Família Cyprinidae

Gènere Danio

Espècie Danio rerio

(Fig. 4) Peix zebra mascle: forma allargada, de

mida més petita, amb un color de fons daurat.

(Fig. 5) Peix zebra femella: forma arrodonida, de

mida més gran, amb un color de fons platejat.

(Fig. 3) Classificació científica del peix zebra.

9

Alimentació

És un animal omnívor. A la natura, s’alimenta de zooplàncton, fitoplàncton, petits

crustacis i larves d’insectes. No té dents a la mandíbula, però té fileres de dents a la part

posterior de la gola.

Comportament

És un animal pacífic, que forma petites agregacions d’individus a la natura. S’han

observat bancs de dos a trenta individus. És molt social i pot conviure amb altres

espècies del mateix gènere. Per això, és un peix molt comú d’aquari.

Cicle vital

L‘època d’aparellament en condicions naturals es produeix entre el juny i el setembre. El

peix zebra és una espècie ovípara. Les femelles ponen entre 200 i 300 ous transparents

a cada posta, els quals mesuren aproximadament entre 1 i 1,5 mm de diàmetre. Un cop

feta la posta a la vora dels rius, no hi ha cap mena de cura parental.

Es distingeixen diferents etapes del cicle vital:

- Durant les primeres 72 hores després de la fertilització són considerats embrions.

Quan tenen 3 dies de vida, es mantenen inactius i resten immòbils al fons. Quan

tenen 5 dies, son capaços de nedar i d’alimentar-se per sí mateixos, ja que

gairebé han consumit tot el vitel.

- Entre les 72 hores i els tretze dies després de la fertilització es consideren larves

primerenques i entre els catorze i els 29 dies, larves mitjanes.

- Des dels 30 dies fins a tres o quatre mesos se’ls anomena joves.

- Quan arriben a la maduresa sexual, al cap d’uns tres mesos, se’ls considera

adults.

A la naturalesa, viuen aproximadament un o dos anys a causa de la depredació i de

possibles paràsits. Als laboratoris poden viure una mitjana de tres anys i mig.

10

(Fig. 6) Imatges que mostren els diferents estadis d’un embrió fins les 72 hores post fertilització.

11

(Fig. 8) Preparat

alimentari per a

peixos adults.

(Fig. 7) Aquaris dels peixos zebra al CSIC.

3.2 Al laboratori

L’espai destinat al peix zebra en un centre d’investigació ha d’estar adaptat a certes

condicions.

Temperatura

L’animal pot tolerar una àmplia gamma de temperatures. En el seu hàbitat natural s’ha

observat que pot sobreviure a 6ºC a l’hivern i a 38ºC a l’estiu. Tot i així, una temperatura

molt baixa pot comportar problemes tant en el desenvolupament com en la reproducció.

La temperatura òptima per a un bon desenvolupament i benestar del peix zebra és

28,5ºC. Per això, la temperatura de l’aigua es manté entre 28-28,5ºC i la de la sala entre

26-27ºC. A més, disposen d’un incubador on s’hi guarden els ous, que es manté a 28ºC.

Aquaris

Els aquaris de la instal·lació del CSIC son

independents i tenen una capacitat per a 40 l

d’aigua. Cada peixera disposa d’un filtre per airejar

l’aigua per tal d’obtenir una concentració d’oxigen

adequada. Està estipulat que per cada litre d’aigua,

hi pot haver com a màxim un peix. Per tant, tenen

aproximadament 40 peixos per peixera.

Per omplir les peixeres, s’utilitza aigua desionitzada per osmosi inversa reconstituïda amb

90 mg/l d’Instant Ocean, un preparat comercial de sals marines, i amb 0,1 mg/l de sulfat

de calci (CaSO₄). El pH de l’aigua no ha de ser ni àcid ni bàsic, ha de mantenir-se entre 6

i 8. Per això el pH òptim és 7.

Alimentació

Al laboratori es dóna de menjar als peixos dues vegades al dia, una

pel matí i l’altra per la tarda. Als adults se’ls dóna un producte

anomenat TetraMin flakes, que porta: peix, subproductes de peix,

cereals, llevat, extractes de proteïnes vegetals, mol·luscs i crustacis,

olis i greixos, algues, sucres i substàncies minerals.

12

Cicle de llum

Els períodes de foscor per al peix zebra són importants tant per poder descansar com per

reproduir-se. Es considera necessari un període de 12 hores de claror i 12 hores de

foscor per mimetitzar les condicions naturals, ja que el Danio rerio és un peix tropical.

D’on provenen?

Els investigadors del CSIC obtenen els peixos d’un majorista, Piscicultura Superior, que

els distribueix també a botigues. Quan els peixos es moren, els congelen perquè els

reculli el Servei de Recollida d’Animals de Laboratori de l’Ajuntament de Barcelona per

incinerar-los.

3.3 Organisme model

El peix zebra és un animal molt utilitzat per investigació als laboratoris ja que presenta

molts avantatges. Al ser un animal petit, es poden tenir molts exemplars en un espai

reduït. És un animal molt assequible, ja que el seu preu no és tan elevat com el de les

rates o els conills.

Les femelles poden arribar a pondre uns 200 ous setmanalment. Al tenir una fecundació

externa es pot observar el desenvolupament de l’embrió, que és transparent, sense

pertorbar els progenitors. A més, té un ràpid desenvolupament. Al cap de dos dies ja han

desenvolupat tots els òrgans i, al cap de tres mesos, ja han assolit la maduresa sexual.

Posseeix tots el òrgans d’un ésser humà, així com una similitud genètica que permet

estudiar diferents malalties i extrapolar-ho a humans. També és capaç de regenerar

diferents parts del seu cos, com la pell, les aletes, el cor, el cervell i el teixit de la retina i

de l’oïda.

El gran avantatge del peix zebra és que no és considerat un animal d’experimentació

mentre no s’alimenta per si sol. L’actual legislació sobre experimentació animal (Real

Decreto 53/2013 i Directiva Europea 2010/63/UE) diu que un peix es considera animal

quan comença l'alimentació exògena, que en el peix zebra té lloc al cap de cinc dies de

fertilització, quan les larves són mòbils i han consumit la major part del vitel. Durant

aquest període, ja és un organisme autònom que ha passat per totes les etapes del

desenvolupament. La majoria d’assaigs en l’àmbit de la toxicologia poden realitzar-se al

llarg d’aquests cinc dies i, per això, l’ús d’embrions de peix zebra no es considera

experimentació animal, sinó un mètode alternatiu.

13

(Fig. 9) Recipients de plàstic

grans i petits per a les

postes.

(Fig. 11) Recipient de plàstic

gran amb tres mascles i cinc

femelles.

(Fig. 10) Recipient de plàstic

petit amb dos mascles i una

femella.

4. EXPERIMENTACIÓ

Sabent que el BPA és un compost estrogènic, l’objectiu d’aquesta experimentació és

comprovar-ne la toxicitat exposant embrions de peix zebra a diferents concentracions del

compost per observar-ne la mortalitat o possibles deformacions, com edemes o

malformacions de la cua, a més de mirar l’expressió del gen cyp19a1b en les diferents

mostres a través de la tècnica de PCR en temps real, i comparant-ho amb embrions no

exposats al tòxic.

S’ha seguit la metodologia oficial segons la normativa per estudis de toxicitat:

- OECD 210 (1992): OECD guideline for testing of chemicals: fish, early-life stage

toxicity test. Informa de com treballar amb peixos, a més d determinar les

condicions que s’han de mantenir.

- ISO 15088 (2007): water quality – Determination of the acute toxicity of waste

water to zebrafish eggs (Danio rerio). Assaig de toxicitat a 120 hores post

fertilització.

4.1 Postes

El primer dia vaig preparar les postes per poder tenir ous al dia següent i poder iniciar

l’experiment. Per començar, vaig agafar recipients de plàstic de dues mides diferents i els

vaig omplir amb aigua de peixos. Als recipients grans, hi vaig col·locar una reixa al fons

per evitar que els peixos es mengessin els ous ja que, un cop feta la posta, no hi ha cap

mena de cura per part dels pares.

14

A continuació, vaig seleccionar tres mascles i cinc femelles per a les peixeres grans i dos

mascles i una femella per a les peixeres petites, esperant obtenir embrions el dia

següent.

4.2 Càlcul de les dissolucions

Un cop preparades les peixeres per les postes, vaig realitzar els càlculs per obtenir

dissolucions amb diferents concentracions de BPA per poder observar els efectes que

produïen en els peixos.

Vam decidir realitzar set concentracions diferents fent servir set plaques, cadascuna de

les quals contindria una concentració diferent de BPA en ppm (parts per milió; 1ppm

equival a 1 mg/l).

Sabíem per estudis anteriors que la LC501 era entre 1000 i 20000 mg/l de BPA,

equivalents a 1 i 20 ppm. Així que vam decidir que una de les plaques contindria una

concentració d’ 1 ppm, una altra de 3 ppm i una tercera de 10 ppm. Ja que a les 20 ppm

el 50% dels embrions es morien, vam acordar preparar plaques amb concentracions

superiors per observar l’increment de mortalitat, concretament 30 i 60 ppm. A més, vam

voler assajar concentracions inferiors per observar possibles efectes morfològics que el

tòxic pot causar a l’embrió, per la qual cosa vam realitzar dues plaques més de 0,1 i 0,3

ppm, aconseguint, d’aquesta manera, set plaques en total (0,1 ppm, 0,3 ppm, 1 ppm, 3

ppm, 10 ppm, 30ppm i 60 ppm).

Cada placa que vaig utilitzar per exposar els ous al tòxic estava formada per 6 pous, un

dels quals corresponia al control negatiu (CN), tal com es mostra a la figura 12, on només

s’hi afegiria aigua de peixos per poder comparar els efectes que produís el BPA, i els

altres cinc eren rèpliques.

1 LC50 (Letal Concentration 50): concentració letal a la qual el 50% del organismes estan morts.

15

(Fig. 12) Model de les

plaques.

(Fig. 13) Stocks.

A cada un dels pous vam decidir posar-hi 3 ml de volum de les dissolucions. Per tant:

El BPA no és soluble en aigua. Per això vaig utilitzar un líquid orgànic anomenat

dimetilsulfòxid o DMSO (CH3SOCH3). Havia de preparar set ampolles amb les

dissolucions de BPA amb un volum final de 25 ml cadascuna, en els quals només hi pot

haver un 0,1-0,2% de DMSO, quantitat que no produeix cap efecte al peix. A l’aigua dels

controls negatius també s’hi va afegir DMSO al 0,1%.

25 µl DMSO

A partir d’aquestes dades, vaig calcular de quin stock2

necessitava partir per obtenir les diferents concentracions.

Les operacions que vaig realitzar per arribar a tenir les set

concentracions de BPA diferents es troben a la pàgina 5

de l’annex.

2 Stock: solució concentrada a partir de la qual es poden preparar solucions menys concentrades.

Eren necessaris 15 ml de dissolució per placa però, com

que al pipetejar es poden cometre errors, vam acordar

preparar-ne més quantitat per evitar que en faltés,

concretament 25 ml.

CN

16

4.3 Exposicions

La posta en el peix zebra està fortament regulada pel fotoperíode i es desencadena

coincidint amb l’inici de la il·luminació. Així, el dia següent a primera hora, ja tenia els

embrions. Primer vaig retirar la reixa de les peixeres i vaig tornar els peixos al seu lloc.

Després, vaig abocar la major quantitat d’aigua dels recipients per la pica. Un cop

quedaven els ous a la base del recipient amb poca quantitat d’aigua, vaig abocar-ho en

una safata de plàstic més petita per poder ajuntar tots els ous, procurant que caiguessin

tots i que no es moguessin gaire ja que, durant les primeres hores, són molt fràgils.

Després, amb una pipeta, vaig omplir les set plaques, cadascuna amb la concentració

corresponent: 0,1 ppm, 0,3 ppm, 1 ppm, 3 ppm, 10 ppm, 30 ppm i 60 ppm, posant 3 ml a

cadascun dels pous i omplint l’últim, corresponent al CN, només amb DMSO al 0,1% en

aigua de peixos.

(Fig. 14) Esquema de la preparació de les dissolucions.

17

(Fig. 17) Placa de 0,3 ppm

de BPA amb embrions de

peix zebra.

(Fig. 15) Al fons, ampolles de

vidre amb les concentracions de

BPA. Al davant, plaques buides.

A continuació, amb un comptagotes, vaig seleccionar els ous i els vaig anar posant als

pous de les plaques, intentant que en cadascun n’hi hagués aproximadament quinze. Els

ous morts o que semblaven tenir algun defecte en les primeres etapes del

desenvolupament van ser rebutjats abans d’iniciar l’experiment.

5. RESULTATS

L’experiment va durar cinc dies ja que, com ja he dit, durant aquest període de temps, un

peix no es considera animal d’experimentació perquè encara no ha començat

l’alimentació exògena, però és un període suficient per estudiar la toxicitat.

Un cop preparades les set plaques, vaig observar al microscopi les larves de peix zebra

al cap de 3, 24, 48 i 120 hpf3 i vaig anotar els resultats obtinguts. Calia comprovar els

diferents estadis de les larves i els efectes que el tòxic els produïa, a més de controlar el

nombre de larves mortes, les quals havien de ser retirades per tal de netejar els pous i

eliminar possibles focus de contaminació deguda a la descomposició. A les 48 hpf vaig

renovar totes les dissolucions per minimitzar la possible degradació del tòxic amb el

temps. Vaig retirar les dissolucions dels pous i els vaig tornar a omplir amb les mescles

noves.

Vaig realitzar taules i gràfics per representar la mortalitat dels embrions exposats a

diferents concentracions de BPA. Els resultats que es mostren són acumulatius, és a dir,

se sumen les dades obtingudes amb les de dies anteriors per observar la variació dels

efectes.

3 Hpf: hores post fertilització. Temps en hores que han passat després que l’ou fos fertilitzat.

(Fig. 16) Preparació de les

plaques amb les diferents

concentracions del tòxic.

18

(Fig. 18) Ou de peix zebra a

les 3 hpf. Encara no ha estat

exposat al tòxic.

5.1 Observació al microscopi òptic a 3 hpf

5.2 Resultats a 24 hpf

Observacions al microscopi òptic

(Fig. 19) Ou de peix zebra a

les 4 hpf. Encara no ha estat

exposat al tòxic.

(Fig. 20) Ou de peix zebra a les

3 hpf coagulat. Encara no ha

estat exposat al tòxic.

El control negatiu (CN) el componen embrions sans que no han estat exposats a un

tòxic. Serveix per poder-los comparar amb els embrions ja exposats i observar els

efectes que aquest hagi pogut causar.

(Fig. 21) Embrió de peix zebra

del control negatiu a les 24

hores post fertilització.


exposat a 0,1 ppm de BPA a les

24 hores post fertilització.


exposat a 0,3 ppm de BPA a

les 24 hores post fertilització.

19

A les concentracions de 0,1 a 10 ppm de BPA no s’observava cap diferència apreciable

respecte els controls. Tant la cua com els ulls estaven ben formats i presentaven

moviment dins l’ou.

Els embrions exposats a 30 ppm de BPA no tenien els ulls i la cua completament formats

i no presentaven moviment ni se’ls veia el batec del cor. Alguns estaven coagulats.

Els embrions exposats a 60 ppm de BPA estaven tots morts.


exposat a 1 ppm de BPA a les

















20

Taula de mortalitat

Aquesta taula mostra el número d’embrions vius i morts de cadascun dels pous de la

placa per les diferents concentracions assajades de BPA a les 24 h d’exposició al tòxic.

S’observa que a les concentracions de 0,1 a 10 ppm gairebé no hi ha mortalitat, a

diferència de la placa de 30 ppm, on es comença a veure una mortalitat més elevada. A

la placa de 60 ppm, els embrions de tots els pous estan morts, exceptuant el control, ja

que en aquest no s’hi ha aplicat el tòxic.

[BPA] Pou 1 Pou 2 Pou 3 Pou 4 Pou 5 CN

0,1

ppm

Total 14 14 17 12 14 13

Vius 14 14 17 11 14 12

Morts 0 0 0 1 0 1

0,3

ppm

Total 15 14 16 15 14 14

Vius 14 13 16 15 12 13

Morts 1 1 0 0 2 1

1 ppm

Total 15 14 15 13 14 14

Vius 14 14 15 12 13 14

Morts 1 0 0 1 1 0

3 ppm

Total 14 14 14 15 16 15

Vius 12 14 13 15 16 15

Morts 2 0 1 0 0 0

10

ppm

Total 17 14 17 16 14 13

Vius 16 14 17 16 13 12

Morts 1 0 0 0 1 1

30

ppm

Total 16 15 14 14 17 15

Vius 11 10 9 11 15 13

Morts 5 5 5 3 2 2

60

ppm

Total 15 15 15 15 15 15

Vius 0 0 0 0 0 15

Morts 15 15 15 15 15 0

(Fig. 30) Taula de mortalitat a les 24 hpf per les diferents concentracions de BPA.

21

Taula resum

Gràfic de mortalitat

En aquesta gràfica es pot observar la variació de mortalitat dels embrions a les 24 hpf per

les diferents concentracions de BPA. Fins a 10 ppm no s’observa una mortalitat anòmala

ja que, si es comparen els resultats de les dissolucions amb els del control negatiu, el

qual no té BPA, no presenten diferències significatives. En canvi, a 30 i 60 ppm

augmenta dràsticament la mortalitat.

[BPA] Total Vius Morts

CN 99 94 5

0,1 ppm 71 70 1

0,3 ppm 74 70 4

1 ppm 71 68 3

3 ppm 73 70 3

10 ppm 78 76 2

30 ppm 76 56 20

60 ppm 75 0 75

5,05 1,41 5,41 4,23 4,11 2,56

26,32

100,00

0

20

40

60

80

100

CN 0,1 ppm 0,3 ppm 1 ppm 3 ppm 10 ppm 30 ppm 60 ppm

% morts 24 hpf

(Fig. 31) Resum dels resultats de mortalitat a 24 hpf per les diferents

concentracions de BPA.

(Fig. 32) Representació gràfica del percentatge de mortalitat a les 24 hpf per les

diferents concentracions de BPA.

22

Taula de puntuació general de morfologia (GMS) a 24 hpf

El sistema GMS (General Morphology Scoring) mostra el desenvolupament normal d’un

embrió de peix zebra fins a 72 h post fertilització amb diferents puntuacions assignades a

criteris de valoració específics. És un mètode simple i ràpid per estudiar la toxicitat

química després d’exposar l’embrió i les possibles malformacions que el tòxic genera en

aquest a diferents parts del cos, com la formació de la cua i els ulls, la pigmentació del

cos, el batec del cor i la circulació de la sang, etc.

(Fig. 33) Taula de puntuació general de morfologia del peix zebra fins a les 72


23

A partir d’aquesta taula de referència es poden extreure resultats l’experiment donant una

puntuació a cada part del peix zebra. Cadascun dels nombres visibles en aquesta taula

simbolitzen la puntuació màxima que es pot obtenir segons la part del peix zebra exposat

a un tòxic que es vulgui comparar per detectar malformacions. Si un apartat té el número

zero significa que no es pot determinar a les hores post fertilització corresponents. A la

part inferior se suma la puntuació total que es pot obtenir a les hores post fertilització

determinades si, al haver comparat un embrió amb la taula, es concreta que està

aparentment sà.

Les taules de puntuació que he realitzat s’han fet seguint les especificacions indicades a

la figura 33.

Les concentracions de 0,1 a 10 ppm tenen la puntuació màxima, set punts, ja que

aparentment estaven ben formats. A 30 ppm la cua i els ulls no estaven completament

formats i no presentaven moviment ni batec del cor i, per això, els vaig assignar un 2,5. A

60 ppm tots els embrions estaven morts i, per tant, tenen un 0.

4 Somite: segments longitudinals en els quals es divideix el cos de certs embrions de vertebrats.

CN

0,1 ppm

0,3 ppm

1 ppm

3 ppm

10 ppm

30 ppm

60 ppm

Max. score

Cua 2 2 2 2 2 2 1 0 2

Somite4 1 1 1 1 1 1 0,5 0 1

Ulls 2 2 2 2 2 2 1 0 2

Moviment 1 1 1 1 1 1 0 0 1

Batec 1 1 1 1 1 1 0 0 1

GMS 7 7 7 7 7 7 2,5 0 7

(Fig. 34) Taula que mostra les puntuacions assignades als peixos zebra exposats a BPA a les 24 hpf.

24

























exposat a 30 ppm de BPA a





25

Els embrions de 0,1 a 0,3 ppm de BPA estaven completament formats i pigmentats,

presentaven moviment i se’ls veia el batec del cor i la circulació de la sang. La major part

ja havien sortit de l’ou.

En els embrions de 10 ppm, tant el cos com els ulls estaven ben formats però poc

pigmentats respecte els embrions del control. Presentaven poc moviment i encara no

havien eclosionat.

La major part dels embrions de 30 ppm havien mort. Els que restaven vius, encara

estaven dins de l’ou.

Taula de mortalitat



S’observa que a les concentracions de 0,1 a 10 ppm no hi ha hagut més mortalitat

respecte les 24 hpf. A la placa de 30 ppm ha continuat augmentant la mortalitat.


0,1

ppm

Total 14 14 17 12 14 13

Vius 14 14 17 11 14 12

Morts 0 0 0 1 0 1

0,3

ppm

Total 15 14 16 15 14 14

Vius 14 13 16 15 12 13

Morts 1 1 0 0 2 1

1 ppm

Total 15 14 15 13 14 14

Vius 14 14 15 12 13 14

Morts 1 0 0 1 1 0

3 ppm

Total 14 14 14 15 16 15

Vius 12 14 13 15 16 15

Morts 2 0 1 0 0 0

10

ppm

Total 17 14 17 16 14 13

Vius 16 14 17 16 13 12

Morts 1 0 0 0 1 1

30

ppm

Total 16 15 14 14 17 15

Vius 5 4 5 9 10 13

Morts 11 11 9 5 7 2

60

ppm

Total 15 15 15 15 15 15

Vius 0 0 0 0 0 15

Morts 15 15 15 15 15 0


26

Taula resum


En aquesta gràfica s’observa que la mortalitat de les concentracions de 0,1 a 10 ppm no

ha variat respecte les 24 hpf i no es diferencia de la del control. En canvi, a la

concentració de 30 ppm la mortalitat ha augmentat un 30,26% respecte les 24 hpf.


CN 99 94 5

0,1 ppm 71 70 1

0,3 ppm 74 70 4

1 ppm 71 68 3

3 ppm 73 70 3

10 ppm 78 76 2

30 ppm 76 33 43

60 ppm 75 0 75

5,05 1,41 5,41 4,23 4,11 2,56

56,58

100,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00


% morts 48 hpf

(Fig. 45) Resum dels resultats de mortalitat a 48 hpf per les diferents




27

Taula de puntuació general de morfologia (GMS) a 48 hpf

Les concentracions de 0,1 a 3 ppm tenen la puntuació màxima ja que estaven ben

formats. Alguns dels embrions ja havien eclosionat. Per això, se’ls ha assignat una

puntuació de 0,5, tot i que en aquest període no es considera un tret puntuable. Els

embrions de 10 ppm no tenien els ulls ni el cos ben pigmentats, presentaven poc

moviment i no havien nascut. Gran part dels embrions de 30 ppm estaven morts i la resta

presentaven diverses malformacions. Els embrions de 60 ppm estaven tots morts.

5 Hatching: eclosió de l’ou.

CN

0,1 ppm

0,3 ppm

1 ppm

3 ppm

10 ppm

30 ppm

60 ppm

Max. score

Cua 3 3 3 3 3 3 0 0 3

Somite 1 1 1 1 1 1 0 0 1

Ulls 3 3 3 3 3 2 0 0 2 + 1

(pigment)

Moviment 1 1 1 1 1 0,5 0 0 1

Batec 1 1 1 1 1 1 0 0 1

Circulació 1 1 1 1 1 1 0 0 1

Pigmentació cap-cos

1 1 1 1 1 0,5 0 0 1

Pigmentació cua

1 1 1 1 1 0,5 0 0 1

Hatching5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0

GMS 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 9,5 0 0 12

(Fig. 47) Taula que mostra les puntuacions assignades als peixos zebra exposats a BPA a les 48 hpf.

28


















(Fig. 53) Embrions de peix

zebra exposats a 3 ppm de

BPA a les 120 hores post

fertilització.










29

Els embrions de 0,1 a 3 ppm de BPA havien nascut tots, presentaven moviment i estaven

ben formats i pigmentats. Però, mentre que els de 0,1 a 1 ppm eren aparentment

normals, gran part dels embrions exposats a 3 ppm tenien la cua lleugerament torta.

Alguns embrions exposats a 10 ppm no havien eclosionat i tots tenien malformacions a la

cua, presentaven edemes, estaven poc pigmentats i es movien poc.

Els embrions de 30 ppm estaven tots morts.

Taula de mortalitat



S’observa que a les concentracions de 0,1 a 3 ppm no hi ha hagut més mortalitat

respecte les 48 hpf. A la placa de 10 ppm ha augmentat la mortalitat i a la placa de 30

ppm han mort tots els embrions.


0,1

ppm

Total 14 14 17 12 14 13

Vius 14 14 17 11 14 12

Morts 0 0 0 1 0 1

0,3

ppm

Total 15 14 16 15 14 14

Vius 14 13 16 15 12 13

Morts 1 1 0 0 2 1

1 ppm

Total 15 14 15 13 14 14

Vius 14 14 15 12 13 14

Morts 1 0 0 1 1 0

3 ppm

Total 14 14 14 15 16 15

Vius 12 14 13 15 16 15

Morts 2 0 1 0 0 0

10

ppm

Total 17 14 17 16 14 13

Vius 5 14 15 10 13 12

Morts 12 0 2 6 1 1

30

ppm

Total 16 15 14 14 17 15

Vius 0 0 0 0 0 13

Morts 16 15 14 14 17 2

60

ppm

Total 15 15 15 15 15 15

Vius 0 0 0 0 0 15

Morts 15 15 15 15 15 0


30

Taula resum


En aquesta gràfica s’observa que la mortalitat de les concentracions de 0,1 a 3 ppm no

ha variat respecte les 24 hpf. En canvi, a la concentració de 10 ppm la mortalitat ha

començat a augmentar, concretament un 24,36%. Als 30 ppm, tots els embrions han

acabat morint.


CN 99 94 5

0,1 ppm 71 70 1

0,3 ppm 74 70 4

1 ppm 71 68 3

3 ppm 73 70 3

10 ppm 78 57 21

30 ppm 76 0 76

60 ppm 75 0 75

5,05 1,41 5,41 4,23 4,11

26,92

100,00 100,00

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00


% morts 120 hpf

(Fig. 58) Resum dels resultats de mortalitat a 120 hpf per les




31

2,56

26,32

100

2,56

56,58

100

26,92

100 100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

10 ppm 30 ppm 60 ppm

Variació mortalitat/temps

24 hpf

48 hpf

120 hpf

5.5 Gràfic de variació de mortalitat de 24 a 120 hpf

En aquesta taula s’observa que la mortalitat a la concentració de 10 ppm es manté

constant durant les 24 i les 48 hores post fertilització i augmenta a les 120 hpf. La

mortalitat a la concentració de 30 ppm augmenta progressivament durant tot l’experiment

fins a arribar al 100% i, a les 60 ppm tots els embrions estan morts al cap de 24 hpf.

L’experiment realitzat corrobora els resultats publicats per la LC50 en estudis anteriors,

que s’havien fixat a concentracions d’entre 1 i 20 ppm de BPA segons les condicions de

l’estudi. En el meu cas, la LC50 es troba entre 10 i 30 ppm, valors en els quals moren el

27% i el 100%, respectivament. Per determinar-la amb precisió, caldria repetir

l’experiment assajant diverses concentracions entre 10 i 30 ppm fins a trobar aquella que

causés el 50% de mortalitat en els embrions.

(Fig. 60) Representació gràfica del % de mortalitat respecte el temps de les

concentracions de 10, 30 i 60 ppm de BPA.

32

6. CONCLUSIONS

1. Tenint en compte els resultats obtinguts, s’observa que es comencen a veure efectes

morfològics en els embrions a partir de concentracions molt elevades del tòxic,

concretament a 10, 30 i 60 ppm.

2. De 0,1 a 1 ppm no s’observen malformacions en els embrions de peix zebra durant tot

l’experiment. Les larves exposades a 3 ppm presenten les cues lleugerament tortes al

cinquè dia d’exposició. Les exposades a 10 ppm comencen a mostrar efectes morfològics

lleus a partir de les 48 hpf i augmenten a les 120 hpf. A 30 ppm, les larves presenten

malformacions a partir de les 24 hpf.

3. La concentració de 10 ppm és inicialment poc tòxica per als embrions, però al cinquè

dia augmenta dràsticament la mortalitat. La de 30 ppm és bastant tòxica i la mortalitat va

augmentant progressivament a mesura que transcorren els dies, fins a arribar a la mort

de totes les larves. La de 60 ppm de BPA és una dosi mortal per als embrions de peix

zebra des de les 24 hpf.

4. L’exposició al tòxic produeix un retràs en el naixement de les larves a partir de 10 ppm

a les 48 hores post fertilització.

Diverses investigacions han demostrat que el BPA que contenen els recipients destinats

a envasar aliments migra al menjar que consumim en quantitats molt petites i, per tant, no

suposa un gran risc. Tot i així, les dades de l’Enquesta de l’Examen Nacional de Salut i

Nutrició (National Health and Nutrition Examination Survey) que realitzen periòdicament

els Centres de Control y Prevenció de Malalties (Centers o Disease Control and

Prevention) dels Estats Units, mostren que el nivell mitjà de Bisfenol A en l’orina d’una

mostra de la població americana s’havia duplicat entre els anys 1988-1994 i 2003-2004,

passant d’una concentració d’1,3 µg/l a una de 2,7 µg/l (d’1 ppm a 3 ppm

aproximadament). Segons els resultats que he obtingut en la meva investigació, aquestes

concentracions no són gaire nocives per als embrions, ja que semblaven aparentment

sans, a excepció d’algunes larves exposades a 3 ppm, que presentaven deformacions

lleus a les cues. Però, aquesta enquesta també exposava que un 5% d’aquesta població

presentava valors d’entre 5,2 µg/l i 15,9 µg/l de BPA a l’orina (entre 5 ppm i 16 ppm,

aproximadament). En els meus resultats, aquests valors ja eren nocius pels embrions

perquè a 10 ppm hi havia un augment de la mortalitat al cap de cinc dies d’exposició al

33

tòxic. És a dir, majoritàriament tenim concentracions baixes de BPA al cos, però sembla

que aquesta concentració augmenta a mesura que passen els anys. Així, es podria

arribar a un punt on els valors de BPA que tinguessin els éssers humans al cos serien

elevats i, per tant, perjudicials per la salut.

7. EXPRESSIÓ DEL GEN CYP19A1B

El BPA és un disruptor endocrí, és a dir, que és capaç de mimetitzar les hormones

naturals. La disrupció endocrina no només compromet el desenvolupament i la

reproducció de l’individu afectat, sinó que pot posar en perill la supervivència de l’espècie.

A més, és un compost estrogènic que pot interaccionar amb el receptor d’estrògens. És

capaç d’activar o inhibir l’expressió de gens que estiguin sota el control d’aquest receptor.

Per això, una vegada havíem observat els efectes que produïen les diferents dosis de

BPA en els embrions de Danio rerio, vam voler intentar determinar si l’expressió d’algun

d’aquests gens podia estar afectada per la presència del compost abans que es

comencessin a detectar efectes tòxics. La nostra hipòtesi era que és possible que el BPA

sigui capaç d’alterar el correcte funcionament o expressió de gens i proteïnes que afectin

diferents processos de l’organisme encara que en determinades concentracions del tòxic

no causi efectes morfològics evidents durant les primeres etapes del desenvolupament

que comprometin la viabilitat de l’embrió.

Per tal de contrastar la hipòtesi anterior, un cop els embrions van ser exposats durant 120

hores post fertilització a diverses concentracions de BPA, vam decidir mirar l’expressió

del gen cyp19a1b, aromatasa de cervell, que codifica l’aromatasa, un enzim implicat en la

síntesi d’estrògens i, per tant, relacionat amb la diferenciació sexual. Determina a cervell

si l’embrió serà mascle o femella, ja que converteix la testosterona (hormona masculina)

en estradiol (hormona femenina).

(Fig. 61) Esquema que mostra el canvi de la testosterona

a estradiol a través de l’enzim aromatasa.

34

(Fig. 62) Recipient

amb TRIzol ®

Reagent.

Per mirar l’expressió d’aquest gen, cal extreure el RNA dels embrions i, a través d’una

tècnica anomenada qRT-PCR o PCR en temps real, amplificar mostres de DNA.

El que esperàvem amb la realització de la investigació, tenint en compte que el BPA pot

afectar l’expressió de gens sota el control del receptor d’estrògens, era que els embrions

presentessin una alta expressió del gen cyp19a1b i, sobre tot, els exposats a

concentracions a les quals no havíem vist efectes morfològics, concretament les plaques

de 0,1 a 3 ppm. Si això fos així, significaria que el BPA és un compost tòxic i perjudicial

encara que no s’observin efectes morfològics.

7.1 Aïllament del RNA

Un cop els embrions van ser exposats al BPA durant cinc dies, els vaig traspassar dels

pous de les plaques a diversos tubs. Vaig repartir els embrions en dues mostres per cada

placa, exceptuant la concentració de 10 ppm que, a l’haver sobreviscut tan pocs

embrions, només n’hi va haver per una mostra. A continuació, vaig extreure tota l’aigua

dels tubs, els vaig congelar en neu carbònica i els vaig conservar a -80ºC.

Per poder mirar l’expressió d’algun gen, cal extreure el RNA i

convertir-lo en cDNA. Quan un gen s’expressa, té lloc la

transcripció de DNA a RNA missatger. Com més elevada sigui

l’expressió d’un gen, més molècules de mRNA s’hauran

sintetitzat. En canvi, seguirà havent-hi la mateixa quantitat de

DNA. Per això, per determinar l’expressió d’un gen, s’utilitza el

RNA en comptes del DNA. Per dur a terme aquest procés, vaig

utilitzar el TRIzol ® Reagent, un reactiu que s’utilitza per

l’aïllament de RNA, de mida gran o petita, a partir de mostres de

cèl·lules i teixits d’origen animal, vegetal, bacterià o de llevat.

Manté la integritat de l'RNA a causa de la inhibició de l'activitat de la RNasa, un enzim

que s’encarrega de la degradació dels àcids ribonucleics.

Un cop seguit el procediment per aïllar el RNA explicat a la pàgina 9 de l’annex, vaig

utilitzar un aparell anomenat Nanodrop que s’utilitza per calcular la concentració d’una

mostra.

35

(Fig. 63) Nanodrop 8000.

7.2 Nanodrop

El Nanodrop és un espectrofotòmetre per volums petits

(2µl) que llegeix l’absorbància d’àcids nucleics o

proteïnes d’una solució aquosa en diferents longituds

d’ona (espectre d’absorció). Té la capacitat de projectar

un raig de llum monocromàtica a través d’una mostra i

mesurar la quantitat de llum que aquesta absorbeix.

L’aparell està connectat a un ordinador que, mitjançant

un software específic, calcula automàticament la

concentració de la mostra .

Abans d’iniciar les lectures cal realitzar un blanc amb

aigua desionitzada per calibrar l’aparell posant-ne 2µl als

pous. El valor que la màquina calculi es restarà a les lectures que s’obtinguin de cada

mostra, perquè seran valors que correspondran a possibles impureses.

Un cop calculat el blanc, cal posar 2 µl als pous del Nanodrop de cada una de les mostres

de RNA extretes diluïdes 4 vegades per no saturar l’aparell i garantir que la lectura de la

concentració sigui fiable. Per diluir-les, s’agafen 2 µl de la mostra original i s’hi afegeixen

6 µl d’aigua desionitzada per obtenir una dilució 1:4.

L’absorbància màxima del RNA i de les proteïnes és a 260 i 280 nm, respectivament.

L’absorbància a 230 nm indica contaminació de la mostra, ja que s’absorbeixen

compostos orgànics. Per això, es realitzen relacions d’absorbància 260/280 i 260/230 nm,

ja que són un indicador de la puresa de la mostra. Els valors ideals per considerar les

mostres pures han d’estar entre 1,8 i 2,0 per la relació 260/280 i entre 2,0 i 2,2 per la

relació 260/230. Valors inferiors per ambdues relacions indicarien degradació o presència

de proteïnes, restes de fenol, provinent del TRIzol ® Reagent, o altres contaminants que

interferirien en les anàlisis posteriors. La corba que representa l’espectre d’absorció

també és indicadora de la puresa de la mostra.

36

Resultats Nanodrop6

6 Resultats de les lectures de les mostres de RNA a l’espectrofotòmetre. A la primera columna s’introdueix

el nom de la mostra. Els gràfics de la següent columna corresponen als espectres d’absorció entre 210 i 320 nm per cada una de les mostres. La resta de caselles indiquen els valors d’absorbància a 280 nm i 260 nm i les relacions 260/280 i 260/230. Finalment, a la columna de la dreta hi ha indicada la concentració en ng/µl de cada una de les mostres de RNA.

(Fig. 64-65) Dades obtingudes del Nanodrop.

37

(Fig. 66) Preparació de la placa

per a l’amplificació a la qRT-PCR.

Els espectres obtinguts, ordenats de menor a major concentració, no presenten cap

anomalia. A 260 nm es mostra l’absorbància màxima del RNA. Els valors obtinguts en les

relacions 260/280 i 260/230 es troben en el rang que es considera correcte i que

assegura la puresa de la mostra.

7.3 PCR en temps real o PCR quantitativa (qRT-PCR)

La PCR és una tècnica molt utilitzada en laboratoris per generar o amplificar una gran

quantitat de fragments de DNA a partir de quantitats molt petites d’una cadena motlle.

La qRT-PCR és una variant de la PCR que permet detectar a l’instant el DNA amplificat a

mesura que es va sintetitzant. Això s'aconsegueix afegint al medi de reacció un marcador

(en el meu cas Sybr Green) capaç d'intercalar-se en la doble cadena de DNA durant la

seva síntesi i emetre fluorescència, que serà detectada pels sensors de l'equip.

En la qRT-PCR, el motlle que s’utilitza és DNA complementari (cDNA), obtingut a partir

de la retrotranscripció del RNA utilitzant un enzim anomenat transcriptasa inversa. El

procediment de la transcripció inversa s’explica a la pàgina 12 de l’annex.

Per assegurar que els canvis que s’observen en el gen amplificat (en el meu cas el gen

cyp19a1b) no es deuen a variacions en la mostra, s’utilitza un gen de referència per

normalitzar les dades. Vaig utilitzar el gen ppia2 (peptidyl-prolyl isomerase A), un gen

implicat en el plegament de les proteïnes, perquè se sap que s’expressa de manera

constant durant el desenvolupament del peix zebra i que no es veu afectat per l’exposició

al BPA. Per tant, si varia durant l’amplificació, és degut a la quantitat de RNA o a

possibles errors de pipeteig. Utilitzar un gen de referència també serveix per comparar

l’expressió d’un gen d’interès en diferents mostres

independentment de la quantitat de mRNA que hi hagi

o l’eficiència de la reacció de retrotranscripció.

Simplement s’ha de calcular la relació que hi ha entre

els nivells d’expressió del nostre gen amb els del gen

normalitzador.

Per dur a terme l’amplificació, primer vaig omplir una

placa de 96 pous, dels quals en vaig ocupar 70, amb

les diferents mostres de cDNA. Per cada mostra vaig

38

(Fig. 67) Equip LightCycler

480 de Roche.

realitzar dos rèpliques biològiques, excepte per a la concentració de 10 ppm de BPA, tal i

com s’explica a l’apartat Aïllament del RNA. A més, vaig utilitzar tres pous de la placa per

cada mostra per poder realitzar la mitjana i minimitzar possibles errors experimentals, de

manera que vaig omplir 35 pous per cada gen a amplificar, és a dir, pel gen de referència

(ppia2) i pel gen d’interès (cyp19a1b). Dos d’aquests 35 pous corresponen al Non

Template Control7. Un cop omplerta la placa, s’havia d’introduir en l’aparell per tal

d’amplificar les mostres.

L'estudi es va dur a terme a l'equip LightCycler 480 de Roche. Per realitzar l’amplificació,

es fan 45 cicles, en els quals s’escalfen i es refreden els fragments de DNA en els

següents passos:

- Desnaturalització: s’escalfa el DNA a 95ºC durant 10

segons per desnaturalitzar-lo i permetre la separació

de les dues cadenes.

- Hibridació de l’encebador i extensió de la cadena: es

refreda a 60ºC durant 30 segons per permetre que

els encebadors8 s’uneixin a la seqüència

complementària del DNA motlle i s’activi l’enzim

polimerasa, que comença a sintetitzar una nova

cadena de DNA complementària en direcció 5’ → 3’

partint de l’encebador.

7 Non Template Control (NTC): és una barreja que conté tots els reactius utilitzats excepte DNA. La qPCR és

una tècnica molt sensible i sempre cal posar-hi un control negatiu que no s’ha d’amplificar. En cas que en aquest control hi hagués senyal d’amplificació, significaria que els reactius estan contaminats i no ens podríem fiar dels resultats obtinguts. 8 Encebadors: seqüències curtes de nucleòtids que són reconegudes per l’enzim polimerasa i que permeten

que s’iniciï la reacció. Són específics per el gen que ens interessa i delimiten la zona de DNA que es vol amplificar.

39

Al final del procés, s’obté un gràfic com aquest:

La línia base són els cicles en els quals no hi

ha canvis detectables en la quantitat de

fluorescència. En canvi, en la part

exponencial es produeix un canvi significatiu

en la fluorescència. A l’inici d’aquesta part, les

rèpliques s’amplifiquen de manera molt

similar. Però, a mesura que transcorre la

reacció, aquesta no es realitza amb la

mateixa eficiència i es produeix una

divergència en la part lineal de la corba. Per

aquest motiu, el paràmetre que s’ha d’utilitzar

per comparar amb les diferents mostres

s’agafa de la part exponencial, on hi ha

menys error experimental.

Els gràfics que vaig obtenir dels dos gens són els següents:

(Fig. 68) Representació dels valors de

fluorescència d’una qRT-PCR de tres

rèpliques d’una mateixa mostra. L’eix vertical

representa la quantitat de fluorescència i l’eix

horitzontal representa el número de cicles.

(Fig. 69) Gràfica d’amplificació de PCR en temps real del gen cyp19a1b.

40

(Fig. 71) Aquest esquema mostra, de manera resumida, el procés per el qual passa una mostra des

de que s’extreu d’un teixit fins que es fa la PCR en temps real.

Primer, extraiem el RNA dels teixits de la mostra de la qual disposem. Després, es realitza la

transcripció inversa per obtenir cDNA i finalment es fa la qRT-PCR en la que, primerament, es

desnaturalitza el DNA i, seguidament, s’uneix l’encebador i s’estén la cadena. Finalment, es repeteix

aquest procés 45 cicles, en els quals s’emet fluorescència i s’obté el gràfic d’expressió del gen.

(Fig. 70) Gràfic d’amplificació de PCR en temps real del gen ppia2.

41

n

o ENN )1(

(Fig. 72) Equació que defineix el

comportament exponencial de la

PCR.

N és el número de molècules

acumulades en el cicle n. No és la

quantitat de molècules de partida. E

és l’eficiència de la reacció.

L'equació que defineix el comportament exponencial de la PCR és:

Per calcular el nombre de molècules de partida cal

conèixer el cicle n de l'equació, anomenat cicle de

quantificació (Cq). Aquest cicle es calcula en la part

exponencial de la corba d'amplificació i és el cicle en

el qual la fluorescència supera clarament el soroll de

fons. El software de l'equip calcula els valors del Cq

per totes les mostres estudiades. Per cada mostra

tinc dos valors de Cq, un pel gen d'interès i un altre

pel gen de referència.

Les dades són exportades al programa Excel per poder fer els càlculs:

- En primer lloc vaig fer la mitjana de les rèpliques biològiques i els triplicats

experimentals. Això dóna un valor promig de Cq per el ppia2 i per el cyp19a1b.

- Aplicant la fórmula a aquests resultats vaig obtenir l'expressió normalitzada del

gen cyp19a1b respecte les diferents concentracions de BPA assajades, que

podem representar gràficament.

(Fig. 73) Gràfic d’expressió del gen cyp19a1b per les dues rèpliques del control i de les diferents


0

5

10

15

20

25

Control 0,1 ppm 0,3 ppm 1 ppm 3 ppm 10 ppm

%00 c

op

ies n

orm

alitz

ad

es d

el

gen

cyp

19a1b

Concentració BPA

Expresió del gen cyp19a1b

Rpl1

Rpl2

42



120 hpf. S’observa que té un

edema.



120 hpf. Té un edema i una

lleugera deformació a la cua.

8. CONCLUSIONS

1. Segons el gràfic de la figura 73, a 1 ppm de BPA sembla que es comença a observar

algun efecte, ja que l’expressió del gen cyp19a1b és bastant més elevada que la del

control, però no es pot assegurar que sigui estadísticament significatiu. S’observa que

l’expressió del gen es dispara clarament a 3 ppm de BPA. A 10 ppm l’expressió és encara

més elevada que en les altres concentracions.

2. A partir d’aquests resultats, es confirma que el BPA és un disruptor endocrí capaç

d’alterar l’equilibri hormonal. Actua com un compost estrogènic capaç d’activar l’expressió

de gens sota el control del receptor d’estrogens, concretament el gen cyp19a1b,

aromatasa de cervell, que codifica l’aromatasa, un enzim relacionat amb la diferenciació

sexual. Per tant, és un compost femnitzador. A partir de 3 ppm de concentració, produeix

una alteració en l’expressió del gen cyp19a1b, que fa que se sintetitzin els estrògens, les

hormones femenines.

9. CONCLUSIONS GENERALS

Si comparem els resultats obtinguts en els efectes morfològics i mortalitat observats en

les exposicions de BPA amb els de l’alteració de gens podem concloure el següent:

- En les observacions microscòpiques només es comencen a detectar clarament

alteracions i malformacions en les larves de 120 hpf exposades a 10 ppm del

tòxic. Aquests embrions presentaven una alta mortalitat i malformacions de la cua

i edemes.

43

2,56

26,32

100

2,56

56,58

100

26,92

100 100

0

20

40

60

80

100

10 ppm 30 ppm 60 ppm

Variació mortalitat/temps

24 hpf

48 hpf

120 hpf



120 hpf. No presenta cap

efecte morfològic evident.

(Fig. 78) Embrions de peix

zebra exposats a 3 ppm de

BPA a les 120 hpf. Tenen una

lleugera deformació a la cua.

- Les anàlisis de la qRT-PCR mostren que a partir de 3 ppm el BPA ja és capaç

d’alterar notablement l’expressió de l’aromatasa de cervell, tot i que a aquesta

concentració no es detecta mortalitat ni efectes morfològics evidents, a excepció

d’uns quants embrions, que presentaven una lleugera deformació de la cua.

(Fig. 76) Representació gràfica del % de mortalitat respecte el

temps de les concentracions de 10, 30 i 60 ppm de BPA.

44

10. VALORACIÓ FINAL

L’objectiu d’aquest treball era investigar els efectes tòxics que produeix el Bisfenol A en

els éssers vius, ja que aquest compost és molt utilitzat en la industria per fabricar,

sobretot, envasos destinats a contenir aliments. Amb la recerca que he realitzat, he pogut

comprovar que aquest tòxic causa diversos efectes morfològics en embrions de peix

zebra i, a dosis molt elevades, els produeix la mort. A més, al mirar l’expressió del gen

cyp19a1b, que codifica l’aromatasa, un enzim implicat en la síntesi d’estrògens, he vist

que el BPA no només pot produir efectes morfològics adversos, sinó que també pot influir

en el correcte desenvolupament dels diferents processos de l’organisme. Amb això, es

demostra que el BPA pot ser nociu per els éssers vius, tant a nivell morfològic com

genètic i, per tant, es confirmen les meves hipòtesis inicials, que eren:

- El BPA és un compost tòxic que causa diversos efectes adversos en els éssers

vius.

- És possible que el BPA sigui capaç d’alterar el correcte funcionament o expressió

de gens i proteïnes que afectin diferents processos de l’organisme encara que en

determinades concentracions del tòxic no causi efectes morfològics evidents

durant les primeres etapes del desenvolupament que comprometin la viabilitat de

l’embrió.

Un cop acabada aquesta experimentació, es podrien seguir altres línies de recerca per

determinar altres efectes, fixar paràmetres de toxicitat, etc., com per exemple:

- Com ja he mencionat a la pàgina 38, es podria repetir l’experiment per determinar

la LC50 entre les concentracions de 10 i 30 ppm i, així, concretar la dosi que

produeix la mort del 50% dels embrions, ja que, entre aquestes dues

concentracions, moren entre el 27% i el 100% de les larves.

- Com que hem determinat que el BPA és un feminitzador que afecta el gen

cyp19a1b, aromatasa de cervell, que determina si l’embrió serà mascle o femella

i, a més, sabem que actua sobretot en les primeres etapes del desenvolupament,

seria interessant exposar embrions a una concentració de BPA que no causi

efectes evidents però on l’expressió del gen es vegi afectada, és a dir, a 3 ppm de

BPA, i seguir el desenvolupament dels peixos fins la vida adulta per intentar

concretar, per exemple, si es veu afectada la proporció de sexes.

45

- També es podria realitzar el mateix experiment amb altres gens per tal de

corroborar que el BPA és un disruptor endocrí.

- Fins i tot, ja que el BPA és molt utilitzat en la fabricació d’envasos, es podrien

realitzar mescles amb altres productes que hi fossin presents per observar si

tenen un efecte additiu que produeixi que l’expressió dels gens sigui més elevada.

- A més, com que el BPA s’ha considerat un compost tòxic i, a més, s’ha prohibit la

seva utilització per fabricar biberons, es podria fer un estudi en humans per

observar l’efecte que podria causar.

Dur a terme aquesta recerca als laboratoris del CSIC m’ha permès experimentar com és

treballar en una investigació real. He pogut entrar en contacte amb les diferents eines de

treball d’un laboratori, així com veure com són les instal·lacions. M’ha semblat molt

interesant poder incorporar-me en una recerca.

Agraïments

Ara que he finalitzat aquest Treball de Recerca, m’agradaria donar les gràcies a totes

aquelles persones que m’han ajudat durant la investigació que he realitzat i que m’han

dedicat el seu temps per ensenyar-me la manera de treballar en un laboratori.

Primer de tot, voldria donar les gràcies al Dr. Benjamí Piña, que em va permetre

incorporar-me al seu laboratori per col·laborar en una de les seves línies de recerca i que

em va iniciar en el món de la toxicologia ambiental des dels àmbits de la química i de la

biologia molecular i del desenvolupament.

També voldria agrair a Marta Casado totes les hores que va passar amb mi per ajudar-

me a calcular les diferents operacions que s’havien de realitzar i a explicar-me tota la part

teòrica dels diferents procediments, així com guiar-me durant les experimentacions amb

les dissolucions de BPA i la tècnica de la qRT-PCR.

I, finalment, a la Dra. Eva Prats, que em va permetre treballar a les instal·lacions

aquàtiques del centre i em va ajudar a manipular els peixos i els embrions.

46

11. Bibliografia i webgrafia

Barrallo, A. (2007). “El Pez Zebra Como Organismo Modelo”. Animales de laboratorio 35:

11-18.

“Curso de Introducción a los Disruptores Endocrinos”. (2004). ISTAS (Instituto Sindical

de Trabajo, Ambiente y Salud).

García-Mayor, R.V. et al. (2012). “Disruptores endocrinos y obesidad: obesógenos”.

Endocrinología y Nutrición 56: 261-267.

ISO 15088 International Standard. (2007). “Water quality – Determination of the acute

toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio)”.

Kimmel, C.B. et al. (1995). “Stages of Embryonic Development of the Zebrafish”.

Developmental Dynamics 203: 255-310.

Matthews, M., Trevarrow, B. and Matthews, J. (2002). “A Virtual Tour of the Guide for

Zebrafish Users”. Lab Animal 31: 34-40.

OECD 210 (1992). “OECD guideline for testing of chemicals: fish, early-life stage toxicity

test”.

Olivares, A. (2011). “Desenvolupament i Aplicació de Bioassaigs per a la Monitorització

Ambiental de Lligands del Receptor d’Hidrocarburs d’Aril (AhR, Compostos Tipus

Dioxina)”. Tesi doctoral, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona.

Raldúa. D. (2012). “Zebrafish as a vertebrate model to assess sublethal effects and health

risks of emerging pollutants”. In: Emerging Organic Contaminants and Human Health. The

Handbook of Environmental Chemistry, p. 395-414. Springer Berlin Heidelberg. ISBN 978-

3-642-28132-7

Reed, B. and Jennings, M. (2010). “Guidance on the housing and care of Zebrafish Danio

rerio”. Research Animals Department, Science Group (RSPCA)

Sanne A.B. Hermsen. (2011). “Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a

modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies”.

Toxicology in Vitro 25: 745–753

47

Danio rerio característiques

http://ca.wikipedia.org/wiki/Peix_zebra

http://daniorerio.info/index.php?option=com_content&view=article&id=13&Itemid=15

http://essersmodelics.csic.es/peix.html

TRizol Reagent

http://www.medsci.uu.se/digitalAssets/85/85502_TRIzol_Method__2_.pdf

https://products.invitrogen.com/ivgn/product/15596026

BPA

http://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/subdetalle/BisfenolA.shtml

http://www.bisphenol-a-europe.org/es_ES/science-2/migration-2

http://www.imim.es/imimat/2010/01/disruptors-hormonals-o-%20endocrins/ca/

http://www.vivosano.org/Portals/13/rs/doc/bpa_largo.pdf

Nanodrop

http://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf

http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-

Purity-Ratios.pdf

PCR

http://digital.csic.es/bitstream/10261/54512/1/Tesis_Ana_Cristina_S%C3%A1nchez_D%C

3%ADaz.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/PCR_en_tiempo_real

http://es.wikipedia.org/wiki/RT-PCR

http://www.ehu.es/SGIker/es/expresion_genica/documentos/analisis_de_expresion.pdf

Símbols de risc químic

http://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADmbolo_de_riesgo_qu%C3%ADmico

http://www.ugr.es/~quiored/lab/seguridad/pictograma.htm

http://ca.wikipedia.org/wiki/Peix_zebra

http://daniorerio.info/index.php?option=com_content&view=article&id=13&Itemid=15

http://essersmodelics.csic.es/peix.html

http://www.medsci.uu.se/digitalAssets/85/85502_TRIzol_Method__2_.pdf

https://products.invitrogen.com/ivgn/product/15596026

http://www.aesan.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/subdetalle/BisfenolA.shtml

http://www.bisphenol-a-europe.org/es_ES/science-2/migration-2

http://www.imim.es/imimat/2010/01/disruptors-hormonals-o-%20endocrins/ca/

http://www.vivosano.org/Portals/13/rs/doc/bpa_largo.pdf

http://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf

http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

http://digital.csic.es/bitstream/10261/54512/1/Tesis_Ana_Cristina_S%C3%A1nchez_D%C3%ADaz.pdf

http://digital.csic.es/bitstream/10261/54512/1/Tesis_Ana_Cristina_S%C3%A1nchez_D%C3%ADaz.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/PCR_en_tiempo_real

http://es.wikipedia.org/wiki/RT-PCR

http://www.ehu.es/SGIker/es/expresion_genica/documentos/analisis_de_expresion.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADmbolo_de_riesgo_qu%C3%ADmico

http://www.ugr.es/~quiored/lab/seguridad/pictograma.htm

ÍNDEX 1. MATERIAL UTILITZAT............................................................................................................... 2

2. MESURES DE SEGURETAT ................................................................................................... 3

2.1 Com anar vestit al laboratori ............................................................................................... 3

2.2 Manipulació de productes químics ..................................................................................... 3

2.3 Símbols de risc químic ......................................................................................................... 4

3. CÀLCUL DE LES DISSOLUCIONS ......................................................................................... 5

4. AÏLLAMENT DEL RNA ............................................................................................................... 9

4.1 Procediment ........................................................................................................................... 9

4.2 Precaucions ......................................................................................................................... 11

5. TRACTAMENT AMB DNASA ................................................................................................. 11

6. TRANSCRIPTASA INVERSA ................................................................................................. 12

2

(Fig. A1) Vas de

precipitats.

(Fig. A2) Proveta.

(Fig. A4) Gradeta.

(Fig. A3) Pipeta

manual.

1. MATERIAL UTILITZAT

Durant tota l’experimentació, vaig utilitzar diferents materials i equips de laboratori. A

continuació, he fet una breu presentació dels estris que més vaig utilitzar:

- Vas de precipitats: recipient cilíndric de vidre molt utilitzat per preparar o escalfar

substàncies o traspassar líquids.

- Proveta graduada: instrument que permet mesurar volums.

- Pipeta manual: instrument que permet mesurar volums de manera precisa. Estan

formades per un èmbol que, al ser pressionat, expulsa el líquid o aire que conté la

punta i, al deixar-lo anar, absorbeix la quantitat de líquid que s’ha establert fent girar

una rodeta. Depenent de la quantitat de líquid que vulguem agafar, utilitzarem una

pipeta o una altra, ja que n’hi ha de diverses mides.

- Gradeta: objecte de plàstic de forma allargada que permet sostenir tubs d’assaig.

- Lupa binocular: instrument format per diverses lents que permet obtenir una imatge

augmentada de l’objecte que observem, fent perceptible allò que no es veu a ull nu.

- Centrifugadora: màquina que posa en rotació una o diverses mostres per separar els

seus components o fases per la força centrífuga. A l'hora d'usar-la s'ha d'equilibrar,

és a dir, s'han de posar mostres de manera simètricament i amb el mateix volum per

tal d’aconseguir el mateix pes. Si no es realitza aquest procés, l’aparell podria

espatllar-se.

- Vòrtex: és un tipus d'agitador que s'usa per homogeneïtzar el contingut de petits tubs

o flascons de líquid. Es compon d'un motor elèctric unit a un tros de goma o cautxú

en forma de copa. A mesura que el motor gira, la peça de cautxú oscil·la ràpidament

en un moviment circular.

- Forn d’hibridació: aparell utilitzat per escalfar mostres a una temperatura i durant un

temps determinats.

3

(Fig. A5) Lupa

binocular.

(Fig. A6)

Centrifugadora.

(Fig. A7) Vòrtex.

(Fig. A8) Forn

d’hibridació.

2. MESURES DE SEGURETAT

Per treballar en un laboratori s’han de seguir diverses normes bàsiques per tal de garantir

la seguretat tant personal com la de la resta de treballadors. S’ha de tenir en compte la

manera de vestir , el correcte ús del material i la manipulació dels productes químics que

hi pugui haver a la zona de treball, ja que poden ser perillosos si es manipulen sense

compte. A continuació, s’expliquen algunes d’aquestes regles que permeten evitar els

riscs per les persones. Al centre vaig assistir a una jornada d’introducció a les normes de

prevenció i seguretat als laboratoris.

2.1 Com anar vestit al laboratori

L’ús de bata, preferentment de cotó, és obligatori, ja que són inevitables les esquitxades

de productes tòxics. S’han d’utilitzar guants adients per cada tasca.

L’ús d’ulleres de seguretat és obligatori sempre que s’estigui al laboratori. Si un producte

químic entra en contacte amb els ulls, s’ha d’utilitzar immediatament un rentaulls i rentar

l’ull aproximadament durant 15 minuts. Si es necessari, s’ha de demanar assistència

mèdica.

2.2 Manipulació de productes químics

Els productes químics poden ser perillosos per les seves propietats tòxiques, corrosives,

inflamables o explosives. S’ha de comprovar el correcte etiquetatge d’ampolles i

recipients, així com etiquetar amb precisió les solucions preparades al laboratori.

4

(Fig. A9)

Pictograma de

seguretat:

comburent.

(Fig. A11)

Pictograma de

seguretat:

corrosiu.

(Fig. A10)

Pictograma de

seguretat:

explosiu.

(Fig. A12)

Pictograma de

seguretat:

inflamable.

La majoria de productes químics orgànics són inflamables. Per això cal evitar la presència

de flames sempre que sigui possible.

No s’han d’inhalar els vapors dels productes químics. S’ha de treballar en vitrines

extractores, especialment quan es manipulen productes tòxics, irritants, corrosius o

lacrimògens.

2.3 Símbols de risc químic

Els símbols de risc químic són pictogrames que es troben en les etiquetes dels productes

químics i serveixen per informar sobre el risc que pot comportar l’ús, la manipulació, el

transport i l’emmagatzematge de la substància. S’han de tenir en compte abans d’utilitzar

algun producte. Alguns d’aquests símbols són:

- Comburent: substàncies que, en contacte amb altres substàncies, especialment

inflamables, produeixen una reacció fortament exotèrmica.

- Explosiu: substàncies que poden reaccionar ràpidament de forma exotèrmica i

explotar en determinades condicions, fins i tot en absència d oxigen.

- Corrosiu: substàncies que, a l’entrar en contacte amb aquestes, es destrueix el

teixit viu i altres materials.

- Inflamable: substàncies que cremen amb facilitat.

- Irritant: substàncies que produeixen irritació sobre la pell, ulls i sistema respiratori.

- Perillós per el medi ambient: substàncies que afecten de manera irreversible el

medi ambient.

- Tòxic: substàncies que per inhalació, ingestió o penetració cutània poden produir

riscos per la salut.

5

(Fig. A13)

Pictograma de

seguretat:

irritant.

(Fig. A14)

Pictograma de

seguretat:

perillós per el

medi ambient.

(Fig. A15)

Pictograma de

seguretat: tòxic.

3. CÀLCUL DE LES DISSOLUCIONS

En aquest apartat s’expliquen els diferents càlculs que vaig realitzar per obtenir les set

concentracions de BPA que vaig utilitzar per l’experimentació. La fórmula que vaig utilitzar

era:

La C correspon a la concentració i la V al volum de la mescla. La concentració inicial pel

volum inicial ha de ser igual a la concentració pel volum que s’obtingui al final.

Les operacions que vaig realitzar són les següents:

Quina concentració necessito en 25 µl de DMSO per obtenir una concentració de 60

ppm en 25 ml?

25 ml ·

= 25000 µl

C · 25 µl = 60 ppm · 25000 µl C = 60000 ppm

Quina quantitat de BPA he de posar per obtenir 1 ml de DMSO a 60000 ppm?

1 ml DMSO ·

·

·

= 0,06 g BPA

Vaig agafar 1 ml de DMSO i hi vaig afegir 0,06 g de BPA per obtenir un stock a 60000

ppm. A partir d’aquí, vaig preparar les dissolucions que necessitàvem.

6

60 ppm

Quin volum he d’agafar d’una solució de 60000 ppm per obtenir una solució de 60

ppm en 25 ml?

V = 0,025 ml = 25 µl DMSO + BPA

30 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,0125 ml = 12,5 µl DMSO + BPA

10 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,00417 ml = 4,17 µl DMSO + BPA

Com que, per preparar la dissolució amb una concentració de 10 ppm havia d’agafar una

quantitat molt petita del stock que tenia, vaig preparar una dissolució menys concentrada

a partir de la dissolució de 60000 ppm.


ppm en 25 ml?

25 ml ·

= 25000 µl

C · 25 µl = 10 ppm · 25000 µl C = 10000 ppm

Quin volum he d’agafar d’una solució de 60000 ppm per obtenir una solució de

10000 ppm en 1 ml?

V = 0,167 ml = 167 µl DMSO + BPA

És una quantitat massa petita

7

Com que volem un volum final de 1 ml hi vaig afegir més DMSO:

1000 µl – 167 µl DMSO + BPA = 833 µl DMSO

10 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,025 ml = 25 µl DMSO + BPA

3 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,0075 ml = 7,5 µl DMSO + BPA

1 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,0025 ml = 2,5 µl DMSO + BPA

Com que, per preparar la dissolució amb una concentració de 1 ppm havia d’agafar una

quantitat molt petita del stock de 10000 ppm, vaig tornar a preparar una dissolució menys

concentrada a partir d’aquest.


ppm en 25 ml?

25 ml ·

= 25000 µl

C · 25 µl = 1 ppm · 25000 µl C = 1000 ppm


8

Quin volum he d’agafar d’una solució de 10000 ppm per obtenir una solució de

1000 ppm en 1 ml?

V = 0,1 ml = 100 µl DMSO + BPA

Com que volem un volum final de 1ml hi vaig afegir més DMSO:


1 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,025 ml = 25 µl DMSO + BPA

0,3 ppm

Quin volum he d’agafar d’una solució de 1000 ppm per obtenir una solució de 0,3

ppm en 25 ml?

V = 0,0075 ml = 7,5 µl DMSO + BPA

0,1 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,0025 ml = 2,5 µl DMSO + BPA

Per preparar la dissolució amb una concentració de 0,1 ppm havia d’agafar una quantitat

molt petita, vaig preparar una dissolució menys concentrada a partir del stock de 1000

ppm.

Quina concentració necessito en 25 µl per obtenir una concentració de 0,1 ppm en

25 ml totals?

C · 25 µl = 0,1 ppm · 25000 µl C = 100 ppm


9


ppm en 1 ml?

V = 0,1 ml = 100 µl DMSO + BPA

Com que volem un volum final de 1ml hi vaig afegir més DMSO:


0,1 ppm


ppm en 25 ml?

V = 0,025 ml = 25 µl DMSO + BPA

4. AÏLLAMENT DEL RNA

En aquest annex s’explica el procediment que vaig seguir per aïllar el RNA de les mostres

de teixit dels embrions de peix zebra que havien estat exposats al tòxic al cap de 120 hpf.

4.1 Procediment

1. Per aïllar el RNA de les mostres, afegir 500 µl TRIzol ® Reagent a cadascuna en dues

fases: primer, afegir 100 µl i triturar les larves amb un homogeneïtzador per disgregar els

Placa

Concentració

BPA

(ppm)

Concentració

stock BPA

(ppm)

Volum

stock

(µl)

Volum

DMSO

(µl)

Volum

H₂0

(ml)

CN - - 25

25

1 0,1 100 25 -

2 0,3 1000

7,5 17,5

3 1 25 -

4 3 10000

7,5 17,5

5 10 25

6 30 60000

12,5 12,5

7 60 25 -

(Fig. A16) Dades per la preparació de 25 µl de dissolució de BPA per les set concentracions diferents.

10

(Fig. A17) Trituració de

les larves de peix zebra

amb el TRIzol ®

Reagent.

(Fig. A18) Eppendorf

on s’observen les

dues fases formades

pel cloroform.

(Fig. A19) Extracció de

la fase aquosa.

teixits. Després, afegir 400 µl més i continuar triturant-les. Com que les mostres tenen un

alt contingut de proteïnes, lípids i material extracel·lular, centrifugar 10 min a 4ºC per

eliminar aquests compostos, així com molècules de DNA d’elevat pes molecular.

Transferir amb una pipeta el sobrenedant, que conté el RNA, a un altre eppendorf.

2. A continuació, afegir 100 µl de cloroform (Cl₃CH), agitar amb un vòrtex i centrifugar 10

min a 4ºC. Això afavoreix la formació de dues fases, tal com es veu a la figura A3: la fase

inferior orgànica, de color vermell, conté cloroform i fenol provinent del TRIzol ® Reagent.

La fase superior aquosa conté el RNA. A més, es forma una interfase que conté lípids i

proteïnes.

3. Transferir la fase aquosa a un nou tub i afegir 250 µl d’isopropanol per precipitar el

RNA. Després d’incubar-ho durant 10 min a temperatura ambient, centrifugar-ho 10 min a

4ºC. El RNA formarà un precipitat transparent al fons del tub.

4. Extreure amb cura el líquid superior i afegir 500 µl d’etanol al 75% per eliminar restes

de sals del medi. Centrifugar 5 min a 4ºC i extreure tot l’etanol.

5. Afegir 20 µl d’aigua desionitzada tractada amb DEPC (Dietilpirocarbonat) per inactivar

possibles RNAses, que degradarien el RNA. Finalment, escalfar 10 min a 60ºC. En

aquest punt, el RNA es pot conservar indefinidament congelat a -80ºC.

11

(Fig. A20) Campana

d’extracció.

4.2 Precaucions

Per prevenir la contaminació de les mostres amb RNAses

durant l’aïllament del RNA, s’han de tenir en compte certes

precaucions:

- Portar sempre guants d’un sol ús per evitar que la pell

contamini la mostra.

- Utilitzar material estèril i pipetes automàtiques reservades

per treballar amb RNA.

A més, s’ha de treballar dins d’una campana d’extracció per

evitar respirar els vapors tòxics dels reactius utilitzats.

5. TRACTAMENT AMB DNASA

La DNasa o Desoxiribonucleasa I és un enzim que degrada específicament el DNA.

S’utilitza per eliminar possibles restes de DNA en preparacions de RNA abans d’utilitzar-

les per la qRT-PCR.

1. A partir de la lectura del Nanodrop, calcular el volum necessari a agafar per posar 5 µg

de RNA.

2. Preparar una “mix” amb 5 µl de tampó per la DNasa (conté sals per fixar el pH i

magnesi, imprescindible per al funcionament de l’enzim) i 1 µl de DNasa.

3. Afegir 6 µl de la “mix” a cada tub, els quals contenen 5 µg de RNA.

4. Afegir aigua desionitzada per aconseguir un volum final de 50 µl.

5. Agitar suaument i incubar a 37ºC durant 30 min.

6. Posar en gel. Afegir EDTA a una concentració final de 5 mM per aturar la reacció.

7. Incubar a 75ºC durant 10 min.

8. Conservar a -20ºC fins a la seva posterior utilització.

12

6. TRANSCRIPTASA INVERSA

En la qRT-PCR, el motlle que s’utilitza és DNA complementari (cDNA), que s’obté a partir

de la retrotranscripció del RNA utilitzant un enzim anomenat transcriptasa inversa. A

continuació s’expliquen els passos a seguir per preparar una mix per obtenir cDNA:

1. La RT (Reverse transcription) es fa en 1 µg de RNA tractat amb DNasa. Com que

tenim 5 µg de RNA en 50 µl, agafarem 10 µl i hi afegim 2 µl d’aigua i 1 µl d’oligo dT9.

2. Incubar durant 10 min a 65ºC. Immediatament, posar en gel.

3. Preparar una mix amb 4 µl de tampó, 2 µl de dNTPs10, 0,5 µl de RNAse inhibidor i 0,5

µl Transcriptor RT enzyme.

4. Afegir 2 µl de la mix a cada tub.

5. Incubar 1h a 50ºC. Incubar 5 min a 85ºC. Posar en gel.

9 Oligo dT: oligonucleòtid de 12 a 18 timidines que s’uneix específicament a les cues poliadenilades del RNA

missatger. 10

dNTPs: barreja dels quatre desoxinucleòtids (A, G, C i T) per la síntesi de les cadenes de DNA.

Mostra (ppm)

RNA Nanodrop (ng/µl)

RNA real (ng/µl)

Volum RNA per 5

µg (µl)

Enzim + Buffer (µl)

Volum H20 (µl)

CN - 1 722,3 2889,2 1,73 6 42,27

0,1 - 1 772,7 3090,8 1,62 6 42,38

0,3 - 1 800,5 3202,0 1,56 6 42,44

1 - 1 577,9 2311,6 2,16 6 41,84

3 – 1 573,8 2295,2 2,18 6 41,82

CN - 2 652,7 2601,8 1,92 6 42,08

0,1 – 2 753,7 3014,8 1,66 6 42,34

0,3 - 2 585,2 2340,8 2,14 6 41,86

1 - 2 609,0 2436,0 2,05 6 41,95

3 – 2 463,3 1853,2 2,70 6 41,30

10 – 2 169,9 679,6 7,36 6 36,64

(Fig. A21) Dades per la preparació de 50 µl de dissolució per totes les mostres.

Índex › rcs_gene › treballs_recerca › 2013-2014-04-1-tr.pdfels éssers vius però que no...

Documents