mutaciones en proteínas de unión al telómero mutaciones en la telomerasa acortamiento del...
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Mutaciones en proteínas de unión al telómero Mutaciones en la telomerasa Acortamiento del telómero
DESENCADENAN SIMILARES RESPUESTAS CELULARES:
Fusión cromosómicaArresto del ciclo celularApoptosis dependiente de p53
DISTINTOS MECANISMOS QUE PRODUCEN DISFUNCIÓN
TELOMÉRICA
TELOMERASA
Transcriptasa inversa que añade repeticiones teloméricas al final de los cromosomas para compensar la pérdida de secuencias que se produce durante la replicación del DNA.
Su ausencia provoca el acortamiento paulatino del telómero.
El progresivo acortamiento desencadena la pérdida de función telomérica.
CONSECUENCIAS DE LA
AUSENCIA DE TELOMERASAGenerar especies de ratones Knock out
telomerasa mTR -/-
ACORTAMIENTO DE LOS TELOMEROS
Blasco et al 1997
RATONES Knock out mTR -/-
Para generar ratones deficientes en la actividad de la telomerasa se delecionó la copia del gen ARN telomerasa (mTR) de la línea germinal.
Mediante Southern blot se determinó la presencia de una única copia del gen.
Para delecionar el gen mTR se construyó el plásmido pPNT-mTRΔ, el que reemplazó el gen mTR completo con un gen de resistencia a la neomicina.
Los ratones mTR-/- carecen de actividad detectable de la telomerasa aunque fueron viables por seis generaciones.
Gene Replacement and
Transgenic Animals
G1
G3
G6
•Telomeros normales
•Fenotipo WT
GENERACIONES DE RATONES mTR -/- (Gen de la telomerasa Knock out)
•Telomeros cortos
•Fenotipo WT
•Telomeros muy cortos
•Fusion de los extremos de los cromosomas
•Apoptosis de células germinales
•Alta tasa de infertilidad
AUSENCIA DE TELOMERASA
OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL Establecer si para la viabilidad celular y la
estabilidad cromosómica es determinante
el largo promedio de los telómeros
o el acortamiento crítico de los mismos
Apoptosis por una disminucion del
largo promedio de los telomeros
Apoptosis por un acortamiento crítico del
telomero de un cromosoma
PRIMER EXPERIMENTOPRIMER EXPERIMENTO
Los telómeros cortos inician la respuesta celular en mTR-/-
mTR -/- (G6)
TELOMEROS CORTOS
SIN TELOMERASA
mTR +/-
TELOMEROS LARGOS
CON TELOMERASA
mTR +/- (iF1)
CON TELOMERASA
mTR -/- (iF1)
SIN TELOMERASA
50 % TELOMEROS CORTOS
50% TELOMEROS LARGOS
2 NUEVAS GENERACIONES
Apoptosis testicularFusión de cromosomas en
metafase de leucocitos
Comparación de los fenotipos
Peso testicular.
WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”
G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos
G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”
iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos
iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
CONCLUSIÓN CONCLUSIÓN
La presencia de telómeros cortos es suficiente para desencadenar una
respuesta celular
La adición de la telomerasarescata el fenotipo W-T
SEGUNDO EXPERIMENTOSEGUNDO EXPERIMENTO
¿EXISTE UNA ELONGACIÓN PREFERENCIAL DE LOS TELOMEROS
CORTOS POR LA TELOMERASA EN RATONES mTR +/- (iF1)?
Se realiza una comparación de la
distribución del largo de los telomeros
en cada genotipo.
WT mTR+/- , G3 mTR-/- , G6 mTR-/- , F1 mTR-/- , F1 mTR+/-
Se utiliza la técnica de Q-Fish
( Quantitative Fluorescence in situ hybridization)
para medir la cantidad de repeticiones teloméricas en cada cromosoma.
Q FISH
El largo de los telómeros en cada genotipo está
representado como una distribución de frecuencia
de las intensidades de la señal (TFUs) expresadas
en unidades fluorescentes arbitrarias.
Es una técnica cuantitativa de hibridación in situ por fluorescencia
Desnaturalizan e hibridan con una sonda CCCTAA (secuencia telomérica) marcada radiactivamente
La intensidad de la fluorescencia en cada telómero es calculada desde una camara digital utilizando técnicas de análisis de imagen.
DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS DE LOS TFUs
Se observó un cambio significativo en la longitud promedio de los
telomeros mTR +/- y los mTR -/- G3
Se observó una longitud promedio similar mTR+/- i(F1) y mTR-/- i(F1)
Pero si existen diferencias significativas en el numero de
repeticones teloméricas
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN La telomerasa restaura la función
telomérica en los mTR+/- i(F1) por adición de repeticiones sobre los
telómeros mas cortos
Y no por elongación global
SE INVESTIGA EN QUE FASE DEL DESARROLLO OCURRE LA RESTAURACION DE LOS TELOMEROS
Utilizan fibroblastos embrionarios (MEF) de ratones de cada genotipo para analizar:
A) Extremos libres de los cromosomas (son detectados por Q-FISH como falta de señal telomérica)
B) Fusión de los cromosomas
C) Viabilidad de los MEF expuestos a radiación ionizante
en todos los genotipos.
TERCER EXPERIMENTOTERCER EXPERIMENTO
MÉTODOMÉTODO
Toman 5 embriones de 13 días de cada genotipo
Analizan 20 metafases de MEF en cada uno de los embriones
Sacan el Nº promedio de extremos libres y de cromosomas fusionados para cada
genotipo
WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1mTR+/-
Análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos
El número de extremos libres en MFEs mTR-/- iF1 es significantemente más elevado que en mTR+/- iF1
F1i mTR-/- muestra un promedio de 1.34 cromosomas sin repeticiones telomericas. F1i mTR+/- muestra solo un promedio de 0.02 cromosomas sin repeticiones.
EXTREMOS LIBRES EN LOS CROMOSOMAS (Q-FISH)
FUSIONES CROMOSOMICAS
Análisis Citogenético de
mTR+/- iF1 y de mTR-/- iF1.
mTR -/- iF1 presenta 0,27 cromosomas fusionados por metafase
mTR+/- iF1 no presenta extremos fusionados.
Del análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos y citogenético llevado adelante en cepas de diferente edad para los genotipos mTR+/- iF1 y mTR-/- iF1 se puede concluir que la restauración de la función de los telómeros ocurre antes del día13,5 del desarrollo.
Método para estudiar la viabilidad de los MEF despues de exponerlos a radiación
ionizante
WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1 mTR+/-
Toman 3 embriones de cada genotipo
De cada embrion se obtienen 2 cultivos independientes de MEF
Sin Irradiar
Se expone a dosis crecientes de
radiación ionzante
Calculan el porcentaje de viabilidad
RESULTADO
Mientras que el WY, mTR-/-G3 y mTR+/- iF1 MFEs muestran niveles similares de daño en su crecimiento,
mTR -/- iF1 MFEs y mTR-/-G6 sufren una significativa reducción en la supervivencia celular
Existe una íntima relación entre la long de los telómeros y la sensibilidad a la RI. Los telómeros cortos presentan una
menor supervivencia frente a radiaciones ionizantes.
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
La función de los telómeros ocurre
antes del día 13,5 del desarrollo.
Los telómeros cortos presentan una menor
supervivencia frente a radiaciones ionizantes
Distribución no al azar de fusiones cromosómicas
CUARTO EXPERIMENTOCUARTO EXPERIMENTO
Generan dos líneas independientes de ratones
Knock Out mTR -/-
LÍNEA 114 individuos
y se analizan 26 metafases de esplenocitos
LÍNEA 211 individuos
y examinan 54 metafases
LÍNEA 114 individuos
y se analizan 26 metafases de esplenocitos
1) Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY)
Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
No hubo una fusión en particular que fuera vista en todas las metafases de un ratón
dado , indicando que las fusiones ocurrieron de novo y no fueron heredados de una
generación previa
Las fusiones son generalmente en los brazos p
En esta linea los cromosomas mas frecuentemente involucrados en fusiones son
el 19 y el 5
QUINTO EXPERIMENTOQUINTO EXPERIMENTO
Chromosomes Frequently Chromosomes Frequently Involved in Fusions Have the Involved in Fusions Have the
Shortest TelomeresShortest Telomeres
ObjetivoObjetivo: Determinar si la presencia de telómeros : Determinar si la presencia de telómeros cortos esta relacionado con los eventos de fusión cortos esta relacionado con los eventos de fusión
cromosómica.cromosómica.
Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa), Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa), de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de fusiones)fusiones)
Cromosomas analizados mediante Cromosomas analizados mediante QFISHQFISH
Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en cada extremo telomérico.cada extremo telomérico.
Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número aumentado de cromosomas sin señal detectable. aumentado de cromosomas sin señal detectable.
Análisis de cromosomas mediante Análisis de cromosomas mediante SKY Fish (spectral karyotyping).SKY Fish (spectral karyotyping).
Utiliza combinación de 24 Utiliza combinación de 24 sondas coloreadas, y sondas coloreadas, y fluorocromos distinguibles fluorocromos distinguibles por espectro de color.por espectro de color.
Se obtienen diferentes Se obtienen diferentes combinaciones de color porcombinaciones de color por
La mezcla de diferenctes La mezcla de diferenctes fluorocromos.fluorocromos.
Asigna a cada cromosoma Asigna a cada cromosoma un color específico.un color específico.
En este caso identifica qué cromosoma En este caso identifica qué cromosoma perdió su señal teloméricaperdió su señal telomérica
ResultadosResultados
Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 ratones examinados.ratones examinados.
Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones examinados.examinados.
Análisis estadístico para establecer la aparente Análisis estadístico para establecer la aparente relación entre cromosomas sin señal de relación entre cromosomas sin señal de telómero y eventos de fusión.telómero y eventos de fusión.
(en comparacion con probabilidad de que cada (en comparacion con probabilidad de que cada cromosoma se involucre en evento de fusion al cromosoma se involucre en evento de fusion al azar).=azar).=cromosomas sin señal telomerica tienen cromosomas sin señal telomerica tienen mayor probabilidad de evento de fusión.mayor probabilidad de evento de fusión.
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
Cromosomas con telómeros muy cortos Cromosomas con telómeros muy cortos
( que perdieron la señal telomérica), son los ( que perdieron la señal telomérica), son los más propensos a sufrir fusión.más propensos a sufrir fusión.
Análisis de las fusiones Análisis de las fusiones cromosómicas que causan cromosómicas que causan
disfunción telomérica.disfunción telomérica.
SEXTO EXPERIMENTOSEXTO EXPERIMENTO
Analizan la secuencia nucleotídica que comprende la fusion de los cromosomas
Clonaron y secuenciaron empalmes de fusión.
Realizan una PCR utilizando primers que hibridan con las secuencias de los minisatélites
Amplifican DNA de esplenocitos de ratones WT y mTR -/- (G5 y G6)
El ensayo en WT no genera producto
Se generan bandas específicas
Secuencian el producto de PCR
El amplicón está compuesto sólo por repeticiones
de los minisatélites
Utilizan Q-FISH dirigido a los minisatélites para determinar si todas
las fusiones se originaban por mecanismos similares
Secuencia amplificada por PCR
Analizan 30 metafases de 2 ratones
ConclusionesConclusiones Las fusiones se producen directamente en los Las fusiones se producen directamente en los
minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non-minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non-homologous end joining).homologous end joining).
Las fusiones no contienen repeticiones Las fusiones no contienen repeticiones teloméricas.teloméricas.
Todas las fusiones mostraron una disminución Todas las fusiones mostraron una disminución en la intensidad de la señal en relación al valor en la intensidad de la señal en relación al valor promedio del total de las señales normales promedio del total de las señales normales (Rango= 2,5%-55%).(Rango= 2,5%-55%).
El promedio de disminución de la señal fue del El promedio de disminución de la señal fue del 21%.21%.
Esta pérdida de secuencias en los minisatélites Esta pérdida de secuencias en los minisatélites sugiere la ausencia de regiones teloméricas en sugiere la ausencia de regiones teloméricas en estas uniones.estas uniones.
SÉPTIMO EXPERIMENTOSÉPTIMO EXPERIMENTO
UNA LÍNEA (LÍNEA 2) M TR -/- INDEPENDIENTE TIENE DISTINTOS CROMOSOMAS CON TELÓMEROS CORTOS Y DIFERENTES
CROMOSOMAS FUSIONADOS.
ObjetivoObservar si el evento fundador de un clon, contribuye con la distribución no al azar de telómeros cortos
(C) Frecuencia de fusiones en cada cromosoma de la línea 2 de ratones. (SKY)(D) Frecuencia de señal de extremos de cromosomas libres en cada cromosoma de la línea 2 (Q-FISH)
Visualizamos la distribución no al azar de fusiones y se observa que: Los cromosomas fusionados eran más frecuentemente los que tenían telómeros cortos, sin embargo, la identidad de éstos era distinta a los de la línea 1 de ratones.
No existe ningún cromosoma en particular que presente los telómeros mas cortos o mas
largos en los ratones examinados
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
OCTAVO EXPERIMENTOOCTAVO EXPERIMENTO
¿EL LARGO TELOMÉRICO EN RATONE W-T
ES CARACTERISTICO DE CADA
CROMOSOMA?
Este análisis pretende establecer si alguna distribución telomérica es significativamente
mas corto o mas larga que las otras distribuciones teloméricas
OBJETIVO
Determinar la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones W-
T utilizando la técnica de SKY y Q Fish.
Los datos son analizados por un método estadísitco
METODO
Toman 5 ratones Wild Type
Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón
Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY
Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma
La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón
No hay ningún cromosoma en particular que tenga una distribución de longitudes de telómeros más cortos o más largos en ratones WT.
C) Tabla final de todos los resultados
obtenidos por el test estadístico
Wilcoxan rank sum
De los 5 ratones nombrados como
A, B, C, D y E.
• Los círculos azules representan
los telómeros significativamente más largos
• Los puntos rojos, los significativamente más
cortos.
• Los asteríscos representan los largos de los
telómeros que fueron solo escasamente
significativos
• Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las
generaciones tardías de los ratones mTR -/-
• Solo los cromosomas con telomeros cortos son los que están implicados en las fusiones .
• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones
mTR +/- (F1).
• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los
cromosomas que presenten telómeros cortos.
CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN
CONCLUSIONES FINALES • Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las generaciones tardías de los ratones mTR -/-
•Solo los cromosomas con telómeros cortos son los que están implicados en las fusiones .
• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones mTR +/- (iF1).
• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los cromosomas que presenten telómeros cortos.
• Dos cromosomas disfuncionales pueden sufrir degradación transitoria de sus extremos seguida de fusión cromosómica por mecanismos de NHEJ en regiones minisatelitales.
Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.Línea 2: Cromosoma 6 fusionado en 6 de 14 ratones. Cromosoma 19 fusionado en 3 de 14 ratones. Cromosoma 5 no presenta fusión.
LÍNEA 114 individuos
y se analizan 26 metafases de esplainocitos
LÍNEA 211 individuos
y examinan 54 metafases
1) Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY)
2) Analizar si la presencia de telomeros cortos está correlacionada con la fusión de los cromosomas (Q-FISH)
Metafase analizada por la técnica SKY
Metafase analizada por la técnica DAPI
Identificacion de cromosomas fusionados
Metafase analizada por la tecnica Q-FISH
Metafase analizada por la tecnica SKY
Identificación de cromosomas con extremos libres
Pérdida de la señal teloméricaControl: analizan un Wild Type y
ven que muestra una señal en cada extremo del cromosoma
Observación: Las mTR -/- van incrementando el Nº de
cromosomas que no presentan señal en sus extremos al
incrementar las generaciones.Los cromosomas implicados en
fusiones presentan frecuentemente telomeros cortos
¿El largo de los telómeros en ratones Wild Type es característico de cada
cromosoma?
EXPERIMENTO CONTROLEXPERIMENTO CONTROL
Hipótesis: Cada cromosoma tiene una distribución del largo de los telómeros y en cada evento de fertilización se establece una
nueva distribución.
Este análisis establece si alguna distribución telomérica es significativamente más corta o más
larga que las otras distribuciones teloméricas
Determinan la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones Wild Type utilizando la técnica de SKY y Q-FISH. Los datos son
analizados por el metodo Wilcoxon´s Rank Sum (programa estadístico).
METODO
Toman 5 ratones Wild Type
Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón
Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY
Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma
La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón
La identidad de los cromosomas que carecen de señal telomérica se corresponde con la identidad
de los cromosomas implicados en fusiones
La identidad de los cromosomas difiere en las 2 líneas
Representa una distribución significativa de los telomeros mas largos
Representa una distribución significativa de los telomeros mas cortos
No existe ningun cromosoma en particular que presente los telómeros más cortos o más largos en los ratones
examinados.