Mutaciones de ERG 11 para Cytochrome P450 Lanosterol 14-demethylase en Candida Albicans Vinculados a Resistencia de Azoles

Liuba Bolao 1, Alejandra Martnez 2, Oscar Moreno 3 and Katherine Restrepo 4 Laboratorio de Biologa Molecular, Estudiante de Pregrado, Facultad de Medicina 1,3,4, Estudiante de Pregrado, Ingeniera Biomdica 2,

Universidad de los Andes, Bogot D.C., Colombia

In the DNA of pathogenic Candida Albicans exists a sequence that codifies for the terminal region of the gene ERG11. This one was amplified in order to be able to sequence and identify mutations in the above mentioned region that codifies for lanosterol 14-demethylase, which is a key protein in the biosynthesis of the Ergosterol that provides a structural support to the fungi cellular membrane. These mutations are a risk for the public health because of the limited amount of drugs that act against this type of pathogenic agents.

En el ADN del patgeno Candida Albicans se encuentra una secuencia que codifica para la regin terminal del gen ERG11. sta se amplific con el fin de poder secuenciar e identificar mutaciones en dicha regin que codifican para lanosterol 14-desmetilasa, la cual es una protena clave en va biosinttica del Ergosterol, el cual es un componente de soporte estructural en la membrana celular de los hongos. Estas mutaciones son un riesgo para la salud pblica, teniendo en cuenta la cantidad limitada de frmacos que actan sobre este tipo de agentes patgenos.

INTRODUCCIN La candidiasis sistmica tiene una mortalidad atribuible cercana al 40%, con tasas de mortalidad anual de 1,2 por 100.000 en pacientes oncolgicos. Y ciertas mutaciones del gen ERG11 de candida albicans producen una resistencia a los Azoles que aumenta la tasa de mortalidad en Colombia (Gmez, 2010). Y ms an en pacientes reincidentes previamente susceptibles a cepas de Candida Albicans, dado que la resistencia a Azoles como el fluconazol se puede desarrollar durante el tratamiento. (Franz et al., 1998).

Hoy en da es importante, por lo anterior, tener en cuenta si la cepa de Candida Albicans es resistente o no a Azoles. Para comprobar esto, se requieren tcnicas biomoleculares modernas, como la comparacin de secuencias de nucletidos o de estructuras proteicas tridimensionales de la cepa en pacientes y la cepa genrica que se encuentra en las bases de datos.

Los Azoles son medicamentos que funcionan interfiriendo en la produccin de ergosterol al inhibir la 14-demethylase que es una enzima que se tiene que acoplar con el Cytochrome P450 para convertir lanosterol en ergosterol. La alteracin de esta va biosinttica altera la fluidez y permeabilidad de la membrana y produce inhibicin del crecimiento y la replicacin celular. (Golan, 2008)

En este estudio de secuencia de nucletidos para una cepa especfica de Candida Albicans se busca lograr relacionar los datos encontrados en la literatura con los resultados obtenidos en la prctica para as comprobar la resistencia a Azoles por mutaciones en ERG11. MATERIALES Y MTODOS Extraccin del ADN La cepa de Candida Albicans utilizada fue sembrada en Agar YEPD (1% Extracto de levadura, 2% Peptona, 2% Dextrosa (Glucosa), 1.5% Agar). Y se incub a 37 C de 24h a 48h. Se llevo a cabo la lisis celular mediante 1.5ml de solucin salina aadida a la caja de Petri.

Se centrifug a 13.000 rpm por 5 min. Y se descart el sobrenadante. Para la extraccin del ADN se agregaron 600ul de buffer de lisis (Tris-HCl 50mM pH 7.2, EDTA 50 mM, SDS 3%, -Mercaptoetanol 1%) y 8ul de proteinasa K (200ug/ml). Posteriormente fue incubada la mezcla a 65C por 60 minutos.

En el protocolo de extraccin fue utilizado el Kit Quick-gDNA MiniPrep, Zymo Research. Y el Kit Wizard Genomic DNA purification, [Promega, Madison (Wisconsin), USA].

PCR Para efectuar la reaccin en cadena de la polimerasa, primero se realiz la mezcla Master Mix de los reactivos en un tubo Eppendorf, la cual est compuesta por: Agua ultrapura, buffer 10X, MgCl2, dNTPs, primer F, primer R y Taq Polimerasa. A continuacin, se agregaron 23ul de la mezcla Master Mix a 3 tubos eppendorf y 2ul de ADN de Candida Albicans. Por otro lado, se realiz un control negativo de la reaccin, agregando 2l de agua ultra pura (en lugar de ADN). Los tres tubos fueron llevados al termociclador, donde primero fueron expuestos a temperaturas entre 90-95C para dentadura las hebras de ADN, luego, se baj la temperatura a ms o menos 60C para poder realizar el anillaje de los primers y por ltimo, se aumento de nuevo a 72C para que la polemizaras pudiera ejecutar la elongacin. Estos tres pasos se repitieron de manera cclica hasta que algn factor como agotamiento de dNTPs o la inactivacin de la polimerasa detuviera el proceso.

Los primers utilizados para amplificar este fragmento de 407 pb fueron los siguientes. Obtenidos mediante Prime 3 Plus por ser un programa de interfaz sencilla. (Abd-Elsalam, 2003).

Forward primer CCCATTAAGAATCCCTGAAACCReverse primer CCCAAATGATTTCTGCTGGT

"1

Tabla 1. Datos sobre los primers utilizados.

Purificacin Con el producto obtenido mediante la PCR, se llev a cabo una purificacin por medio del Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System [Promega, Madison (Wisconsin), USA]. El funcionamiento de este kit consiste en la implementacin de una columna de rosca que contiene una solucin de unin del ADN a la membrana por silice. ste tambin utiliza un buffer de lavado que elimina impurezas de la PCR, los cuales pueden generar ruidos al momento de secuenciar y alterar los resultados.

Secuenciacin Se utiliz el secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer [Applied Biosystems, Foster City (California), USA] junto con las reacciones de secuenciacin que se efectuaron con el Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).Anlisis de Secuencias Para analizar la informacin obtenida despus de la secuenciacin de los nucletidos, se recurri a herramientas bioinformticas que estn presentes en la base de datos de la NCBI y EMBL-EBI como lo fueron: Blastn alineamiento de su secuencia respecto a la base de datos. Megablast comparacin de dos secuencias de nucletidos. EMBOSS Transeq traduccin a aminocidos. Asimismo, se recurri al software CLC (Fig. 2) el cual edita y purga secuencias. Y Cn3D para la representacin espacial de la mutacin en la protena.

RESULTADOSSe obtuvo una secuencia de 410 pb.

Figura 1. Resultado del PCR en gel de Agarosa.

Secuencia Obtenida

TCCCAAATGATTTTTGCTGGTTCAGTAGGTAAAACCACCATTGAACTATAATCAGGGTCAGGCACTTTATAACCATCAATAGGTCCATCTTAAGTTATAAACAAAAGTAGTTAAAATGGTTCCCAATTGAACATAAGCAAATTGTTCCCCAATACATCTATGTCTACCACCACCAAATGGTAAATAAGGTGAAGAAACCCCTTTAGAAACTTTCCCAAACCCATAATCAACTTCATCAGAAGAGTTAAATGAAACAGAATTAGCTTTGGCAGCAGCAGTGTCCCATCTAGTTGGATCAAAATCTTCAGGGTTATCAAAATATCTTTCACTAGTATGAGCATAACCTGGAGAAACTAAAACGTAATGACCTTTTGGAACAATATAATTGGGTTCAGGGATTCTTAATGGGA

Tabla 2. Anlisis del BLAST de la NCBI.

En el BLAST la secuencia obtenida se apareo desde el nucletido 1155 hasta el 1562.

Mutaciones obtenidas en la secuencia con megablast de la NCBI

1. Sustitucin del nucletido 1174. A por C. 2. Delecin del nucletido G 1479. 3. Sustitucin del nucletido 1549. G por A.

Secuencia de Aminocidos (Frame-1) Obtenida

PLRIPEPNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDPTRWDTAAAKANSVSFNSSDEVDYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTFVYNLRWTY*WL*SA*P*L*FNGGFTY*TSKNHLG

Description

Candida albicans strain CHC34 cytochromeP450 lanosterol 14-alpha-demethylase (ERG11) gene, complete cds.

Max score 737

Totalscore 737

Query cover 99%

E value 0.0

Ident 99%

Accession KM609916.1

"2

Hebra Templada Longitud Inicio Parada Tm GC% Auto Complementariedad

Forward 22 1155 1176 56.72 45.45 0.00

Reverse 20 1561 1542 56.27 45.00 0.00

Tabla 2. Anlisis del blastp de la NCBI.

Mutaciones obtenidas en la secuencia con Blastp de la NCBI

1. Sustitucin del aminocido 331 T por una P. -T331P-. Marcado segn Ogino, 2007.

DISCUSIN Se realiz una representacin 3D en el programa Cn3D de la mutacin T335P de la protena cytochrome P-450 lanosterol 14alpha-demethylase partir de la estructura ms cercana encontrada a NCBI. Se tom para el modelo la protena 3GW9_A (E-value: 1.00e-57, bit-score: 186, aligned-length: 439, Identity to query: 31%). Y se sealo de amarillo en la figura 3 la mutacin T331P identificada.

En la literatura (Marichal et al., 1999) se encontraron dos mutaciones parecidas a T331P. T229A que causaba resistencia a Fluconazole y T315A que aunque no es resistente es inactivada en una tasa de 1:5 a la 14alpha-demethylase.

La Treonina es un aminocido no cargado pero polar gracias a su grupo -OH. (Devlin, 2006). Si al sustituirlo por una Alanina produce dos diferentes actividades como la inactividad de la protena o la resistencia, es probable que una sustitucin a Prolina produzca una mutacin ms significativa. Dado que la Prolina es importante para diferentes estructuras de soporte como el colageno por su capacidad de formar puentes de hidrogeno con otros compuestos una vez es hidroxilado, (Berisio, Vitagliano, Mazzarella, & Zagari, 2009), sera importante una sustitucin en est regin de la protena.

CONCLUSIONES Es importante analizar las diferentes mutaciones que posee una secuencia de nucletidos y posteriormente los aminocidos que conforman la protena, porque debido a estas interacciones moleculares podra darse o no una resistencia a Azoles, lo que en muchos casos podra significar la vida o la muerte de un paciente. Y hoy en da la bioinformticas juega un papel crucial en el anlisis de estas variaciones.

Aunque se obtuvo el gen a amplificar correcto y se analizaron diferentes sustituciones y una delecion. La similitud con la protena es bastante alta generando slo una mutacin de tipo sustitutiva, siendo las otras missense.

El continuo anlisis de este gen es necesario para la deteccin de nuevas cepas con resistencias a Azoles, lo que requiere pruebas consecutivas de los pacientes infectados nuevos y reincidentes.

Figura 2. Protena modelo de cytochrome P-450 lanosterol 14alpha-demethylase que seala en amarillo la mutacin T331P.

Description

cytochrome P-450 lanosterol 14alpha-demethylase, partial [Candida albicans]. GenBank: BAC16520.1

Score 230 bits(587)

Expect 7E-71

Method Compositional matrix adjust

Identities 108/109(99%)

Positives 108/109(99%)

Gaps 0/109(99%)

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Figura 3. Secuencia consenso de nucletidos obtenida.

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TCCCAAATGAT T T T TGCTGGT T CAGT AGGT AAAACCACCAT TGAACT AT AAT CAGGGT CAGGCACT T T AT AACCAT CAAT AGGT CCAT CT T AAGT T AT

T CCCAAATGAT T T T TGCTGGT T CAGT AGGT AAAACCACCAT TGAACT AT AAT CAGGGT CAGGCACT T T AT AACCAT CAAT AG- T CCAT CT T AAGT T AT

GGCCCCAAAGTGT AAACCT AT AAT CAGGGT CAGGCACT T T AT AACCAT CAAT AGGT CCAT CT T AAGT T AT

AAACAAAAGT AGT T AAAATGGT T CCCAAT TGAACAT AAGCAAAT TGT T CCCCAAT ACAT CT ATGT CT ACCACCACCAAATGGT AAAT AAGGTGAAGAAA

AAACAAAAGT AGT T AAAATGGT T CCCAAT TGAACAT AAGCAAAT TGT T CCCCAAT ACAT CT ATGT CT ACCACCACCAAATGGT AAAT AAGGTGAAGAAA

AAACAAAAGT AGT T AAAATGGT T CCCAAT TGAACAT AAGCAAAT TGT T CCCCAAT ACAT CT ATGT CT ACCACCACCAAATGGT AAAT AAGGTGAAGAAA

CCCCT T T AGAAACT T T CCCAAACCCAT AAT CAACT T CAT CAGAAGAGT T AAATGAAACAGAAT T AGCT T TGGCAGCAGCAGTGT CCCAT CT AGT TGGAT

CCCCT T T AGAAACT T T CCCAAACCCAT AAT CAACT T CAT CAGAAGAGT T AAATGAAACAGAAT T AGCT T TGGCAGCAGCAGTGT CCCAT CT AGT TGGAT

CCCCT T T AGAAACT T T CCCAAACCCAT AAT CAACT T CAT CAGAAGAGT T AAATGAAACAGAAT T AGCT T TGGCAGCAGCAGTGT CCCAT CT AGT TGGAT

CAAAAT CT T CAGGGT T AT CAAAAT AT CT T T CACT AGT ATGAGCAT AACCTGGAGAAACT AAAACGT AATGACCT T T TGGAACAAT AT AAT TGGGT T CAG

CAAAAT T T T CAGGGT T AT CAAAAT AT CT T T CACT AGT ATGAGCAT AACCTGGAGAAACT AAAACGT AATGGACCT CT TGGTGGCG

CAAAAT CT T CAGGGT T AT CAAAAT AT CT T T CACT AGT ATGAGCAT AACCTGGAGAAACT AAAACGT AATGACCT T T TGGAACAAT AT AAT TGGGT T CAG

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