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MODIFICACIÓN GENÉTICA DE LEVADURAS VÍNICAS
Amparo QuerolIATA-CSIC, Valencia (España)
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VENTAJAS DE LAS LEVADURAS SECAS ACTIVAS
1. INICIO RÁPIDO DE LA FERMENTACIÓN
2. REGULARIDAD EN EL CURSO DE LA FERMENTACIÓN
3. SEGURIDAD DE UNA BUENA FERMENTACIÓN
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Condiciones climatológicas favorables
Condiciones climatológicas desfavorables
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tiempo de fermentación (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
frecu
enci
a (%
)
0
20
40
60
80
100
B-I (T73) B-II B-VI B-VIII
mm T-73
T-73
B-II
B-II
B-VI
B-VI
B-VIII
B-VIII
¿Se impone la levadura inoculada durante la fermentación?
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POSIBILIDAD DE MEJORA GENÉTICA
1. Del proceso de fermentación alcohólica
2. De la calidad de las propiedades del vino
3. Del proceso de producción de la levaduracomercial
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MODIFICACIÓN GENÉTICA DE “STARTERS”Levaduras vínicas modificadas genéticamente mediante técnicas del DNA recombinante(Querol y Ramón, 1996 y Pretorius 2000).
Gen expresado Efecto en la levadura vínica o en el vino
Toxina “killer” K1 Ventaja ecológica de la cepa al inocular
Pectato liasa Problemas de filatración e incremento del aroma afrutado
Poligalacturonsas ND
β-(1,4)-endoglucanas Incremento del aroma afrutado
β-(1,4)-endoglucanas Incremento del aroma afrutado
Arabinofuranosidasa Incremento del aroma afrutado
β-glucosidasa Incremento del aroma afrutado e incremento de resveratrol
Xilanasa Incremento del aroma afrutado
L(+)-lactato deshidrogenasa Aumenta la acidez del vino
Malato permeasa y enzima málico Disminución de la acidez del vino
Disminución de la acidez del vino Incremento de los aromas secundarios: ésteres
Sobreexpresión de glicerol-3-fosfato dehidrogenasa Incremento en la producción de glicerol
Expresión de bacteriocinas dePediococcus acidilactici y Leuconostoc carnosum
Inhibición del crecimineto de baterias alterantes del vino
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AMPLIACIAMPLIACIÓÓN DEL GENOTIPO KILLERN DEL GENOTIPO KILLER
K2
K1
K1/K2
K2 K1
K2
K1
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FERMENTACIFERMENTACIÓÓN MIXTAN MIXTA
S. cerevisiae
Lactobacillus casei
LDH
LDH
ETANOL + ÁCIDO LÁCTICO
GLUCOSA
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FERMENTACIFERMENTACIÓÓN MALOLN MALOLÁÁCTICACTICA
L-malato L-lactatoNAD+
+ CO2
mlemle
mleA
mleS
mle Lactobacillus delbrueckii
Lactococcus lactis
Leuconostoc oenos
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FERMENTACIFERMENTACIÓÓN MALOLN MALOLÁÁCTICACTICA
mleS
S. cerevisiae
L. lactis
mleS
mleSS. pombe mae1mae1
MÁLICO LÁCTICO
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Enzimas comerciales
- Pectinasas• Mejorar rendimiento• Mejorar procesos de filtración y clarificación• Extracción de Fenoles (Antocianos, Taninos,
otros)• Extracción de precursores del aroma• Estabilidad del vino
- Glucanasas- Glucosidasas
• Liberación de aromas primarios
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POSIBILIDADESPOSIBILIDADES
• Adición directa: producción usando hongos filametosos
• Sobreexpresión en levadura vínica
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INCREMENTO DE AROMAINCREMENTO DE AROMA
PRIMARIOS
SECUNDARIOS
TERCIARIOS
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Terpeno
Glucosa
Terpenono volátil
+
GLUG
A
BGL
G+TT
Terpenovolátil
ArabinosaApiosaRamnosa
AROMA PRIMARIO
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LEVADURAS VLEVADURAS VÍÍNICAS HIDROLNICAS HIDROLÍÍTICASTICAS
S. cerevisiae
Aspergillus niger ABFBGL
ABF
Candida molischiana BGL
T
G
Terpenono volátil
+
ABFA G
A
BGL
G+TT
Terpenovolátil
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0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
T73 AbfB BglN AbfB+BglN
µM
t-piceidc-piceidt-resveratrolc-resveratrol
INCREMENTO DEL RESVERATROL
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AROMAS SECUNDARIOS
ÉSTER - SINTASAÉSTER - HIDROLASA
ALCOHOL ACETIL TRANSFERASA
A-CoA + AlcoholAATF
É S T E R
Éster -sintasaÉster - Hidrolasa
Alcohol + Acido
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Mejora del proceso de producciónindustrial de levaduras vínicas
Sobreacumulación de glucógeno y de
trehalosa
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Producción de levaduras vínicas a escala de laboratorio
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Sobreacumulación de glucógeno
Glucosa GlucógenoGlucógeno sintasa
Glucógeno fosforilasa
Glucógeno sintasa: gen GSY2Glucógeno fosforilasa: gen GPH1
1. Sobreexpresión del gen GSY2
2. Deleción del gen GPH1
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Sobreacumulación de trehalosa
Glucosa TrehalosaTrehalosa sintasa
Trehalasa
Trehalosa sintasa: genes TPS1 y TPS2Trehalasa: gen NTH1 y gen ATH1
1. Sobreexpresión de los genes TPS1 y TPS2
2. Deleción del gen NTH1 y/o del gen ATH1
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Etanol Acetaldehído
Elaboración de vino de Jerez
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Elaboración de vino de Jerez
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Estructura y localización de Flo1p
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Estructura y localización de Flo11p
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Deleción del gen FLO1
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Deleción del gen FLO11
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Caracterización del gen FLO11
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MODIFICACIÓN GENÉTICA DE “STARTERS”
1. Regulación de la expresión génica
2. Mejora de respuesta al estrés de levaduras vínicas industriales
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EXPRESIÓN GÉNICA EN LEVADURAS
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REGULACIÓN GÉNICA(Diferencias entre vinos)
Vino tintoVino blanco
PGK1HSP30SPI1
1/2 1 2 3 4 5 6 1/2 1 2 4 6 8 9
Días Días
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MODIFICACIÓN GENÉTICA DE “STARTERS”
1. Sistemas de integración en el genomade la levadura: levaduras GRAS
2. Regulación de la expresión génica
3. Mejora de respuesta al estrés de levaduras vínicas industriales
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MEJORA DE RESPUESTA AL ESTRÉS DE LEVADURAS VÍNICAS INDUSTRIALES
1. Aspectos fisiológicos y moleculares de la adaptación a las condiciones adversas de los procesos industriales
2. Identificación de nuevos genes implicadosen la resistencia a estrés de cepas vínicas
3. Mejora genética: aumento de la resistenciaa estrés de cepas vínicas.
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RESISTENCIA A ESTRÉS, EXPRESIÓNGÉNICAY COMPORTAMIENTO
FERMENTATIVO
1. Viabilidad frente a varias condiciones de estrés
2. Expresión de genes marcadores de estrés
3. Comportamiento en condiciones de microvinificación
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Characterisation regarding stress response of three commercial wine strains, one of them
having problems of fermentative arrest: T73, LYCC047 y LYCC082
• Behaviour under microvinification conditions • Viability under several stress conditions• Expression of stress marker genes such asHSP12, HSP82, HSP26 or HSP104 (chaperones)
Stress adaptation
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0
50
100
150
200
250
0 5 7 12 14
Time (days)
Glu
cose
con
cent
ratio
n(g
/L)
LYCC082
LYCC047
T73
Microvinifications in synthetic must with low nitrogen concentration
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5.3 cm3.3 cm3.2 cm3.9 cmOxidative5
78%75%88%42.5%Glucose starvation4
0.0035%0.0022%0.0041%0.0014%Osmotic3
15%15%19%7%Ethanol2
0.8%3.1%2.7%0.45%Heat shock1
W303 dipl.T73LYCC082LYCC047
1 number of viable cells after 2 hours at 45ºC2 number of viable cells after 5 hours in presence of 8% (v/v) ethanol3 number of viable cells after 16 hours in presence of 3M KCl4 number of viable cells 48 hours after glucose depletion 5 diameter of the region of growth inhibition under H2O2
Resistance to several stress conditions
STRESSSTRAIN
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Response to ethanol stress (8% v/v, 1 h)
02468
101214
LYCC047 LYCC082 T73 W303
HSP12 SSA3
Indu
ctio
n Le
vels
Strains
Hsp12p protects membranesagainst desiccation and ethanol-induced stress
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Stress adaptation
1. The commercial S. cerevisiae strains are more resistant to different stresses.
2. In general, we observed an over-expression of the genes coding heat shock proteins Hsp12 and Hsp104 in commercial S. cerevisiae strains.
3. S. cerevisiae sherry strains (flor yeasts) are less resistant to osmotic stresses and more resistant to alcohol and acetaldehyde than the strains isolated during the alcohol fermentation.