Modelo in vitro de fotobiología: su utilidad en fotoprotección

Francoise Bernerd^ y Daniel Asselineau^

Arch. Argent. Dermatol . 53 (Supl.):21-23, 2003

El so l e j e r c e e f e c t o s s o b r e la p ie l a c o r t o y l a rgo p l a ­z o . E s t o s i n c l u y e n e r i t e m a , f o t o e n v e j e c i m i e n t o y c á n c e r e i n v o l u c r a n l os c o m p a r t i m i e n t o s s u p e r f i c i a l ( e p i d e r m i s ) y p r o f u n d o ( d e r m i s ) \s c a m b i o s s e r e l a c i o n a n c o n la a c c i ó n b i o l ó g i c a d e la l uz U V so la r , e n la q u e pa r t i c i ­p a n l os e s p e c t r o s U V B ( 2 9 0 - 3 2 0 n m ) y U V A ( 3 2 0 - 4 0 0 n m ) . El c o n o c i m i e n t o d e los e v e n t o s i n i c i a l es e s út i l p a r a c o m p r e n d e r s u s c o n s e c u e n c i a s c l í n i c a s y b i o l ó g i c a s , p e r o t a m b i é n b r i n d a m u c h a i n f o r m a c i ó n r e f e r e n t e a la f o t o p r o t e c c i ó n . L o s e s t u d i o s //? i//Vo e n v o l u n t a r i o s a m e n u d o s o n d i f í c i l e s p o r r a z o n e s t é c n i c a s o é t i c a s . P o r o t r a p a r t e , l os c u l t i v o s c e l u l a r e s c u t á n e o s /n ¡//trono r e ­p r o d u c e n c o n f i d e l i d a d l as c o n d i c i o n e s f i s i o l ó g i c a s //? iz/Vo, e n p a r t i c u l a r e n lo q u e s e re f i e re a la o r g a n i z a c i ó n t i s u l a r y a la e v a l u a c i ó n d e la p e n e t r a c i ó n d e las r a d i a ­c i o n e s U V . P a r a r e c o n s t i t u i r la p ie l h u m a n a //? vitro f a c t i b l e u t i l i za r u n e q u i v a l e n t e d é r m i c o v i a b l e (ge l d e c o ­l á g e n o c o n f i b r o b l a s t o s ) y u n a e p i d e r m i s d i f e r e n c i a d a c o n c a p a s c ó r n e a s ^ ^.

E s t a p ie l r e c o n s t i t u i d a in vitro p u e d e s o m e t e r s e a r a y o s U V B o U V A p a r a a n a l i z a r las r e s p u e s t a s t e m p r a ­n a s y t a r d í a s i m p l i c a d a s e n las l e s i o n e s a n ive l t i su lar . L o s r e s u l t a d o s r e v e l a n q u e e n e s t e s i s t e m a in vitro s e p r o d u c e n r e a c c i o n e s i n i c i a l e s i d é n t i c a s - p o r e j e m p l o , a l t e r a c i ó n d e la s í n t e s i s d e A D N o los d í m e r o s d e p i r i m i -d i n a " y a p a r i c i ó n d e c é l u l a s a c t í n i c a s ^ - a las i n d u c i d a s p o r l as r a d i a c i o n e s U V B e n la p ie l h u m a n a . L a s r a d i a ­c i o n e s U V A , m u y penet rantes"^ , p r o v o c a n m o d i f i c a c i o n e s d é r m i c a s a c e n t u a d a s . E s t o s h a l l a z g o s d e m u e s t r a n q u e la s e n s i b i l i d a d c e l u l a r a los r a y o s U V A y la p e n e t r a c i ó n de los r a y o s U V B y U V A d i f i e r e n . C o m o los o b j e t i v o s d e las r a d i a c i o n e s U V B y U V A s o n d i s p a r e s , e x a m i n a m o s la e f i c a c i a d e v a r i a s p a n t a l l a s s o l a r e s c o n d i s t i n t o s e s ­p e c t r o s d e a c c i ó n . El m o d e l o in I / Z / A C p e r m i t e a p l i c a r p r o ­d u c t o s s o b r e la s u p e r f i c i e c u t á n e a e n f o r m a s i m i l a r a la r ea l . E s t u d i a m o s u n f i l t ro U V B c o n v e n c i o n a l ( 2 - e t i l h e x i l -p - m e t o x i c i n a m a t o , 2 - E H M C ) , o t r o U V A d e a m p l i o e s p e c ­t ro ( t e r e f t a l i d e n o - d i a l c a n f o r - á c i d o s u l f ó n i c o , T D A S ) y u n

' Director de la Unidad de Fotoenvejecimiento. ^ Coordinador de Grupo, Estudio del Envejecimiento Cutáneo, In­vestigaciones L'Oréai, Clichy, Francia.

t e r c e r o U V B -i- U V A d e a m p l i o e s p e c t r o ' . C o m p r o b a m o s q u e c u a n d o e l F P S e s i g u a l , la e f i c a c i a a n t i - U V B e s s i ­mi la r , p e r o la a n t i - U V A va r ía^ . E s t o s d a t o s i l u s t r an el e m p l e o d e p ie l h u m a n a r e c o n s t i t u i d a in vitro para e v a ­lua r l os e f e c t o s e p i d é r m i c o s y d é r m i c o s d e las r a d i a c i o ­n e s U V a n i ve l t i su l a r y d e t e r m i n a r la e s p e c i f i c i d a d d e las r e s p u e s t a s a los r a y o s U V B y U V A , q u e p o d r í a n re la ­c i o n a r s e c o n las c o n s e c u e n c i a s c l í n i c a s d e la e x p o s i ­c i ó n a l s o l . A d e m á s , el m o d e l o p a r e c e s e r út i l p a r a a n a ­l izar las p a n t a l l a s d e s t i n a d a s a p r e v e n i r l as l e s i o n e s in ­d u c i d a s p o r el so l y d e s t a c a la n e c e s i d a d d e c o n t a r c o n f o t o p r o t e c c i ó n e f e c t i v a d e a m p l i o e s p e c t r o a n t i - U V B y a n t i - U V A .

MATERIAL Y METODOS

Célu las y c u l t i v o s

S e r e c o l e c t a r o n q u e r a t i n o c i t o s y f i b rob las tos c u t á n e o s h u m a n o s . S e c u l t i v a r o n q u e r a t i n o c i t o s e n 3 T 3 s e g ú n la t é c n i c a d e R h e i n w a i d y G r e e n ^ y d e f i b r o b l a s t o s e n s u e ­ro b o v i n o f e ta l al 1 0 % e n DMEM.

Recons t i t uc i ón in vitro

L o s q u e r a t i n o c i t o s s e s e m b r a r o n (3 ,3 l O V c m ^ ) e n un e q u i v a l e n t e d é r m i c o o b t e n i d o d e s p u é s d e la c o n t r a c c i ó n d e los f i b r o b l a s t o s (10"^) i n c l u i d o s e n u n ge l d e c o l á g e n o , c o m o s e d e s c r i b i ó e n o t r o s t r a b a j o s " . L o s c u l t i v o s per ­m a n e c i e r o n s u m e r g i d o s d u r a n t e 7 d í a s y l u e g o s e c o l o ­c a r o n s o b r e u n a g r a d i l l a a n i ve l d e la i n t e r f a s e l i 'qu ido-a i re y s e m a n t u v i e r o n d u r a n t e o t r o s 7 d í a s n u t r i é n d o s e p o r c a p i l a r i d a d . L a p ie l a s í r e c o n s t i t u i d a s e u t i l i zó p a r a i r r a d i a c i ó n y e v a l u a c i ó n d e las p a n t a l l a s s o l a r e s .

Fuentes de rad iac iones UV y p r o c e d i m i e n t o

S e i r rad ió c o n U V B m e d i a n t e u n t u b o f l u o r e s c e n t e T L 2 0 W / 1 2 e q u i p a d o c o n u n f i l t ro a p r o p i a d o y la U V A c o n u n a l á m p a r a d e x e n ó n d e 1 0 0 0 W y f i l t ros W G 3 3 5 d e 3 m m y U G 5 d e 2 m m . El m a t e r i a l s e t r a t ó s o b r e u n s o p o r ­t e s i n m e d i o d e cu l t i vo y l u e g o s e t r a n s f i r i ó a o t r a s p l a -

2 1

Francoise Bernerd y Daniel Assellneau

c a s c o n m e d i o d e c u l t i v o y s e i n c u b ó ( 3 7 ° C , C O ^ 5 % ) . P o r ú l t i m o , s e t o m a r o n m u e s t r a s p a r a e s t u d i o s h i s t o l ó ­g i c o s o s e c o n g e l a r o n e n n i t r ó g e n o l í q u i d o p a r a e f e c t u a r t i n c i o n e s i n m u n o l ó g i c a s . L a s p a n t a l l a s s o l a r e s t ó p i c a s (~2 m g / c m ^ ) s e a p l i c a r o n 10 m i n u t o s a n t e s d e la e x p o s i ­c i ó n a l os r a y o s UV.

T i n c i o n e s i n m u n o l ó g i c a s

S e m a r c a r o n los c o r t e s ' ° c o n a n t i c u e r p o s m o n o c l o -n a l e s c o n t r a l os d í m e r o s d e t i m i d i n a " o la v i m e n t i n a .

RESULTADOS Y DISCUSION

L a p i e l r e c o n s t i t u i d a in vitrosimilar a la h u m a n a n o r m a l , y a q u e c o n s t a d e e p i d e r m i s e s t r a t i f i c a d a e n l as e t a p a s t a r d í a s d e la d i f e r e n c i a c i ó n y c a p a s c ó r ­n e a s , s o b r e u n e q u i v a l e n t e d é r m i c o c o n f i b r o b l a s t o s v i a b l e s .

L a e x p o s i c i ó n a r a d i a c i o n e s U V ( 5 0 m J / c m ^ ) p r o ­d u c e la a p a r i c i ó n d e c é l u l a s a c t í n i c a s t í p i c a s e n 2 4 h o r a s . L o s c o r t e s h i s t o l ó g i c o s r e v e l a n c é l u l a s d e a s ­p e c t o r e d o n d e a d o , c o n c i t o p l a s m a e o s i n o f í l i c o y n ú ­c l e o c o n d e n s a d o r E s t e e f e c t o b i o l ó g i c o d e l os r a y o s U V B p u e d e r e p r o d u c i r s e e n la p ie l r e c o n s t i t u i d a in i 7 -

/ / o s u m i n i s t r a n d o la m i s m a d o s i s y e n i g u a l l a p s o . P o r o t r a p a r t e , e n e l s i s t e m a in vitro \as c é l u l a s a c t í n i c a s t a m b i é n s e u b i c a n e n l a s c a p a s s u p r a b a s a l e s d e la e p i d e r m i s . L a m a r c a c i ó n e s p e c í f i c a d e l as c é l u l a s a c ­t í n i c a s r e v e l a la f r a g m e n t a c i ó n d e l A D N c a r a c t e r í s t i c a d e la a p o p t o s i s ' ° ' ^ .

L o s á c i d o s n u c l e i c o s s e c o m p o r t a n c o m o c r o m ó f o -r o s d i r e c t o s , p o r lo q u e u n a d e l as c o n s e c u e n c i a s m á s i m p o r t a n t e s d e l a s r a d i a c i o n e s U V B e s la a l t e r a c i ó n d e l A D N , e n p a r t i c u l a r l o s d í m e r o s d e p i r i m i d i n a y c i e r ­t o s f o t o p r o d u c t o s ' ^ . E s t a s l e s i o n e s p o d r í a n v i n c u l a r s e c o n l a s i n f l u e n c i a s d e l e t é r e a s u l t e r i o r e s d e la e x p o s i ­c i ó n a l soP^ . L o s a n t i c u e r p o s c o n t r a l o s d í m e r o s d e t i m i d i n a " p e r m i t e n i d e n t i f i c a r m o d i f i c a c i o n e s d e l A D N e n t o d a s l a s c a p a s e p i d é r m i c a s . S e c o m p r u e b a c o m ­p r o m i s o d e l n ú c l e o d e l os q u e r a t i n o c i t o s , q u e d e s a p a ­r e c e n d e la e p i d e r m i s e n f o r m a p r o g r e s i v a d e s p u é s d e 4 d í a s ^ " . E s t o s h a l l a z g o s c o n f i r m a n q u e e s f a c t i b l e r e p r o d u c i r l a s r e a c c i o n e s b i o l ó g i c a s c u t á n e a s e n u n m o d e l o in vitro.

I r rad iac ión UVA y a l t e rac i ón de los f i b r o b l a s t o s dér­m i c o s

L a a c c i ó n d e l as r a d i a c i o n e s U V A ( s i n c o n t a m i n a ­c i ó n U V B ) e n la p i e l r e c o n s t i t u i d a in vitro se o b s e r v a e n e l e q u i v a l e n t e d é r m i c o . 4 8 h o r a s d e s p u é s d e la e x p o s i c i ó n a u n a d o s i s r e a l i s t a d e r a y o s U V A d e 2 5 J / c m ^ o b s e r v a m o s la d e s a p a r i c i ó n d e l os f i b r o b l a s t o s s u p e r f i c i a l e s . A u n q u e l o s f i b r o b l a s t o s d e s a p a r e c e n a l

c a b o d e 2 d í a s , l a a p o p t o s i s d e l as c é l u l a s d é r m i c a s c o m i e n z a a l as 6 h o r a s d e la e x p o s i c i ó n ' ^ . L o s e s t u ­d i o s c i n é t i c o s r e v e l a n q u e e l e q u i v a l e n t e d é r m i c o p u e ­d e r e c o l o n i z a r s e p o r l a p r o l i f e r a c i ó n y m i g r a c i ó n d e l os f i b r o b l a s t o s p r o f u n d o s i n d e m n e s y e l i n c r e m e n t o d e la s í n t e s i s d e p r o t e í n a s d e la m a t r i z e x t r a c e l u l a r c o m o la f i b r o n e c t i n a . E s t o s e v e n t o s b i o l ó g i c o s p o d r í a n e s t a r i n v o l u c r a d o s e n l a s a l t e r a c i o n e s d é r m i c a s q u e a c o m p a ñ a n a l f o t o e n v e j e c i m i e n t o ' ^ ' ' ^ .

EVALUACION DE LA EFICACIA DE LAS PANTALLAS SOLARES

El m o d e l o c u t á n e o t r i d i m e n s i o n a l p r e s e n t a la v e n ­t a j a d e la p r e s e n c i a d e c a p a s c ó r n e a s , q u e p e r m i t e n a p i j c a r a g e n t e s t ó p i c o s s o b r e la s u p e r f i c i e , c o m o e n la v i d a r e a l . T e n i e n d o e n c u e n t a l as l o n g i t u d e s d e o n d a a s o c i a d a s a l d a ñ o b i o l ó g i c o d e la p ie l r e c o n s t i t u i d a in vitro, e v a l u a m o s la e f i c a c i a d e d i s t i n t a s p a n t a l l a s s o ­l a r e s e n la p r e v e n c i ó n d e l os e f e c t o s d e l e t é r e o s d e l as r a d i a c i o n e s U V B y U V A . C a d a v e z e s m á s o b v i o q u e s e r e q u i e r e p r o t e c c i ó n a n t i - U V B y a n t i - U V A c o m ­b i n a d a ' ' " ' .

E n p r i m e r l u g a r c o m p a r a m o s u n f i l t r o a n t i - U V B c l á ­s i c o , e l 2 - E H M C y o t r o d e a m p l i o e s p e c t r o c o n a b s o r ­c i ó n m á x i m a e n e l r a n g o U V A , e l T D A S ' ^ . S e p r e p a r a n d o s p a n t a l l a s e n s o l u c i ó n a c u o s a , c o n f a c t o r e s d e p r o ­t e c c i ó n s o l a r d e t e r m i n a d o s m e d i a n t e t é c n i c a s e s t á n ­d a r in vivo muy s i m i l a r e s - 5 ,8 p a r a e l 2 - E H M C y 5,1 p a r a e l T D A S ' . El a n á l i s i s d e l as p a n t a l l a s a p l i c a d a s a la p ie l r e c o n s t i t u i d a in K /ZAO m u e s t r a i g u a l e f i c i e n c i a e n la p r e v e n c i ó n d e l e s i o n e s i n d u c i d a s p o r l os r a y o s U V B c o m o l a s c é l u l a s a c t í n i c a s . E s t e r e s u l t a d o n o l l a m a la a t e n c i ó n , p o r q u e l o s F P S s o n s e m e j a n t e s y e v i t a n el e r i t e m a ^ " . N o o b s t a n t e , la e x p o s i c i ó n a r a d i a c i o n e s U V A r e v e l a d i f e r e n c i a s a p a r t i r d e la d o s i s d e 4 0 J / c m ^ . El 2 - E H M C n o i m p i d e la d e s a p a r i c i ó n d e l o s f i b r o b l a s t o s d é r m i c o s , p e r o e l T D A S s í . E s t o s d a t o s r e g i s t r a d o s in K / z / o c o n c u e r d a n c o n l os o b t e n i d o s in i / / i / c ' 2 i 2 2

T a m b i é n e v a l u a m o s o t r o f i l t r o s o l a r c o n a b s o r c i ó n e n l o s e s p e c t r o s U V B ( 3 0 3 n m ) y U V A ( 3 4 4 n m ) . E s t a p a n t a l l a e v i t a l as a l t e r a c i o n e s i n d u c i d a s p o r l os r a y o s U V B ( c é l u l a s a c t í n i c a s y l e s i o n e s d e l A D N ) y l as m o ­d i f i c a c i o n e s d é r m i c a s s e c u n d a r i a s a l os r a y o s U V A .

R e s u m i e n d o , l a p i e l r e c o n s t i t u i d a p a r e c e s e r út i l p a r a i n v e s t i g a r l os e f e c t o s d e l as r a d i a c i o n e s U V in vitro e i d e n t i f i c a r a l t e r a c i o n e s b i o l ó g i c a s e s p e c í f i c a s d e l e s p e c t r o U V . A d e m á s , l a a p l i c a c i ó n t ó p i c a d e d i ­v e r s o s p r o d u c t o s p e r m i t e c o m p a r a r d i s t i n t a s p a n t a l l a s s o l a r e s y s u e f i c a c i a e n la p r e v e n c i ó n d e l e s i o n e s b i o ­l ó g i c a s e s p e c í f i c a s . L o s h a l l a z g o s s e ñ a l a n q u e e l v a ­lo r d e l F P S n o e s s u f i c i e n t e p a r a d e t e r m i n a r la e f e c t i ­v i d a d e n t o d o e l e s p e c t r o U V y q u e s e r e q u i e r e p r o ­t e c c i ó n d e a m p l i o e s p e c t r o a n t i - U V B y a n t i - U V A .

2 2 Arch. Argent. Dermatol.

Modelo in v/troáe fotobiología: su utilidad en fotoprotección

BIBLIOGRAFIA

1. Lavker , R .M. : C u t a n e o u s a g i n g : c t i r ono log i c ve r sus photoaging. En: Gilctirest, B.A. Ed. Photodamage. BlackweII Science. Cambridge; 1995; págs. 123-135.

2. Asselineau, D.; Bernard, B.A.; Bailly, C. et al: Epidermal mor-phogenesis and induction of 67 kD keratin polypeptide by cul­ture at the liquid-air interface. Exp Cell Res 1985; 159:536-539.

3. Asselineau, D.; Bernard, B.A.; Bailly, C. et al: Retinoic acid im-proves epidermal morphogenesis. Dev Biol 1989; 133:322-325.

4. Vink, A.A.; Berg, R.J.W.; de Grujil, F.R. et al: Induction, repair and accumulation of thymine dimers in the skin of UVB-irradi-ated hairless mice. Carc inogenes is 1991; 12: 861-864.

5. Young, A.R.: The sunburn cell. Pho todermato l 1987; 4: 127-134.

6. Kohen, E.; Santus, R.; Hirschberg, J. : Optical properties of the skin. En: Kohen, E.; Santus, R.; Hirschberg, J. Eds.: Pho-tobiology. Academic Press. Londres; 1995; págs. 303-321.

7. Fourtanier, A.: Mexoryl® SX protects against solar-simulated UVR- induced photocarc inogenes is in mice. P h o t o c h e m Photob io l 1996; 64: 688-693.

8. Bernerd, F; Vioux, C ; Assel ineau, D.: Evaluation of the pro-tective effect of sunscreens on human skin reconstructed in vitro exposed to UVB or UVA. Pho tochem Photob io l 2000; 7 1 : 314-320.

9. Rheinwaid, J.G.; Green, H. :Serial cultivation of strains of hu­man keratinocyte: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cel l 1975; 6: 331-343.

10. Bernerd, F; Assel ineau, D.: Successive alteration and recov-ery of epidermal differentiation and morphogenesis after spe-cific UVB-damages in skin reconstructed in vitro. Dev Biol 1997; 183; 123-138.

11. Roza. L.; van Der Wulp, K.J.M.; MacFarlane, S.J.; Lohman, P.H.M. et al: Detection of cyclobutane thymine dimers in DNA human cells with monoclonal antibodies raised against a thym­ine dimer-containing tetranucleoide. Pho tochem Photob io l

1988; 48: 627-633. 12. Gavrieli, T.; Sherman, Y.; Ben-Saason, S.A.: Identification of

programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992; 119: 493-501.

13. Ross, P.M.; Cárter, D.M.: Cutaneous DNA damage and re­pair En: Goldsmith, L.A. Edif.: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of the Skin. 2"" ed. Oxford University Press. New York; 1991; pags. 410-451.

14. Sarasin, A.: The molecular pathways of ultraviolet-induced carcinogenesis. Mut Res 1999; 428: 5-10.

15. Bernerd, F; Asselineau, D.: UVA exposure of human skin re­constructed in vitro induces apoptosis of dermal fibroblasts: subsequent connect ive t issue repair and implications in photoaging. Cell Death and DIfferent 1998; 5: 792-802.

16. Gilchrest, B.A.: Dermatoheliosis (Sun induced aging). En: Gilchrest, B.A. Edif.: Skin and aging processes. CRC Press. Boca Ratón, FL; 1989; pags. 97-116.

17. Pathak, M.A.: Sunscreens: progress and perspectives on photoprotection of human skin against UVB and UVA radia-tion. J Dermatol 1997; 23: 783-800.

18. Schaefer, H.; Moyal, D.; Fourtanier, F: Recent advances in sun protection. Semin Cutan Med Surg 1998; 17: 266-275.

19. Fourtanier, A.; Labat-Robert, J. ; Kern, P. et al: In vivo evalua­tion of photoprotection against chronic ultraviolet A irradiation by a new sunscreen Mexoryl® SX. Pho tochem Photobio l 1992; 55: 549-560.

20. Rosen, C.F En: Gasparro, F Edif.: Sunscreen Photobiology: Molecular cel lularand physiological aspects. Springer-Verlag and Landes Bioscience; Berlín; 1997; págs. 63-68.

2 1 . Ley, R.D.; Fourtanier A.: Sunscreen protection against ultra­violet radiation-induced pyrimidine dimers in mouse epider­mal DNA. Pho tochem Photob io l 1997; 65: 1007-1011.

22. Seite, S.; Moyal, D.; Trichard, S. et al: Mexoryl® SX: a broad spectrum absorption UVA filter protects human skin from the effects of repeated suberythemal doses of UVA. J Photochem Photob io l B io logy 1998; 44: 69-76.

Tomo 53 Suplemento 2003 2 3