microscopio
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Biología Celular y Molecular.
PRACTICA # 1.
“USO DEL MICROSCOPIO.”
Objetivo:
El alumno utilizara distintos tipos de microscopios, tomando en cuenta sus
cuidados y las técnicas adecuadas para su manejo, además de llevar a
cabo la tinción de Gram e identificara organismos Gram positivo y Gram
negativos en una muestra problema que le brindara el instructor.
Introducción:
El microscopio es un excelente auxiliar de gran precisión en el desarrollo de los
trabajos microbiológicos de un laboratorio.
El microscopio es un instrumento capaz de amplificar cientos y hasta miles de
veces la imagen de los microorganismos, los cuales no son visibles a simple
vista. Su nombre deriva de las raíces “Micros” que significa pequeño y “Scopeo”
que significa ver, por lo tanto significa ver lo pequeño.
Existen diferentes tipos de microscopios tales como:
Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopio electrónico.
Microscopio compuesto: se denomina así porque los del objeto se logra
mediante la combinación de dos juegos de lentes: los objetivos y los oculares.
El microscopio compuesto es el más comúnmente usado en los laboratorios
escolares e incluso industriales, por lo que a continuación describiremos más
detalladamente su estructura.
Sistema de soporte.(pie y brazo) sostiene a todo el microscopio
Sistema eléctrico de iluminación. Depende de los caprichos de cada productor.
Sistema mecánico. Todo accesorio capaz de moverse para optimizar las
funciones de las diferentes partes
Sistema óptico. Conjunto de elementos que posibilitan el incremento de
visibilidad:
oculares, platina, condensador, corredera de platina, revolver, diafragma,
oculares, espejos de conducción, objetivos (2.5x lupa débil. 5x lupa fuerte, 10x
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seco débil, 40-60x seco fuerte, 100x inmersión)
OBJETIVO AUMENTOS DISTANCI FRONTAL
LUPA 5X 20-25 mm
SECO DEBIL 10X 5-6 mm
SECO FUERTE 40-60X 0.5-0.15 mm
INMERSION 100X 0.15-0.02 mm
Manejo del microscopio:
El banco y la mesa deben estar a la altura que le permita al observados
usar el microscopio en posición vertical de manera confortable.
Encender la fuente de iluminación.
Montar la preparación a observar.
Con la lente objetiva de menor aumento en el eje, enfocar la imagen
usando para ello el tornillo micrométrico, hasta que la imagen sea lo más
clara posible.
Mover el condensador si la luz es inadecuada.
Terminar de aclarar la imagen moviendo el tornillo micrométrico.
Cambiar al objetivo seco fuerte y aclarar la imagen con el tornillo
micrométrico. Este objetivo no tiene tope por lo que es necesario cuidar
de no romper el cubreobjetos con la lente del objetivo, mediante
observación lateral de la operación.
Finalmente si es necesario, cambiar al objetivo de inmersión, para ello se
debe colocar una gota de aceite de inmersión entre la lente del objetivo
y el cubreobjetos. Este objetivo tampoco tiene tope por lo que se debe
cuidar no bajarlo demasiado, observando la operación lateralmente.
Observar la preparación. Para cambiar de campo de observación se debe
mover la preparación mediante el carro de la platina arriba-abajo o hacia
la derecha o la izquierda.
Hacer esquemas y anotaciones de lo observado, anotando el objetivo con
el que se observa.
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Cuidados del microscopio.
Toda persona que maneje un microscopio deberá tener en cuenta que es
un instrumento de alto costo de precisión y delicado, por lo que debe
tomar los siguientes cuidados:
El microscopio debe ser guardado en un lugar seco y fresco al cubierto
del polvo.
Para su traslado debe ser tomado con una mano del brazo y con la otra
mano por debajo del soporte o base.
Antes de su uso hay que revisar que las lentes estén limpias, de no ser
así limpiarlas usando solamente papel especial (papel ceda) para evitar el
rayado de las lentes
En caso de haber usado aceite de inmersión deberá limpiarse con un
papel ceda impregnado con una solución de éter, alcohol y acetona,
teniendo cuidado de no usar la mezcla en exceso, puesto que el
pegamento con el que se fija las lentes es soluble en esta mezcla.
Por ningún motivo se desarmara alguna parte del microscopio, ya que
solamente deben hacerlo personas calificadas.
Las partes del soporte deben ser limpiadas con una franela húmeda con
agua, de preferencia destilada para evitar la precipitación de sales;
ocasionalmente el tornillo micrométrico se limpiara con aceite o grasa
especial, el tornillo micrométrico no requiere de aceite.
Las preparaciones a observar deben estar siempre limpias de grasa de
las manos.
Las lentes del microscopio deberán quedar limpias la terminar de
trabajar con el microscopio.
En caso de alguna duda, o falla deberá preguntarle al profesor a cargo.
Los diez mandamientos del microscopio.
1. No lo golpearas, si lo transportas será en posición vertical y sujetándolo
contra tu cuerpo.
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2. Lo inspeccionaras siempre antes de usarlo, si se encuentra alguna avería
o cualquier otra irregularidad, notificaras al encargado para que t
asignen otro microscopio.
3. Limpiaras siempre las lentes con papel ceda, usando un poco de vapor de
aliento.
4. Nunca usaras disolventes para limpiar las lentes, solo en caso de que sea
muy necesario para retirar el exceso de aceite de inmersión y lo harás
muy rápidamente.
5. No le desmontaras ninguna pies, excepto el ocular y eso si te lo pide el
maestro
6. No lo colocaras en el borde de la mesa ni lo tendrás cerca de la llama del
mechero, ni lo guardaras junto con sustancias corrosivas.
7. No lo arrastraras sobre la mesa cuando se encuentre encendido o recién
apagado, porque se funde el foco.
8. Al iniciar tu observación comenzaras con el seco débil, luego si es
necesario, pasaras al seco fuerte o inmersión, siempre y cuando no
tengas un ocular menor de 8X ni mayor a 12.5x.
9. Limpiaras el microscopio periódicamente, nunca le pondrás grasa o aceite
en sus partes mecánicas, ni tampoco intentes desarmarlo y menos forzar
su funcionamiento.
10. Cuando termines de hacer tus observaciones, siempre apagaras la
lámpara inmediatamente y no moverás el microscopio hasta que la
lámpara se haya enfriado.
MATERIALES
MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO
MICROSCOPIO (SENCILLO)
PICETA
ASA MICROBIOLOGICA O ALAMBRE DE PLATINO
GOTEROS
CUBREOBJETOS Y PORTAOBJETOS
PUENTE DE TINCIONES
MECHERO FISCHER
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UN PORTA ASA
REACTIVOS:
SAFRANINA
LUGOL
ALCOHOL-CETONA
CRISTAL VIOLETA
MUESTRAS:
LEVADURA DE CERVEZA
CULTIVOS DE QUESO
CEBOLLA (TELA DELGADA)
SANGRE
Preparación de reactivos:
Cristal violeta: es una solución utilizada para teñir bacterias; estas
adquieren un color morado.
a) *cristal violeta
alcohol etílico al 95%
preparación: disolver 2 g de cristal violeta en 20ml de alcohol.
b) *oxalato de amonio
*agua destilada
preparación: diluya 0.8 de oxalato de amonio en 80 ml de agua
destilada.
Diluya la solución en 4 partes de agua destilada (20-80ml
respectivamente), mezclar con un volumen igual de solución “B”.
Solución de yodo yoduro “lugol”: esta solución identifica el almidón en
los alimentos y tejidos vegetales, y sirve como mordiente en la
tinción de bacterias por la técnica de Gram.
*Yodo
*Yoduro de potasio.
*Agua destilada.
Disolver 1g de yodo y 3g de KI en 300 ml de H2O destilada. Dejarlo
reposar y filtrar.
Safranina: el coloran6te de safranina es útil en la tinción de Gram
principalmente para teñir bacterias.
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*safranina.
*alcohol etílico al 95%.
*agua destilada.
Disolver 2.5g de safranina en100 ml de alcohol etílico al 95%.
Mezclar 25ml de esta solución con 75 ml de H2O destilada.
Alcohol-cetona: utilizado como diluyente y decolorante en las
tinciones.
*alcohol.
*cetona.
Preparación: mezclar 60ml de alcohol absoluto y 40 ml de acetona.
Elaboración del frotis:
Colocar una gota de agua sobre un portaobjetos y en ella disolver una
pequeña parte de colonia.
Colocando un portaobjeto en Angulo de 45ᵒ con el portaobjetos,
extender la suspensión de microorganismos. A esto se le llama extensión
de los microorganismos o frotis.
Fijar el frotis a la flama, para esto pasar varias veces el portaobjetos
sobre la flama, cuidando que no hierva la preparación. El calor se
controla pasando cada vez el portaobjetos sobre el dorso de la mano
para cuidar que este tenga una temperatura soportable.
Una vez que el frotis se ha secado completamente, colocarlo sobre una caja
Petri o sobre un puente de tinción y practicarle la tinción de Gram.
Tinción de Gram.
Cubrir el frotis con cristal violeta (dejar actuar 1 minuto)
Lavar el exceso de colorante con la piseta
Cubrir el frotis con lugol (dejar actuar 1 minuto)
Lavar el exceso de lugol con la piseta
Decolorar la preparación, agregando alcohol-cetona (15-30 segundos)
Cubrir el frotis con safranina (15-30segundos)
Lavar con agua corriente y dejar secar al aire.
Observar al microscopio con todos los objetivos.
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Resultados.
Se lograron los objetivos de la práctica, puesto que pude observar en el
microscopio, diferentes tipos de microorganismos tanto en su estado
natural, como en tinciones.
Se aprendieron y reconocieron las partes del microscopio además de
manejarlo correctamente.
Muestra de levadura de cerveza hidratada en agua y vista al microscopio.
Es una pequeña tela extraída de la cebolla, observada al microscopio.
Cocos vistos en la muestra del cultivo de queso son Gram negativas por su
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pared celular pintada en rosa.
Muestra de sangre vista al microscopio sin aplicar ninguna técnica de
tinción.
Muestra de sangre vista al microscopio con la tinción de Gram aplicada.
Discusión.
Aunque la mayoría de los libros de biología manejan la microscopia, no toman en
cuenta algunos microscopios, en el manual (microbiología general) aparecen
varios. Encontramos que en “Biología celular” de Jack Burke, explican
perfectamente tres microscopios que son: microscopio de luz, microscopio
electrónico y el microscopio de contraste de fases.
En “fisiología celular” de A.C. Giese solo encontramos el microscopio de campo
oscuro, el polarizante y el de interferencia. Realmente se dan las bases físicas
principalmente en el primer libro citado, donde se hablan de lo importante de
las características de la luz para ser manipuladas de la mejor manera que nos
convenga. En el manual se nos habla un poco sobre la historia del microscopio, y
es en donde se pueden conocer las partes del microscopio fácilmente, para ser
utilizado con eficacia en el laboratorio. También se dan a conocer los cuidados
que se deben tomar en cuenta para el buen funcionamiento del microscopio,
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esto es difícil de encontrar en algún libro , porque los demás libros sólo dan el
fundamento de la microscopia,; pero hablan poco de cómo utilizarlo en el
laboratorio ya que esto es muy importante.
En Microbiología encontré otro microscopio que no se había mencionado:
Microscopia de Normanski. Esta utiliza las diferencias de e índices de
refracción y produce el contraste por interferencia; pero su diferencia con el
microscopio de fases, radica en el sistema mediante el cual se paran los rayos
interferentes (Un prisma). Produce una imagen casi tridimensional y es útil
para observar organismos vivos en el interior de animales vivos. En este libro
se menciona su utilidad primordial de diferentes microscopios, y todos tienen
principios físicos; ya que utilizan la luz para amplificar una imagen.
Conclusiones.
Las tinciones son de gran ayuda en microscopia debido a que gracias a los
colorantes utilizados en las tinciones se logran apreciar con más claridad los
microorganismos, además de poder identificar algunos organelos que contienen
los antes mencionados.
Dependiendo del tipo de tinción, se podrán observar los organismos. Dado que
en una tinción simple no se pueden apreciar distintos tipos de microorganismos
y en las tinciones diferenciales siempre se podrán diferenciar mínimo dos tipos
de organismo en el frotis. Tales tinciones son:
Tinción de Gram.
Tinción Zielh-Nielssen