Microscopa y Preparacin de MuestrasMicroscopa es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal.Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo se requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas son, tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas de salida, procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc.Exceptuando tcnicas especiales como las utilizadas en microscopio de fuerza atmica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto tnel, la microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de algn tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio. El objetivo de la preparacin de muestras para microscopa ptica es permitir que las estructuras de los materiales se revelen con suficiente contraste de modo que las caractersticas de inters sean descritas, grabadas y caracterizadas en detalles visibles a una escala menor que la agudeza visual del ojo humano.La escala ltima de observacin estar limitada por a resolucin del sistema de imagen del microscopio.1. Lentes y desviacin de la luzEl trmino lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plstico u otro material transparente, generalmente de dimetro circular, que posee dos superficies pulidas y diseadas de una manera especfica para producir la convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. La accin de una lente depende de los principios de refraccin y reflexin, los cuales pueden entenderse mediante unas sencillas reglas de geometra que rigen el paso y trayecto de la luz a travs de la lente. Estos conceptos son materia de estudio de la ptica Geomtrica y permiten comprender el proceso de magnificacin, las propiedades de las imgenes real y virtual, as como tambin los defectos (aberraciones) de las lentes.La palabra lente proviene del latn "lentis" que significa "lenteja" por lo que a las lentes pticas se les llama as por su semejanza con la forma de la legumbre.Las lentes son instrumentos pticos que concentran o dispersan los rayos de luz. Sus dos superficies pueden ser curvas (biconvexas, bicncavas o cncavo-convexas) o una de ellas puede ser plana (plano-convexas, plano-cncavas). Las lentes de superficies convexas se denominan positivas, convergentes, recolectoras o de aumento. Las lentes de superficies cncavas son conocidas como negativas, divergentes, de dispersin y producen una imagen reducida.

Diversos tipos de lentesLa luz se propaga con una trayectoria rectilnea y con una velocidad constante en cada medio. Cuando incide en un objeto, el rayo luminoso se comporta de diversas maneras, producindose: Refraccin, Reflexin, Difraccin, Absorcin-Transmisin, Interferencia y Polarizacin. Describiremos someramente la refraccin.1.1 Refraccin de la luz: Las propiedades de las lentes se deben gracias a los fenmenos de refraccin que experimentan los rayos luminosos que las atraviesan. Cuando una radiacin electromagntica en la forma de rayo luminoso, denominado incidente, viaja de un medio o una superficie y atraviesa otro medio, las ondas luminosas sufren el fenmeno conocido como refraccin, el cual se manifiesta mediante una desviacin en la direccin de la luz. Si el rayo incidente llega de manera perpendicular a la superficie de una lmina de vidrio, de superficies paralelas, no es desviado de su trayecto rectilneo, pasando del aire al vidrio y de este ltimo al aire nuevamente. Por el contrario, si el rayo incide de manera oblicua sobre la superficie de la lmina de vidrio, es desviado de su direccin rectilnea, en principio al entrar al vidrio, pues pasa de un medio menos denso (aire) a otro medio de mayor densidad (vidrio) y es desviado nuevamente al salir del vidrio hacia el aire.Cuando la luz pasa de un medio a otro, la velocidad de la onda disminuye. La nueva direccin que toma el rayo refractado depende de la densidad del medio que atraviesa. Los efectos de la refraccin son responsables de algunos fenmenos que nos son familiares, por ejemplo, la aparente deformidad de un objeto parcialmente sumergido en un vaso de agua. La refraccin de la luz visible en las lentes es de vital importancia, pues les permite concentrar un haz de rayos luminosos en un punto especfico.Si dividimos la velocidad de la luz en el vaco entre la que tiene en un medio transparente, obtenemos un valor que llamamos ndice de refraccin de ese medio y es el cociente entre velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la luz en el medio que se estudia:

n: ndice de refraccinc: velocidad de la luz en el vacov: velocidad de la luz en el medio material transparente

1.2 ndice de refraccinEl ndice de refraccin de un medio es una medida para saber cunto se reduce la velocidad de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el ndice de refraccin del agua es n= 1,33, quiere decir que la luz es 1,33 veces ms rpida en el vaco que en el agua y es un valor que tiene que ver con las propiedades de las lentes.

Ejemplos del ndice de refraccin en algunos medios transparentes. (*) En condiciones normales de presin y temperatura, se considera 1 el valor.

1.3Punto FocalEl punto focal es el punto en donde confluyen los rayos luminosos refractados, despus de atravesar la lente. Se puede apreciar, por ejemplo, cuando al recibir los rayos solares sobre una lupa planoconvexa o biconvexa, se forma un punto muy luminoso y muy caliente. Los rayos calorferos siguen el mismo trayecto que los luminosos.

1.4 Distancia Focal La distancia focal de una lente es la distancia entre el centro ptico de la lente y el foco (o punto focal). El foco es el punto donde se concentran los rayos de luz. Es la relacin existente entre la longitud del tubo del microscopio empleado y la amplificacin usada en un momento dado.

2 Unidades de longitud para describir microorganismosA nosotros nos interesan los submltiplos del metro porque los elementos conque trabajan las ciencias biolgicas experimentales tienen dimensiones por debajo del metro. Para darnos una idea veamos en forma comparativa el tamao de las clulas, las bacterias, los virus y las molculas. De todos los submltiplos delmetrolos ms usados son: el milmetro (10-3metros), el micrmetro (10-6metros), el nanmetro (10-9metros) y elrmstrong(10-10metros). El nanmetro (nm) es mil millones de veces inferior al metro. Una unidad an ms pequea es el ngstrom (), que es diez mil millones de veces menor que el metro; esta ltima unidad no forma parte oficialmente del sistema mtrico decimal, aunque tambin se emplea. Las clulas de las bacterias, los hongos, las algas y los protozoos se miden en micrmetros. Los virus y las estructuras subcelulares, tales como los ribosomas y las membranas, en nanmetros. Y los tomos y molculas se miden en angstroms.

3 Microscopio pticoSe usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cual permite observar los detalles estructurales de los microorganismos. El microscopio ptico normal que se usa para observar bacterias y otros organismos celulares es un microscopio compuesto, el cual est provisto de una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto a observar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificacin de la imagen. A travs de la refraccin o reflexin de los rayos luminosos mediante el sistema de lentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es ms grande que el objeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.3.1 Microscopio SimpleLos primeros microscopios, construidos por Leeuwenhoek alrededor de 1675, eran simples, es decir, contenan slo una lente o lupa. Estas eran lentes convexas (ms gruesas en el centro que en la periferia). La muestra u objeto podran entonces ser enfocados por el uso de la lupa colocada entre el objeto y el ojo. Estos "microscopios simples" podran difundir la imagen en la retina por ampliacin mediante el aumento del ngulo visual en la retina.El objeto a observar se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formacin de una imagen virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder diptrico de la lente y cuanto ms alejado est el punto prximo de la visin ntida del sujeto.El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a que la longitud de onda de la luz visible le impone limitaciones.El microscopio que se observa en la imagen fue construido hacia 1668 y mide 10 cm de longitud; esos microscopios simples de una sola lente producan una ampliacin de hasta 275 veces (275x) y tenan un poder de resolucin de 1,4m.;no padecan las aberraciones que limitaban la eficacia de los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke. Con ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez protistas microscpicos de vida libre y parastica, clulas espermticas, clulas sanguneas, nematodos microscpicos, rotferos y hasta bacterias.3.2 Microscopio compuestoTiene varias lentes combinadas, capaces de producir gran aumento. Existen varios aditamentos que utilizados en el microscopio ptico ordinario, aumentan mucho su rendimiento como instrumento de observacin, p. ej. Microscopio en Campo Oscuro (Ultramicroscopio), Microscopio de Contraste de Fases, Microscopio de Fluorescencia, Microscopio de Luz Ultravioleta, Microscopio de Interferencia, Microscopio de Contraste de Interferencia Diferencial de Nomarski.Existe adems el Microscopio electrnico, que debido a sus posibilidades para obtener imgenes claras de los objetos ms diminutos, ha hecho contribuciones de la mayor importancia, sobre todo en el estudio de la constitucin y ciclos vitales de los virus filtrables. De campo luminosoEl material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estn naturalmente coloreados. Para formar una imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. Tambin se usan mtodos de tincin, segn las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.El campo del microscopio est intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen ms oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos, pudindose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y 3000 aumentos.El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de dimetro ni consigue resolver dos lneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola lnea) De campo oscuroEl microscopio de campo oscuro es un microscopio que utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia.El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms pequeas que el poder separador del sistema ptico usado por transparencia.

Los condensadores que se emplean en microscopa de campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numrica mayor al del objetivo. De campo de fluorescencia El microscopio de fluorescencia... es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un electrn de un tomo absorbe toda la energa de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situacin inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energa que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.Aprovechando este fenmeno, se han creado los flurocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitacin que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los ms comunes son el DAPI que tie el ncleo de las clulas y el GFP.

4 Partes del MicroscopioUn microscopio compuesto tiene ms de una lente objetiva. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar. El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestos de tal manera que producen las ranuras de luz. El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

4.1 El sistema mecnico Parte mecnica del microscopio

Esquema de un microscopio ptico.La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos sostienen la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie y soporte:contiene la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo:llamada tambin asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante unabisagra, permitiendo la inclinacin del tubo para mejorar la captacin deluzcuando se utilizan losespejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie. El can tiene forma cilndrica. El can se encuentra en la parte superior de la columna, enfoca el objeto mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos. El tornillo macromtrico o macroscpico:girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rpido de la preparacin. El tornillo micromtrico o microscpico:mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm, que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. La platina:es una pieza metlica plana en la que se coloca el objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Las pinzas:son dos piezas metlicas que sirven para sujetar el objeto. Se encuentran en la platina. El revlver:es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido de un pin que lo fija.

4.2 Sistema pticoEs el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego ampla.

El ocular:se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de la pieza con elojodel observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen unaescalamicromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado. Los objetivos:se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersin. Losobjetivos secos:se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. Elobjetivo de inmersin: Est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

4.3 Sistema de iluminacinEste sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:

Fuente de iluminacin:Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas conleds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas. El espejo:Necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino unalmparaque cumple la misma funcin que el espejo. Condensador:Est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia. Diafragma:El condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.

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