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Sección Especial / Special Section: X Reunión Nacional de Óptica
Microscopía de barrido con muestreo espacial del plano del detector
Scanning microscopy with spatial sampling of the detector plane
Emilio Sánchez-Ortiga(1,*,S), Genaro Saavedra(1,S), Colin Sheppard(2), Ana Doblas(1,S),
Manuel Martínez-Corral(1,S), Pedro Andrés(1,S)
1. Departamento de Óptica, Universidad de Valencia, Dr. Moliner 50, 46100, Burjassot, Spain.
2. Division of Bioengineering, National University of Singapore, 7 Engineering Drive 1, Singapore.
(*) Email: [email protected] S: miembro de SEDOPTICA / SEDOPTICA member
Recibido / Received: 10/12/2012. Revisado / Revised: 26/02/2013. Aceptado / Accepted: 01/03/2013.
DOI: http://dx.doi.org/10.7149/OPA.46.2.137
RESUMEN:
Se presenta la implementación de un microscopio confocal de barrido en el cual se emplea como detector una cámara CCD. Este tipo de detección posee numerosas ventajas con respecto a la detección típica en la microscopia confocal. Se demuestra la aplicabilidad de nuestro sistema que, al realizar un muestreo espacial de la distribución de intensidades en el plano del detector, permite llevar a cabo técnicas de aumento de la resolución tridimensional del sistema.
Palabras clave: Microscopía Láser Confocal de Barrido, Imagen 3D, Super-Resolución.
ABSTRACT:
We present the implementation of a confocal scanning microscope in which the signal detection is performed through a matrix sensor, specifically, a CCD camera. This kind of detection has several advantages over the conventional detection in confocal microscopes. One of those advantages is the possibility to recover information of the sample that vanishes when the confocal image is directly acquired by the integration of light into a signal. We demonstrate the applicability of the system which allows implementing super-resolution techniques in a very easy manner.
Key words: Confocal Laser Scanning Microscopy, 3D Imaging, Super-Resolution.
REFERENCIAS Y ENLACES / REFERENCES AND LINKS
[1]. E. Sánchez-Ortiga, C. J. R. Sheppard, G. Saavedra, M. Martínez-Corral, A. Doblas, A. Calatayud, “Subtractive imaging in confocal scanning microscopy using a CCD camera as a detector”, Opt. Lett. 37, 1280-1282 (2012). DOI
[2]. C. J. R. Sheppard, A. Choudhury, “Image formation in scanning microscope”, Opt. Acta 24, 1051-1073 (1977). DOI
[3]. T. Wilson, R. Carlini, “Size of the detector in confocal imaging systems”, Opt. Lett. 12, 227-229 (1987). DOI
[4]. T. Wilson, Y R. Carlini, “Effect of detector displacement in confocal imaging system”, Appl. Opt. 27, 3791-3799 (1988). DOI
[5]. R. Heitzmann, V. Sarafis, P. Munroe, J. Nailon, Q. S. Hanley, T. M. Jovin, “Resolution enhancement by subtraction of confocal signals taken at different pinhole sizes”, Micron 34, 293-300 (2003). DOI
[6]. C. J. R. Sheppard, C. J. Cogswell, “Confocal microscopy with detector arrays”, J. Mod. Opt. 37, 267-279 (1990). DOI
[7]. M. Martínez-Corral, G. Saavedra, “The resolution challenge in 3D optical microscopy”, Prog. Opt. 53, 1-67 (2009). DOI
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1. Introducción
La microscopía confocal se ha erigido en una de
las técnicas más útiles y sencillas de realizar
dentro de la microscopía óptica moderna. A
pesar de que fue propuesta hace más de medio
siglo ha sido en las últimas dos décadas cuando
ha encontrado su auge gracias a diferentes
desarrollos tecnológicos. Dentro de estos
desarrollos se encuentran el láser, los detectores
de área extensa, así como los sistemas de barrido
con precisión sub-micrométrica. La idea clave de
este microscopio óptico, que rompe ciertas
barreras de la microscopia convencional en
términos de resolución, es la conjunción de una
iluminación puntual de la muestra y una
detección puntual de la luz reflejada por la
misma. Como se muestra en la Fig. 1, esto se
consigue proyectando sobre la muestra, a través
de un objetivo de microscopio, el haz láser
emitido a la salida de una fibra óptica. La luz que
refleja dicha muestra es colectada por el mismo
objetivo de microscopio y, mediante un divisor
de haz (BS), es proyectada sobre un orificio de
dimensiones microscópicas. Este orificio, al que
llamamos pinhole, actúa eliminando la luz que
proviene de planos desenfocados de la muestra
confiriéndo al sistema su capacidad de
seccionado óptico. La luz que atraviesa el pinhole
llega a un detector de área extensa,
normalmente un tubo fotomultiplicador (PMT),
que la transfiere en una señal eléctrica. Dicha
señal es almacenada en un ordenador como un
píxel de la imagen confocal. Para obtener una
imagen bidimensional (2D) es necesario realizar
un barrido trasversal de la muestra. Asimismo,
gracias a la capacidad de seccionado óptico del
sistema, es posible realizar una imagen sintética
tridimensional (3D) a partir de la compilación de
pilas de imágenes 2D capturadas mediante un
barrido axial de la muestra.
En el sistema que proponemos se sustituye el
pinhole y el detector de área extensa por una
cámara CCD [1]. Ésta se sitúa en el plano del
pinhole, es decir, en el plano del espacio imagen
conjugado con el plano focal objeto del objetivo
de microscopio. Como veremos, este tipo de
detección alternativa no sólo permite obtener
imágenes equivalentes a las de un microscopio
confocal si no que le confiere al sistema una
mayor flexibilidad y permite la implementación
de una manera sencilla de técnicas de aumento
de resolución.
Fig. 1. Esquema de un microscopio confocal de barrido.
2. Fundamento teórico
En esta sección realizaremos una descripción
teórica de la formación de imágenes en un
microscopio confocal de barrido teniendo en
cuenta la forma del detector. Introduciremos
también la técnica conocida como imagen
confocal substractiva que produce un aumento
en la resolución tridimensional del sistema. Esto
servirá de motivación para la propuesta de
detección matricial empleando una cámara que
realice un muestreo espacial del plano del
detector. Hay que puntualizar que utilizaremos
los términos detector y pinhole indistintamente
ya que éste último es el elemento que afecta al
proceso de formación de imágenes en
microscopia confocal.
2.a. Formación de imágenes confocal
A continuación vamos a considerar la formación
de imágenes coherente a través de un
microscopio confocal de barrido. Para ello,
suponemos que el sistema tiene simetría de
revolución entorno al eje óptico y que se tiene
un detector puntual centrado en dicho eje y
situado en el plano imagen del sistema de
colección. Tras realizar un barrido
tridimensional, teniendo un objeto con una
reflectancia en amplitudes dada por y
para una longitud de onda de iluminación , la
distribución de intensidades de la imagen
confocal viene dada por [2]:
(1)
siendo y
las coordenadas normalizadas en la
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dirección radial y axial, respectivamente, el
ángulo de apertura del objetivo y , , la
respuesta impulsional en amplitudes de los
sistemas de iluminación y colección dadas por:
(2)
siendo , la función pupila del
objetivo de microscopio y la función de
Bessel de primera especie de orden cero. Si
asumimos que los sistemas de colección e
iluminación son iguales, se puede demostrar que
la respuesta impulsional en intensidades del
microscopio confocal en las direcciones
transversal y axial puede escribirse en la forma
(3)
donde es la función de Bessel de primera
especie de orden uno. Es fácil ver que ambas
respuestas corresponden a la respuesta
impulsional de un sistema convencional elevada
al cuadrado. Como consecuencia, la respuesta
impulsional 3D de un microscopio confocal es
más estrecha que la de un microscopio
convencional lo que supone una mayor
resolución. En la Fig. 2 se representa un corte
axial de la respuesta impulsional de ambos
microscopios.
2.b. Influencia de la geometría del detector
En la sección anterior hemos considerado que la
imagen confocal se obtiene a través de la
integración de la luz que atraviesa un pinhole
puntual centrado eje en una señal para cada
posición de barrido. En la práctica el detector
posee un cierto tamaño ya que la relación señal
ruido disminuye drásticamente a medida que se
reduce el tamaño del detector. Se puede
demostrar [3] que para un detector circular de
tamaño finito, , la respuesta impulsional del
microscopio confocal viene dada por:
(4)
donde
(5)
y siendo el radio del detector. Para los dos
casos límites del tamaño del detector se obtiene
una expresión sencilla de la respuesta
impulsional en intensidades del microscopio
confocal:
(6)
Como vemos, si el detector es puntual se
obtiene la respuesta impusional de un
microscopio confocal ideal mientras que si el
tamaño del detector tiende a infinito
(equivaldría a un microscopio de barrido sin
Fig. 2. Representación de un corte axial de la respuesta impulsional en un (a) microscopio convencional, (b) microscopio confocal.
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Fig. 1. Respuesta impulsional en intensidades de un microscopio confocal de barrido para (a) distintos radios a del detector, (b) un detector puntual separado una distancia con respecto al eje óptico en la dirección transversal.
pinhole) la respuesta impulsional es
exactamente la misma que para un microscopio
convencional. En el resto de casos estaríamos en
una situación intermedia, es decir, dependiendo
del tamaño del detector se produciría un
ensanchamiento equivalente de la respuesta
confocal ideal (ver Fig. 3(a)).
Otro de los parámetros que influyen en la
distribución de intensidades de un microscopio
confocal de barrido es la posición del detector.
Una vez conocido el efecto del tamaño del
detector, es interesante estudiar como varía la
respuesta impulsional del sistema cuando se
considera un detector puntual desplazado una
cantidad con respecto al eje óptico. Es fácil ver
que dicha respuesta, en la dirección transversal,
puede expresarse como [4]:
(7)
En las curvas de la Fig. 3(b), se observa que
existen ciertas posiciones del detector que
producen una respuesta impulsional en la
dirección transversal más estrecha que para el
caso en el que éste se encuentra centrado en el
eje óptico. Sin embargo, conforme aumenta la
separación con respecto al eje óptico, aparecen
unos lóbulos laterales que distorsionan dicha
respuesta. En realidad la influencia del tamaño
del detector puede entenderse a partir de lo que
ocurre cuando se tiene un detector infinitesimal
desplazado. Para un cierto tamaño del detector,
la respuesta impulsional vendría dada por la
integración de la respuesta de distintos
detectores infinitesimales desplazados dentro
del área del detector de tamaño finito.
2.c. Mejora en la resolución tridimensional
por combinación de señales para
distintos tamaños de pinhole
Como hemos visto en la sección 2(b), la
geometría y la posición del detector tienen un
papel fundamental en las características de la
distribución de intensidades imagen obtenida en
un microscopio confocal. Si bien supone una
limitación práctica a la hora de aproximarse al
caso ideal, es posible aprovechar esta
dependencia para aumentar la resolución
tridimensional del sistema. Existen una serie de
técnicas que permiten mejorar la resolución de
un microscopio confocal por medio de la
combinación de señales obtenidas con
detectores de distinta geometría. Una de dichas
técnicas es la conocida como imagen
substractiva en microscopia confocal [3]. Se basa
en la substracción de las señales,
apropiadamente escaladas, obtenidas barriendo
la muestra en ausencia de pinhole (o con un
pinhole relativamente grande) y con un pinhole
de tamaño óptimo para la detección confocal. De
este modo, la distribución de intensidades
obtenida para la imagen substractiva se puede
escribir como:
(8)
siendo un factor de peso que permite escalar
ambas señales convenientemente. La respuesta
impulsional de la imagen substractiva en las
direcciones transversal y axial viene dada por:
(9)
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Fig. 2. Representación de la respuesta impulsional en las direcciones transversal y axial para los microscopios convencional y confocal y las obtenidas mediante la técnica de imagen substractiva.
Para obtener una respuesta óptima el factor
de peso se escoge de forma que:
(10)
En la Fig. 4 se puede observar como la técnica
de imagen substractiva presenta una respuesta
impulsional más estrecha tanto en la dirección
transversal como en la axial con respecto a la del
microscopio confocal y, por tanto, una mejor
resolución.
Para poder llevar a cabo esta técnica en un
microscopio confocal estándar son necesarios
dos brazos de colección: uno de los brazos sin
pinhole y el otro con un pinhole de pequeño
tamaño. Lógicamente este proceso requiere de
una perfecta alineación entre ambos brazos de
colección de tal forma que las señales
substraídas correspondan a zonas equivalentes
de la muestra.
2.d. Muestreo espacial en el plano del
detector
Como hemos visto el microscopio confocal,
empleado en condiciones óptimas, posee mayor
resolución que un microscopio convencional.
Este hecho puede resultar paradójico teniendo
en cuenta que en el microscopio confocal se
desecha cierta información por medio del
empleo del pinhole. Dicha paradoja no es tal ya
que, como se deduce de los cálculos anteriores,
se esta incorporando al sistema información
acerca de como se distribuye espacialmente la
luz en el plano del detector. Es fácil comprender,
pues, el papel crucial que juega el tamaño del
pinhole en la detección confocal. Idealmente
dicha detección se realiza con un pinhole
infinitesimal. En la práctica se emplean
diferentes tamaños de pinhole (dependiendo del
objetivo de microscopio empleado) que van de
unas pocas decenas a cientos de micras. A
medida que el tamaño del pinhole aumenta la
imagen confocal se “emborrona” como
consecuencia de la adición de información a la
imagen confocal ideal, aproximándose a la que
se obtendría con un microscopio convencional
cuando el tamaño del detector es
suficientemente grande. Mediante este
razonamiento se puede concluir que al integrar
en una señal la luz que atraviesa el pinhole se
está perdiendo gran cantidad de información.
Esto sugiere un tipo alternativo de detección
confocal, mediante el uso de un detector
matricial, en el que se realiza un muestreo
espacial en el plano del detector de la
distribución de intensidades imagen del campo
reflejado por la muestra para cada posición de
barrido. El empleo de un detector matricial en
microscopía confocal fue propuesto años atrás
[6]. Sin embargo, al no existir un detector óptimo
para llevarla a cabo, este tipo de detección no
tuvo un gran impacto. El rápido desarrollo de los
sensores CCD en los últimos años hace viable la
detección matricial presentándola no sólo como
una seria alternativa a la detección usual, si no
abriendo la posibilidad de realizar un procesado
de la señal confocal para cada posición de
barrido de la muestra.
Para una cámara con píxeles
separados una distancia , suponiendo
que éstos son infinitesimales, colocada en el
plano imagen, la función del detector matricial
vendría dada por:
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(11)
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donde hemos escrito la coordenada radial
normalizada en función de sus componentes
transversales y donde hemos supuesto que
el píxel central de la cámara se sitúa centrado
sobre eje óptico. Es directo ver que se registran
distintas señales correspondientes a detectores
desplazados con respecto al eje óptico para cada
posición de barrido de la muestra. Por tanto, es
posible combinar dichas señales elementales
para obtener una señal equivalente a la
detección confocal, con la flexibilidad de poder
variar tanto el tamaño del detector como su
posición. Asimismo, surge la posibilidad de
obtener señales correspondientes a distintos
detectores en paralelo, de tal forma que es
directo implementar técnicas de aumento de
resolución como la presentada en la subsección
anterior.
3. Montaje experimental
Como hemos dicho, el microscopio confocal
propuesto se basa en la sustitución del pinhole y
el detector de área extensa por una cámara CCD
situada en el plano del detector. El software que
hemos desarrollado permite controlar distintos
parámetros de la cámara como son la ganancia,
tiempo de exposición y el número de píxeles
activos de la cámara así como su posición. La
señal para una posición de barrido se obtiene
mediante la integración numérica de los píxeles
activos de la cámara. La posibilidad de elegir el
número de píxeles activos de la cámara es muy
relevante a la hora de realizar una imagen ya que
el tiempo de respuesta de la cámara depende de
dicho número y, a su vez, determina el tiempo de
adquisición para cada posición del barrido. Una
de las ventajas del sistema es que de esta
manera tenemos un pinhole sintético de tamaño
variable y cuya alineación puede llevarse a cabo
de manera muy sencilla. Obviamente, dicho
pinhole sintético presentará una forma cuadrada
(o bien de círculo pixelado). Por otra parte, si la
muestra se ilumina por transmisión con una
fuente extensa de luz blanca, es posible
identificar la zona de barrido mediante la
visualización directa de la imagen de campo
claro capturada por la cámara CCD. Además, si el
sensor posee tres canales cromáticos se puede
llevar a cabo la adquisición en color de imágenes
confocales (dentro de las limitaciones
espectrales del filtro de Bayer del sensor). De
esta forma, nuestra implementación también
supone una reducción de coste debido a que la
realización de detección en color en un
microscopio confocal estándar exige tres tubos
fotomultiplicadores con sus correspondientes
filtros. Las ventajas anteriores sumadas a la
posibilidad de realizar diferentes técnicas
basadas en el muestreo espacial del plano del
detector otorgan gran robustez y flexibilidad al
sistema.
El microscopio de barrido propuesto se
muestra en la Fig. 5. En éste se emplea un láser
He-Ne de longitud de onda 632.8 nm acoplado a
una fibra óptica para iluminar puntualmente la
muestra. El barrido de la muestra se realiza
mediante un sistema piezoeléctrico (PZT) que
permite desplazamientos tridimensionales de
0.1 m. En la mayoría de los resultados que se
mostrarán más adelante se empleó un objetivo
de microscopio de aumento 100× y apertura
numérica (AN) 0.9. Dicho objetivo de
microscopio está conjugado al infinito por lo que
se emplean dos lentes de tubo de 200 mm de
distancia focal tanto en iluminación como en
Fig. 5. Esquema del microscopio confocal propuesto en el que se realiza un muestreo espacial del plano del detector para cada posición de barrido de la muestra.
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colección. La cámara CCD empleada posee 8-bits,
1600×1400 píxeles de 4.4 m de tamaño. Si se
emplea todo el detector la máxima velocidad de
adquisición es de 6 frames por segundos. Sin
embargo, para los tamaños típicos del pinhole
(entre 4×4 y 20×20 píxeles activos) la velocidad
de adquisición aumenta hasta cerca de los 500
frames por segundo.
4. Resultados
En primer lugar probaremos las características
del microscopio propuesto como sistema
formador de imágenes. Para ello, se realiza la
imagen de un test USAF-1951 de alta resolución
en negativo, creado por una deposición de
cromo sobre vidrio con una serie de líneas
transparentes. La imagen obtenida tras el
barrido con un pinhole sintético de 6x6 píxeles
se muestra en la Fig. 6(a). Para evaluar la
resolución del sistema en la dirección
transversal empleamos una microesfera
reflectante con un diámetro más pequeño que la
respuesta impulsional del sistema. El perfil
obtenido de dicha microesfera se representa en
la Fig.6(b). El valor teórico de la anchura a media
altura (FWHM) de la respuesta impulsional en la
dirección transversal para el objetivo de
microscopio usado en este experimento es de 0.7
m, que coincide con el valor obtenido
experimentalmente a partir del perfil de la
microesfera. Para evaluar la resolución en la
dirección axial se realizó un barrido de un espejo
plano en la dirección del eje óptico. La curva
obtenida en dicho barrido es una buena
aproximación de la respuesta impulsional del
sistema en la dirección axial y se conoce como la
función . Este proceso lo realizamos para
distintos tamaños del pinhole sintético, como
puede verse en la Fig. 6(c). La FWHM de la
respuesta impulsional teórica en la dirección
para un sistema confocal ideal con el objetivo de
microscopio empleado es de 1.09 m, valor al
que se aproxima la medida experimental para el
pinhole sintético más pequeño.
Por último, para comprobar la capacidad de
seccionado óptico del sistema se empleó
nuevamente el test USAF-1951 pero esta vez
inclinado con respecto al eje óptico. Se tomó la
imagen para un tamaño de pinhole sintético de
50×50 píxeles y otra con 8×8 píxeles. Como era
de esperar (ver Fig. 7), para el pinhole sintético
grande la luz proveniente de planos que están
fuera de foco sigue estando presente mientras
que en el otro caso dicha luz es bloqueada por el
pinhole sintético.
Una vez probada la funcionalidad del sistema
veamos cómo implementar la técnica de imagen
subtractiva en el mismo. Como dijimos en la
sección 2.c, en un microscopio confocal estándar
son necesarios dos brazos de colección con
distintos tamaños de pinhole para poder llevar a
cabo la técnica. Sin embargo, con nuestro
sistema ambas señales se pueden obtener en
paralelo a partir de un único brazo de colección
y estando seguros de la perfecta alineación del
sistema. Para obtener una imagen substractiva
se sigue el siguiente procedimiento: en la
adquisición se selecciona un número de píxeles
activos relativamente grande, a los que
Fig. 6. Evaluación de las características del microscopio como sistema formador de imágenes, (a) Imagen confocal de un test USAF-1951 de alta resolución en negativo, (b) perfil de la imagen obtenida de una microesfera reflectante de 0.1mm de radio (evaluación de la respuesta impulsional en la dirección transversal), (c) curvas V(z) para distintos tamaños del pinhole sintético.
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Fig. 7. Imágenes del test USAF-1951 en negativo al que se le ha inducido una cierta inclinación con respecto al eje óptico para tamaños del pinhole sintético de: (a) 50×50 píxeles, (b) 8×8 píxeles.
Fig. 8. Medida de la respuesta impulsional mediante (a) barrido transversal de una microesfera de 0.1 m de radio y (b) curvas .
llamaremos pinhole sintético abierto y que sería
equivalente a la captura sin pinhole. A partir de
este pinhole sintético es posible extraer la señal
que se obtendría con un pinhole cerrado
aplicando una máscara de recorte que seleccione
un pequeño número de píxeles. Para cada
posición de barrido se obtienen
simultáneamente las señales del pinhole
sintético abierto y cerrado y, mediante la
combinación apropiada de ambas, la señal
substractiva.
En la Fig. 8 se muestran las medidas
experimentales de la respuesta impulsional
transversal y axial para los casos: pinhole
sintético abierto formado por 60×60
píxeles activos, pinhole sintético cerrado
formado por 8×8 píxeles activos y la
correspondiente señal substractiva . Al
igual que anteriormente, para medir la respuesta
impulsional transversal se escaneó una
microesfera reflectante mientras que en la
dirección axial se realizó el barrido de un espejo
plano en la dirección del eje óptico. Como puede
verse la respuesta impulsional en ambos casos
es sensiblemente más estrecha en la señal
substractiva que en la señal confocal.
En la Fig. 9 se muestran imágenes de un corte
de piel de cebolla obtenidas con nuestro sistema
para los distintos casos. Como puede observarse,
la calidad visual de la imagen obtenida mediante
la substracción de las señales e
ha aumentado notablemente. Esta mejoría se
puede evaluar en términos de las frecuencias
espaciales que han sido transmitidas a través del
sistema, es decir, analizando el dominio de
Fourier (ver Fig. 10). Como puede verse,
mediante la técnica substractiva se obtiene una
mayor eficiencia en la transmisión de
frecuencias medias y altas. De hecho, es posible
entender el proceso de formación de imágenes
confocales substractivas como un cambio en el
reparto de pesos otorgado a las componentes
espacio-frecuenciales de la imagen confocal. De
este modo, las frecuencias espaciales altas en la
imagen substractiva se han transmitido con un
peso mayor al que tendrían mediante la
formación de imágenes puramente confocal.
Con el fin de obtener un resultado más visual
que el anterior, empleamos un objetivo de
microscopio cuya AN y aumento son inferiores a
las del usado anteriormente, en concreto, un 50×
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Fig. 9. Imágenes de un corte de piel de cebolla obtenidas con nuestro sistema y sus respectivas transformadas de Fourier para los casos: (a) pinhole sintético abierto, (b) pinhole sintético cerrado y (c) imagen substractiva resultante. En la transformada de Fourier se representa la frecuencia de corte mediante una circunferencia de línea discontinua.
Fig. 3 Perfiles de las transformadas de Fourier para los casos de pinhole sintético abierto (convencional), pinhole sintético cerrado y la técnica substractiva.
Fig. 11. Cortes transversales y axiales de una muestra de celulosa obtenidos con nuestro sistema para los casos de (a)-(d) un pinhole sintético abierto (convencional), (b)-(e) un pinhole sintético cerrado (confocal) y (c)-(f) la obtenida mediante la combinación de ambas (substractiva).
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Fig. 12. Transformadas de Fourier de los cortes axiales correspondientes a los casos (a)pinhole sintético abierto, (b) pinhole sintético cerrado y (c) técnica substractiva. Las coordenadas y corresponden a las frecuencias espaciales en la dirección transversal y axial, respectivamente.
y 0.55 AN. Como objeto se emplean fibras de
celulosa. En la Fig. 11 se muestra un corte
transversal y uno axial de las imágenes
obtenidas para pinhole abierto, cerrado y con la
técnica substractiva. Nótese que, dado que el
paso de barrido (0.1 m) es aproximadamente
10 veces menor que el límite en resolución
transversal marcado por la difracción para el
objetivo de microscopio empleado, estas
imágenes presentan un emborronamiento
notable. En este caso, además de la mejoría en la
resolución transversal, tanto en los cortes
transversales como en los axiales se aprecia una
notable mejora en la capacidad de seccionado
óptico del sistema cuando se obtiene la imagen
substractiva. Para entender mejor este efecto,
hemos calculado las funciones de transferencia
óptica en la dirección axial para los tres casos
bajo estudio. En el caso de pinhole sintético
abierto, Fig. 12(a), se observa claramente el cono
de pérdidas [7]. La presencia de dicho cono
implica que las frecuencias axiales no han sido
transmitidas a través del sistema. Por otro lado,
en las Figs. 12(b)-(c), se comprueba que para la
técnica substractiva este cono se ha rellenado
con mayor eficiencia que en el caso puramente
confocal.
5. Conclusiones
Hemos presentado un tipo de detección
alternativa para un microscopio confocal de
barrido en el que se realiza un muestreo del
plano del detector empleando una cámara CCD.
Las señales obtenidas por los distintos píxeles se
pueden combinar de distintas formas, de modo
que es posible obtener imágenes confocales para
distintos tamaños y posiciones del pinhole a
partir de un único barrido de la muestra. Esto
permite implementar técnicas de aumento de
resolución tridimensional basadas en la
combinación de imágenes confocales obtenidas
mediante pinholes de distintos tamaños. Como
hemos demostrado, el sistema presenta gran
robustez y flexibilidad. Además su
implementación en un microscopio convencional
comercial es directa sin más que añadir una
entrada de fibra óptica un cabezal de barrido.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el Plan
Nacional I+D+I por el proyecto FIS2009-9135 y
por la Generalitat Valenciana mediante el
proyecto PROMETEO2009-077.