microbiologia n4 hidrolisis

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MICROBIOLOGIA SANITARIA UNI - FIA

I. Objetivos

Comprobar si el microorganismo es capaz de producir enzimas para sintetizar los sustratos.

Determinar si ocurrió la hidrolisis del almidón mediante el uso de un colorante (lugol).

Observar si hay presencia de almidón o no en los cultivos. Observar las características al ocurrir la fermentación de un

carbohidrato.

II.Fundamento teórico

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Lo que llamamos almidón no es realmente un polisacárido, sino la mezcla de

dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos están formados por unidades de

glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces a 1-4 lo que da

lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen

ramificaciones debidas a enlaces a 1-6.

El almidón sufre hidrólisis por acción de la amilasa, esta puede ser alfa amilasa

o beta amilasa, en el caso de la primera la hidrólisis produce principalmente

dextrina y en menor proporción la alfa maltosa. La beta maltosa procude alfa

maltosa totalmente debido a que actúa desde el extremo no reductor de la

cadena, catalizando la hidrólisis del segundo enlace α-1,4, rompiendo dos

unidades de glucosa (maltosa) a la vez.

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Los microorganismos pueden usar alimentos macromoleculares; para ello, es

necesaria una hidrólisis extracelular preliminar, igual que en los animales

superiores. Los distintos microorganismos elaboran para este fin una cierta

variedad de enzimas extracelulares que segregan al medio, el objetivo de esta

práctica es evaluar que microorganismos producen amilasa y son por tanto

capaces de utilizar el almidón.

ALMIDÓN+H 2Oamilasa→

DEXTRINA+AZÚCARES

HIDRÓLISIS DE PROTEINAS

Muchas bacterias heterotróficas degradan proteínas exógenas utilizando los

productos como fuentes de energía de carbono-nitrógeno. Como las moléculas

de proteínas son demasiadas grandes para pasar por las membranas, las

bacterias producen proteasas que hidrolizan las proteínas a péptidos

As bacterias producen peptidasas que desdoblan los péptidos en aminoácidos

sencillos que son entonces catabolizados de alguna manera depende de la

especie,, la cepa y el tipo de aminoácido.

Cuando las bacterias utilizan los aminoácidos, los esqueletos de carbono de los

aminoácidos sufren degradación oxidativa a compuestos que entran en el ciclo

ATC para oxidación. La entrada en el ciclo ATC puede ser por la vía acetil-CoA,

α-cetaglutarato, succinato, fumarato u oxaloacetato.

La hidrólisis de las proteínas termina por fragmentar las proteínas

enaminoácidos.

Existen 3 tipos de hidrólisis:

Hidrólisis ácida: Se basa en la ebullición prolongada de la proteínacon

soluciones ácidas fuertes (HCl y H2SO4). Este método destruye

completamente el triptófano y parte de la serina y la treonina.

Hidrólisis básica: Respeta los aminoácidos que se destruyen por la hidrólisis

anterior, pero con gran facilidad, forma racematos. Normalmente se utiliza

(NaOH e BaOH).

Hidrólisis enzimática: Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es

lenta y a menudo incompleta, sin embargo no se produce racemización y no

se destruyen los aminoácidos; por lo tanto es muy específica.

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PROTEINA+H 2O proteinasa→

POLIPEPTIDOS

POLIPÉPTIDOS+H 2O peptidasas→

Mezclade aminoácidos individuales

HIDRÓLISIS DE GRASAS

Las grasas se pueden hidrolizar hirviéndolas con álcalis, con lo que se forma, glicerina y jabones.

Esto puede ocurrir de forma natural por la acción del grupo de enzimas llamadas lipasas.

Las grasas de las dietas sufren una lipólisis intensa en el duodeno y durante su absorción en el intestino delgado

LÍPIDOS+H 2O lipasa→

ACIDOSGR ASOS+GLICERINA

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Los mecanismos anaeróbicos de producción de energía que no están implicados en la cadena respiratoria o en los citocromos se llaman fermentación.

La fermentación de carbohidratos, realizada por bacterias facultativas bajo condiciones de anaerobiosis, es una oxidación incompleta. Un metabolito, derivado del sustrato que se fermenta, actúa como aceptor final de electrones.

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Los productos de fermentación son frecuentemente ácidos orgánicos, alcoholes y otras sustancias de bajo peso molecular, incluidos gases como hidrogeno y dióxido de carbono.

La fermentación se denomina según los productos finales predominantes:

- Fermentación hemoláctica: se produce solo ácido láctico.

- Fermentación heteroláctica: se produce ácido láctico, etanol y CO2.

- Fermentación acida mixta: se produce etanol, ácido acético, fórmico, CO2

Y H 2.

- Fermentación alcohólica: se produce solo etanol.

FERMENTACIÒN LÀCTICA: se llama al proceso celular donde se utiliza glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico.

La fermentación láctica es una ruta metabólica anaeróbica que ocurre en el citosol de la célula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico.

Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lácticas), algunos protozoos y ocurre en los tejidos animales, en ciertos protozoarios, hongos y bacterias.

El patrón de fermentación de un microorganismo es de gran valor taxonómico y es influenciado por el tipo de sustrato disponible en el medio de cultivo, su pH y la temperatura de incubación. Los caldos para fermentación tienen indicadores de pH, cuyo cabio de color evidencia la producción de ácidos. Además se le coloca a estos tubos una campana de Durham (tubo invertido), para detectar la posible producción de gas. La gran cantidad de ácido producido por la fermentación en bacterias facultativas es suficiente para hacer virar el indicador incorporado al medio a su forma ácida.

III. Metodología

HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

El almidón es un carbohidrato complejo que es degradado por microorganismos que contienen amilasas.Las moléculas de yodo están atrapadas dentro de la hélice no ramificada de unidades de glucosa de la cadena de amilosa para formar un compuesto de inclusión azul. Si la red se desintegra como ocurre durante la hidrólisis del almidón y las dextrinas por definición se produce una mezcla de dos moléculas de polisacáridos poliglucosa: amilosa lineal que solo da glucosa con la hidrólisis se denomina glucosán.

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FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS

Este medio se usa como prueba presuntiva en la detección del grupo coliforme. El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de éstos, sin embargo sí se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona proporciona nitrógeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La fermentación de la lactosa da como productos finales ácido y gas, este último es detectado en las campanas de fermentación (Durham).

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IV. Procedimiento

Preparación de Medios de Cultivo

A. Hidrólisis de almidón

a. Seleccionar las colonias que se utilizaran.

b. Enumerar las placas Petri y dividirlas con una línea vertical en dos secciones: A y B.

Medio VolumenAgar Almidón 15 ml x 5 = 75mlCaldo Lauril triptosa

15 ml x 10 = 150ml

Agua destilada 150ml

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c. Agregar el agar almidón a las placas Petri.

d. Con el inoculador obtener una pequeña muestra de la colonia para la sección A, otra para la B.

e. Incubar por 48hrs a una temperatura de 35°C.

f. Se le agregara lugol al cultivo después de incubarlo para determinar si hay presencia de almidón o no

B. Fermentación de carbohidratos

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g. Identificar dos tubos de fermentación con caldo lauril triptosa: A y B.

h. Con el inoculador obtener una muestra de la colonia para cada tubo de fermentación.

i. Incubar por 24hrs a una temperatura de 37°C. Observar a las 24hrs si hay formación de gas.

j. Después de incubar, observar las características de cada tubo y determinar el pH.

V.Resultados

B A

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HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

GRUPO HIDRÓLISISSECCIÓN “A” SECCIÓN “B”

Nº1: Baño de la FIA No hay Si hayNº2: Lavadero Teatro UNI No hay No hayNº3: Lavadero Teatro UNI No hay No hayNº4: Estanque de Arquitectura

Si hay Si hay

Nº5: Estanque de Arquitectura

Si hay Si hay

oloración con lugol en cada placa Petri.

FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

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GRUPO CANTIDAD DE CRECIMINETO

FORMACIÓN DE GAS

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO

Nº1 TUBO “A” Escaso No hay pH = 7TUBO “B” No hay - -

Nº2 TUBO “A” No hay - -TUBO “B” No hay - -

Nº3 TUBO “A” Escaso No hay pH = 7TUBO “B” Escaso No hay pH = 7

Nº4 TUBO “A” Abundante No hay pH =6TUBO “B” Abundante No hay pH = 7

Nº5 TUBO “A” No hay - -TUBO “B” Abundante No hay pH = 7

VI. Conclusiones

Si agregamos LUGOL al cultivo y este adquiere una coloración azul- violeta podemos decir que el cultivo presenta almidón, si es

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incoloro entonces no hay almidón por lo tanto el microorganismo presente ha hidrolizado el almidón.

La enzima requerida para la hidrolisis el almidón es la AMILASA. En los cultivos en donde hubo una coloración azul podemos decir que los microorganismos de ese cultivo no producen esa enzima.

Llegamos a darnos cuenta de que si no usamos el lugol no sabríamos si es que hay hidrólisis o no, resaltando la importancia de su uso en el laboratorio.

La fermentación de carbohidratos es un proceso que se lleva a cabo sin la presencia de oxigeno (anaeróbico).

Si ocurre la fermentación del carbohidrato entonces se adquiere un color amarillento y la acidez que presenta el medio de cultivo también se puede observar la formación de un gas con la ayuda de la campana de Durham.

Con el papel indicador comprobamos la acidez del medio de cultivo, algunas veces se verá formación de un gas dependiendo del tipo de bacteria que se haya sembrado.

VII.Recomendaciones

Repetir el procedimiento en cultivos donde no se vi la formación de gas, ni crecimiento en los tubos.

Para esterilizar, poner al fuego el inoculador y la boquilla de cada tubo por unos segundos.

Al inocular las placas hacerlo cerca a la llama del mechero. La prueba debe interpretarse inmediatamente después de añadir

el reactivo LUGOL porque éste tiende a desvanecerse con el tiempo.

VIII. Anexos

AGAR ALMIDÓN

Fórmula:

Ingredientes por litro.

Extracto de carne 3 gAlmidón Soluble 10 g

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Agar 12 g

pH final: 7.5 ± 0.2 a 25 °C

Método de preparación:

1) Suspender 25 g en 1 litro de agua destilada o desmineralizada.

2) Calentar a ebullición para disolver completamente.

3) Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 °C.

4) Distribuir en la forma deseada.

CALDO LAURIL SULFATO

Medio selectivo recomendado para la detección y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos.

Considerar como positivos aquellos tubos que presentan gas.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Triptosa 20.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Lactosa 5.0 Cloruro de sodio 5.0 Lauril sulfato de sodio 0.1 Fosfato dipotásico 2.75 Fosfato monopotásico 2.75

pH final: 6.8 ± 0.2

Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación.

El resultado de una siembra se llama: Cultivo

Las siembras pueden ser:

- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez

- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

Métodos Generales:

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1) Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.

Medio de cultivo: Liquido

Instrumento: Asa

Finalidad: poner la bacteria en suspensión

2) Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Medio de cultivo: agar base inclinado

Instrumento: asa o aguja bacteriológica

3) Siembra por estría por agotamiento:

Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:

a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.

b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas

c- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.

Medio de cultivo: solido en placa de Petri

Instrumento. Asa

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Finalidad. Obtener colonias aisladas

4) Por picadura o punción: Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.

Medio de cultivo. Semisólido

Instrumento: aguja bacteriológica

Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias

5) Siembra en TSI: (Por picadura y estrías en superficie): el TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol.

En este medio sembraremos por picadura y estrías en superficie, como ya conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

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IX. Cuestionario

1. Definir

ENZIMAS: Algunas sustancias, en pequeñas cantidades tienen la capacidad de acelerar las reacciones quimias sin que se alteren ellas mismas después de la reacción; aceleran la velocidad de esta sin que necesariamente la inicien. Las sustancias que se comportan así se llaman catalizadores o agentes catalíticos. Las enzimas pertenecen a esta categoría de sustancias y son producidos por los organismos vivos. Así podemos definir una enzima como el agente catalítico orgánico producido por las células vivas.

HIDRÓLISIS: Es una reacción química entre una molécula de agua y otra molécula, en la cual la molécula de agua se divide y sus átomos pasan a formar parte de otra especie química. Esta reacción es importante por el gran número de contextos en los que el agua actúa como disolvente.

FERMENTACIÓN: La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, que no requiere oxígeno, y el producto final es un compuesto orgánico. El proceso de fermentación es característico de algunos microorganismos: algunas bacterias y levaduras. También se produce en la mayoría de las células de los animales (incluido el ser humano), excepto en las neuronas, que mueren rápidamente si no pueden realizar la respiración celular; algunas células, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven obligadas a fermentar; el tejido muscular de los animales realiza la fermentación láctica cuando el aporte de oxígeno a las células musculares no es suficiente para el metabolismo aerobio y la contracción muscular.

2. ¿Qué son las enzimas extracelulares y enzimas intracelulares?

Podemos reconocer dos tipos de enzimas según el sitio donde actúen: enzimas intracelulares o endoenzimas (funcionan en las células), y enzimas extracelulares o exoenzimas (actúan fuera de las células). La función principal de las exoenzimas es realizar todos los cambios necesarios en los nutrientes del medio para permitir que entren en la célula como alimento. Las enzimas intracelulares sintetizan material celular y efectúan reacciones catabólicas de las cuales se desprende la energía que aprovecha la célula.

3. ¿Qué es el almidón y las proteínas?

http://es.wikipedia.org/wiki/Disolvente

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula_de_agua

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_qu%C3%ADmica

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El almidón es el principal polisacárido de reserva de la mayoría de los vegetales, y la principal fuente de calorías de la mayoría de la Humanidad. Es importante como constituyente de los alimentos en los que está presente, tanto desde el punto de vista nutricional como tecnológico. Gran parte de las propiedades de la harina y de los productos de panadería y repostería pueden explicarse conociendo el comportamiento del almidón.

Lo que llamamos almidón no es realmente un polisacárido, sino la mezcla de dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos están formados por unidades de glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces a 1-4 lo que da lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen ramificaciones debidas a enlaces a 1-6.

PROTEINA: un polipéptido o grupo de polipéptidos que forman una molécula con una función específica. Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen (una porción de ADN) mediante el código genético.

4. ¿Qué son los polipéptidos?

Las moléculas que forman las proteínas reciben el nombre de polipéptidos. Se trata de péptidos compuestos por, al menos, diez aminoácidos (una clase de molécula de tipo orgánico).Un polipéptido, en otras palabras, es una secuencia de aminoácidos que están vinculados a través de enlaces peptídicos. Si los aminoácidos encadenados son más de un centenar, ya puede hablarse de proteína.

5. ¿Cómo se almacena la energía en la célula?

La energía adquirida por las células se conserva en ellas en las mitocondrias donde más tarde se liberara por el ciclo de krebs, para ser utilizada principalmente cuando se requiera en forma de adenosín trifosfato (ATP). Tanto si proviene de la luz solar o de la oxidación de compuestos orgánicos, se invierte en la formación de ATP, en una proporción muy alta. El ATP es entonces el "fluido energético" que pondrá en marcha las demás funciones de la célula.

6. ¿Qué es la respiración aeróbica y anaeróbica?

Respiración aeróbica: La respiración aeróbica, o respiración celular en presencia de oxígeno, utiliza el producto final de la glicólisis, el piruvato, en el ciclo TCA, para producir mucha más moneda de energía en forma de ATP, que la que se puede obtener por cualquier vía anaeróbica. La respiración aeróbica

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es característica de las células eucariotas cuando tienen suficiente oxígeno, y la mayor parte tiene lugar en las mitocondrias.

Respiración anaeróbica: La respiración anaeróbica (tanto la glucólisis como la fermentación), se lleva a cabo en la parte líquida del citoplasma, mientras que la mayor parte de la producción de energía de la respiración aeróbica, tiene lugar en las mitocondrias. La respiración anaeróbica deja una gran cantidad de energía en las moléculas de etanol o lactato, que la célula no puede utilizar y debe excretar.

X.Bibliografía

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http://minificciones.files.wordpress.com/2012/08/13-reacciones-de-hidrc3b3lisis.pdf(Hidrolisis)

http://www.buenastareas.com/ensayos/Hidrolisis-Del-Almidon/2509376.html(Hidrolisis de almidón)

http://deproteinas.com/hidrolisis-de-proteinas(Hidrolisis de proteínas)

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/carbohidratos.pdf(Fermentación de carbohidratos)

PELCZAR. Microbiología. 4ta edición(Enzimas, proteínas, hidrolisis)

http://www.monografias.com/trabajos91/reporte-laboratorio-respiracion/reporte-laboratorio-respiracion.shtml(Respiración anaerobia y aerobia)

http://definicion.de/polipeptido/ (polipéptidos, proteinas)

http://definicion.de/polipeptido/

http://www.monografias.com/trabajos91/reporte-laboratorio-respiracion/reporte-laboratorio-respiracion.shtml

http://www.monografias.com/trabajos91/reporte-laboratorio-respiracion/reporte-laboratorio-respiracion.shtml

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/carbohidratos.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/carbohidratos.pdf

http://deproteinas.com/hidrolisis-de-proteinas

http://www.buenastareas.com/ensayos/Hidrolisis-Del-Almidon/2509376.html

http://www.buenastareas.com/ensayos/Hidrolisis-Del-Almidon/2509376.html

http://minificciones.files.wordpress.com/2012/08/13-reacciones-de-hidrc3b3lisis.pdf

http://minificciones.files.wordpress.com/2012/08/13-reacciones-de-hidrc3b3lisis.pdf

microbiologia n4 hidrolisis

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