metodos para la deterinacion de capacidad antioxidante en vegetales

5/25/2018 Metodos Para La Deterinacion de Capacidad Antioxidante en Vegetales

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Resumen

En muestras de semillas de Theobroma cacao (Cacao), Capsicum bacatum (Ajes dulces, verdes y rojos) y semillasdeArtocarpus altilis (fruto de pan), se determin la capacidad antioxidante aplicando diversas metodologas y se

analiz la informacin que proporciona cada mtodo. Luego de proceder a la extraccin y cuantificacin de los poli-fenoles, se evalu la actividad antioxidante utilizando las tcnicas de sistema modelo -caroteno/linoleato, el mto-do del barrido de radicales libres (DPPH), el mtodo del tiocianato (peroxidacin cido linoleico) y el poder reductor.En todos los ensayos de determinacin de actividad antioxidante, los resultados obtenidos fueron comparables.

Palabras Clave: Theobroma cacao, Capsicum bacatum, Artocarpus altilis, capacidad antioxidante, polifenoles.

Abstract

In samples of Theobroma cacao seeds (Cocoa), Capsicum bacatum sweet (Sweet pepper, red and green) and ofArtocarpus altilis seeds (bread fruit), the antioxidant capacity was determined by applying various methods andanalyzed the information provided by each one. After proceeding to the extraction and quantification of polyphenols,

the antioxidant activity was assessed by the -caroteno/linoleato model system technique, the scanning free radicalsmethod (DPPH), the thiocyanate method (linoleic acid peroxidation) and reducing power. In all the determinationsfor antioxidant activity, results were comparable.

Key words: Theobroma cacao, Capsicum bacatum,Artocarpus altilis, antioxidant capacity, polyphenol

Mtodos para la determinacin de la actividadantioxidante de vegetales

Methods for determination of plants antioxidant activity

ALICIA M RINCN1*, MARA N PREZ DE R2, LIZETBOU RACHED1,ALBIN ROMERO2, LUISA C BUCARITO2, FANNY PADILLA1

1 Unidad de Investigacin Anlisis de Alimentos. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

2 Ctedra Tecnologa Cosmtica. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.* Correspondencia a: [email protected]

Introduccin

Desde hace dcadas, se ha evidenciado la relacindirecta que existe entre la sobreproduccin de radi-cales libres en el organismo y diversos desrdenes fi-

siolgicos (tales como dao a la membrana celular,oxidacin de lipoprotenas, inactivacin de enzimas);ciertos estados patolgicos y con el envejecimiento(Rieger, 1989; Stockdale, 1987).

A fin de impedir la acumulacin de radicales li-bres, el organismo cuenta con diferentes mecanismosde defensa antioxidantes producidos de manera end-gena, pero a medida que se avanza en edad y/o porcondiciones de fuertes agresiones prooxidativas, co-

mo la exposicin intensa y reiterada a la exposicinsolar, estos medios resultan insuficientes para prote-ger al organismo (Rieger, 1993). Con base a esto se hapostulado que los organismos envejecen porque las

clulas acumulan el dao de los radicales libres en eltiempo, por lo que los antioxidantes son comnmenteusados en el cuidado de la piel para prevenir esteenvejecimiento (Lupo, 2001; Rabe y col., 2006; VonOppen-Bezalet, 2009; Knaggs, 2009).

Diversos compuestos presentes en productos ve-getales tienen la propiedad de actuar como antirradi-cales o antioxidantes (Pietta, 1998; Udo y col., 2001).En estos productos se ha evidenciado la presencia de

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los compuestos fenlicos que tienen propiedades an-tioxidantes, esta caracterstica ha favorecido su inclu-sin en formulaciones cosmticas especialmenteaquellas con propiedades antienvejecimiento.

En la actualidad no existen Mtodos Oficiales parala determinacin de la capacidad antioxidante de las

materias primas que se emplean en cosmtica, por locual, se han venido utilizando con este fin diversasmetodologas.

De all la importancia de la aplicacin de estosmtodos para la determinacin de la Actividad An-tioxidante en algunos productos vegetales.

Materiales y mtodos

OBTENCIN Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

Las semillas secas y fermentadas de cacao (Theo-broma cacao) y las semillas de fruto de pan (A. altilis)fueron obtenidas en el sector de Ocumare de la Costa,Estado Aragua, Venezuela. Los Ajes dulces (Capsicumbacatum), variedades verde y roja, fueron adquiridosen el Mercado de Quinta Crespo, Caracas. Venezuela.

Todas las muestras se lavaron, se secaron y se molie-ron (en el caso de Artocarpus, previo a este proceso lefue eliminada la capa externa). Posteriormente se liofi-lizaron, molindose nuevamente y pasndose por untamiz N 40. Todas las muestras se guardaron en enva-ses plsticos con tapas de cierre hermtico, a tempe-ratura ambiente y al abrigo de la luz.

CUANTIFICACIN DE LOS COMPUESTOSFENLICOS TOTALES

Los compuestos fenlicos en los extractos meta-nlicos fueron estimados por ensayo colorimtrico,basado en los procedimientos descritos por Montreau(1972), el cual se basa en la extraccin de los poli-fenoles totales de la muestra con solucin metanol:agua (50:50) y solucin de acetona:agua (70:30). Enuna alcuota del extracto se desarrolla coloracin conel reactivo de Folin Ciocalteau, leyendo la absorban-cia a 750 nm. La concentracin de polifenoles en lamuestra se determin usando una curva patrn decido glico en un rango de 20-500 g/ml. Los resul-tados se expresan como equivalentes de cido glico(EAG) g/100g de muestra seca.

DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Esta propiedad fue evaluada por diferentes mto-dos espectrofotomtricos:

1. DETERMINACIN DEL PODER REDUCTOR(YEN YDUH, 1993):

El poder reductor de los compuestos fenlicos se

determina mediante la capacidad de reducir el Fe+3

(frrico) a Fe+2 (ferroso) con formacin del azul de Pru-sia, a 700 nm. Los resultados se cuantifican contrauna curva estndar de cido ascrbico. Los resulta-dos son expresados como equivalentes de cido as-crbico (EAAs) g/100 g de muestra.

II. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ME-DIANTE EL MTODO DE LA PEROXIDACIN DEL CIDO LI-NOLEICO (MTODO DEL TIOCIANATO)

La actividad antioxidante se determin de acuer-do al mtodo descrito por Yen y Hsieh (1998), el cualse basa en la peroxidacin del cido linoleico, usandotiocianato de amonio y cloruro ferroso. La absorban-cia se determina a 271 nm. La actividad antioxidantese determina por el grado de peroxidacin del cidolinoleico, a las 72 horas, aplicando la frmula:

AA = 72 [aumento de la Abs. de la mx/ aumento dela Abs. del control] x 100

II. DETERMINACIN DE LAACTIVIDADANTIOXIDANTEUSANDO EL SISTEMA MODELO -CAROTENO/ LINOLEATO

Las muestras metanlicas fueron evaluadas si-guiendo el mtodo descrito por Hidalgo-Fernndez ycol. (1994), el cual se basa en la capacidad que tienenlos antioxidantes de impedir la prdida del color del -caroteno. La relacin dosis/respuesta de la actividadantioxidante para los extractos se determina a diferen-

tes concentraciones. La actividad antioxidante (AA) delos extractos es evaluada en trminos de decolora-cin del -caroteno usando BHA en metanol (100ppm) para propsitos comparativos. Los ensayos serealizaron por triplicado y los resultados se expresancomo el valor promedio desviacin estndar.

III. DETERMINACIN DE LA CAPACIDADANTIOXIDANTE DELOS POLIFENOLES EXTRADOS, UTILIZANDO EL MTODODEL BARRIDO DE RADICALES LIBRES (DPPH)

Se determin la capacidad antioxidante mediantesecuestro de los radicales libres de acuerdo al mto-do descrito por Snchez-Moreno y col. (1998). El mis-mo se basa en la generacin de radicales libres apartir de una solucin metanlica de 1,1- difenil-2-pi-cril-hidracil. En forma de radical, el DPPH absorbe a515 nm, absorbancia que va disminuyendo por la re-duccin por un agente oxidante, o por especies radi-cales. La determinacin se efecta a intervalos detiempos diferentes hasta que la reaccin alcanza unequilibrio (time at the steady state). El porcentaje deDPPH remanente fue calculado como sigue:

%DPPHrem=[(Abs a 515 nm)muestra/(Abs a 515 nm)control] x 100



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aliCia m rinCAn, mar@a n p9re De r, lieT Bou raCHeD, alBin romero, luisa C BuCariTo, Fanny paDilla

ANLISIS ESTADSTICO

Todas las determinaciones se realizaron por tripli-cado y se expresaron los valores como los promedio la desviacin estndar (DE). La significancia estads-tica se determin mediante el anlisis de varianza deuna va (ANOVA) y un valor de p aj verde > aj rojo > semilla de

Artocarpus.

DETERMINACIN DEL PODER REDUCTOR(MTODO DEYEN YDUH MODIFICADO)

En la Tabla II se presentan los valores del poderreductor, expresado como mg equivalentes de cidoascrbico por 100 gramos de muestra. En este ensa-

yo, el color amarillo de la solucin de ensayo cambiaa diferentes matices entre el azul y el verde, depen-diendo del poder reductor de cada compuesto. Lapresencia de reductores como los antioxidantes,causa la conversin del Fe+3 del complejo ferricianurousado en este mtodo, a la forma ferrosa. As, por la

medicin del azul de Prusia a 700 nm, se puede moni-torear la concentracin de Fe+2. Altos valores de ab-sorbancia a 700 nm indican un poder reductor alto(Barros y col., 2006).

Los resultados muestran que existen diferenciasestadsticamente significativas en el poder reductorde los extractos de las muestras evaluadas (p< 0,05);siendo el orden del poder reductor semillas de ca-cao>aj verde>aj rojo>semillas de Artocarpus. Esteorden se correlaciona con el contenido de polifenolestotales en las muestras analizadas, siendo mayor el po-

der reductor a mayor contenido de polifenoles.

ACTIVIDADANTIOXIDANTE DETERMINADA POR ELMTODO DEL BLANQUEAMIENTO DEL -CAROTENO

En la Tabla III se muestra la Actividad Antioxidante(%) determinada por el mtodo del blanqueamientodel -caroteno en muestras de semillas de cacao, ajes,variedades verde y roja, y semillas de Artocarpus.

El ensayo se basa en el blanqueamiento de la so-lucin de -caroteno y de la habilidad de los antioxi-dantes para inhibir la decoloracin de la solucinpropiciada por la oxidacin del cido linoleico. El radi-cal libre del cido linoleico ataca al -caroteno alta-

Muestra Polifenoles totales(g/100 g) DE

CacaoTheobroma cacao 6,66d 0,06

Aj verdeCapsicum bacatum 0,79c 0,08

Aj rojoCapsicum bacatum 0,74b 0,09

Semillas Fruto de pan

Artocarpus altilis 0,26a 0,01

Los resultados son el promedio de tres mediciones por separado DE. Las letras diferentes en una misma columna indica diferenciasestadsticamente significativas p



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Muestra Actividad antioxidante(%) DE

CacaoTheobroma cacao 89,64 2,94

Aj verdeCapsicum bacatum 67,5 0,57

Aj rojoCapsicum bacatum 67,0 2,21

Semillas Fruto de pan

Artocarpus altilis 54,29 2,93

Los resultados son el promedio de tres mediciones por separado DE. Las letras diferentes en una misma columna indican diferenciasestadsticamente significativas p aj rojo >semillas de artocarpus, lo cual se correlaciona conla cantidad de polifenoles presentes en la muestrasanalizadas.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTEPOR EL MTODO DE LA PEROXIDACIN DEL CIDO

LINOLEICO (MTODO DELTIOCIANATO)

En la Tabla IV se muestran los resultados del por-centaje de actividad antioxidante determinada por elmtodo de la peroxidacin del cido linoleico. Lamuestra de cacao present el porcentaje ms elevadode actividad antioxidante, lo cual se correlaciona conlos resultados de los otros mtodos aplicados, as co-mo con el contenido de polifenoles totales. Las mues-tras de aj verde y rojo presentaron valores similaresde actividad antioxidante. El orden de la capacidadantioxidante en las muestras fue similar a los otros

mtodos utilizados en este trabajo: cacao > aj verde >aj rojo > semillas de Artocarpus.

DETERMINACIN DE LA CAPACIDADANTIOXIDANTEDE LOS POLIFENOLES EXTRADOS, UTILIZANDO ELMTODO DEL BARRIDO DE RADICALES LIBRES (DPPH)

El radical libre DPPH posee una absorcin carac-terstica a 515 nm (color prpura), la cual decrecesignificativamente cuando est expuesto a la accinde barrido por parte de un extracto rico en com-puestos fenlicos antioxidantes- por suministro de

tomos de hidrgeno o por donacin de electrones.Una disminucin en la absorbancia, a 515 nm, indicaun alto barrido del radical por parte del extracto. Elbarrido de los radicales libres es uno de los mecanis-mos conocidos mediante el cual los antioxidantesinhiben la oxidacin de los lpidos. El ensayo permiteevaluar en forma rpida la actividad antioxidante invitro de compuestos especficos o extractos.

En la figura 1 se muestran los valores de actividadde barrido del radical DPPH por el extracto metan-lico de la harina de semillas deA. altilis. A mayor

concentracin del extracto de harina de artocarpus,mayor es la actividad de barrido, reflejado por elaumento de la absorbancia. Como puede observar-se, los extractos de la semilla de cacao presentan losvalores ms bajos de CE50, por lo que se requieremenos concentracin de ese extracto para secues-trar los radicales libres, teniendo entonces ms efi-ciencia como antirradical.

An cuando es frecuente el relacionar la capaci-dad antioxidante de los productos naturales con elcontenido de polifenoles totales presentes (Kukoski ycol., 2005; Imeh y Khokhar, 2002; Pinelo y col.,2004), en algunos trabajos se ha reportado una corre- Figura 1. Actividad de barrido (%) de radicales DPPH por elextracto metanlico de semillas de Artocarpus.



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Muestra CE50 (g/g DPPH) TEC50 EA

Cacao

Theobroma cacao 4,72 0.001a 45,57 0.96 0,0047

Aj verde

Capsicum bacatum 25,13 0.012c 24,16 3.25 0,0016

Aj rojo

Capsicumbacatum 20,80 0.006a 64,43 0.59 0,0007

Semillas defruto

de pan

Artocarpus altilis 54,27 0.004d 31,90 1.93 0,0006

Las letras indican diferenciasestadsticamente significativas p

metodos para la deterinacion de capacidad antioxidante en vegetales

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