Lic. TM Rodolfo B. Musayn H

Obtencin de Muestra: Biopsia de hueso y Aspirado de Mdula Osea

Biopsia de Hueso

Biopsia de Hueso

Biopsia de Hueso

Biopsia de Hueso vs AMOBIOPSIA

MIELOGRAMA

CITOMETRIA DE FLUJO

Mielograma Se debe conocer las caractersticas morfolgicas y los

recuentos celulares de sangre perifrica del paciente. La extensin se examina inicialmente a bajo aumento para evaluar la celularidad global, la presencia de lagunas grasas o monomorfismo, la relacin mieloeritroide aproximada, la existencia de megacariocitos y la posible presencia de clulas extraas.

A continuacin, la mdula debe visualizarse con el

objetivo de inmersin. Con este objetivo, de mayor aumento, se procede al recuento porcentual de los elementos celulares de las diferentes lneas hematopoyeticas y del resto de la celularidad medular.

Valorar la morfologa de las series: Eritroide,

leucocitaria, el sist. mononuclearfagoctico, cl. plasmticas y serie megacarioctica. Para que el recuento porcentual, o mielograma, posea reproducibilidad el nmero de elementos celulares contados debe ser muy elevado, como mnimo de 500 o 1000 clulas.

MIELOGRAMA

Blastos Promielocitos Mielocitos Metamielocitos Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfocitos Plasmocitos Monocitos Clulas reticulares Megacariocitos Eritroblastos Normoblastos

85 01 02 03

06 01 01

01

0.3 1.8 5.0 7.0 13.0 0.5 0.0 3.0 0.0 0.5 0.1 0.2 1.0 7.0

5,0 5,0 20,0 30,0 32,0 4,0 0,7 17,0 3,0 5,0 2,0 2,0 8,0 32,0

DESCRIPCION: Muestra con espculas de tejido medular, hipercelular, de aspecto homogneo. 85% de los elementos corresponden a blastos, de tamao grande, relacin N/C baja, membrana nuclear ms o menos regular, con presencia de ncleos lobulados y monocitoides, nucleolos prominentes, citoplasma basfilo, agranular en algunos con presencia de cuerpos de Aer. El componente granuloctico en maduracin a maduro corresponde a menos del 10% de la CNE, asimismo el componente monocitico representa menos del 10% de la misma.

Estudia la composicin qumica de las clulas, siendo posible detectar la localizacin topogrfica de enzimas, lpidos, carbohidratos, protenas y sustancias inorgnicas (como Hierro).Tinciones que detectan la localizacin y actividad de sustancias intracelulares.

Procedimiento:Paso 1: Fijacin Paso 2: Lavado Paso 3: Coloracin Paso 4: Lavado Paso 5: Verif. Col. (control interno) Paso 6: Contrastar. Paso 7: Lectura Recuerda:

Si bien es una tcnica sencilla y de poca complejidad, guarda mucha importancia en el dx. L.A.; es por ello que su interpretacin requiere de experiencia y buen criterio.

REACCION DE PEROXIDASALa peroxidasa es una enzima lisosomal, la cual transfiere hidrgeno de la bencidina al perxido.

+

3 3 DAB

Precipitado Marrn Oscuro(- ) : Estirpes linfticas, megacarioctica y eritroide. (+) (- )

(+): Blastos mieloides hasta neutrfilos, Eo y bas

Esterasas no especficas El sustrato del reactivo reacciona con las esterasas de la muestra. Los productos intermedios reaccionan

con una sal diazoica produciendo la coloracin de reveladoPositividad: Toda la estirpe granuloctica es positiva, la estirpe monoctica.

Esterasas Especficas. El naftol AS-D cloroacetato esterasa produce la hidrlisis

enzimtica del naftol AS- D cloroacetato a un compuesto con naftol, a su vez reacciona con una sal diazonio para formar un compuesto insoluble de color rojo violeta.

(+), estirpe monoctica y granuloctica (+) con FNA, estirpe granuloctica.

PAS Acido Perydico de SchiffDeteccin de CarbohidratosGlucgeno + Acido Perydico Aldehidos + Reactivo Schiff Rotura enlaces C-C Color Magenta Purpura

(+) Toda estirpe, se reconoce por el patrn.

Fosfatasas Acidas Hidrlisis de los steres fosfato en

medio cido. Bajo condiciones adecuadas, se

libera naftol AS-BI del naftol AS-OL fosfato y acoplado a una sal diazotada, produciendo un compuesto rojo naranja

(+) Estirpes linfticas, y precursores granulocticos desde promielocitos

Principio semejante al anterior, la reaccin requiere

Fosfatasa Alcalina

pH alcalino Es la prueba para el Dx diferencial entre LMC y Rx Leucemoide (+): Precursores mieloides desde del promielocito.

ResultadosPeroxidasa Sudn Black Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Segmentado Eosinofilo Basofilo Monocito Linfocito Negativo a Granular + Granular +++ Granular ++ Granular ++ Granular ++ Granular ++ Granular +++ Dbil a Granular + Negativo PAS Negativo Granular fino + Granular fino ++ Granular fino +++ Granular fino + Negativo a + Negativo a + Negativo a + Granular grueso, mazacote Negativo Fino granular + Fosfatasa Alcalina Negativo Negativo a + Negativo a + Negativo a + Negativo a + Negativo Negativo Negativo Negativo Fosfatasa Acida Negativo Difuso + Difuso + Difuso + Difuso + Difuso ++ Negativo Negativo Clulas T, focal + Negativo Difuso +++ Esterasa sin Fluor Dbil + + ++ + + + Negativo +++ Dbil positivo Esterasa con Fluor Dbil + + ++ + + + Negativo Negativo a + Dbil +

Normoblasto Megacariocito

Negativo Negativo

Negativo Negativo

++ +++

++ Negativo a +

Por qu utilizar coloraciones citoqumicas? En la actualidad para otros pases la citoqumica

esta en desuso. Para nuestro contexto es til por su bajo costo. Orienta muy acertadamente el diagnstico de las leucemias AGUDAS. Provee informacin sobre los depsitos de Hierro, MODULO III.

InmunohistoqumicaTcnica basada en la reaccin antgeno anticuerpo, altamente especifca, donde el complejo formado se hace microscpicamente visible. En razn de revelar el marcado enzimtico de los anticuerpos por microscopa de luz, las reacciones enzimasustrato, emplean cromgenos incoloros cuyos productos finales son coloreados, entre ellos se emplea:Diaminobenzidine (DAB) 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) 4-chloro-1-naphthol (CN)

ProcedimientoCortes de parafina: 3 - 4 micras, dejar secar a 37 C.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Desparafinar e hidratar con agua destilada. Incubar con perxido de hidrgeno 3% 10 minutos. Enjuagar con buffer TRIS 3 minutos Incubar con el 1er Ac 30-45 minutos Enjuagar con buffer TRIS 3 minutos Incubar con el 2do Ac biotinilado 16 minutos

Incubacin: Anticuerpo Primario:Usado en solucin a diferentes diluciones con el agente bloqueante. Los tiempos de incubacin dependen de las propiedades del antgeno o anticuerpo as como de la temperatura.

Anticuerpo Secundario: Debe ser de especie diferente sobre la especie de donde provienen las clulas o tejidos o al anticuerpo primario. Debe reconocer especficamente la inmunoglobulina de la especie en la cual se ha extraido el anticuerpo primario (Fc).AFINIDAD AVIDEZ - TITULO

PROCEDIMIENTO DEL METODO

7. Enjuagar con buffer TRIS 3 minutos 8. Incubar con el complejo estreptavidina-peroxidasa 16 9. Enjuagar con buffer TRIS 3 minutos. 10.Colocar el cromgeno DAB 3-5 minutos. 11.Enjuagar con agua destilada. 12.Contrastar con hematoxilina 10-30 segundos 13. Deshidratar y aclarar con xilol. 14. Montar en un medio resinoso.

minutos.

MTODO DIRECTO

INDIRECTO DOS PASOS

INDIRECTO TRES PASOS

ENVISION

CD 3

CD 20

CD 30

Aplicaciones Antgenos intracelulares: Ig de la membana basal del

glomrulo.

Antgenos de Membrana, antgenos tisulares en el

diagnstico de enfermedades autoinmunes.

Marcadores Tumorales

Tipificacin de Sndromes Linfoproliferativos.

Citometra de Flujo Metodo analtico por el que se mide la emision de

fluorescencias y la dispersin de clulas o partculas microscpicas. Alineadas secuencialmente mediante una corriente

lquida laminar, pasan una a una, a gran velocidad frente a un haz de luz laser de longitud de onda adecuada.

Parmetros de medicin en la Citometra de Flujo

Procedimiento

Recepcin de Solicitud: datos clnicos y

dx. presuntivo Lisado de glbulos rojos no nucleados Aplicacin de Ac : paneles (postlizado) Adquisicin y almacenamiento de data Anlisis e interpretacin Impresin e informe

Preparacin de la Muestra

Prerparacin del Citmetro

Paneles de Procesamiento

Resultados Serie LinfoideBlasto CD 34 CD 10 CD 8 HLA DR CD 19 CD 20 CD 22 HLA DR IgH R IgL R CD 2 CD 3 CD 4 CD 5 CD 7 CD 45 RA TCR R CD 2 CD 3 CD 5 CD 7 CD 8 CD 45 RO TCR R CD 2 CD 8+ CD 16 CD 56 CD 57

Linfocito B Linfocito T Linfocito T Linfocito Maduro Helper Citotxico NK

Clula Plasmtica CD 38 IgH R IgL R cLg

tdt

antgeno de inmadurez

Mielo/Monoblas to CD 13 CD 33 CD 34 inmadurez HLA DR Monocito CD 13 CD 14 CD 33 HLA DR

Promielocit Mielocito o CD 13 CD 33 CD 11 b CD 13

Metamielocit Segmentado o CD 11 b CD 13 CD 16 Eritrocito Glicoforina A CD 11 b CD 13 CD 16 Plaquetas CD 41 CD 42b CD 61 CD 62P activado

Eosinfilo CD 11b CD 15

Basfilo CD 13 CD 11b CD 33 CD 38

Aplicaciones en el Laboratorio Diagnstico basado en el Anlisis Celular Pronstico basado en el Anlisis Celular Evaluacin y Monitorizacin del tratamiento Anlisis de Lesin y Muerte Celular

Inmunofenotipo

Se identifica una proliferacin clonal inmadura de estirpe mieloide, corresponde al 78,02% del total celular evaluado, son de tamao intermedio, parcial y levemente granulares. Expresan CD45, CD13, CD34, HLA-DR. CD117, parcial CD15, CD33, MPO, CD64, CD71, siendo negativas a CD11b, CD4, CD14, marcadores linfoide T y B. Los granulocitos fueron del 7,18%, linfocitos T policlonales del 6,63% con CD4/CD8 de 1,21 (normal).

Inmunofenotipo de Subpoblaciones Linfocitarias

Anlisis de LT CD4 CD87,97%

9,66%CD3-APC

7,02%

CD3-APC

10,61%CD3-APC

Deteccin y Cuantificacin de Precursores Hematopoyticos CD34 +

Estudio de los cromosomas, estructura y herencia

Cariotipo - Fundamento El conjunto de cromosomas de una clula. Se mantiene inalterable en todas las clulas de un

individuo as como en los individuos de una misma especie. A veces se producen alteraciones que son estudiadas

con tcnicas de citogentica clsica.

Procedimiento1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Cultivo Celular 48 -72 horas Aadir un mitgeno que estimula la divisin celular Aadir un inhibidor de la mitosis las clulas se detienen en metafase Cosechar las clulas Aadir solucin hipotnica hincha las clulas. Se fijan las clulas con metanol y acetona. Se resuspenden las clulas. Se extienden en los portaobjetos. Se tien las preparaciones. Se observa al microscopio.

Resultados

Nomenclatura ISCN 95

FISH Fundamento Tcnica que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluorforo para

detectar o confirmar anomalas gnicas o cromosmicas. Se basa en la hibridacin in situ, deteccin y localizacin de

secuencias especficas de cidos nucleicos en estructuras biolgicas morfolgicamente conservadas. Utiliza sondas complementarias a un segmento de DNA. Estas sondas son biotiniladas no radioactivas.

Procedimiento

PREPARACION PREVIA DE LA MUESTRA PREPARACION DE LAS PLACAS PREPARACION DE LAS SONDAS HIBRIDACION LAVADOS POST-HIBRIDACION DETECCION TINCION DE CONTRASTE (yoduro de propidium o DAPI) VISUALIZACION (microscopio de epifluorescencia)

Procedimiento

Resultados

Aplicaciones del Cariotipo y FISH Determinar la prevalencia de anomalias y de variantes cromosmicas en

parejas con esterilidad e infertilidad.

Determinar presencia de alteraciones numricas( aneuploidias).

Determinar presencia de alteraciones estructurales (translocaciones deleciones, microdeleciones, inversiones, duplicaciones,etc.) Determinar presencia de variantes cromosmicas (sitios fragiles,

variaciones satelitales, heterocromatina centromrica aumentada, etc.)