CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE MÉTODO DEL DNS Y DE BIOMASA POR PESO SECOPráctica de Laboratorio #4

Objetivos Logrados

1. Se realizo un reconocimiento general de las características, capacidades y utilidades de algunos equipos usados comúnmente en el laboratorio, además una breve introducción al adecuado empleo de estos con el fin de obtener el mayor beneficio y aprovechamiento que estos ofrezcan.2. La apropiación de los métodos espectrofotométricos y de sus principios basados en la propiedad de absorción de radiación electromagnética de las moléculas, además del reconocimiento de su importancia en diferentes procesos tanto para microorganismos como para macromoléculas en los cuales se necesita una cuantificación de la cantidad de materia que se posee.3. Se obtuvo un aprendizaje de gran valor en cuanto a la implementación de dos métodos de cuantificación, los cuales permiten llegar a una relación importante en función de la concentración de un soluto por medio de la cual se puedan conocer posteriormente concentraciones desconocidas.

Resultados

← Método del Acido Dinitro SalicílicoA continuación se presentan en la Tabla los datos obtenidos en la primera parte de esta práctica, y las curvas de calibración obtenidas para cada prueba con su respectivo ajuste.|Concentración [g/L] |Absorbancia Prueba 1 |Absorbancia Prueba 2 ||0,25 |0,171

|0,149 ||0,5 |0,445 |0,462 ||0,75 |0,76 |0,776 ||1 |1,079 |1,116 |

[pic][pic]

Para esta primera parte del procedimiento vale la pena destacar que los datos obtenidos experimentalmente tienen una aproximación muy cercana a la linealidad cumpliendo la ley de Beer con lo cual no queda duda de la eficacia en el empleo del reactivo DNS con el objetivo de obtener un espectro visible, la relación obtenida por medio del ajuste de datos nos permite construir un modelo de ajuste a través del cual podríamos conocer la concentración de una sustancias entre este rango de datos por medio de su absorbancia. Para este procedimiento se realizaron dos pruebas de cada una de las soluciones lo que permitió la realización de dos cuervas de calibración, con lo cual se tenía más certeza en el resultado, en este caso efectivamente los porcentajes de diferencia entre ambas curvas fueron muy pequeños tanto en pendientes como en acercamientos a la idealidad (R2), agregando veracidad al procedimiento.← Método del Peso Seco

Para la segunda parte de la practica en la cual se intereso en obtener la masa de una cantidad de sustancia problema y junto con esta obtener concentraciones, para luego sacar de estas y de las diferentes lecturas entregadas por el espectrofotómetro la

curva de Concentración vs Absorbancia para la biomasa que se presenta en la grafica.

|Concentración [g/L] |Absorbancia para Biomasa ||1,25 |1,282 ||1,19 |1,117 ||0,6 |0,863 ||0,13 |0,362 |

[pic]

Las soluciones llevadas al espectrofotómetro a 540nm presentaron unas medidas de absorbancia, que fueron correspondiendo a un patrón de proporcionalidad directa con respecto a las concentraciones calculadas por el peso de la biomasa seca en el papel, a partir de estos dos valores se pudo aproximar una función similar a una recta con pendiente positiva. El valor obtenido de R cuadrado cercano a 1 permite afirmar que el modelo es útil para hallar concentraciones de este tipo de soluciones, aunque no asegura un valor exacto de esta.

Preguntas

1. Azúcar ReductorEs un azúcar que en su constitución tiene un grupo carbonilo o aldehído que se comporta como un agente reductor, a través del cual pude reaccionar con otras moléculas, reactividad que depende en si mismo de la disponibilidad de su grupo carbonilo. También se considera que un azúcar es reductor cuando puede oxidarse, por ejemplo, al hacer reaccionar glucosa con

Br2/H2O, reactivo de Fehling o reactivo de Tollens, se transforma el aldehído en ácido carboxílico. En esta reacción la glucosa se oxida (actúa como reductor) y reduce al reactivo añadido. La glucosa se considera el azúcar reductor más abundante en el organismo, por lo cual su contenido en la sangre es vigilado cuidadosamente y sometido a regulación por el mismo cuerpo.[pic]

2. Fundamentación del Método del DNS (Acido Dinitro salicílico).La reacción consiste en agregar un acido como el dinitrisalicilico a un azúcar que presenta propiedades reductoras como la glucosa, el azúcar se oxida y el acido se reducirá cambiando su color de amarillo a rojo. De este modo conociendo la cantidad de acido se podrá conocer la cantidad del azúcar presente en la solución. Esta determinación se realiza con la ayuda de un espectrofotómetro.

3. Fundamentación del Método de MillerConsiste en aplicar DNS a un azúcar reductor en presencia de varios compuestos. Sal de Rochelle que evita la reacción del DNS con el oxigeno disuelto, Fenol para incrementar la cantidad de color producido, Bisulfito de sodio para estabilizar el color en presencia de fenol e Hidróxido de sodio que se requiere para la acción reductora del azúcar sobre el DNS.

Conclusiones

✓ Una de las cosas que permitió reconocer esta practica fue el hecho de como los principios de la espectrofotometría tiene una importante aplicación en el trabajo con microorganismo y macromoléculas, puesto que claramente se pudo observar que la absorbancia tiene una relación directamente proporcional con la concentración en la medida en que esta aumenta o disminuye

según sea la cantidad de soluto en la solución. Lo anterior es de gran importancia pues esta relación entre absorbancia y concentración nos permite por ejemplo hacer un seguimiento y tener control sobre concentraciones de cierta especie durante un proceso.

✓ El método del DNS es una fuerte herramienta a la hora de evaluar la concentración de un producto obtenido en un proceso biológico en el cual las cantidades de concentración de nuestro interés no presenten ningún contraste de tipo visible con respecto a la solución y por lo tanto no podamos obtener valores de absorbancia directamente, siendo necesario medir la absorbancia de manera indirecta ayudados por los mecanismos de derivatización, a través de los cuales una solución reacciona formando un compuesto que da cuenta de la cantidad de su inicial.

✓ A la hora de referirnos sobre la conveniencia de los métodos espectrofotométricos nos encontramos con una gran exactitud y eficiencia puesto que si lo comparamos con métodos como la titulación, al momento de calcular la concentración de una solución problema, los método espectrofotométricos presentan mejores resultados que las titulaciones ya que no se usa ningún tipo de agente químico que interactúe con la solución, además se pude realizar en una menor cantidad de tiempo y utilizando cantidades muy pequeñas.

✓ Al analizar los datos obtenidos en los dos métodos empleados vemos como el valor para R2 es muy cercano a 1 al realizar el ajuste de los datos experimentales, lo anterior sugiere una alta confiabilidad al calcular valor de concentración para estas soluciones, en el modelo matemático sobre el que se fundamentan estos métodos.

Otro texto de la consulta1. Investigue más acerca del método de DNS y describe el fundamento del método.

El método DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 540nm. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas, de la Absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la Concentración (eje de abscisas: X). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus absorbancias, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. La concentración de una solución problema (desconocida), se averigua por interpolación de la Abs de la solución en la curva de calibración, o a través de la ecuación de la recta (y = mx +b) donde: Absorbancia (y) = constante (m) x concentración + absorbancia del blanco.

Fundamento.

El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa.

2. Mencione otros métodos de determinación de carbohidratos.

Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:

Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.

3. Mencione algunas aplicaciones y ventajas del método DNS.

Esta técnica es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de medios líquidos y sólidos cuya molécula de sustrato sean azúcares reductores como glucosa, xilosa, entre otros

Ventajas

Simple, la coloración final desarrollada es estable durante 24 hrs, sensible y adaptable durante la manipulación de un gran número de muestras a la vez. Es útil en la determinación de azúcares reductores en solución.

4. ¿Qué son los azúcares reductores?

Es un azúcar que tiene un grupo aldehído, cetona, hemicetal, o hemiacetal, pudiendo reducir a una agente oxidante (Ag+ o Br2). Debido a que la reacción sólo se produce con azucares que pueden revertir a la forma de cadena abierta, todos los monosacáridos son azúcares reductores.

5. Mencione 5 ejemplos de azúcares reductores

D-Glucosa

L-Fucosa

D-Fructuosa

D-Manosa

D-Xilosa