metodo de la reductasa, flora total y colimetria
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ÁREA DE LABORATORIO
ÁREA PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
REDUCTASA Este método es un indicador indirecto de la
población microbiana de la leche y depende de la actividad metabólica de los diferentes microorganismos presentes de la leche bajo las condiciones del test.
Este método mide indirectamente la densidad bacteriana en la leche, en términos de intervalo de tiempo requerido después del comienzo de la incubación, para que una mezcla colorante-leche de un color característico se decolore hasta el blanco.
MATERIALES Tubos de ensayo con tapa rosca Pipetas de10 y 1 ml Frasco para la muestra Baño maria a 36ºC + 1ºC
REACTIVO Colorante azul de metileno (una tableta de 8.8mg
de tiocianato de azul de metileno en 200 cc de agua destilada)
Mantener en refrigeracion
(TODO EL MATERIAL UTILIZADO EN ESTE TEST DEBE SER ESTERIL)
PROCEDIMIENTO1. Identificación de los tubos en forma legible
2. Agitación vigorosa de la muestra
3. Verter 10cc de la muestra en el tubo
4. Agregar 1cc de Tiocianato de azul de metileno
5. Colocar la tapa sin ajustar
6. Poner en B.M a 36ºC ± 1ºC sin agitar ni invertir
7. Una vez que la muestra alcanza temp de 36ºC , ajustar la tapa del tubo e invertir 3 veces
Si en esta ultima etapa luego de la inversión se produce la decoloración se informara el tiempo de reductasa como TRAM P.I. (Preincubacion)
PROCEDIMIENTO8. De no existir decoloración incubar por 30
minutos. Al final de este periodo invertir suavemente los tubos una vez. Si se ha producido la decoloración informar como TRAM 30 minutos
9. Si la muestra continua sin decolorarse, incubar por una hora mas
10. Si al final de este periodo se produce decoloración informar TRAM 1 hora
COLIMETRÌA Bacterias coliformes:
Son bacilos Gram negativos, aerobios facultativos, no formadores de esporas, que fermentan la lactosa, con producción de acido y gas, y pertenecen comúnmente a los generos Escherichia, Aerobacter, Klebsiella.Una fuente de estos organismos es el tracto intestinal de los animales de sangre caliente.
COLIMETRÌA El método se basa en colocar la muestra de leche
en un medio de cultivo solido y selectivo (agar-bilis-rojo-violeta) incubarlo en condiciones adecuadas y estimar la cantidad de bacterias coliformes en base al numero de colonias rojas obscuras que se desarrollen.
MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOSINSTRUMENTAL Estufa Pipetas volumétricas de 2cc Pipetas de 25cc Cajas de petri de 10cc de diametro Aparatos para recuento de colonias Baño de agua a 45ºC± 1ºC Matraz erlenmeyer de 250cc
MEDIO DE CULTIVO Agar bilis-rojo-violeta o Agar Mac Conckey
MEDIO DE DILUCIÓN Agua peptonada
PROCEDIMIENTO1. En condiciones asepticas transferir 2cc de muestra a cada caja
de petri
2. Anadir 10 a 15 cc de medio de cultivo a 45ºC ± 1ºC 3. Con movimientos circulares horizontales mezclar
cuidadosamente el medio de cultivo con la muestra 4. Solidificar dejando la caja de Petri en reposo durante 5 a 10
minutos sobre una superficie horizontal,5. Inmediatamente esparcir sobre la superficie solidificada
aprox 4cc de medio de cultivo a 45ºC± 1ºC para formar una capa delgada (evitar desarrollo de microorg en la parte superficial) y enfriar hasta completa solidificacion
6. Incubar cultivos colocando las cajas de petri en posicion invertida dentro de la estufa regulada a 32ºC± 1ºC manteniendo alli durante 24 horas
FLORA TOTAL: MATERIALES 1. PIPETAS SEROLÓGICAS DE PUNTA ANCHA DE 1, 5 CM3
2. Y 10 CM3
3. GRADUADAS EN 1/10 DE UNIDAD.
4.
5. CAJAS PETRI DE 90 MM X 15 MM,.
6.
7. ERLENMEYER Y/O FRASCO DE BOCA ANCHA DE 100 CM3, 250 CM3, 500 CM3 Y 1 000 CM3 CON TAPA DE ROSCA AUTOCLAVABLE.
8.
9. TUBOS DE 150 MM X 16 MM
10.
11. GRADILLAS
12.
13. CONTADOR DE COLONIAS
14. BALANZA DE CAPACIDAD NO SUPERIOR A 2 500 G Y DE 0,1 G DE SENSIBILIDAD.
15.
16. BAÑO DE AGUA REGULADO A 45°C ± 1°C.
17.
18. INCUBADOR REGULABLE (25°C - 60°C)
19. AUTOCLAVE.
20. REFRIGERADORA PARA MANTENER LAS MUESTRAS Y MEDIOS DE CULTIVO
21. CONGELADOR PARA MANTENER LAS MUESTRAS A TEMPERATURA DE -15°C A -20°C
MEDIOS DE CULTIVO Agar para recuento en placa (Plate Count Agar).
Preparación
MEDIO DE DILUCIÓN Agua peptonada al 0,1 % (diluyente)
PROCEDIMIENTO 1. Para cada dilución el ensayo se hará por
duplicado. En cada una de las cajas Petri bien identificadas se depositará 1 cm3 de cada dilución. Para cada depósito se usará una pipeta distinta y esterilizada.
2. Inmediatamente, verter en cada una de las placas inoculadas aproximadamente 20 cm3 de agar
para recuento en placa–PCA, fundido y templado a 45°C ± 2°C. La adición del medio no debe pasar
de más de 45 minutos a partir de la preparación de la primera dilución
PROCEDIMIENTO 1. Cuidadosamente, mezclar el inoculo de siembra
con el medio de cultivo imprimiendo a la placa Movimientos de vaivén: 5 veces en el sentido de las agujas del reloj y 5 veces en el contrario.
2. Como prueba de esterilidad verter agar en una caja que contenga el diluyente sin inocular. No debe haber desarrollo de colonias.
3. Dejar reposar las placas para que se solidifique el agar.
4. Invertir las cajas e incubarlas a 30°C ± 1°C por 48 a 75 horas.
PROCEDIMIENTO 5. No apilar más de 6 placas. Las pilas de placas deben estar
separadas entre sí, de las paredes y del techo de la incubadora.
6. Pasado el tiempo de incubación seleccionar las placas de dos diluciones consecutivas que presenten entre 15 y 300 colonias y utilizando un contador de colonias, contar todas las colonias que hayan crecido en el medio, incluso las pequeñitas, pero, se debe tener cuidado para no confundirlas con partículas de alimentos o precipitados, para esto, utilizar lupas de mayor aumento.
7. Las colonias de crecimiento difuso deben considerarse como una sola colonia si el crecimiento de este tipo de colonias cubre menos de un cuarto de la placa; si cubre más la caja no será tomada en cuenta en el ensayo.
8. Anotar el número de colonias y la respectiva dilución.
GRACIAS