METABOLISMO DELNITROGENO

Funciones del nitrógeno en la levadura

• Función estructural– Membranas– Orgánulos subcelulares– Síntesis de proteínas estructurales

• Función regulatoria– Formación de ácidos nucleicos– Síntesis de enzimas– Síntesis de transportadores

• El contenido de nitrógeno en la levadura es de un 6% de su peso: de este del 10 al 30% está formando parte de la estructura proteica.

FUENTES DE NITROGENO

• Las principales fuentes de nitrógeno para la levaduras son:

– Ion amonio (NH4)– Aminoácidos– Aminas

• La levadura puede sintetizar todos los aminoácidos a partir del amonio y de las cadenas carbonadas producidos en el metabolismo de los azúcares.

Utilización de compuestos nitrogenados

• Se pueden considerar tres grupos:– Compuestos utilizados directamente en la

biosíntesis– Compuestos que deben ser modificados antes de

ser utilizados en la biosíntesis– Compuestos utilizados como donadores de N o de

catión amonio mediante reacciones de desaminación y transaminación.

Mecanismos de transporte de metabolitos

Transportador

Transportador

Difusión Facilitada

• Es asistida por un transportador proteico, pero no requiere de suplementación directa de energía para funcionar – Este modo de transporte se utiliza para igualar

concentraciones entre el medio y la célula – Para aumentar la velocidad de transporte a bajos

gradientes– No permite concentrar intracelularmente

metabolitos (No funciona contra gradiente)

Difusión facilitada de aminoácidos

• El transporte está acoplado al movimiento de iones.• Muchos transportadores de aminoácidos son

simportes con iones de hidrógeno– La estrategia permite acoplar el transporte de iones,

con alto gradiente, a un compuesto con bajo gradiente.

• Los protones que entran a la célula deben ser excretados nuevamente para impedir la acidificación del citoplasma

• Este sistema de transporte solo funciona activamente en las primeras etapas de la fermentación

Difusión facilitada de aminoacidos en Sacch.

cerevisiae

A: Acoplado a la escresion de protones

B: acoplado a un intercambio de iones potasio

Características de los transportadores de aminoácidos

• Algunos transportadores son altamente específicos

• Otros transportadores actúan con un grupo de aminoácidos relacionados.

• Algunos transportadores son reprimidos por la presencia de ión amonio.

Tipos de transportadores de aminoácidos

• Transportador General de Aminoacidos: GAP– Es reprimido por el ión amonio– Numero de protones co-transportados = 2

• Dicarboxilic Aminoacid permeasa: DAP– No es reprimido por el ión amonio– Numero de protones co-transportados = 2 o 3

• Branched chain aminoacid permeasa: BAP– No es reprimido por el ión amonio– Numero de protones co-transportados = ?

Transporte de Amonio

• Se han descrito dos permeasas para el ión amonio• El transporte es inhibido de manera no competitiva

por ciertos aminoácidos (arginina y ac. Aspartico) • El ingreso del ión esta acoplado, por razones de

carga, a la excreción de protones por la ATPasa de la membrana.

• Por tanto, esta actividad de transporte necesita una fuente energía para poder funcionar.

Mecanismos de absorción de nitrógeno amoniacal

ATPasa

FACTORES QUE AFECTAN LA UTILIZACION DE NITROGENO POR LA

LEVADURA

Concentración de etanolTemperaturapHPresión de CO2

Composición de la membrana Plasmatica Grado aireaciónCepa de levadura

Efecto de concentración de etanol

• Disminuye la fuerza motriz a través de la membrana

• Inhibe el bombeo activo de protones provocado por la ATPasa de la membrana.

• Los mecanismos de trasporte activo disminuyen o se eliminan

• El etanol desactiva la GAP por modificación de su parte proeíca.

Efecto del etanol sobre el transporte de N

La difusión facilitada de aminoácidos es fuertemente inhibida por el etanol (aumenta la difusión pasiva de protones).

La levadura acumula aminoácidos en la vacuola cuando la concentración de etanol todavía es baja.

Efecto de la Temperatura

• El transporte de amonio ha demostrado ser independiente de la temperatura

• La velocidad de acumulación de aminoácidos disminuye con las bajas temperaturas porque afecta al transporte activo.

• La demanda cuantitativa de aminoácidos afecta la intensidad de la función de transporte

• .

Efecto del pH

• Los mecanismos de transporte activo son afectados por los pH bajos del mosto

• El pH optimo para el transporte del amonio esta entre 6,0 y 6,5.

• Se ha observado que las levaduras disminuyen en un 50% la utilización del amonio cuando crecen a pH 3,25 respecto de pH 4.0.

Efecto de la composición de la membrana

plasmática• Su efecto se ve regulado por varios factores:

– Concentración de esteroles (aireación)– Grado de insaturación de los residuos acidos de

los fosfolípidos de la membrana. (mejor una doble insaturación linoleico que monoinsaturado oleico.

– El grado de insaturación de los ácido grasos de la membrana afecta la actividad de la GAP.

– El efecto es atribuido a una mayor fluidez en la vecindad de los sitios de las permeasas.

Efecto de la aireación

• La aireación influye indirectamente a través de su acción sobre la composición de la membrana plasmática

• Como ya sea ha mencionado la utilización de prolina esta condicionada a la disponibilidad de oxígeno en el mosto

• En condiciones de anaerobiosis se ha determinado la excreción de prolina y urea posiblemente como resultado del metabolismo de la arginina.

• La aireación mejora la utilización del nitrógeno del mosto en fermentación (mayor producción de energía metabólica)

Efecto de la presión de CO2

• La presión de CO2 disminuye la velocidad y la concentración de absorción de aminoácidos del mosto (alrededor de un 50%)

• El CO2 altera la formación y la excreción de productos secundarios del metabolismo de los aminoácidos afectando su ingreso a la célula

Efecto del Nitrógeno sobre la Fermentación Alcohólica

Nitrógeno en los mostos

• Amplio rango de concentraciones:

TOTAL = 60 - 2400 mg/L

• Principalmente nitrógeno orgánico ( polipeptidos aminoácidos, proteínas, ión amonio)

• Los nitritos y los nitratos están presentes en niveles muy bajos < 0,3%.

NITROGENO LIBRE ASIMILABLE

• La determinación del N total no tiene una gran relevancia para predecir deficiencias para la levadura.

• La determinación del N total mediante el método de Kjeldal no es un buen predictor.

• Sólo tienen relevancia la fracción de nitrógeno asimilable por la levadura (YAN).

Aspectos relacionados con el Nitrógeno

• Como sabemos las principales fuentes de nitrógeno para la levadura corresponden a:

Amonio Aminoácidos

La nutrición dependerá de la disponibilidad en el mosto y de la posibilidad que las formas nitrogenadas ingresen a la célula.

+ = YAN

Hay 1 excepción

Concentraciones de YAN en el mosto

• Su concentración es muy variable pues depende de varios factores.

• Un estudio en 90 mostos de 25 c.v. provenientes de cuatro distintas regiones, entregó valores muy variables

28 - 336 mg/L

Media 120 mg/L

Aspectos relacionados con el YAN

• Desgraciadamente no existe una concentración fija que permita definir una disponibilidad suficiente de YAN

• El YAN debería ser analizado en cualquier mosto pero de preferencia:– En viñas de suelos pobres que provocan limitaciones al

crecimiento (bajo vigor)– Viñas con enfermedades degenerativas (virus, nematodos,

filoxera)– Viñas con estrés hídrico prolongado– Viñas con historial de fermentaciones flojas o que se

paralicen.

Antecedentes sobre la concentración de YAN

• En ocasiones 140 ppm se citan como nivel mínimo necesario.

• Cuando existen factores de estrés, las necesidades aumentan

• En general se establece que las levadura en fase de crecimiento prefieren unas 500 ppm pero con estos niveles pueden fermentar demasiado rápido (mayores necesidades de refrigeración).

• Valores entre las 200 y las 400 ppm parecen suficientes; las concertaciones depende de los grado Brix y otras condiciones.

Antecedentes sobre la concentración de YAN (2)

• En el mosto de uva el contenido de N alfa-amino es mayor que el de amonio (promedio de unas 2 a 3 veces).

• Cuando se adiciona una elevada concentración de amonio se altera el equilibrio drásticamente lo que puede perturbar la síntesis de algunos aminoácidos.

• Un ejemplo de interés industrial es: Si la concentración de metionina es baja y la de amonio elevada, puede producirse la síntesis de H2S aunque la concentración de nitrógeno asimilable sea elevada. Una adición de este aminoácido elimina la alteración.

• Las fuentes de aminoácidos ( extracto de levadura, hidrolizados de proteínas de soya) suelen impartir defectos sensoriales.

EFECTOS DEL NITROGENO

• Los estudios efectuados con mostos de distintas concentraciones de nitrógeno inicial permiten afirmar lo siguiente:– La concentración inicial no modifica la velocidad

especifica máxima de crecimiento.

– Afecta el nivel de crecimiento máximo y la tasa de descenso poblacional.

– La velocidad máxima de producción de CO2 es proporcional a la concentración de nitrógeno inicial.

– El tiempo total de fermentación depende de la conc. inicial de nitrógeno de acuerdo a una relación exponencial inversa (r = 0,931)

Aspectos cuantitativos

• Cuando la disponibilidad aumenta fuertemente: 300 a 800 mg/L. la asimilación de nitrógeno se eleva en pequeña extensión 200 a 260 mg/L

• Los datos de Bely (1991) muestran un pequeña reducción en la duración de la fermentación cuando el contenido de FAN excede los 300 mg/L.

• La respuesta eficiente más tardía coincide con la mitad de la fermentación.

• En las etapas avanzadas de la fermentación tienen un mayor efecto las fuentes más complejas de nitrógeno, efecto que se debería al cambio de transportadores.

• Las condiciones redox afectan las asimilación del nitrógeno. El oxígeno estimula la eficiencia en la utilización del nitrógeno

Azúcar

conc. (g/l)

Nitrógeno Asimilado (mg FAN/l)

Rendimiento Biomasa (g M.S./l)

Nitrógeno asimilado/biomasa

(%p/p)

Velocidad de fermentación (gCO2/l dia)

183 208 233 258

71.8 127.5 128.6 143.2

2.06 2.63 2.85 2.38

3.3 4.9 4.5 6.0

8.4 12.3 11.5 9.1

Concentración de azúcar y asimilación de nitrógeno, biomasa y velocidad media de fermentación

Efecto de la cepa de levadura• Se ha determinado una amplia variación entre cepas de

Sacch. cerevisiae en relación a su patrón de utilización de aminoácidos y concentración total de nitrógeno.

• Las diferencias cuantitativas son mas amplias que las cualitativas

• La cepa Montrachet es muy exigente en sus requerimiento de nitrógeno.

• Las cepas AWRI72 Y AWRI77 muestran una gran sensibilidad para la acumulación de tirosina y baja para glicina y alanina.

• La cepa Epernay2 excreta elevadas cantidades de arginina luego de haberla absorbido del medio.

Utilización de YAN por distintos strain

mg/L

• Epernay 2 392

• Prise de Mousse 449

• Montrachet 473

• AWRI 350 330

• AWRI 2 430

• Flor 402

Competencias microbiológicas

• El crecimiento de hongos disminuye de manera dramática el YAN

• Botrytis cinerea puede disminuir el YAN entre un 7 y 61%

• Un importante desarrollo de flora apiculada puede hacer que el YAN sea deficiente para Saccharomyces

Antecedentes sobre suplementación de YAN

• La forma de suplementación más utilizada es la adición de (Fosfato de amonio) FDA.

• La adición de FDA no es un panacea, en ocasiones los suplementos complejos presentan mejores respuestas

• Lo anterior puede deberse a que la levadura trabaja mejor si dispone de un equilibrio entre aminoácidos y amonio.

15.5ºC 20ºC CEPA %

Residual r2 %

Residual r2

EPERNAY 2 FLOR PRISE DE MOUSSE MONTRACHET

23.2 16.8 12.2 10.8

0.571 0.619 0.506 0.504

15.5 16.0 10.6 9.0

0.485 0.414 0.427 0.248

MEDIA 15.8 0.593 12.8 0.456

Porcentaje de y correlación entre el N inicial y el N asimilado a dos temperaturas

Práctica de la suplementación Nitrogenada

• Cuando se efectúan suplementaciones abundantes, es muy importante hacerlas en forma parcializada.

• Las aplicaciones masivas al inicio de la fermentación provocan un desequilibrio en la distribución del nitrógeno asimilable, esto origina: problemas sensoriales, baja eficiencia de la aplicación, acelera demasiado la fermentación, generando calor y provocando perdida de aromas.

• Las adiciones deberían parcializarse en los 2 a 4 primeros días.

• Todas las adiciones deberían haberse realizado cuando la concentración de sólidos soluble llega alrededor de 10º Brix.