PRACTICA N3

PRACTICA N3

METABOLISMO BACTERIANO. ENZIMAS DE LOS MICROORGANISMOS. FERMENTACIBACTERIANA I. EXPERIMENTO N 1: HIDRLISIS DEL ALMIDN1. OBJETIVO: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como carbohidratos y protenas.El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede ser hidrolizado por los cidos minerales.La primera desdobla las macromolculas de la amilosa y la amilopectina, de las cuales se compone el almidn, en unidades de 6-7moleculas de Glucosa. Con ms tiempo de exposicin, esa enzima logra desdoblar a estos oligosacridos llevndolos a maltosa, punto en el que la enzima maltasa se encarga de desdoblar esta molcula hasta Glucosa.La -amilasa puede desdoblar las molculas de amilosa y amilopectina pero solo a partir de los extremos no reductores de estas molculas. Cada vez son escindidas dos unidades de glucosa en forma de maltosa, punto en el que la maltasa entra en juego. Las molculas de amilasa son desdobladas de esta forma pero las de amilopectina son solo desdobladas en un 50% ya que la enzima no puede desdoblar las ramificaciones propias de esta macromolcula, se hace necesaria entonces la intervencin de la a-amilasa para desdoblarla por completo.-amilasa + Almidn Dextrina + -maltosa-amilasa + Almidn -maltosaLas amilasas son enzimas extracelulares.

2. MATERIALES: Solucin de yodo (lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli 1 Placa de Agar Almidn3. PROCEDIMIENTO: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn. Inocular en estras cada sector con las cepas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37C por 24 h4. RESULTADOS:Empleando la solucin de Lugol para evidenciar la hidrlisis, se obtiene:

Bacillus subtilis : al presentar la muestra color pardo marrn, se concluye que el B subtilis hidroliza parcialmente al almidn (poco hidroltico)Escherichia coli : La muestra presenta color azulado, a partir de lo cual se concluye que la E. coli hidroliza totalmente al almidn.

5. CONCLUSION: Ambas son capaces de utilizar al almidn como nutriente; sin embargo, la E. coli requiere de ms nutrientes que el B. subtilis.6. IMPORTANCIA:Conocer el grado de hidrlisis de las bacterias Gram + y Gram como evidencia de su actividad enzimtica y sus requerimientos energticos.

II. EXPERIMENTO N2: HIDROLISIS DE LA GELATINALa gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar gel cuando se disuelve en agua caliente. Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna bacteria que la prive de su propiedad gelatinizante.La hidrolisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y a la enzima encargada de ello se le llama gelatinasa.1. OBJETIVO:Conocer y estudiar a la enzima encargada de hidrolizar la gelatina2. MATERIALES: Cepa de S. Aureus Cepa de B. Subtilis Cepa de E. Coli Asa de kolle en aguja Tres tubos de gelatina nutriente estril3. PROCEDIMIENTOS: Inocule cada uno de los organismos en un tubo de gelatina nutriente por puntura hasta el fondo del tubo, una sola vez Llevar a temperatura ambiente por 2 a 7 das.4. RESULTADO: Gelatina + S. Aureus: prueba positiva, se observ hidrolisis parcial de la gelatina Gelatina + B. Subtilis: prueba positiva, se observ hidrolisis total de la gelatina Gelatina + E. Coli: prueba negativa, no se observ hidrolisis.5. CONCLUSIN: Podemos afirmar que dentro de los diferentes microorganismos los bacilos tiene la propiedad de hidrolizar la gelatina y con ello afirmar que poseen la enzima gelatinasa.

III. EXPERIMENTO N3: PRODUCCIN DE HEMMOLISINAS1. OBEJTIVOS:Conocer que microorganismos tienen la capacidad de secretar exoenzimas que causar lisis en los glbulos rojos.2. MATERIALES: Cepa de S. Aureus y B. subtilis Agar sangre

3. PROCEDIMIENTO: -Dividir en dos placas Petri

Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37C por 24-28 h.

4. RESULTADOS:

En ambos sectores se observ la presencia de hemolisinas. En el cultivo de S. Aureus se vio halos en todo el borde; este debido a que este microorganismo es un gran positivo y productor de hemolisina beta la cual produce una hemolisis completa , la destruccin y decoloracin total de la hemoglobina , y por eso la presencia de una zona hemoltica clara alrededor de la colonia. En el cultivo de B. Subtilis se observ cambio en la coloracin a un tono verdoso esto debido a que este microorganismo elabora un pigmento llamado biliverdina

5. CONCLUSION:-Este experimento nos demuestra que en los diferentes microorganismos producen distintos tipos de hemolisis; el grado de hemolisis se relaciona con su grado de patogeneidad, especialmente los betas hemolticos.

IV. EXPERIMENTO N 5 : FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOSLafermentacines un procesocatablicodeoxidacinincompleta, que no requiere oxgeno, y el producto final es un compuesto orgnico. Segn los productos finales, existen diversos tipos de fermentaciones.Hay fermentacin natural, cuando las condiciones ambientales permiten la interaccin de los microorganismos y los sustratos orgnicos susceptibles, y artificial, cuando el ser humano propicia condiciones y el contacto referido.La prueba contendr lo siguiente: Agar TSI (3 azucares y hierro) favorece el crecimiento de la mayora de bacterias. Azucares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa. Un indicador de pH.

NC : no cambio de pH.A : cido.AG : cido y gas.B : bsico.Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la obtiene la bacteria de protena y su producto final es gas de amoniaco.

1. MATERIALES: Cultivo de Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Y Bacillus S. 3 tubos con TSI en plano inclinado.

2. PROCEDIMIENTO: Sembrar por estra y puntura: E. coli - TSI S. aureus - TSI B. subtilis - TSI Incubar por 24 h. a 37 C

3. RESULTADOS:

E. coli: Se observa que el fondo y la superficie han cambiado.

Ants. De la seimbraDesp. De la siembra

Staphilococcus aureus: se observa que tanto la superficie como el fondo han cambiado, esto debido al medio acido.

Ants. De la seimbra Despus

Bacillus subtilis: Se observa que la superficie mantuvo su color esto debido al medio alcalino, con esto se demuestra que no hubo fermentacin de carbohidratos en la superficie.Mientras que al fondo del tubo se muestra claramente la fermentacin de carbohidratos, por la accin del medio acido.

Ants. De la seimbraDesp. De la siembra

Mediante estos experimentos se llega a conocer la accin fermentadora de los microorganismos en un determinado medio.En los cultivo de S. aureus y E. coli. Se demostr que si hubo fermentacin por el pH que mantienen.

V. EXPERIMENTO N 7: REDUCCIN DE CIDO SULFHDRICO

1. OBJETIVO: Determinar la capacidad bacteriana para producir HS (cido sulfhdrico)Mecanismo: Cuando se realiza la fermentacin de las protenas obtiene como producto cido sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados, algunas bacterias tienen enzimas que desprenden el cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido con hidrogeno del sustrato para formar cido sulfhdrico, por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +. H2S + FeO3 FeS + H2SO4

2. MATERIALES: Cultivo de E. Coli y Proteus Vulgaris Tubos de TSI con superficie inclinada (2)3. PROCEDIMIENTO: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. Coli y Proteus respectivamente, por estra y puntura. Incubara 37OC por 24Hrs y observar la formacin de FeS color negro.4. RESULRADOS: Ants. De la seimbra Desp. De la siembraE. coli: Se observa que no se produce cido sulfhdrico (no reduce) ni tampoco se produce gas.

Ants. De la seimbra Desp. De la siembra

Proteus Vulgaris: se observan los cambios por la aparicin de un precipitado negro (FeS) a lo largo de la picadura, tornndose alcalino en la superficie y acido en el fondo. Se produce la reduccin, hay formacin de cido sulfhdrico, utilizndose al azufre del medio como aceptor final de H+.

5. APLICACIN: Es til para la identificacin de bacterias de los gneros Salmonella, Campylobacter y Brucella y permite diferenciar entr especies de Proteus.

VI. EXPERIMENTO N 8 : DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION DEL INDOL1. FUNDAMENTOEl Indol es un compuesto que se genera mediante la desanimacin reductiva deltriptfano y esta reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseenlas enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas.

Para detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovacs; el indolproducido reacciona generando una coloracin rosa intensa.

2. MATERIALES: Cultivo de E.Coli y Bucillus Subtilis Caldo Triptfano 2 tubos con 3cc cada uno Solucin de Kovacs Pipeta de 1cc

3. PROCEDIMIENTO:Se incuba a 37C durante 24 horas y tras la incubacin, aadimos unas gotas de reactivo de Kovacs.Si se ha producido Indol aparecer un anillo rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.

Indol negativo Indol positivo4. RESULTADOS E.Coli (+) Bacteria que si produce indol al agregar gotas de solucin Kovacs

Es una propiedad de algunas bacterias que degradan el aminocido triptfano formando Indol.

B.Subtilis () Bacteria que no produce indol a pesar de agregar gotas de solucin Kovacs.

EXPERIMENTO N 9: DETECCION DE LA CATALASALa catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar el oxgeno Le falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay oxigeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrogeno para formar Agua Oxigenada, pero esta no puede desdoblarse en H2O y O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria. 1. MATERIALES: Cultivo d E.coli y S. aureus Tubos de Triptosa Caldo (2) Agua Oxigenda 3,0 %2. OBJETIVO:Identificar cules son los microorganismos anaerbicos que producen catalasa, exponindolos a un medio donde que contenga agua oxigenada.3. PROCEDIMIENTO: Incubar en cada tubo una de las cepas Incubar a 37 C por 24 horas Cubrir la superficie del caldo con agua oxigenada y observar la presencia de burbujas en el tubo donde hay catalasa.

4. RESULTADOS:1.- Tubo con E.coli: Negativo

2.- Tubo con S.Aureus: Positivo (Presencia de burbujas)

5. CONCLUSIONES: La presencia de burbujas en el tubo que contiene S.Aureus se debe a que este microorganismo produce la enzima catalasa, y por lo tanto el agua oxigenada contenida en el medio trmino siendo disociada en oxigeno (burbujas) y agua.

El tubo que contena E.Coli no sufri ningn cambio a simple vista ya que este microorganismo no produce catalasa, por lo tanto se asume que estando en este medio la E.Coli no pudo sobrevivir.

Existen bacterias que pueden vivir estando en un medio que contiene H202

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