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Indice Diferencias fisiológicas y reproductivas entre Bos Taurus y Bos Indicus. Pietro S. Baruselli, Emiliana de O.S. Batista, Roberta Machado Ferreira, Gabriel Bo ………….. 6

Criterios en la Elección del Programa Reproductivo para Novillas de Carne: Pubertad vs Madurez Reproductiva, Protocolo J-Synch vs Protocolo Convencional. Gabriel A. Bó, Javier de la Mata , Andres Vera Cedeño, Alejo Menchaca …………………………… 22

Enfermedades venéreas: Nuevos desarrollos en técnicas de giagnóstico en toros. A. García Guerra ………………………………………………………………………………………………………………… 42

Efecto de la edad y el estado fisiológico de la donante sobre la calidad de los ovocitos y la producción de embriones in vitro. P.S. Baruselli, E.O.S. Batista, L.M. Vieira, R.M. Ferreira, B.G. Guerreiro, B.M. Bayeux, J.N.S. Sales, A.H. Souza, L.U. Gimenes …………………………………………………………………………………….………..….. 65

Protocolos de IATF que alargan el proestro y su efecto en la preñez. A. Menchaca, R. Núñez-Olivera, C. García-Pintos, J. de la Mata, E. Huguenine, G. Bó ……….. 85

Programas de IATF de alta fertilidad con semen sexado. G.A. Bó, E. Huguenine, J.J. de la Mata, R.L.S. de Carneiroy A. Menchaca……………………….…. 106

Perdidas gestacionales en receptoras de embriones In Vitro: Factores de riesgo y estrategias para diminuirlas. A. García Guerra, R. V. Sala, L. Carrenho-Sala, J.C.L., Motta, E. Walleser, L. F. Melo, L. Leffers, M. Fosado, J. F. Moreno, M. C. Wiltbank ………………………………………………………………………………. 122

Programas de IATF e re-IATF en ganado zebuíno. Baruselli, P.S.; Vieira, L.M. ………………………………………………………………………………………………… 139

Implementación de programas de IATF a gran escala. Alejo Menchaca ……………………………………………………………………………………………………………….. 157

Estrategias para el uso eficiente de receptoras de embriones In Vitro. A. García Guerra, R. V. Sala, J.C.L., Motta, E. Walleser, L. F. Melo, L. Leffers, M. Fosado, J. F. Moreno, M. C. Wiltbank ………………………………………………………………………………………………….. 162

Momento de inseminación y expresión de celos en vacas de leche sincronizadas con dispositivos con progesterona y estradiol. Tschopp, J.C. y Bó G.A ……………………………………………………………………………………………………… 176

Animales del futuro, la revolución CRISPR Alejo Menchaca ……………………………………………………………………………………………………………… 200

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Diferencias fisiológicas y reproductivas entre Bos Taurus y Bos Indicus

Pietro S. Baruselli1, Emiliana de O.S. Batista1, Roberta Machado Ferreira1, Gabriel Bo2 1Departamento de Reprodução animal, USP, São Paulo, SP, Brasil

2Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), Córdoba, Argentina. (e-mail: barusell@usp.br)

Introdução

O uso estratégico da inseminação artificial em tempo fixo (IATF) em fêmeas Bos indicus

e Bos taurus como ferramenta de multiplicação de indivíduos geneticamente superiores

promove melhora na eficiência reprodutiva, antecipando a concepção e aumentando a taxa de

prenhez ao final da estação de monta (Baruselli et al. 2002, Penteado et al. 2005, Bó et al. 2007).

Esses resultados impactam positivamente o retorno econômico das propriedades que produzem

carne e leite (Baruselli 2016).

Existem marcantes diferenças entre os grupos genéticos na resposta aos tratamentos

de sincronização da ovulação (Bo et al., 2003; Baruselli et al., 2007). Em fêmeas taurinas (Bos

taurus), especialmente vacas da raça Holandesa, maiores concentrações de progesterona (P4)

durante a sincronização acarretam maiores taxas de concepção após a IATF (Wiltbank et al.

2011). Entretanto, em fêmeas zebuínas (Bos indicus), a elevada concentração de P4 durante o

protocolo de sincronização promove efeitos negativos na taxa de crescimento folicular,

reduzindo do diâmetro do folículo dominante e, consequentemente, a taxa de ovulação

(Carvalho et al. 2008).

Contudo, os resultados de pesquisas apontam maior concentração sanguínea de P4

durante protocolo de sincronização da ovulação em fêmeas zebuínas comparadas às taurinas

(Batista 2015, Carvalho et al. 2008). Esta maior concentração circulante de P4 pode ser explicada

pela maior capacidade do corpo lúteo (CL) em produzir P4 (Segerson et al. 1984) ou pela menor

metabolização hepática neste grupo genético (Batista et al., 2015). Entretanto, acredita-se que

por possuir menor tamanho de CL, as fêmeas zebuínas não apresentem maior produção de P4

comparada às fêmeas taurinas. Em concordância com esta hipótese, há relatos de maior

capacidade esteroidogênica do CL em fêmeas taurinas comparadas às zebuínas (Segerson et al.,

1984). No entanto, na literatura existem indícios de menor metabolização hepática em fêmeas

zebuínas comparadas com fêmeas taurinas (Bastos et al., 2012; Batista et al., 2015).

Desta forma, este artigo tem o intuito de apresentar informações sobre as diferenças na

fisiologia reprodutiva de fêmeas Bos taurus e Bos indicus relacionadas ao metabolismo de P4

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durante protocolo de sincronização da ovulação para IATF. Essas informações são importantes

para otimizar o emprego das biotecnologias da reprodução nos sistemas de produção de carne

e leite e assim aumentar produtividade dos rebanhos.

Comportamento estral

O comportamento de estro ocorre quando há queda nas concentrações de P4 e

aumento nas concentrações de estradiol (E2)(Allrich 1994). Este comportamento pode ser

influenciado pela idade (De Silva et al. 1981), raça (Rae et al. 1999) e produção de leite (Lopez

et al. 2004). Ingestão de matéria seca, peso corporal e metabolismo de esteroides também

podem exercer influência sobre o comportamento estral (Sartori et al. 2010).

A maioria das fêmeas zebuínas iniciam a manifestação de cio no período noturno

(Pinheiro et al. 1998, Bertam 2000), sendo que 30 % destes animais iniciam e encerram o estro

durante a noite (Pinheiro et al., 1998). Em condições brasileiras de manejo, foi avaliado o

comportamento reprodutivo de vacas de corte com auxílio de radiotelemetria (Heat-Watch).

Verificou-se que a duração do estro em Bos indicus é menor do que em Bos taurus (12,9 ± 2,9

horas em Nelore vs. 16,3 ± 4,8 horas em Angus; Mizuta 2003). Apesar disso, o intervalo entre o

estro e a ovulação não apresentou diferenças entre estas duas raças (Nelore, 27,1 ± 3,3 h vs.

Angus, 26,1 ± 6,3 h). A curta duração do estro verificada em zebuínos dificulta a eficácia da

detecção de cio (Galina e Orihuela 2007). No entanto, especificamente em vacas leiteiras de alta

produção, a duração do estro pode também estar reduzida (Nebel et al. 1997), devido ao

elevado metabolismo hepático de E2 presente nesta categoria (Lopez et al. 2004). Entretanto,

Bastos (2012) demonstrou que em condições climáticas e nutricionais semelhantes, vacas

zebuínas e taurinas podem manifestar estro com mesma intensidade e duração (Bastos 2012).

Esses dados demonstram que é necessário conhecer as características do estro

comportamental e da ovulação para implementar eficientes programas reprodutivos, levando

em consideração as diferenças entre Bos indicus e Bos taurus.

Crescimento folicular

O desenvolvimento dos folículos nos ovários de bovinos manifesta-se em um padrão de

ondas. Cada onda de crescimento folicular é caracterizada inicialmente pela emergência

folicular (grupo de pequenos folículos de 3 a 4 mm que são recrutados), seguida da fase de

crescimento conjunto dos folículos recrutados por cerca de três dias (Ginther et al. 2003). Deste

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grupo de folículos, apenas um continua seu desenvolvimento (folículo dominante), enquanto os

outros reduzem seu tamanho (folículos subordinados; Lucy et al. 1992), estabelecendo-se o

fenômeno da divergência folicular (Ginther et al. 1989). Assim, o folículo dominante presente

no momento da regressão luteínica culmina na ovulação (Fortune et al. 2004). Estudos

evidenciaram as características endócrinas da emergência e do desvio folicular em Bos indicus,

que estão apresentadas na Figura 1.

Figura 1 - Concentrações plasmáticas de FSH e de LH normalizadas para o momento do desvio folicular (0h) em novilhas Nelore (n=12). Pirassununga – SP, 2004. *representa diferença estatística entre os pontos (P<0,05) para a curva de FSH (adaptado de Gimenes et al., 2008b).

O intervalo entre ovulações é 21 dias, tanto para fêmeas Bos indicus, como para fêmeas

Bos taurus (Bó et al. 2003; Baruselli et al., 2007). No entanto, em vacas Holandesas de alta

produção, devido ao maior tempo entre luteólise e ovulação, esse intervalo pode ser mais longo,

por volta de 23 dias (Sartori et al. 2004). Considerando o número de ondas de crescimento

folicular por ciclo estral, fêmeas Bos taurus apresentam de duas a três ondas (Bastos 2012). Em

fêmeas zebuínas, há relatos de duas a quatro ondas (Figueiredo et al. 1997).

Sabe-se que no início de cada onda de crescimento folicular, tanto vacas (Bastos 2012)

como novilhas Bos indicus apresentam maior número de folículos antrais que vacas e novilhas

Bos taurus (Carvalho et al. 2008, Batista 2015, Gimenes et al. 2009). Essa característica tem

influência direta na eficiência técnica de transferência de embriões e de OPU-FIV, indicando

vantagem para fêmeas zebuínas sobre as taurinas (Baruselli et al., 2016, Bo et al., 2016).

Neste contexto, sabe que o hormônio Anti-Mulleriano (AMH) tem correlação positiva

com a população folicular em fêmeas Bos taurus e Bos indicus. Foi observado maior

concentração de AMH em novilhas zebuínas comparada às taurinas (1,0 vs 0,3 ng/mL, P < 0,05;

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Batista et al. 2014). Posteriormente, Guerreiro et al., 2014 observaram que tanto em fêmeas

Bos taurus como em Bos indicus há uma correlação positiva entre produção de embriões in vitro

e AMH. Esta informação também se estendeu para produção in vitro de embriões de bezerras

taurinas e zebuínas (Batista et al. 2016).

Acredita-se que maiores concentrações de insulina e IGF-1 são responsáveis pelo maior

número de folículos recrutados em zebuínos, que taurinos (Bó et al. 2003, Sales et al. 2015,

Sartori et al. 2016, Sales 2011). Corroborando com essa hipótese, foi observada maiores

concentrações pré-prandias de insulina na fase estrogênica (fase de recrutamento folicular)

compara à progesterônica em fêmeas Bos indicus comparada às fêmeas Bos taurus (Bastos

2012).

Além da diferença na população folicular entre fêmeas Bos indicus e Bos taurus, há

também diferença no diâmetro médio dos folículos dominante e ovulatório. Os tamanhos

foliculares médios do folículo dominante e subordinado na divergência folicular são maiores em

fêmeas taurinas (Folículo dominante = 8,5 mm e folículo subordinado = 7,2 mm; Ginther et al.

1997) comparadas às zebuínas (Folículo dominante = 5,4 mm a 6,2 mm e folículo subordinado

5,4 a 5,8 mm; Gimenes et al. 2008a).

Figura 2 Diâmetros do folículo dominante (DF) e do maior folículo subordinado (SF) normalizado para o dia do desvio em 12 novilhas Nelore (↓ desvio observado). As novilhas foram examinadas por ultrassonografia a cada 12 h da ovulação (Dia 0) até o Dia 5. O desvio ocorreu 2,5± 0,2 dias (59,1 ± 5,8 h) após a ovulação, e os diâmetros médios para DF e maior SF no desvio foram de 6,2±0,2 e 5,9±0,2 mm, respectivamente (Média ± SEM). A taxa de crescimento do DF diferiu do SF após o desvio folicular (P <0,0001). (adaptado de Gimenes et al., 2008a).

Ainda, o tamanho que o folículo dominante atinge capacidade ovulatória em diferentes

diâmetros, quando comparado fêmeas Bos taurus com Bos indicus. Vacas Holandesas ovularam

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folículos maiores ou igual à 10 mm de diâmetro, com a administração de 40 mg de LH (Sartori

et al. 2001). Entretanto, em fêmeas zebuínas a administração do mesmo indutor de ovulação

levou à ovulação de 33,3%, 80%, e 90% dos animais com folículos de 7 a 8,4 mm; 8,5 a 10 mm e

maior que 10 mm de diâmetro, respectivamente (Gimenes et al. 2008). Esses dados

demonstram que a capacidade ovulatória em fêmeas Bos indicus é adquirida com diâmetros

inferiores aos observados em fêmeas Bos taurus. Ainda, sabe-se que em fêmeas Bos taurus o

diâmetro do folículo ovulatório pode variar entre 12,9 a 17,1 mm (Ginther et al. 1989, Bastos

2012, Batista 2015) e em fêmeas Bos indicus de 9,4 a 12,1 mm (Figueiredo et al. 1997, Sartorelli

et al. 2005, Bastos 2012, Batista 2015).

O diâmetro do CL também parece ser menor em Bos indicus que em Bos taurus (Batista

2015, Bastos 2012). Em fêmeas zebuínas o diâmetro do CL varia de 17 a 21 mm (Figueiredo et

al. 1997), já em taurinos são relatados diâmetros entre 20 e 30 mm (Ginther et al. 1989). Da

mesma forma, há relatos de que a concentração de P4 produzida pelo CL também é inferior em

zebuínos em relação aos taurinos (Segerson et al. 1984).

Carvalho et al., 2008 realizou estudo com sincronização de ovulação em novilhas Bos

indicus (Nelore e Gir), Bos taurus (Angus e Holandês) e cruzadas Bos indicus x Bos taurus (Nelore

x Angus e Gir x Holandês) submetidas à mesmo manejo experimental. O protocolo de

sincronização da ovulação consistiu no emprego de dispositivo intravaginal de P4 e benzoato de

estradiol no início do tratamento. Durante a permanência do dispositivo intravaginal, as

concentrações de P4 sérica foram superiores e permaneceram mais elevadas em novilhas Bos

indicus. Os autores discutem que esse achado pode ser decorrente da diferença de metabolismo

entre esses grupos genéticos, atribuindo menor taxa metabólica em zebuínos. Esse resultado

deve ser levado em consideração quando do emprego de tratamentos com P4 em fêmeas Bos

indicus. Elevados concentrações de P4 diminuem a pulsatilidade de LH e podem comprometer

o crescimento folicular e ovulação.

Metabolismo de hormônios esteróides e IATF

Folículos ovulatórios com maior diâmetro têm maior capacidade de produzir E2 (Perry

et al. 2014) e o tamanho deste folículo está positivamente correlacionado com o tamanho do CL

formado, e assim, com sua capacidade em produzir P4 (Peres et al. 2009, Sá Filho et al. 2013).

A concentração de hormônios esteroides circulante é o resultado de sua produção e

metabolismo (Wiltbank et al. 2012), que ocorre principalmente no fígado (Sangsritavong et al.

2002). A principal fonte de P4 na vaca é o CL (Niswender 2002). Especificamente em vacas

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leiteiras foi demonstrado que um fator determinante na taxa de metabolismo de P4 é o fluxo

sanguíneo hepático (Sangsritavong et al. 2002). Dois vasos sanguíneos, a artéria hepática e a

veia porta, são responsáveis por tal fluxo. A veia porta drena sangue do trato digestivo para o

fígado. Assim, com o aumento da ingestão de matéria seca, há um aumento no fluxo do trato

digestivo e consequentemente no fígado, desta forma aumentando o metabolismo de P4

hepático (Sangsritavong et al. 2002).

Como citado anteriormente, há relatos na literatura de que fêmeas Bos taurus têm

maior capacidade esteroidogênica que fêmeas Bos indicus (Randel 1976, Segerson et al. 1984).

Entretanto, trabalhos recentes têm demonstrado que fêmeas zebuínas apresentam maior

concentração circulante de esteroides, quando comparada às fêmeas taurinas (Carvalho et al.

2008, Bastos 2012, Batista 2015). Contudo, embora fêmeas taurinas apresentem estruturas

ovarianas de maior diâmetro que fêmeas zebuínas, há indícios de que fêmeas Bos indicus

tenham uma menor metabolização de hormônios esteroides comparada às fêmeas Bos taurus

(Carvalho et al. 2008, Bastos 2012, Batista 2015). Em concordância com esta hipótese, foi

observado em fêmeas zebuínas maior concentração circulante de P4, que fêmeas taurinas

quando ambos grupos genéticos foram submetidas à mesma dieta (baixa ou alta ingestão de

matéria seca) e tinham apenas como fonte de P4 um dispositivo intravaginal de P4 (Batista

2015).

Sabe-se que existem duas possíveis vias de metabolização de P4 no fígado, uma via

envolvendo ação de enzimas da família citocromo P450, e outra via envolvendo enzimas 5α e

5β redutases. Há poucos estudos in vivo a respeito da regulação das enzimas hepáticas que

metabolizam P4 em bovinos. No entanto, a maioria dos metabólitos encontrados no sangue

indicam que o principal caminho de metabolismo de P4 envolve as enzimas AKR1C e AKR1D, ou

seja, enzimas envolvendo o caminho das redutases (Stupnicki and Williams 1968,

Schwarzenberger et al. 1997). Neste contexto, Batista et al., 2015 observaram maior abundância

de transcritos para o gene CYP3A4 (gene da família citocromo P450) no fígado de novilhas Bos

indicus (Nelore) comparadas às Bos taurus (Holandesa), independente da dieta fornecida (alta

ou baixa ingestão de matéria seca). No entanto, em novilhas taurinas foi observada maior

abundância de transcritos para os genes envolvendo o caminho das 5α e 5β redutases,

particularmente os genes AKR1D1, AKR1C4 e SRD5A1. Desta forma, embora exista um papel

crítico do elevado fluxo sanguíneo hepático no aumento do metabolismo de esteroides no

fígado (Sangsritavong et al. 2002), os resultados deste estudo foram indicativos de que a

expressão de enzimas hepáticas relacionados ao metabolismo de P4 é, ao menos parcialmente,

regulada pelo grupo genético. Ainda, esses resultados podem justificar as diferenças nas

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concentrações circulantes de P4 observadas entre fêmeas zebuínas e taurinas (Batista et al.

2015). Desta forma, uma possível hipótese é que o metabolismo mais lento de esteroides em

fêmeas Bos indicus possa ser uma característica inerente a raça e não apenas um efeito exclusivo

da ingestão de matéria seca.

Assim, em novilhas zebuínas, é indicada a utilização de dispositivos intravaginais que

contenham baixa concentração de P4 para evitar comprometimento no crescimento folicular e

resposta ao protocolo de sincronização. Contudo, o fornecimento alimentar adequado durante

a estação reprodutiva pode colaborar na redução das concentrações plasmáticas de P4,

melhorando a resposta folicular ao protocolo de sincronização da ovulação. Além disso, o uso

de PGF2α no início do protocolo de sincronização promove lise do CL e assim pode reduzir os

efeitos negativos da P4 no crescimento folicular (Figura 2).

Figura 2. Modelo hipotético gráfico de fatores envolvidos no metabolismo de progesterona (P4) em novilhas Bos indicus (Nelore) e Bos taurus (Holandesa) durante protocolo de sincronização da ovulação com dispositivo intravaginal de P4 (adaptado de Batista, 2015).

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Em relação às gonadotrofinas, sabe-se que a concentração de P4 tem importante efeito

na magnitude da onda de liberação LH (Giordano et al. 2012). Quanto a magnitude do pico de

LH, há grande variação nos valores descritos na literatura entre raças e períodos do ciclo estral.

Há relatos de menor onda pré-ovulatória de LH em novilhas Bos indicus que em novilhas Bos

taurus ou cruzadas (Randel 1984). Em fêmeas da raça Holandesa, há relatos de valores entre 0,5

a 1,5 ng/mL (Ginther et al. 1999, Ginther et al. 2001). Em fêmeas da raça Nelore, há relatos entre

0,5 a 1,0 ng/mL em animais sincronizados com dispositivo de P4 (Cipriano et al. 2011).

Em recente trabalho do nosso grupo com novilhas Bos indicus e Bos taurus mantidas nas

mesmas condições de manejo (Batista et al., 2017, artigo submetido) foi observado menor pico

de LH após administração de 0,01 mg de GnRH nos animais mantidos sob altas concentrações

de P4, independentemente do grupo genético (Tabela 1). No entanto, a diferença no pico de LH

em novilhas taurinas submetidas à alta e baixa concentrações de P4 foi maior comparada a

diferença no pico de LH em novilhas zebuínas (Figura 3). Ainda, verificou que a onda pré-

ovulatória de LH é maior em Bos taurus que em Bos indicus.

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Tabela 1. Onda de liberação LH após o tratamento com GnRH em novilhas Bos indicus (Nelore) e Bos taurus (Holandesa) com Baixa ou Alta concentração de P4 no momento do tratamento. Todos os valores são expressos como média ± EPM.

Bos indicus (Nelore) Bos taurus (Holandesa) P

Item

Baixa P4

(n = 6)

Alta P4

(n = 5)

Baixa P4

(n = 8)

Alta P4

(n = 5)

Grupo

Genético [ ] P41

Genetic Group*

[ ] P4

P4 (ng/mL) 0.2 ± 0.02 4.4 ± 0.2 0.1 ± 0.007 2.9 ± 0.4 0.06 0.0008 0.20

LH (ng/mL) 8.3 ± 0.8cB 3.3 ± 0.3dC 27.0 ± 1.9aA 6.9 ± 0.4bB 0.0001 < .0001 0.01

Momento do pico de LH (min) 125.0 ± 4.9 102.0 ± 3.3 116.3 ± 2.4 96.0 ± 5.0 0.37 0.02 0.54

AUC (área sobre a curva) 1,482.5 ± 145.8 612.6 ± 45.7 3,862.4 ± 175.2 1,188.8 ± 50.5 <.0001 <.0001 0.34

1. a b,c Indica diferença no pico de LH (ng/mL) entre os grupos (Baixa e Alta P4) no mesmo grupo genético. 2. a ≠b P ≤ 0,05 3. c ≠d P = 0.07 4. A,B,C Indica diferenças no pico de LH (ng/mL) entre os grupos genéticos (Bos taurus e Bos indicus) no mesmo ambiente de P4

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Figura 3.

Concentração plasmática de LH em novilhas Bos indicus (Nelore) e Bos taurus (Holandesa) sob alta e baixa concentração de progesterona (P4) normalizada para amplitude máxima de LH. Asterisco (*) indica diferença na média de concentração plasmática de LH entre os grupos de Alta e Baixa P4. A seta indica o momento do pico de LH (ng/mL).

Neste contexto, condições anovulatórias frequentemente verificadas em zebuínos parecem estar

associadas ao comprometimento da liberação de LH, responsável pela continuidade do crescimento e

indução da ovulação do folículo dominante. Em um experimento, D'occhio et al. 1990 observaram que,

aos 30 dias pós-parto, vacas Bos taurus (Hereford x Shorthorn) apresentavam maior concentração

plasmática de LH do que vacas Bos indicus (Brahman). Da mesma forma, esses autores verificaram que

entre 50 e 120 dias pós-parto as vacas Bos taurus apresentaram maior secreção pulsátil de LH que vacas

Bos indicus, além de maior taxa de prenhez.

Considerações finais

Os dados acima apresentados demonstram a importância do conhecimento das particularidades da

fisiologia reprodutiva de fêmeas Bos taurus e Bos indicus que têm implicações diretas na eficiência das

biotecnologias da reprodução utilizadas para multiplicação de indivíduos geneticamente superiores. A

adoção dessas tecnologias (inseminação artificial e transferência de embriões) melhora a eficiência

reprodutiva e proporciona maior produtividade e retorno econômico para a pecuária de corte e de leite.

Tempo (min)

-120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120

bL

H (

ng

/mL

)

0

10

20

30

40 Bos taurus (Hol) - Alta P4

Bos taurus (Hol) - Baixa P4

*

*

*

*

*

*

*

Tempo (min)

-120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120

bLH

(ng

/mL)

0

2

4

6

8

10

12

14 Bos indicus (Nel) - Alta P4

Bos indicus (Nel) - Baixa P4

*

**

*

*

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Referências

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Memorias

20

Memorias

21

Memorias

22

Criterios en la Elección del Programa Reproductivo para Novillas de Carne: Pubertad vs

Madurez Reproductiva, Protocolo J-Synch vs Protocolo Convencional

Gabriel A. Bó 12, Javier de la Mata 3, Andres Vera Cedeño3 Alejo Menchaca 4

1 Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), Zona Rural, General Paz (5145), Córdoba,

Argentina.

2 Instituto A.P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de

Villa María, Villa del Rosario, Córdoba, Argentina.

3 Actividad Privada y Maestría en Reproducción Bovina, IRAC-Facultad de Ciencias Agrarias,

Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.

4 Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal Uruguay, Montevideo, Uruguay.

e-mail: gabrielbo62@gmail.com

Resumen

Durante los últimos años se ha producido un gran avance en el desarrollo de programas de

inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), lo cual incrementó notablemente la cantidad de

animales incluidos en estos programas. Datos de análisis de resultados de programas de IATF

indican que es posible obtener porcentajes de preñez promedio del 50% a primo inseminación,

tanto en vacas con cría al pie como en Novillas. Sin embargo, los resultados de preñez obtenidos

en Novillas muchas veces son variables e impredecibles, sobre todo en Novillas con alto

porcentaje de cebú y las que se quieren preñar con 15 meses de edad. Dentro de las posibles

causas de estos variables resultados podemos mencionar la alta tasa de inmadurez en las Novillas

en el momento que se las quiere inseminar y el tratamiento que se utiliza para la IATF. En ese

aspecto, se han reportado cuanto mayor sea el porcentaje de Novillas inmaduras (sin un CL) en

un lote menores serán los resultados a la IATF. Además, se ha reportado recientemente que las

tasas de preñez a la IATF se podrían incrementar si se disminuye el período de crecimiento del

folículo dominante ovulatorio y se prolonga la duración del proestro. Nosotros recientemente

reportamos datos de un tratamiento realizado utilizando un protocolo basado en benzoato de

estradiol (EB) y un dispositivo con progesterona (P4; que son las hormonas más usadas en

Latinoamérica) pero donde la remoción del dispositivo con progesterona fue realizada 6 días

después y se prolongó el proestro administrando GnRH como inductor de la ovulación a las 72 h

Memorias

23

en lugar de las 48 h. Este protocolo fue denominado J-Synch las tasas de preñez a la IATF fueron

numéricamente mayores a las obtenidas con el protocolo convencional en Novillas Holando

Argentino y significativamente mayores en Novillas de carne y receptoras de embriones. El

objetivo de esta revisión es discutir en profundidad el tema de pubertad y madurez reproductiva

en Novillas y como estos factores afectan la preñez. Además, presentar resultados obtenidos con

el protocolo J-Synch en comparación con los protocolos convencionales de IATF.

Pubertad en el Ganado Bovino

La pubertad es la edad a la cual un animal alcanza la madurez sexual y es precedida por un

periodo de maduración sexual y desarrollo fisiológico. Las gónadas de los animales son

responsables de la producción de gametas viables que, después de la fertilización, resultan en la

generación de descendientes. La función de las gónadas es regulada por factores locales y

endocrinos, donde la pituitaria e hipotálamo tienen roles críticos. Comprender los factores que

regulan la función de la pituitaria y hipotálamo durante el periodo de maduración sexual, y cómo

estos cambios preparan la primera ovulación en hembras, es la clave para entender los

acontecimientos de desarrollo prepuberal.

Existe bastante información sobre el patrón de desarrollo de los folículos antrales ováricos y del

tracto reproductivo en la ternera después del nacimiento y los mecanismos endocrinos que

controlan la maduración sexual también están más claros. Todo este proceso por lo tanto será

revisado en conjunto. Desde un punto de vista práctico, hay probablemente mas interés en el

mecanismo que regula el desarrollo postnatal ovárico en el bovino comparado con otras especies

de campo, debido a la presión para obtener terneros de Novillas a una edad temprana y a la

intensidad de esfuerzos dirigidos hacia la mejora genética. La edad de la primera ovulación en el

ganado es bastante variable (Kinder et al., 1995) y sería útil adelantar el momento de la primera

ovulación para tener varios ciclos antes del primer servicio, ya que la fertilidad aumenta al paso

de los ciclos después de la primera ovulación puberal (Byerley et al., 1987).

Desarrollo del tracto reproductivo

En mamíferos el sexo genotípico de un individuo es el resultado de una cascada de

eventos controlados por factores endocrinos y genéticos. La determinación del sexo es el proceso

que resulta en la formación de los testículos o de los ovarios y pareciera estar principalmente

bajo control genético (en gran parte por genes de los cromosomas sexuales X e Y) (Cotinot et al.,

2002). La diferenciación sexual es el subsiguiente desarrollo de las gónadas y órganos accesorios

Memorias

24

sexuales y está bajo control endocrino. La naturaleza del control endocrino esta dirigida por

determinación sexual y por lo tanto, el sexo fenotípico de un individuo es determinado por la

expresión correcta de su constitución genética.

Observaciones de Novillas que fueron sacrificadas en intervalos mensuales mostró que

el peso ovárico aumentó hasta los 4 meses de edad, se mantuvo hasta los 8 meses de edad y

luego aumentó más rápido cuando las Novillas comenzaron a ciclar y desarrollar un cuerpo lúteo

(7 a 10 meses de edad). No había ningún folículo antral visible en el nacimiento pero un pequeño

número apareció antes de 1 mes de edad. El número de folículos antrales alcanzó un pico a los 4

meses de edad, disminuyó hacia los 8 meses y luego se estabilizó. El peso de la vagina y cervix

aumentaron gradualmente hasta los 4 meses de edad, y luego más rápidamente hasta la primera

ovulación. El peso del útero aumento desde el nacimiento hasta la primera ovulación.

En un estudio en Novillas de carne (Honaramooz et al., 2004), utilizando ultrasonografía

transrectal entre las semanas 2 y 60 de edad, el diámetro del útero, del cervix y la vagina

aumentaron rápidamente desde la semana 2 a 24 de edad y aumentaran de nuevo después de

la semana 32 de edad. La primera ovulación ocurrió a las 63.7 ± 1.1 semanas de edad. Las

dimensiones del ovario aumentaron rápidamente desde la semana 2 a 14 edad y nuevamente de

la semana 34 a 60. Los folículos antrales aparecieron a las 2 semanas de edad y el número de

folículos ≥ 3 mm de diámetro y el diámetro máximo de los folículos aumentaron en un modo

similar a las dimensiones ováricas, con un aumento marcado del diámetro máximo del folículo

mayor durante los 80 días antes de la primera ovulación. El diámetro del folículo mayor fue

positivamente correlacionado con el diámetro de varios segmentos del tracto reproductivo.

Desarrollo folicular ovárico

La imagen ultrasonográfica transrectal proporciona un medio de monitoreo frecuente, no-

invasivo de los folículos antrales ováricos en un mismo grupo de animales a cualquier edad (Evans

et al., 1994a, 1994b). Utilizando ultrasonografía transrectal, los folículos antrales ováricos

pueden ser visualizados y medidos independientemente de la profundidad en el ovario. Cuando

esas observaciones fueron hechas diariamente, durante un período de tiempo extenso,

mostraron que las Novillas de carne prepuberes tienen ondas de desarrollo de folículos antrales

(Adams et al., 1994) en forma similar al ganado adulto. Las ondas foliculares en Novillas

prepuberes, como en vacas adultas, fueron precedidas por un pico de concentración sérica de

FSH (Figura 1) (Evans et al., 1994). En un estudio extenso, se realizaron examinaciones

transrectales diarias por periodos de al menos 17 días, en intervalos de 6 a 12 semanas, desde

las 2 semanas de edad hasta la primera ovulación (Evans et al., 1994 a, c). Las Novillas de carne a

Memorias

25

las 2 semanas de edad mostraron ondas foliculares ováricas regulares (Figura 1; Evans et al.,

1994c). El número de folículos pequeños (3-5 mm de diámetro), medios (6-8 mm de diámetros)

y grandes (≥9 mm de diámetro) aumentó desde la semana 2 a 14 de edad, así como también el

diámetro máximo del folículo mayor de cada onda (Figura 1) El diámetro del folículo mayor

aumentó más rápidamente desde la semana 24 a 44 de edad. La primera ovulación fue vista en

promedio a las 56.0 ± 1.2 semanas de edad. Las concentraciones sérica máximas de estradiol

fueron mayores desde la ultima onda no ovulatoria y la primera ovulatoria en el periodo

peripuberal comparada con las ondas no ovulatorias de las semanas 9 a 12 antes de la primera

ovulación. Bergfeld et al. (1994) encontró que el máximo diámetro folicular del folículo mayor

de cada onda aumento en los últimos 30 días antes de la primera ovulación.

En resumen, observaciones previas posmortem y estudios ultrasonograficos en terneras

mostraron un claro aumento postnatal del número de folículos antrales. Los estudios

ultrasonográficos mostraron después del aumento post-natal de folículos en crecimiento, una

meseta seguida de otro aumento a las 30 semanas, y especialmente en las últimas 11 semanas,

previas a la primera ovulación. Parecería que aumentos en la producción de estrógenos desde

los folículos ováricos manejan el modo bifásico del crecimiento de la genitalia tubular, ya que el

crecimiento del ovario y de los folículos ováricos mostraron un patrón similar que la genitalia

tubular. Las concentraciones circulantes de estradiol son bajas al principio pero aumentan con la

edad mientras las Novillas prepuberes maduran, en particular durante las 12 semanas antes de

la primera ovulación. Sin embargo, el mayor aumento ocurre pocos días antes de la primera

ovulación. La primera ovulación en Novillas frecuentemente no está asociada con estro, y el

subsecuente cuerpo lúteo es más pequeño que uno de un ciclo normal y puede ser de vida más

corta. Este ciclo corto es seguido por estro y una fase luteal de duración normal.

Memorias

26

Figura 1. Representación esquemática de los perfiles de crecimiento del folículo dominante y del

folículo mayor subordinado, asociado con las concentraciones de FSH en Novillas entre 15 y 30

días de edad.

Secreción hormonal durante el periodo prepuber

Existe un aumento marcado pero pasajero en la secreción de LH y FSH en las terneras de 6 a 24

semanas de edad (Evans et al., 1992). La secreción de LH es claramente pulsátil y este aumento

temprano en la secreción parece ser debido principalmente a un aumento en la amplitud del pulso

de LH (Evans et al., 1992, 1994c). Posteriormente, la concentración sérica de LH y FSH permanece

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

15 17 19 21 23 25 27 29 31

Mean

FS

H (

ng

/ml)

Age (days)

4

5

6

7

8

9

15 17 19 21 23 25 27 29 31

Fo

llic

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ete

r (m

m)

Folli

cle

dia

met

er

mm

) M

ean

FSH

(n

g/m

l)

Memorias

27

baja; la frecuencia de los pulsos de LH aumenta durante los últimos 40 a 80 días previos a la

primera ovulación. La concentración sérica de FSH permanece relativamente estable en el periodo

previo a ovulación (Evans et al., 1994c). Por lo tanto, el aumento postnatal temprano en la

secreción de gonadotrofinas parecería conducir el aumento paralelo del número y tamaño de los

folículos ováricos antrales. En el periodo peripuberal, aumenta la frecuencia del pulso de LH que

causa el crecimiento de los folículos antrales más grande aumentando la producción de estradiol,

durante un período de 30 a 80 días previos a la primera ovulación.

Maduración Sexual

El aumento temprano en la secreción de gonadotrofinas puede reflejar una maduración postnatal

temprana del eje hipotalámico hipofisiario, seguido por el establecimiento de influencias

inhibitorias, que sostienen la secreción de gonadotrofinas inhibida hasta que se adquiere un

adecuado estado de crecimiento somático o de desarrollo. Ciertamente, altos niveles de nutrición

permiten un inicio más rápido de la maduración sexual, con un aumento prepuberal más temprano

de la frecuencia de pulsos de LH, el tamaño máximo del folículo más grande de la onda y de la

secreción de estrógeno. En terneras, el aumento temprano de la secreción de LH parece involucrar

un aumento en la amplitud del pulso de LH (Evans et al., 1992, 1994c). La regulación del feedback

negativo de la secreción de LH es establecido temprano en terneras y parecería no ser un factor

principal en la regulación en el aumento postnatal temprano en la secreción de LH. Una

disminución de la inhibición opioide de secreción de LH puede ser un factor causante del aumento

postnatal temprano en la secreción de LH (Evans et al., 1992). Una inhibición poderosa opioide

de la secreción de LH es restablecida después del aumento postnatal temprano en la secreción de

LH, y parece disminuir antes de la primera ovulación. La importancia funcional del aumento

temprano pasajero postnatal de la secreción de gonadotrofinas es confuso, aunque esto

seguramente estimula el desarrollo del pool de folículos antrales ováricos.

Durante mucho tiempo se sostuvo que una reducción en la supresión de la secreción de LH por el

estradiol sobre los últimos 40 a 50 días antes de la primera ovulación, permite un aumento de la

frecuencia de los pulsos de LH mediado por GnRH (Day et al., 1986, 1987). Esto por último

estimula el crecimiento de los folículos antrales ováricos y la producción de estradiol, hasta que

un folículo produzca suficiente estradiol para causar un pico preovulatorio de LH. La disminución

del feedback negativo del estradiol puede ser mediado por una disminución del número de

receptores de estradiol en el hipotálamo. Cuando la primera ovulación fue inducida por tratamiento

con progestágeno en Novillas, el número de receptores de estradiol en el hipotálamo disminuyó.

Los receptores de estradiol no están presentes en neuronas de GnRH. Por lo tanto, los efectos del

estradiol tienen que ser indirectos. Los opioides endógenos podrían mediar los efectos del estradiol

sobre la secreción de LH como un poderoso inhibidor de la secreción de LH en terneras antes de

la madurez, efecto que parece desaparecer antes de la primera ovulación. Además, la inhibición

prepuberal de la secreción de LH por opioides endógenos en terneras, parece involucrar una

supresión del sistema neuronal dopaminérgico estimulatorio (Honaramooz et al., 2000). Se

desarrolla también un sistema neuronal adrenérgico de tipo estimulatorio 20 semanas antes de

la primera ovulación. Esto puede tener un papel en la estimulación de la secreción de LH antes de

la primera ovulación, a medida que disminuyen los efectos del feedback negativo del estradiol y

de los opioides endógenos.

Memorias

28

En resumen, los cambios en la regulación de la secreción de LH por el feedback negativo del

estradiol parecen ser críticos para el aumento de la secreción de LH que conducen al crecimiento

de los folículos antrales ováricos y la producción de estrógenos antes de la primera ovulación en

Novillas. Sin embargo se están encontrando otros reguladores en Novillas y en otras especies, que

pueden estar involucrados en este proceso, probablemente mediando o influenciado los cambios

en el feedback negativo del estradiol sobre la secreción de LH

Efecto de la Nutrición

La nutrición de la ternera en el periodo prepuber va a influenciar el comienzo de la pubertad. El

objetivo de este trabajo fue comparar el inicio de la pubertad de terneras destetadas

precozmente con Rúter® (ACA; Asociación de Cooperativas Argentinas, San Nicolás, Argentina)

vs un grupo control destetadas tradicionalmente. Además, se evaluó el efecto del tipo de destete

sobre la tasa de preñez. Se utilizaron para este estudio 37 hembras puras de pedigree de la raza

Bonsmara que tenían en su ascendencia el mismo padre (Mandela, S.I. 2165). Se efectuaron 8

réplicas de trabajo, las cuales fueron bloqueados por edad de nacimiento. Se utilizó uno de dos

métodos de destete. Destete Rúter® (DR), en el cual las hembras fueron separadas de las madres

en el día 45 de vida para ser trasladados a un corral donde recibieron alimentación con Rúter® y

rollo de alfa ad libitum y de ahí en adelante alimentación con Balanceado Iniciador (ACA) con 18%

de proteína bruta. Luego a los 6 meses de edad pasaron a recibir un concentrado proteico

denominado Terminador (ACA) con 45% de proteína bruta y mezcla con maíz (80% maíz y 20%

concentrado, aproximadamente 3 kg/día divido en dos comidas diarias. En el grupo Destete

Tradicional (DT), las hembras permanecieron con las madres hasta los 6 meses de edad y en ese

momento fueron destetadas y pasaron a recibir alimentación similar a la del grupo DR. A los 45

días de vida y a partir de ese momento en adelante, todas las hembras fueron pesadas

rutinariamente una vez por mes hasta los 18 meses de edad. En ambos grupos a partir de los 10

meses de edad se empezaron a revisar por ultrasonografía (Mindray® DP30 Vet, Shenzhen, China)

y con una frecuencia de cada 15 días, luego una vez por semana desde los 13 meses de edad en

adelante hasta la ovulación que fue corroborada con la presencia de un CL 7 días después (Moran

et al., 1989). En ese momento todas las vaquillonas con un CL fueron sincronizadas para recibir

un primer servicio por inseminación artificial a tiempo fijo (IATF). Se efectuó un protocolo J-Synch

(de la Mata y Bó, 2012) en el cual recibieron en el Día 0 un dispositivo intravaginal de

progesterona (DIB 0,5 g, Zoetis) y 2 mg de benzoato de estradiol (Gonadiol, Zoetis). En el Día 6 se

retiraron los dispositivos y se aplicó 500 µg de prostaglandina (PGF2α, Rio de Janeiro). Luego, 72

h más tarde todas las vaquillonas fueron IATF y recibieron 100 µg de acetato de gonadorelina

(GnRH, Gonasyn gdr, Zoetis). Se realizó el diagnostico de preñez a los 25 Días de gestación y en

ese momento las vaquillonas vacías fueron resincronizadas con el mismo protocolo para recibir

el segundo servicio. Los datos fueron analizados mediante el procedimiento MLGM (InfoStat,

UNC). No se encontraron diferencias entre el diámetro del folículo a la pubertad, semanas a la

pubertad, ganancia diaria de peso, peso final y la tasa de preñez después de dos servicios (P≥0,18;

Tabla 1). Además, no se encontraron interacciones entre las variables estudiadas. Se concluyó

Memorias

29

que el uso del DR no afecta la llegada a la pubertad, ni la tasa de preñez de vaquillonas

comparadas con un grupo DT.

Tabla 1. Efecto del tipo de destete sobre la ganancia de peso diaria.

Grupo Peso

inicial

Peso

final

Ganancia

diaria

Semanas a

la

pubertad

Diámetro FD a

la pubertad

(mm)

Tasa de

Preñez

DR 62,6

±4,7

453

±10,4

0,88

±0,4

69,0

±0,1

12,0

±0,4

46,2%

(6/13)

DT 69,3

±4,1

461

±11,2

0,91

±0,4

65,3

±0,2

13,5

±0,4

50,0%

(12/24)

Los resultados no difieren significativamente, (P≥ 0,18).

Protocolos de IATF en Novillas

La inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) tuvo grandes avances en los últimos 20 años. La

compresión de la fisiología ovárica en vacas y Novillas (Bó et al., 2016) ha permitido la aplicación

con éxito en forma masiva de la técnica en numerosos rodeos en todo el mundo. Existen varias

ventajas en la implementación de la IATF y dentro de las más destacadas en Novillas se podrían

mencionar la inducción a la ciclicidad en animales prepúberes (estimulación hormonal), la mejora

genética de la progenie y, de capital importancia, la facilidad de partos evitando las distocias. En

general, los porcentajes de preñez alcanzados con la IATF se aproximan al 50 % en rodeos para

carne (Bó et al., 2013), siendo muchas veces variables estos resultados en la categoría vaquillona

debido a factores como: manejo, recría, nutrición y hormonas utilizadas en los distintos

tratamientos. A la hora de seleccionar los programas para sincronizar Novillas se pueden utilizar

prostaglandinas (PGF), progesterona y estradiol o análogos de la hormona liberadora de

gonadrotrofinas (GnRH) combinadas con PGF. Durante la última década se desarrollaron nuevas

generaciones de protocolos denominados “tratamientos cortos”, que han demostrado mejorar las

tasas de preñez. Estos se fundamentan en disminuir el período de inserción de dispositivos con

progesterona, reduciendo el período de dominancia del folículo y prolongado el proestro previo a

la ovulación (CO-Synch 5 d + CIDR; Bridges et al., 2008). Recientemente hemos desarrollado un

nuevo tratamiento corto que utiliza estradiol y progesterona para sincronizar la emergencia de onda

folicular y GnRH como inductor de ovulación, promoviendo un proestro prolongado (denominado

J-Synch; de la Mata y Bó, 2012).

Efecto de la prolongación del proestro sobre la fertilidad

Memorias

30

El protocolo más utilizado para vacas y Novillas en EEUU utiliza GnRH y un dispositivo con

progesterona por 7 días, con una tasa de preñez cercana al 50%. Bridges et al. (2008) compararon

un protocolo Co-Synch de 7 días con un dispositivo de progesterona con IATF a las 60 h y un

protocolo Co-Synch de 5 días con IATF a las 72 h en vacas de razas para carne. En este estudio,

las tasas de preñez fueron 10,5 puntos porcentuales superiores en las tratadas con Co-Synch de

5 días. En Novillas de razas de carne de 15 meses también demostró ser exitoso el tratamiento

Co-Synch 5 d con IATF a las 72 h cuando se comparó con otros dos protocolos (Perry et al., 2012)

alcanzando tasas de preñez por encima de 60%.En estudios recientes (Whitter et al., 2013) se

reportó que las vacas cruza Angus sincronizadas con el Co-Synch 5d + CIDR, tuvieron mayor

porcentaje de preñez que aquellas que recibieron un protocolo Co-Synch 7d + CIDR (58,1 % vs

55,1 %; P < 0,05).

En todos estos trabajos se justificó la mayor tasa de preñez en el hecho que estos protocolos se

caracterizan por un menor periodo de inserción del dispositivo y un proestro de mayor duración

(Bridges et al., 2008). En este caso se denominó proestro al período comprendido desde la

remoción del dispositivo y aplicación de la primera dosis de PGF hasta la inducción de la ovulación

con GnRH 72 h más tarde. En trabajos posteriores (Bridges et al., 2010) se observó que animales

tratados e inseminados con tratamientos de proestros prolongados tuvieron tasas de preñez

mayores que los animales tratados con tratamientos de proestros cortos. Además los niveles de

estradiol preovulatorios fueron mayores en proestros largos que en proestros cortos, aunque los

diámetros de los folículos preovulatorios no difirieron entre tratamientos (Bridges et al., 2010).

Las concentraciones plasmáticas de estradiol durante el proestro afectaron directamente sobre

el medio ambiente uterino y su habilidad para mantener la preñez y el desarrollo del concepto

los primeros días de gestación. Así se demostró que la mayor duración del proestro y la mayor

concentración plasmática de estradiol pre-ovulatorio generaron mayor expresión de genes que

codifican para receptores de estradiol y una mayor concentración de receptores de progesterona

a nivel uterino durante los primeros 15,5 días de desarrollo embrionario (Bridges et al., 2012).

Además, que las alteraciones de estas concentraciones de estradiol podrían afectar las funciones

uterinas durante los estadios de gestación tardía o en momentos iniciales de la gestación

(implantación y placentación) pudiendo perder la habilidad para mantener la preñez (Bridges et

al., 2013).

Tratamiento J-Synch

A partir de 2011, realizamos una serie de experimentos con el objetivo de desarrollar un nuevo

tratamiento usando EB y P4 para sincronizar el inicio de una nueva onda folicular con un período

reducido de inserción de dispositivo con progesterona de 6 días (en lugar de 7 u 8 días), y

administrando GnRH como inductor de ovulación a las 72 h (Día 9) desde la remoción del

dispositivo junto con la IATF, promoviendo un proestro prolongando. Este tratamiento fue

denominado J-Synch (de la Mata y Bó, 2012). Se comparó la eficiencia en la sincronización de la

ovulación con el tratamiento convencional y las Novillas pertenecientes al grupo J-Synch tuvieron

Memorias

31

un horario medio de ovulación de 93,7 ± 12,94 h que fue mayor (P<0,0001) al del grupo

Convencional, con una media de 65,0±13,67 h (de la Mata et al., 2015b). Esta diferencia fue de

28,7 h entre tratamientos pero no se vio reflejada en el diámetro del folículo ovulatorio que no

varió entre grupos (J-Synch: 13.0±1,0 mm vs Convencional: 12,8±0,95 mm). Sin embargo la tasa

de crecimiento folicular fue superior en las Novillas del grupo J-Synch (1,3±0,4 mm/día, P=0,05)

que en las grupo Convencional (1,0±0,4 mm/día). Al analizar el desarrollo luteal la media de

volumen luteal calculada durante los Días 4 a 12 fue mayor (P=0,04) en el grupo J-Synch

(398,7±10,0 mm3) en comparación al grupo Convencional (357,3±10,0 mm3) y los niveles de P4

en sangre también fueron mayores (P=0,03) en el grupo J-Synch que en el Convencional.

Tasas de preñez con los tratamientos J-Synch vs los Convencionales

Como se mencionó anteriormente, los tratamientos con estradiol y dispositivos con

progesterona por 7 días (Convencionales) son los más utilizados en la actualidad en Sudamérica

con los que se alcanzan tasas de preñez aceptables (Bó et al., 2013). En experimentos de dinámica

mostrados anteriormente observamos que el proestro inducido en Novillas tratadas con el

protocolo J-Synch tuvo una duración promedio entre 95 y 97 h. Entonces, se formuló una

hipótesis, que la prolongación del proestro aumenta las tasas de preñez con respecto a

tratamientos convencionales que generan un proestro de menor duración. Para esto se hicieron

varios experimentos con el objetivo de comparar las tasas de preñez logradas entre Novillas

tratadas con un protocolo J-Synch en comparación protocolos convencionales (de la Mata et al.,

2015b). En el primer Experimento se utilizaron Novillas cíclicas Angus y Angus x Hereford de 18

a 24 meses de edad, con una condición corporal de 4 a 6 (escala 1 al 9), y los animales fueron

divididos en dos grupos para recibir uno de dos tratamientos de IATF. El grupo J-Synch, recibió

en el Día 0, 2 mg de EB por vía IM), junto con un DIB 0,5 g (Zoetis). En el Día 6 se retiraron los

DIB de todas las Novillas y se administró PGF por vía im. El Día 9 (72 h pos remoción del DIB) las

Novillas fueron IATF junto con la administración de GnRH. A los animales del grupo Convencional,

en el Día 0, se les aplicó 2 mg de EB junto con un DIB 0,5 g. El Día 7 se removieron los DIB y se

administró PGF por vía IM y 0,5 mg de ECP. El Día 9, entre 52 a 54 h pos remoción del DIB, los

animales fueron IATF. El diagnóstico de gestación se realizó entre los 61 y 90 días desde la IATF,

mediante ultrasonografía (Chison 600 Vet, lineal – 5MHz) y palpación rectal. Todos los datos

fueron analizados con regresión logística mediante el software Infostat. Durante los meses

invernales en los que se llevaron a cabo estas réplicas, tanto en el año 2011 como en 2013 se

registraron bajas precipitaciones, lo cual afectó fuertemente la calidad forrajera y por ende un

estrés nutricional general de las Novillas. Al considerar los resultados por tratamiento de ambas

réplicas, la tasa de preñez total fue mayor para las Novillas del grupo Convencional (49,3%;

138/280) que las del grupo J-Synch (37,8%; 104/275; P<0,01). Creemos que el protocolo

implementado para inducir un proestro prolongado (J-Synch) afectó en forma negativa la tasa de

preñez en condiciones de invierno y esto puede atribuirse a un menor tiempo de inserción del

dispositivo con progesterona en las Novillas que recibieron J-Synch, que luego de la IATF tuvieron

baja CC, generando folículos de pequeño tamaño. Esto puede haber comprometido la fertilidad

Memorias

32

y/o la ovulación subsiguiente. En Novillas, la probabilidades de obtener una exitosa tasa de

preñez a la IATF se logra con un rango de diámetro ovulatorio entre 10,8 y 15,6 mm (Perry et al.,

2007), por lo que estas Novillas probablemente no hayan alcanzado un diámetro folicular

adecuado. Por otro lado, las Novillas del grupo Convencional alcanzaron tasas de preñez

estándares, lo que nos hace pensar que la administración exógena de CPE puede haber

compensado la falta de estradiol endógeno producido por los folículos preovualtorios. Jinks et

al., (2012), reportó que la suplementación con CPE durante el periodo preovulatorio incrementó

los porcentajes de preñez en vacas inducidas a ovular folículos pequeños. Esto podría explicar en

parte el efecto negativo de un proestro prolongado en Novillas con balance energético negativo

y disminución de peso corporal.

En el segundo Experimento se utilizaron Novillas cíclicas Angus y Hereford de 15, 18 y 24 meses

de edad, con una condición corporal de 6 a 8 (escala 1 a 9), y los animales fueron divididos para

recibir los mismos tratamientos que en el Experimento 1 (de la Mata et al., 2015b). En este caso

las Novillas fueron sincronizadas en la Primavera con buena disponibilidad de pasto y en un plano

de aumento de peso. En este caso la preñez general fue numéricamente mayor en el grupo J-

Synch (59,7%; 175/293) que en el convencional (53,1%; 154/290; P=0,12). Sin embargo en el

Experimento 3, realizado en Anguil La Pampa (de la Mata et al., 2015a), la tasa de preñez fue

mayor (P<0,01) en las Novillas tratadas con el protocolo J-Synch (67,9%; 70/103) que las del grupo

Convencional (46,6%; 49/105). En este caso se pintó la base de la cola con pintura (Paintstick, LA-

CO industries, INC, EEUU) como método de detección visual de celo (línea de aproximadamente

25 cm). En el grupo Convencional, las Novillas fueron observadas para determinar manifestación

de celo a las 36 h de removidos los DIB, para ser inseminadas 12 h más tarde (48 h), mientras que

las que manifestaron celo después de las 36 h y/o no manifestaron celo, fueron IATF el Día 9 (54

h post retiro de dispositivo). Las Novillas del grupo J-Synch fueron observadas para determinar

manifestación de celo a las 48 h de removidos los DIB, para ser inseminados 12 h más tarde (60

h) junto con la aplicación de GnRH, mientras que las que manifestaron celo luego de las 60 h y/o

no lo hicieron fueron IATF entre 72 y 74 h post retiro de dispositivo (Día 9) junto con la

administración GnRH. La tasa de detección de celos fue del 30% y no difirió entre los grupos. Sin

embargo, la tasa de preñez de las Novillas inseminadas a celo detectado fue mayor en las Novillas

del grupo J-Synch (80%, 32/40) que en las del Convencional (50%, 15/30; P<0,1) que repercutio

en la tasa de preñez acumulada como se indicó anteriormente. Considerando estos dos

experimentos realizados en primavera, podemos observar que las tasas de preñez logradas

fueron 60,6 % (157/259) para el tratamiento J-Synch y 47,9% para el tratamiento Convencional,

existiendo una diferencia significativa a favor del primer tratamiento (P<0,01). Estos datos

demuestran que en condiciones favorables de CC, nutrición y plano de aumento de peso, como

las que se presentaron en la primavera el protocolo J-Synch resulta en mayores tasas de preñez

que el convencional. A fin de confirmar estos resultados se realizó un ensayo de campo, con la

participación de dos experimentos en Uruguay con 4.947 Novillas Angus x Hereford mestizas (Bó

et al., 2016). Un objetivo secundario fue determinar los efectos del momento de la IATF y la

Memorias

33

adición de eCG al momento de retirar el dispositivo con progesterona sobre las tasas de preñez.

En el Experimento 1, todas las Novillas recibieron un dispositivo con progesterona de 0,5 g más

2 mg de EB en el Día 0. Las Novillas en el grupo de tratamiento convencional recibieron PGF y CPE

y se retiraron los dispositivos en el Día 7 PM. Las Novillas se subdividieron para ser IATF en el día

9 AM o PM (es decir, 48 o 56 h después de retirado el DIB). Las Novillas en el grupo de tratamiento

J-Synch recibieron PGF y el DIB fue retirado el Día 6 PM y recibieron GnRH y fueron IATF en el Día

9 AM o PM (es decir, 60 o 72 horas después de retirado el DIB). Todas las Novillas en este

experimento también fueron tratadas con 300 UI de eCG (Novormón 5000, Syntex S.A.) al retiro

del DIB. En el Experimento 2, todas las Novillas fueron tratadas con el protocolo J-Synch como se

describe en el Experimento 1, pero a la remoción del dispositivo (Día 6 PM), las Novillas fueron

divididos para recibir 300 UI de eCG o ningún tratamiento eCG en ese momento, y fueron

subdivididas además, para recibir GnRH e IATF en el Día 9 AM o PM (es decir, 60 o 72 horas

después de retirado el DIB). La tasa de preñez fue mayor (P<0,05) en Novillas tratadas con el

protocolo J-Synch (56,1%ñ 613-1125 vs 50,7%; 620/1224; P<0,01). Sin embargo, la eliminación

de eCG del protocolo J-Synch en el Experimento 2 resultó en una reducción de la tasa de (eCG:

57,1%; 739/1295 vs No eCG: 53,1%; 692/1303; P<0,05). En resumen, la adición de eCG mejora

las tasas de preñez a la IATF y se confirmó una mayor tasa de preñez en las Novillas tratadas con

el protocolo J-Synch que en el Convencional.

Se realizó luego otro trabajo con el objetivo de evaluar las tasas de preñez en vacas y Novillas

cruza cebú sincronizadas con el protocolo J-Synch y evaluar además el efecto de la presentación

de celos al momento de la IATF sobre las tasas de preñez (Vera Cedeño, 2016 sin publicar). Este

trabajo se realizó en la Estancia El Mangrullo, localizada en Lavalle, Provincia de Santiago del

Estero. Se utilizaron 253 animales cruza cebú por Bonsmara y Bonsmara puras, que fueron

bloqueadas por categoría (vacas secas cruza Bonsmara, vacas secas Bonsmara puras y Novillas

cruza Bonsmara). Los animales fueron examinados en el Día 0 por ultrasonografía (Mindray DP30

Vet, 7.5 MHz, China) y recibieron la aplicación de dispositivos intravaginales con progesterona

(P4, Synkro xy 0,5 g, Proagro S.A., Argentina) y 2 ml de estradiol benzoato (EB; Benzoato de

Estradiol, 2 mg, Synkro xy, Proagro S.A.). Luego de 6 días se procedió a retirar los dispositivos

con P4 y se realizó la aplicación de 2 ml de PGF (D+Cloprostenol 75.0 µg/ml, Synkro xy, Proagro

S.A.). En ese momento todos los animales fueron pintados (10 a 15 cm de largo por 5 cm de

ancho) sobre la zona sacro coxígea (CeloTest, Biotay S.A., Argentina). Los animales despintados

diagnosticado mediante la observación de la pérdida de la pintura (pp) correspondiente ≥ 30%

(en celo) recibieron 2.5 ml de GnRH (Acetato de Buserelina, 4 µg/ml, Synkro xy, Proagro S.A) y

fueron IATF entre las 62 y 67 h (primera IATF) y los animales que no mostraron celo recibieron la

misma dosis de GnRH y la IATF entre las 69 y 72 h (segunda IATF).

Las Novillas fueron además subdivididas de forma aleatoria, donde la mitad de ellas recibieron

1,5 ml de Gonadotrofina Coriónica Equina (eCG; 200 UI/ml, Novormon 5000, Syntex S.A.,

Argentina).

Memorias

34

La tasa de preñez alcanzada en este experimento fue del 62.4% Los resultados analizados

demuestran que se encontraron diferencias significativas entre los animales que estaban

despintados (en celo) a las 60 h en comparación con los que no mostraron celo en ese momento

(P<0.04; Tabla 2). También se encontró diferencias significativas cuando se analizó la utilización

de la eCG en la categoría Novillas (P<0,05, Tabla 3). Cuando se comparó la tasa de preñez entre

los animales que estaban pintados a las 60 h y que se despintaron antes de la segunda IATF

realizada entre las 68 y 72h, las diferencias fueron solo numéricas (no significativas) en

comparación con las vacas que nunca se despintaron (sin celo) durante todo el experimento

(Tabla 4). Por último no hubo un efecto significativo de estructura ovárica en el Día 0, condición

corporal, inseminador y toro sobre las tasas de preñez (P>0,07). No se encontraron interacciones

entre las variables estudiadas. A continuación se muestran las tablas de los resultados.

Tabla 2. Efecto de presentación del celo AM diagnosticada por la pérdida de pintura sobre la taza

de preñez.

ab

Porcentajes con superíndice distintos difieren significativamente (P<0,04).

Tabla 3. Efecto de la adición de adición de la eCG en Novillas sobre la tasa de preñez.

Categoría N Preñadas Porcentaje

Despintadas 169 113 67 %a

Pintadas 84 45 53 %b

Tratamiento n Preñadas Porcentaje

Con eCG 39 26

66%a

Memorias

35

ab

Porcentajes con superíndice distintos difieren significativamente (P<0,05).

Tabla 4. Efecto de la presentación del celo a la segunda IATF realizada entre las 68 y 72 h sobre

la tasa de preñez

ab

Porcentajes con superíndice distintos difieren significativamente (P>0,05).

Con respecto a la presentación de celos, las vacas que mostraron celo a la primera IATF

comparándolas con las que no mostraron celo en ese momento las diferencias fueron

estadísticamente significativas, lo que indica que el horario de la inseminación está íntimamente

correlacionado con el celo de los animales, pero cuando se tuvo en cuenta a los animales que no

mostraron celo a la primera IATF y que si mostraron celo a la segunda IATF las diferencias con las

que no mostraron celo durante todo el tratamiento fueron solo numéricas en este trabajo. Por

último, los resultados también confirman lo reportado anteriormente que la adición de eCG

aumenta las tasas de preñez en Novillas cruza que son IATF.

Sin eCG 45 21 46%b

Categoría N Preñadas Porcentaje

Pintadas y con celo

PM

39 24 62%

Pintadas y sin celo

PM

45 21 47%

Memorias

36

Consideraciones finales

En terneras hay una estimulación posnatal inicial del crecimiento de folículos antrales ováricos

debido a un aumento de gonadotrofinas. La regulación y razón de esto es confusa y puede

simplemente reflejar una maduración inicial del eje hipotálamo-gonadal-pituitario ya que

después de este momento ha sido demostrado que todas las facetas del eje son capaces de

funcionar. Esta actividad endocrina inicial parece ser posteriormente sostenida por una supresión

por feedback negativo hasta que las Novillas tengan un tamaño corporal suficiente o tengan una

madurez metabólica para reproducirse con éxito. Aunque las hormonas de la nutrición y

metabólicas como la hormona de crecimiento marcadamente afectan la tasa de la maduración

sexual en las Novillas, los mecanismos de unión entre nutrición, crecimiento y desarrollo son

confusos. La primera ovulación es precedida, probablemente durante un período de 40 a 80 días,

por sensibilidad disminuida de la secreción de LH a la supresión por feedback negativo,

permitiendo un aumento de la secreción de LH (aumento de la frecuencia pulsátil de LH) y un

aumento de los folículos antrales y de la secreción de estrógeno. Un aumento de la secreción de

estrógeno eventualmente causa un pico preovulatorio LH y la primera ovulación. El estrógeno

parece ser el principal agente del feedback negativo sobre la secreción de LH, indirectamente por

otros sistemas neuronales. Sin embargo, la supresión inicial del aumento postnatal temprano de

la secreción de LH puede no implicar al estradiol, pero sí un mecanismo opioide dependiente del

estrógeno.

Con respecto a los protocolos de IATF, el tratamiento J-Synch demostró ser eficiente para la

sincronización y ovulación en Novillas para carne. Este protocolo también fue utilizado con éxito

en Novillas de raza lechera con datos similares a los que se describieron en esta presentación

(Ré et al. 2014) y recientemente se reportó su utilización en vacas receptoras de embriones

reportándose resultados de preñez de más de 60 % (de la Mata et al. 2013) y mayores tasas de

preñez con embriones producidos in vitro que con el tratamiento Convencional (Menchaca et al.,

2016).

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Memorias

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Memorias

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Memorias

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ENFERMEDADES VENÉREAS: NUEVOS DESARROLLOS EN TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO EN TOROS.

A. García Guerra1

1 Department of Animal Sciences, The Ohio State University, 2027 Coffey Rd,

Columbus, OH, 43210, USA. garciaguerra.1@osu.edu

INTRODUCCIÓN Uno de los factores más importantes que impacta en la producción ganadera y lechera es la reproducción (Wiltbank et al. 1961; Stevenson 2005). Específicamente, fallas en la concepción y las pérdidas embrionarias tempranas han sido identificadas como la causa primaria de reducción en los porcentajes de terneros destetados y la mayor causa de pérdidas reproductivas en ganado lechero (Wiltbank et al. 1961; Santos et al. 2004). Las causas infecciosas de infertilidad, muerte embrionaria y fetal son un motivo significativo de disminución en la performance reproductiva en el ganado. (BonDurant 2005).

La lista de causas infecciosas que producen mortalidad embrionaria y fetal en el ganado vacuno es extensa e incluye bacterias, hongos, virus y protozoarios (Givens and Marley 2008). En el ganado bovino han sido descriptos numerosos agentes infecciosos de transmisión venérea (BonDurant 2005; Givens and Marley 2008). Sin embargo, solo en dos de las enfermedades reproductivas la transmisión venérea es casi exclusivamente el único medio de transmisión y los agentes causantes son parásitos obligados del tracto reproductivo. Estas enfermedades se denominan Tricomoniasis Bovina (TB) y Campilobacteriosis Genital Bovina (CGB).

La Tricomoniasis bovina es causada por Tritrichomonas foetus mientras que la Campilobacteriosis es causada por Campylobacter fetus subsp. venerealis (Cfv). Ambas enfermedades se caracterizan por causar infertilidad en la hembra (Bartlett 1947; Plastridge et al. 1964), perdidas embrionarias y fetales tempranas (Parsonson et al. 1976), bajas tasas de preñez (Stewart et al. 1998; Waldner et al. 2013) y abortos (Clark et al. 1986). En contraste, los toros no muestran signos clínicos y son considerados portadores asintomáticos (Samuelson and Winter 1966; Dennett et al. 1974). Las enfermedades de transmisión venérea son transmitidas durante el servicio y por ello han generado gran preocupación en sistemas de producción extensiva que utilizan servicio natural (Dennett et al. 1974). La menor incidencia en ganado manejado en forma intensiva ha sido atribuida al uso de inseminación artificial (IA) (Yang et al. 2012), bajo estrictos controles en la extracción y congelado de semen por centros acreditados (CSS 2011).

Importantes pérdidas económicas han sido atribuidas a Tricomoniasis en ganado de carne (Speer and White 1991) y lechero (Goodger and Skirrow 1986). Un modelo de simulación desarrollado por Rae y colaboradores (Rae 1989), demostró que dependiendo de la prevalencia en los toros y con una reducción en la producción de

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terneros del 14 al 50%, retorno económico por vaca servida se reducía del 4 al 10%, respectivamente. Sin embargo, las pérdidas económicas pueden ser mayores cuando se incluyen el costo que conlleva el descarte de vacas y toros y los costos de testeos y vacunación. De forma similar fue estimado que el 4% de las vacas en los Estados Unidos no se preñaron a causa de CGB y las pérdidas económicas asociadas fueron de $167 millones (Skirrow 1994). Datos recientes de un brote de CGB en un rodeo de Saskatchewan, Canadá, indicaron que los porcentajes de preñez pueden verse reducidos entre un 16 a un 62% cuando toros infectados con Cfv son usados (Waldner et al. 2013).

La presente revisión no pretende abarcar todos los aspectos de las dos principales enfermedades venéreas en bovinos. Existen muchas publicaciones que abarcan los aspectos más importantes de la enfermedad y su diagnóstico tanto en machos como en hembras (BonDurant 1997; BonDurant 2005; Mshelia et al. 2007). El objetivo principal es resumir la epidemiologia de las enfermedades venéreas, y más importante, destacar y analizar los diferentes métodos diagnósticos disponibles para la detección de TB y CGB en el toro.

EPIDEMIOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES VENÉREAS EN EL BOVINO

Prevalencia

La Tricomoniasis Bovina y la Campilobacteriosis Genital Bovina están mundialmente distribuidas. A pesar de que el uso de IA ha disminuido la incidencia de estas dos enfermedades, específicamente en el ganado lechero, continúan siendo un problema importante a nivel mundial en rodeos de carne manejados en sistemas extensivos. La prevalencia individual de TB en toros en distintos países está representada en la Tabla 1. La prevalencia individual es usualmente menor al 5% exceptuando unos pocos estudios. La prevalencia de rodeos se estima entre el 0,76 y el 44,1% (Dennett et al. 1974; Griffiths et al. 1984; Bondurant et al. 1990; Yao et al. 2011; Mendoza-Ibarra et al. 2012) y la prevalencia dentro de un rodeo varía entre el 4 y el 83% (Dennett et al. 1974; Bondurant et al. 1990; Perez et al. 1992). La prevalencia dentro de un rodeo se ha usado como una medida de la propagación de la enfermedad entre toros en rodeos infectados. Sin embargo, una de las mayores limitaciones en esta estimación es la falta de consideración al tamaño del rodeo, el número y cantidad de animales en servicio, y la proporción de toros por vaca utilizada. Por otra parte, la prevalencia no excede usualmente el 50%, probablemente debido a la alta proporción de toros jóvenes en la población de toros en los rodeos (Rae et al. 1999).

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Tabla 1. Prevalencia individual de Tricomoniasis bovina en toros de diferentes áreas geográficas.

País N Test Prevalencia Fuente† Publicación

Argentina 5313 cultivo 1,3% Monitoreo (Fort et al. 2004)

Canadá 735 cultivo <0,001% Monitoreo (Waldner et al. 2017)

Colombia 146 cultivo 13,7% Monitoreo (Griffiths et al. 1984)

Costa Rica 378 cultivo 5,3% Monitoreo (Perez et al. 1992)

Namibia 1201 PCR 3,7% Laboratorios (Madoroba et al. 2011)

S. África 1999 PCR 4,5% Laboratorios (Madoroba et al. 2011)

España 103 cultivo/PCR 32% Monitoreo (Mendoza-Ibarra et al. 2012)

USA 2909 cultivo 0,17% Matadero (Grotelueschen et al. 1994)

USA 1975 cultivo 6,0% Encuesta Rae et al., 2004 (Rae et al. 2004)

USA 31202 qPCR 3,7%

Programa de

control (Szonyi et al. 2012)

USA 347 cultivo/PCR 0,27% Laboratorios (Rodning et al. 2008)

USA 8222 cultivo/PCR 0,21%

Programa de

control (Yao et al. 2011)

†Programa de control (se refiere a estimaciones obtenidas de controles forzados por el gobierno de toros reproductores); Matadero (se refiere a muestras recolectadas de toros enviados a faena); Laboratorios (se refiere a estimados obtenidos de laboratorios diagnósticos de muestras recibidas en un periodo definido de tiempo); Monitoreo (basado en muestreos aleatorios o convenientes de una población de toros de diferentes rodeos); Encuesta (basado en un muestreo aleatorio estratificado de rodeos en un área geográfica definida).

La estimación reportada de prevalencia individual de CGB en toros, medida en diferentes áreas geográficas está representada en la Tabla 2. La prevalencia de rodeos ha sido reportada oscila entre el 9% y el 89% (Griffiths et al. 1984; McCool et al. 1988; Bawa et al. 1991; Pellegrin et al. 2002). A pesar de que la prevalencia de rodeos reportada ha sido relativamente alta, se debe considerar que los valores estimados reportados están basados en rodeos con antecedentes de bajo rendimiento reproductivo. En Australia, la prevalencia dentro del rodeo fue estimada en 15%, con una variación entre el 3,7% y el 48% (McCool et al. 1988).

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Tabla 2. Prevalencia individual de Campilobacteriosis Genital Bovina en toros de distintas áreas geográficas.

† Matadero (se refiere a muestras recolectadas de toros enviados a faena); Laboratorios (se refiere a estimados obtenidos de laboratorios diagnósticos de muestras recibidas en un periodo definido de tiempo); Monitoreo (basado en muestreos aleatorios o convenientes de una población de toros de diferentes rodeos).

Factores de riesgo

El aumento de la prevalencia de T. foetus en toros adultos ha sido reportada en numerosas publicaciones (Skirrow et al. 1985; Bondurant et al. 1990; Rae et al. 1999; Rae et al. 2004). Toros mayores de 3 años tienen 3.5 a 17 veces más probabilidades de ser portadores de T. foetus que toros menores de 3 años (Perez et al. 1992; Mendoza-Ibarra et al. 2012). Sin embargo, es importante remarcar que toros jóvenes de 1 a 2 años pueden convertirse en portadores y esto debe ser considerado cuando se implementan programas de control (Clark et al. 1974; Kimsey et al. 1980). Por otro lado, la relación entre edad y riesgo de infección con CGB es menos clara. La compra de nuevos toros fue asociada con una disminución del riesgo de infección con CGB del 35%. No está claro si esta asociación se debe a la introducción de toros jóvenes vírgenes o es un reflejo de mejores prácticas de manejo en esos rodeos (Jimenez et al. 2011). Toros de tan solo 20 meses de edad han sido infectados exitosamente con Cfv (Dufty et al. 1975). En toros jóvenes expuestos a Cfv a los 20, 34, 47 o más de 66 meses, se logró establecer el estado de portador en un 60%, 83%, 83% y 100% de los mismos, respectivamente (Dufty et al. 1975; Bier et al. 1977).

El uso de pasturas comunitarias se ha asociado con un aumento en el riesgo de enfermedad y si no se toman medidas preventivas puede significar una disminución en las tasas de preñez (Waldner and Garcia Guerra 2013). El uso de pasturas comunitarias se ha asociado a infección con T. foetus (OR=2.3 a 5.4) (Gay et al. 1996; Mardones et al. 2008). De forma similar, un estudio realizado en Argentina observo que el movimiento de toros entre rodeos vecinos duplica la posibilidad de detectar Cfv (Jimenez et al. 2011).

COLECCIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

Country N Test Subespecie Prevalencia Fuente† Publicación

Argentina 6763 IF No 0,9% Monitoreo (Fort et al. 2004)

Australia 504 cultivo Cfv 4% Matadero (Turnbull 1977)

Brasil 327 IF No 52,3% Monitoreo (Pellegrin et al. 2002)

Canadá 735 qPCR parA Cfv 1,1% Monitoreo (Waldner et al. 2017)

Canadá 529 Elisa/cultivo Cff 3,4%

Centro de

IA (Devenish 2005)

Colombia 146 cultivo Cfv 15% Monitoreo (Griffiths et al. 1984)

Namibia 1201

PCR

16SrRNA No 2,08% Laboratorios

(Madoroba et al.

2011)

S. África 1912

PCR

16SrRNA No 1,78% Laboratorios

(Madoroba et al.

2011)

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Recolección de muestras

Los métodos de recolección de muestras en toros tienen como objetivo obtener material prepucial o esmegma. Los tres métodos principales que se han utilizado para colectar muestras son: el método de aspiración, el lavaje prepucial y el raspador metálico o plástico. Una de las mayores desventajas del método de lavaje prepucial es que es más laborioso, y aunque modificaciones posteriores apuntaban a simplificar el procedimiento de recolección todavía requieren el uso de centrifugación luego de colectada la muestra. El uso tanto del método de aspiración como el de lavaje prepucial no presentan diferencias en cuanto a la sensibilidad cuando se utilizó el cultivo o la detección por PCR para T. foetus (Schonmann et al. 1994; Irons et al. 2002; Mukhufhi et al. 2003). De forma similar, en otro estudio el uso del raspador metálico y el método de aspiración resultaron en una sensibilidad después del cultivo del 91.6% y 93.3% respectivamente (Parker et al. 1999). Asimismo, el uso del raspador plástico y el método de aspiración resultaron en una alta concordancia cuando el cultivo o PCR fueron usados como método de detección (k≥0.88) (Mendoza-Ibarra et al. 2012).

Por otro lado, el método de aspiración ha resultado en una mejor recuperación de Cfv y en menor contaminación del medio de cultivo que el método de lavaje prepucial (Tedesco et al. 1977). Contrariamente, el uso del raspador plástico resulto mejor que el método de aspiración para el diagnóstico de Cfv por PCR en tiempo real (McMillen et al. 2006) o cultivo (Tedesco et al. 1977). Dado que tanto el uso del raspador de metal como el método de lavaje son muy laboriosos, el método de aspiración con pipeta parece ser un método más simple y rápido (Clark et al. 1971; Irons et al. 2002). Aunque la técnica del raspador de metal pareciera presentar algunos beneficios para la recuperación de Cfv, el hecho de necesitar esterilizarlo después de cada uso ha generado poca popularidad. Sin embargo, más recientemente una versión plástica y desechable de este dispositivo ha salido al mercado transformándolo en una excelente alternativa al método de aspiración.

Transporte de las muestras

Usualmente las muestras prepuciales son obtenidas a campo y el transporte al laboratorio puede demorarse en condiciones desfavorables. Ambos, Cfv y T. foetus son sensibles a los cambios de temperatura y las condiciones en América del Norte varían desde altas temperaturas en el verano a temperaturas extremadamente bajas en el invierno (Bryan et al. 1999; Davidson et al. 2011). En consecuencia, el transporte en condiciones inapropiadas puede resultar en una proporción importante de falsos negativos (Riley et al. 1995; Monke et al. 2002). Además, las muestras prepuciales son inherentemente complejas debido a la microflora normal, sumado esto a la posible contaminación por heces o por otras fuentes. Es por ello por lo que el control de contaminación de las muestras es un paso esencial en el diagnóstico de las enfermedades venéreas, especialmente cuando se requiere la presencia de organismos viables como en el diagnostico por cultivo e identificación.

Tritrichomonas foetus

Memorias

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Un gran número de medios de transporte han sido descriptos y la eficacia para mantener organismos viables varía entre 24 y 96 horas. El transporte a altas temperaturas (22-37°C) requiere la presencia en el medio de productos de origen animal (leche o suero) y antibióticos (Reece et al. 1983). Por otro lado, el congelamiento de las muestras debe ser evitado durante el transporte porque la viabilidad disminuye drásticamente y no es posible detectar organismos después de las 3 horas (Bryan et al. 1999). A pesar de la cantidad de medios de transporte disponibles, es importante tener en cuenta que el transporte de las muestras en medios no nutritivos disminuye la sensibilidad en un 14% (Skirrow et al. 1985). Desde la aparición del InPouch™ FT® kit para cultivo, este se ha convertido en el método de elección para el transporte de muestras porque también sirve como medio de cultivo. Se ha comprobado que temperaturas superiores a los 42°C por menos de 24 horas producen un efecto perjudicial para la supervivencia de T. foetus. Sin embargo, el uso de PCR en tiempo real permite la detección de animales portadores (Clavijo et al. 2011; Davidson et al. 2011). El rango óptimo para mantener la viabilidad de T. foetus parece comprender temperaturas entre los 20 y los 37°C y si bien la refrigeración a 4°C puede ser practicada debería mantenerse a un mínimo (Bryan et al. 1999; Clavijo et al. 2011).

Campylobacter fetus subsp. venerealis

El uso de medios de transporte para recuperar Cfv es esencial cuando el tiempo de traslado excede las 6 a 8 horas y cuando el cultivo será usado como el método de diagnóstico (Clark et al. 1972). La baja supervivencia del organismo ha sido identificada como uno de los mayores problemas para el diagnóstico de CGB (Monke et al. 2002). De los numerosos medios de transporte enriquecidos que se han desarrollado, solo dos mostraron un desempeño superior y han sido ampliamente aceptados (Monke et al. 2002).

El medio de transporte enriquecido y modificado Weybridge (mWTEM) (Lander 1990) es inoculado con la muestra e incubado a 37°C por 3 días antes de cultivarlo en el medio de cultivo. Sin embargo el tiempo transcurrido entre la inoculación y la incubación debe ser reducido para evitar perdida de viabilidad de los organismos (Lander 1990). Otro tipo de medio de transporte que es conocido como el TEM australiano, fue desarrollado por Clark y colaboradores. (Clark and Dufty 1978). La mayor desventaja de este medio es que el aire en el tubo debe ser remplazado para conseguir un ambiente microaerófilo. El TEM australiano debe ser transportado a una temperatura de entre 18 y 37°C por no más de 2 días y posteriormente incubado a 37°C por 4 días. Un estudio comparando el TEM Australiano y el mWTEM demostró que este último era significativamente más eficiente, con proporciones de aislación de organismos del 25% y 75% respectivamente y un mejor control en la contaminación (Hum et al. 1994). El uso de medios de transporte es engorroso y aumenta los costos del diagnóstico. Sin embargo, un estudio reciente demostró que el cultivo directo es significativamente más sensible que el cultivo luego de la incubación en mWTEM por 24 horas, siempre y cuando el intervalo entre la colección de la muestra y su cultivo fuera de menos de 6 h (Chaban et al. 2013).

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DIAGNOSTICO

Tricomoniasis

La identificación de T. foetus se hace basada en la morfología característica y el movimiento observado al microscopio (Kimsey et al. 1980). Se ha reportado que la sensibilidad de la observación directa de secreciones prepuciales es del 68 al 90% (Bartlett et al. 1947; Hammond et al. 1950). Sin embargo, la observación directa es efectiva y practica cuando son pocos los toros por examinar y el laboratorio se encuentra a poca distancia (Kimsey et al. 1980). Por ello los métodos diagnósticos basados en cultivo de las muestras son más efectivos que la examinación directa de las muestras prepuciales (Tedesco et al. 1979). Independientemente del medio de cultivo usado, T. foetus se incuba a 37°C hasta 10 días realizando observaciones periódicas al microscopio (Clark et al. 1971; Campero et al. 2003; Parker et al. 2003). La sensibilidad del cultivo y posterior observación en muestras provenientes de toros, se ha estimado entre 73 y el 97% (Clark et al. 1971; Schonmann et al. 1994; BonDurant 1997; Parker et al. 2003).

En 1990 se introdujo el sistema InPouch™TF® (Thomas et al. 1990), y en la actualidad es uno de los sistemas más utilizados en Norteamérica. Está compuesto por una bolsa de plástico flexible subdividida en 2 compartimentos o cámaras, que contiene 4 ml de un medio patentado. La muestra es inoculada en la cámara superior, el líquido es forzado hacia la cámara inferior e incubado en posición vertical para lograr la concentración de los organismos en el fondo. Por medio de un visor plástico reutilizable se realiza la observación microscópica directamente en la bolsa. Esta metodología posee numerosas ventajas: pequeñas cantidades de inoculo son necesarias para obtener resultados positivos, relativamente rápida, detección temprana, se usa tanto como medio de cultivo como de transporte, menos susceptible a roturas o derrames, puede almacenarse a temperatura ambiente por un año, y evita la contaminación al no haber necesidad de abrir las bolsas para la observación (Thomas et al. 1990; Parker et al. 2003).

Junto con el InPouch™TF®, el medio de Diamond’s son los medios más utilizados. Aunque algunos estudios no mostraron diferencia en la sensibilidad comparando ambos medios (Thomas et al. 1990; Appell et al. 1993; Schonmann et al. 1994) otros han probado una mayor sensibilidad con el uso del InPouch™TF® (Parker et al. 2003). Por otra parte, muestras inoculadas en el InPouch™TF® son detectadas más rápido (36 a 72 horas) y el control de contaminación es más eficiente (Thomas et al. 1990; Perez et al. 1992; Mendoza-Ibarra et al. 2012). Uno de las mayores desventajas del método de cultivo y visualización directa es la potencial presencia de tricomonas móviles no patogénicas similares a T. foetus (Campero et al. 2003). Por esta razón la especificidad del método de cultivo se ha estimado entre un 91 y 98% cuando diferentes medios de cultivo son utilizados (Campero et al. 2003; Perez et al. 2006; Cobo et al. 2007).

La presencia de tricomonas no patogénicas y la necesidad de realizar observaciones rutinarias por aproximadamente 7 días ha incentivado el desarrollo de métodos diagnósticos mejorados. Basado en las diferencias entre las especies de Tritrichomonas

Memorias

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y otras tricomonas en las secuencias en el gen 5.8s rARN y las regiones que lo flanquean (ITS), se diseñó un método de PCR convencional que permite la detección especifica de T. foetus (Felleisen 1997). Si bien los reportes iniciales encontraron que el uso del cultivo previo a la prueba de PCR mejoraba la sensibilidad, estudios recientes indicaron que muestras directas (sin previo cultivo) pueden ser usadas exitosamente (Chen and Li 2001; Mendoza-Ibarra et al. 2012). El desarrollo de esta prueba de PCR fue ampliamente aceptado y mostro tener una sensibilidad similar o incluso superior al cultivo, con valores entre 66 y 98% (Mukhufhi et al. 2003; Cobo et al. 2007; Yao et al. 2011) y valores de especificidad entre 98 y 100% (Parker et al. 2001; Cobo et al. 2007). La necesidad de procesar los productos de amplificación de las muestras para poder visualizarlos en geles de agarosa transformaba la examinación de grandes números de muestras en una tarea sumamente laboriosa. La necesidad de métodos diagnósticos más sensibles sumado a los grandes avances en el estudio de los métodos de PCR condujeron al desarrollo de métodos para la detección de T. foetus por PCR en tiempo real, como la prueba de nucleasa Taq (McMillen and Lew 2006). El uso de esta prueba ha sido ampliamente aceptado y muestra una concordancia del 96-97% con el cultivo en InPouch™TF® (Cooper et al. 2008; Effinger and Weikel 2008). Estudios recientes provenientes de nuestro laboratorio indicaron que la sensibilidad y especificidad de la PCR en tiempo real de muestras enriquecidas mediante cultivo fue del 95.5% y 100%, respectivamente (García Guerra et al. 2013; Garcia Guerra et al. 2014). Estos no fueron diferentes a la sensibilidad (95%) y la especificidad (98.8%) obtenida cuando se cultivaron y evaluaron por observación directa en el InPouch™TF® kit (P>0.10).

Un aspecto interesante de los métodos basados en PCR es la alta sensibilidad que proveen. Por lo cual, se ha investigado la posibilidad de examinar pooles de muestras. Un estudio realizado por Kennedy y colaboradores (Kennedy et al. 2008), experimento con grupos de 5 muestras individuales usando PCR convencional. Los resultados de este ensayo fueron alentadores al mostrar que la especificidad y sensibilidad comparada con la PCR individual, eran del 100%. En este aspecto, recientemente hemos conducido un estudio para determinar la sensibilidad de una prueba de PCR en tiempo real (Taq nuclease) para la detección de T. foetus, en pooles de muestras prepuciales enriquecidas por cultivo en grupos de hasta 25 toros. Se recolectaron muestras prepuciales de 150 novillos y 187 toros vírgenes por el método de aspiración. Las muestras fueron inoculadas en el InPouch™TF® kit, incubadas a 37°C por 7 días. Simultáneamente, muestras de un toro naturalmente infectado con T. foetus fueron recolectadas semanalmente. Los cultivos fueron observados microscópicamente en días alternos y todas las muestras fueron analizadas individualmente con la prueba de PCR en tiempo real. Los grupos de muestras prepuciales fueron hechos incluyendo cantidades fijadas de muestras positivas y negativas en proporciones de 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 y 1/25. La sensibilidad de los pooles de muestras de distintos tamaños se determinó mediante el cálculo de la proporción de pooles que resultaron positivos.

La sensibilidad de la PCR en tiempo real para los diferentes pooles, creados usando muestras de un toro positivo, no fue significativamente diferente (Figura 1), con una sensibilidad total del 94%. La prueba de PCR en tiempo real para la detección de Tricomoniasis en grupos de hasta 25 muestras, es altamente específica y tiene una buena sensibilidad (Garcia Guerra et al. 2014).

Memorias

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Figura 1. Sensibilidad estimada e intervalo des de confianza de 95% para pooles de muestras prepuciales de diferente tamaño enriquecidas mediante cultivo y evaluadas mediante PCR en tiempo real (Garcia Guerra et al. 2014).

El agrupado (pooling) de muestras prepuciales para la detección de T. foetus usando PCR en tiempo real proporciona una nueva y efectiva estrategia para el monitoreo de toros. Sin embargo, la necesidad de recolectar las muestras en medio de cultivo y por lo tanto de incubarlas por un número días previo al testeo, planteó un desafío en áreas remotas y significo un considerable aumento de los costos. Por esa razón, decidimos diseñar un experimento para evaluar la sensibilidad de una prueba de PCR en tiempo real disponible comercialmente para la detección de T. foetus tanto en muestras prepuciales directas individuales y en pooles, sin la necesidad de cultivo. Muestras de 9 toros infectados con T. foetus (n=121) fueron recolectadas e inoculadas en InPouch™TF® o en 2 ml de una solución de fosfato salino bufereada (PBS). Muestras prepuciales de 1016 toros, fueron también recolectadas en ambos InPouch™TF® y PBS. Todas las bolsas de InPouch™TF® fueron inoculadas y evaluadas de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Las muestras prepuciales inoculadas directamente en PBS fueron individualmente evaluadas usando una prueba de PCR en tiempo real realizada por un laboratorio diagnóstico comercial. Las muestras prepuciales directas fueron luego aleatoriamente divididas para agruparlas en pooles de 5 y 10 muestras asegurándose que cada grupo contenía una muestra de un toro infectado, previo a la evaluación por PCR en tiempo real. La sensibilidad fue estimada para el cultivo y la PCR en tiempo real para las 121 muestras directas y las enriquecidas en cultivo, provenientes de los 9 toros infectados. No se encontraron diferencias (P=0,12) entre las estimaciones de sensibilidad para el cultivo, 95% (95% CI: 89,6% -97,7%); PCR en tiempo real de muestras enriquecidas en cultivo, 95% (95% CI: 90,7 – 98,2%); y muestras prepuciales directas, 90,1% (95% CI: 83,5% - 94,2%). Tampoco hubo diferencia (P=0,08) entre la sensibilidad de la PCR en tiempo real de muestras prepuciales directas en 110 grupos de 5 muestras (83,6%, 95% CI: 75,6% - 89,4%) o 10 muestras (77,3%, 95% CI: 68,6% – 84,1%). El uso del muestreo repetido a intervalos semanales y evaluadas mediante PCR en tiempo real, aumento la sensibilidad al 100% (sensibilidad acumulada) en los grupos de 5 y al 96% en los grupos de 10. El uso de muestras prepuciales directas agrupadas

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parece ser relativamente sensible. Sin embargo, esta estrategia requiere muestreos repetidos para optimizar la sensibilidad (García Guerra et al. 2013).

Figura 2. Sensibilidad acumulada e intervalos de confianza al 95% en pooles de 5 0 10 muestras directas y evaluadas mediante PCR en tiempo real colectadas a intervalos de 1 semana.

A,B Diferentes superíndices indican diferencias significativas (P<0.05).

Campilobacteriosis genital bovina

La aislación por medio del cultivo es la técnica más comúnmente usada para el diagnóstico de CGB. Como Cfv es microaerófilo requiere una atmosfera compuesta de 85% de nitrógeno, 10% dióxido de carbono y 5% de oxígeno (Plastridge et al. 1957). Dos métodos selectivos diferentes han sido utilizados para permitir el crecimiento de Cfv y al mismo tiempo que prevenir el crecimiento de bacterias saprofitas y otros contaminantes. Estos son: el uso de filtrado de las muestras o el uso de medios de cultivo selectivos con antibióticos.

Los dos medios selectivos más comunes son el agar selectivo para Campylobacter (CSA) y el agar de Skirrow (Hum et al. 1994). La sensibilidad del CSA varía entre 64 y el 94% cuando las muestras son incubadas a las pocas horas de recolectadas (Dufty 1967; Dufty and McEntee 1969; Clark et al. 1972; Hum et al. 1994). Por otro lado, la sensibilidad del agar Skirrow varia entra el 32 y el 68% (Hum et al. 1994; Monke et al. 2002; Chaban et al. 2013). Otro método posible es el filtrado de las muestras antes del cultivo en agar sangre con un filtro con tamaño de poro de 0.65µm para la aislación de Cfv (Wagenaar and Van Bergen 2010). Un método perfeccionado para su uso en muestras fecales es la filtración pasiva, permitiendo que los organismos móviles de Cfv puedan migrar a través del filtro hacia la superficie de la placa de cultivo. Ese método ha sido extensamente usado para la aislación de campilobacterias en otros tipos de muestras (le Roux and Lastovica 1997; Jokinen et al. 2012). Esta metodología fue empleada recientemente en muestras prepuciales y resulto en una sensibilidad del 87%

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y mostro un desempeño significativamente mejor al del agar de Skirrow (32%) cuando se practicó cultivo directo (Chaban et al. 2013). Este método proporciona una simple y económica técnica para la aislación de Cfv. Una de las mayores desventajas de los métodos de cultivo es el sobre crecimiento de contaminantes como Pseudomonas aeruginosas, Proteus spp y hongos (Monke et al. 2002; Chaban et al. 2013). A pesar de que los medios selectivos detallados previamente contienen antibióticos para controlar el crecimiento de esos organismos, la contaminación continúa siendo un problema. El uso de filtración pasiva parecería ser la medida más efectiva para controlarlo (Chaban et al. 2013).

El uso de métodos de cultivo requiere la habilidad de distinguir, una vez aislado, entre Cfv y Cff (Campylobacter fetus subsp. fetus). Luego de aislar las colonias con morfología consistente con Cfv, se determinan las características fenotípicas (catalasa, crecimiento a 42°C o en la presencia de 3.5% NaCl, etc.) junto a la tolerancia a 1% de glicina para permitir la distinción entre Cfv y Cff (Wagenaar and Van Bergen 2010). La caracterización fenotípica de Cfv está influenciada por el tamaño del inoculo y el medio basal usado, lo cual ha derivado en una pobre reproducibilidad (On and Holmes 1991). Estos inconvenientes sumados al descubrimiento de cepas de Cfv tolerantes a 1% de glicina (Schmidt et al. 2010) hace el uso del cultivo sumado a la identificación fenotípica, un método engorroso y lento.

Los desafíos que presentan los medios de cultivo, particularmente los relacionados a transportes prolongados, promovieron el desarrollo de técnicas diagnósticas basadas en la identificación de antígenos de Cfv, removiendo así la necesidad de mantener la viabilidad de los organismos en la muestra. La técnica de inmunofluorescencia (IF) directa (DFAT siglas en inglés) detecta la presencia de Cfv por medio de anticuerpos policlonales conjugados con FITC (Mellick et al. 1965). Una de las ventajas de esta técnica es que la muestra es recolectada en una solución de formalina tamponada y puede ser mantenida refrigerada durante varios días (Jimenez et al. 2011). El uso de DFAT ha demostrado tener una sensibilidad comparable o mejor que los métodos de cultivo (Mellick et al. 1965). La sensibilidad de DFAT varía entre 80 y 94% (Dufty 1967; Clark et al. 1972; Figueiredo et al. 2002). Por otro lado, la especificidad ha sido estimada en 89% y uno de las mayores preocupaciones con este test, es la reacción cruzada con ciertos tipos de Cff (Figueiredo et al. 2002). Aunque la diferenciación entre subespecies no es posible, las ventajas en las condiciones de transporte, almacenamiento y el tiempo de obtención de resultados han hecho muy popular esta técnica en Sudamérica y Australia.

La necesidad de métodos más rápidos y precisos para la detección de Cfv, han llevado al desarrollo de técnicas moleculares. La necesidad de mantener los organismos viables y la dificultad de diferenciar subespecies puede potencialmente verse solucionado con el desarrollo de estas técnicas moleculares como así también la posibilidad de reducir la cantidad de pasos diagnósticos. Hum y colaboradores (Hum et al. 1997), desarrollaron un test de PCR convencional múltiple para la detección y subespeciación de C. fetus que se utiliza mundialmente. Este test utiliza dos pares de primers: MG3F/MG4R que tienen como objetivo el gen de inanición de carbono presente en ambos Cff and Cfv, y VenSF/VenSR que tienen como objetivo el gen parA presente

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solo en Cfv (Hum et al. 1997). ). La concordancia con el test de tolerancia a la glicina, en más de 600 aislaciones, ha variado entre un 70 y un 100% (Hum et al. 1997; Willoughby et al. 2005; Abril et al. 2007). Sin embargo, su uso usualmente se ha limitado a la identificación de organismos aislados mediante cultivo (Chaban et al. 2013). Un estudio reporto el uso de esta prueba en muestras prepuciales recolectadas en mWTEM, mostrando una sensibilidad del 85.7% y una especificidad del 99% comparado con el cultivo. El almacenamiento prolongado en mWTEM por más de 24 horas perjudico la detección de Cfv, siendo atribuido a la contaminación con Pseudomonas que producen enzimas ADN asas (Schmidt et al. 2010).

La necesidad de manipular las muestras luego de realizar PCR convencional, condujo al desarrollo de pruebas de PCR en tiempo real basados en la detección de los genes de Cfv previamente descriptos. Dos pruebas de PCR en tiempo real para la detección del gen parA han sido reportadas (McMillen et al. 2006; Chaban et al. 2012). Ambos utilizan un método de extracción de ADN por lisis térmica directamente de muestras prepuciales y un límite de detección significativamente mejor que el de la PCR múltiple convencional desarrollada por Hum y/o el cultivo (McMillen et al. 2006). Dada la necesidad de producir datos precisos para evaluar el rendimiento de esta nueva prueba, nuestro equipo diseño un estudio para determinar la sensibilidad y especificidad clínica en muestras prepuciales de toros. Muestras de 300 toros vírgenes y 13 toros infectados con Cfv fueron colectadas en PBS. La especificidad de la PCR en tiempo real fue calculada a parir de las muestras de los toros vírgenes, comparando con los resultados de cultivos bacteriológicos realizados en medio de transporte enriquecido. La sensibilidad fue calculada a partir de muestras de toros infectados, recolectadas semanalmente, y comparadas con los resultados de DFAT y del cultivo bacteriológico. La especificidad del 85% para la prueba de PCR en tiempo real y del 100% para el cultivo bacteriológico fue significativamente diferente (P<0,05). La sensibilidad promedio fue del 85.4% para la PCR en tiempo real, 82,3% para el cultivo directo con filtro en agar sangre, 72,1% para DFAT y 32,7% para el cultivo directo en agar Skirrow. Las diferencias en la sensibilidad según el método usado variaron con la temperatura ambiente exterior como muestra la Tabla 3. El muestreo repetido aumento significativamente la sensibilidad de la PCR en tiempo real. El uso de este método como prueba de monitoreo a partir de muestras prepuciales directas tuvo una sensibilidad comparable a la del cultivo bacteriológico (García Guerra et al. 2014).

Para la implementación de la PCR en tiempo real como método diagnóstico para la detección de Cfv, fue necesario analizar las condiciones del transporte de las muestras desde el campo al laboratorio. Se diseñó un estudio para determinar el efecto del tiempo y la temperatura durante el transporte en la sensibilidad clínica de la PCR en tiempo real para Cfv a parir de muestras prepuciales de toros colectadas en PBS. La sensibilidad en muestras transportadas por periodos cortos (2 a 48 horas) fue mayor cuando estas eran almacenadas a 4°C y 30°C, mientras que la sensibilidad en muestras con periodo de transporte prolongado (96 horas) fue mayor cuando eran almacenadas a -20°C (Tabla 4). Idealmente las muestras prepuciales deberían ser almacenadas a 4°C e ingresar al laboratorio dentro de las 48 horas de recolectadas, de no ser posible deberían congelarse a -20°C para minimizar la perdida de sensibilidad de la prueba (Garcia-Guerra et al. 2016).

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Tabla 3. Valores ajustados de sensibilidad (Intervalo de confianza del 95%) para el diagnóstico mediante cultivo bacteriológico, DFAT y PCR en tiempo real para la detección de Cfv en muestras prepuciales colectadas en diferentes temperaturas ambiente.

a,b Valores con superíndices diferentes indican diferencias significativas (P<0,05). Filtro = filtro de 0,65-µm de membrana de éster de celulosa colocada sobre una placa de agar sangre. Skirrow = placas de agar Skirrow.

El uso de la evaluación de grupos de muestras por PCR en tiempo real ha probado ser una estrategia valiosa para otras enfermedades venéreas de los bovinos como se mencionó previamente. Por ello, realizamos un experimento para evaluar el desempeño de la prueba de PCR en tiempo real para Cfv en pooles de muestras prepuciales. Fueron muestreados 8 toros infectados y 176 toros de un año, vírgenes. La sensibilidad de la PCR en tiempo real fue comparable para muestras individuales y grupos de 5 muestras, mostrando una disminución (P<0.05) en grupos de 10 muestras (Figura 3). La sensibilidad de los pooles de diferentes tamaños aumento con los muestreos repetidos, particularmente en las muestras individuales y los grupos de 5 muestras (sensibilidad del 99.9%). Pooles de 5 muestras es una opción viable para disminuir los costos cuando se realizan evaluaciones de un gran número de toros para la detección de CGB a partir de muestras prepuciales directas usando el método de PCR en tiempo real (Garcia-Guerra et al. 2016).

Tabla 4. Comparación del efecto del tiempo y temperatura del transporte en la sensibilidad de la PCR en tiempo real para el diagnóstico de CGB (n=348 alícuotas de 58 muestras provenientes de 8 toros infectados).

Temperatura de transporte (oC)

Tiempo de transporte

(horas) -20 4 30

2 0,82b 0,93 0,99a

48 0,95 0,95 0,99a

96 0,95 0,86b 0,84b a,b Indica diferencias significativas (P<0,05)

Una falla importante de esta nueva técnica es el porcentaje relativamente alto de falsos positivos (15%) en toros vírgenes presuntamente libres de Cfv. Respecto a ello, se cree

Temperatura ambiente (°C)

Método N -5 0 5 10 15

Cultivo + filtro 260 87,0a

(77,5-92,9)

87,0 a

(78,1-92,6)

87,0 a

(78,3-92,5)

87,0 b

(77,9-92,6)

86,9 b

(77,0-92,9)

Cultivo +

Skirrow 251

39,6 c

(26,1-54,8)

30,5 d

(19,6-44,3)

22,8 d

(13,9-35,0)

16,6 e

(9,4-27,4)

11,8 d

(6,1-21,4)

DFAT 244 71,3 b

(57,1-82,3)

73,8 b

(60,8-83,6)

76,1 b

(63,7-85,2)

78,3 c

(65,9-87,1)

80,3 b

(67,5-88,9)

PCR en tiempo

real 260

85,5 a

(75,5-91,8)

89,2 a

(81,3-94,0)

92,0 a

(85,4-95,8)

94,2 a

(88,4-97,2)

95,8 a

(90,7-98,1)

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que el gen parA está incluido en una isla genómica (Gorkiewicz et al. 2010; Ali et al. 2012) que contiene factores de virulencia específicos de Cfv pero también se han identificado genes de movilidad dentro de esta región (Gorkiewicz et al. 2010). La presencia de estos últimos genes indicaría la posibilidad de transferencia horizontal de genes. Si este fenómeno es responsable por la identificación errónea reportada, es un misterio y requiere mayor investigación en el futuro. Se han utilizado, con algún grado de éxito, otros genes para identificar Cfv por técnicas de PCR (como el ISCfe 1) (Abril et al. 2007), sin embargo ninguno ha sido apropiadamente investigado para determinar la sensibilidad y especificidad clínica en muestras de campo.

Figura 3. Sensibilidad de la PCR en tiempo real en pooles de muestras prepuciales de distinto tamaño (n=35 / tamaño de pool). Las barras representan el intervalo de confianza del 95%.

CONCLUSIONES: ESTRATEGIAS DE CONTROL

Existen numerosas estrategias para el control de enfermedades venéreas, incluyendo la identificación y remoción de animales infectados, tratamientos y vacunación preventiva o terapéutica. Las estrategias de vacunación y tratamiento no serán discutidas aquí, prefiriendo enfocar la discusión en estrategias basadas en la identificación de los toros portadores. La identificación y remoción de animales portadores ha sido la práctica por excelencia (Clark et al. 1983). Sin embargo, numerosos factores pueden afectar la precisión para detectarlos como ser: adecuada recolección y manejo de las muestras, tiempo y condiciones de transporte, técnicas usadas y su sensibilidad y especificidad, así como variaciones en el nivel de infección. Se han descripto periodos de entre 4 y 8 meses en los cuales la infección por T. foetus puede no ser detectada (Bartlett et al. 1947). A pesar que esos son considerados toros atípicos, otros estudios han mostrado que solo entre el 50 y 68% de los toros son consistentemente positivos en todas las muestras recolectadas (Hammond et al. 1950). Esto también ha sido descripto en toros infectados con Cfv aunque no se han reportado estimaciones precisas (Plastridge et al. 1957).

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El muestreo repetido se ha vuelto necesario para eludir este problema. Las recomendaciones en la cantidad de examinaciones necesarias para certificar que un toro está libre de infección oscilan desde 2 hasta 6 (Dufty and McEntee 1969; Perez et al. 2006; CSS 2011; Jimenez et al. 2011). El uso de hasta 4 muestreos consecutivos examinados por cultivo para detectar T. foetus aumenta la sensibilidad de 73 a 99% (Rae et al. 1999). El muestreo repetido y la examinación usando la prueba de PCR también han resultado en una mayor sensibilidad (Cobo et al. 2007; Yao et al. 2011). La cantidad de información acerca del muestreo repetido para la detección de Cfv es escasa en la literatura, sin embargo un estudio indicó que la sensibilidad del cultivo de muestras de semen aumentaba desde el 39 al 95% cuando se usaron 3 muestras consecutivas (Plastridge et al. 1957).

A pesar de las recomendaciones generales encontradas en la literatura, la estrategia a elegir debe ser cuidadosamente evaluada en base a cada situación. La sensibilidad y especificidad del método diagnostico a usar y la probabilidad de infección a priori deberían indicar si se debe realizar uno o múltiples evaluaciones (Parker et al. 1999). Estos factores determinan el valor predictivo de un método; por ello la probabilidad a priori o la prevalencia indicaran la estrategia a seguir. La nueva prueba de PCR en tiempo real para ambos, T. foetus y Cfv, presenta ventajas significativas como: la posibilidad de recolectar las muestras en tubos con PBS prescindiendo así de la necesidad de usar medios de transporte, alta sensibilidad y especificidad especialmente en el caso de T. foetus, la habilidad de procesar un gran número de muestras en poco tiempo, y la posibilidad de agrupar muestras como una estrategia para disminuir los costos de examinación.

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65

Efecto de la edad y el estado fisiológico de la donante sobre la calidad de los ovocitos y la

producción de embriones in vitro

P.S. Baruselli1, E.O.S. Batista1, L.M. Vieira1, R.M. Ferreira1, B.G. Guerreiro1, B.M. Bayeux1,

J.N.S. Sales2, A.H. Souza3, L.U. Gimenes4

1Departamento de Reprodução Animal, USP, São Paulo, SP, Brasil; 2Departamento de Medicina

Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, Brasil; 3Ceva Saúde Animal, Paulínia,

SP, Brazil; 4Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, FCAV-

UNESP, Jaboticabal, Brazil.

Resumo

O sucesso da produção in vitro de embriões (PIV) depende da quantidade e qualidade dos

complexos cumulus oócitos (CCOs) aspirados durante a ovum pick up (OPU). Diversos fatores

aparentam ser críticos para a qualidade oocitária, incluindo tamanho do folículo, fatores ambientais

como estresse calórico, genética, idade e estágio de lactação dos animais doadores, sendo que

todos estes fatores tem uma grande influência no resultado da PIV. O objetivo desta revisão é

ressaltar algumas áreas críticas que podem auxiliar veterinários a aumentar a eficiência da OPU e

implementar a PIV com sucesso em sua rotina. O trabalho terá foco em achados recentes da

literatura e aspectos fisiológicos que podem interferir na qualidade dos oócitos encaminhados para

PIV de fêmeas jovem (bezerras e novilhas pré-púberes), vacas gestantes e não gestantes e possíveis

interações com a lactação e dias pós-parto durante a OPU.

Palavras-chave: bovino, FIV, oócito, gestação.

Introdução

A aspiração folicular guiada por ultrassonografia (ovum pick up - OPU) associada com

produção in vitro de embriões (PIV) são tecnologias importantes que podem melhorar a eficiência

reprodutiva e produtiva tanto do gado de leite quanto de corte (Merton et al., 2003; Pontes et al.,

2010). A indústria de PIV evoluiu rapidamente na última década e algumas tecnologias paralelas

como genômica e a descoberta de marcadores de produção de embriões (por exemplo, ensaio de

AMH) estão induzindo um progresso genético mais direcionado e eficiente. Por exemplo, o uso

de tecnologia genômica permite a identificação de animais de genética superior em idades muito

mais jovens. Como resultado, produtores estão impulsionando tanto a indústria quanto a

comunidade científica a desenvolverem técnicas que sejam mais adequadas para animais mais

jovens utilizados em rotinas de OPU-PIV, acelerando o ganho genético ao diminuir o intervalo

entre gerações.

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66

Apesar da idade do animal em que a OPU é feita, o sucesso da PIV depende da quantidade

e da qualidade dos complexos cumulus oócitos (CCO) aspirados durante a OPU. Evidentemente,

diversos fatores aparentam ser críticos para a qualidade oocitária, incluindo tamanho do folículo

(Lonergan et al., 1994; Seneda et al., 2001), fatores ambientais como estresse calórico (Torres-

Júnior et al., 2008; Ferreira et al., 2011; Ferreira et al., 2016), genética (Gimenes et al., 2015; Sales

et al., 2015), idade (Batista et al., 2016a) e estágio de lactação dos animais doadores (Baruselli et

al., 2016), sendo que todos estes fatores tem uma grande influência no resultado da PIV. Além

disso, o papel direto do ambiente hormonal durante o desenvolvimento folicular e qualidade

oocitária tem sido demonstrado na literatura científica. Assim, foco tem sido dado aos possíveis

efeitos positivos dos níveis circulantes de progesterona (P4) na determinação da qualidade

oocitária na PIV (Lonergan, 2011). No entanto, um estudo recente do nosso grupo de pesquisa

demonstrou que nem a exposição à níveis baixos de LH, nem os ciclos de P4 são limitantes para a

viabilidade oocitária e o desenvolvimento para o estágio de blastocisto (Batista et al., 2016b).

Pesquisas adicionais são necessárias para elucidar algumas destas complexas interações entre

hormônios reprodutivos e qualidade oocitária.

A raça do gado também constitui um dos fatores que influenciam na eficiência da OPU-

PIV. Doadoras Bos indicus (raças zebuínas) e Bos taurus (raças taurinas) aparentam ter diferenças

significativas quanto ao resultado da PIV (Pontes et al., 2010; Guerreiro et al., 2014a; Gimenes et

al., 2015). Na maior parte da literatura publicada é aparentemente notável que fêmeas Bos indicus

possuem uma recuperação muito maior de oócitos durante a OPU; presumidamente por conta da

maior população folicular ovariana e a maior concentração plasmática de hormônio anti-

Mulleriano (Batista et al., 2014). Além disso, em doadoras zebuínas têm-se observado maior

quantidade de oócitos viáveis em comparação com doadoras taurinas (Guerreiro et al., 2014a;

Gimenes et al., 2015).

Alguns problemas de manejo, como o tipo de dieta, o nível de consumo da ração e o estresse

calórico possuem conhecidamente um alto impacto na qualidade oocitária e na PIV. No entanto, a

interferência destes fatores pode diferir em gado Bos indicus e Bos taurus. O nível de consumo de

energia, por exemplo, pode afetar os níveis circulantes de insulina e IGF-1 (revisão de Sartori et

al., 2016). O aumento excessivo na concentração de insulina sanguínea, principalmente em vacas

leiteiras em fase final de lactação, está negativamente associado com a qualidade oocitária

(revisado por Baruselli et al., 2016). A exposição ao estresse calórico é um efeito conhecidamente

deletério à competência oocitária em gado Bos taurus (Ferreira et al., 2011; Ferreira et al., 2016).

Surpreendentemente, doadoras Bos indicus, apesar de mais resistentes às condições de estresse

calórico ambiental, também são afetadas por ele e podem necessitar aproximadamente quatro

meses para recuperar a qualidade oocitária para os níveis pré-estresse calórico, mesmo após um

curto período de exposição ao calor (Torres-Júnior et al., 2008).

De modo geral, diversos fatores podem ser prejudiciais para qualidade oocitária e devem

ser levados em consideração durante a PIV. Portanto, o objetivo desta revisão é realçar algumas

Memorias

67

áreas críticas que podem auxiliar veterinários a aumentar a eficiência da OPU e implementar a PIV

com sucesso em sua rotina. A revisão terá foco em achados recentes da literatura e aspectos

fisiológicos que podem interferir na qualidade dos oócitos encaminhados para PIV de gado jovem

(bezerras e novilhas pré-púberes), vacas gestantes e não gestantes e possíveis interações com a

lactação e dias pós-parto durante a OPU.

Efeitos dos diferentes estágios reprodutivos e de desenvolvimento e na qualidade oocitária e

produção in vitro de embriões

Qualidade oocitária e PIV em bezerras doadoras

A população de folículos ovarianos no nascimento em bovinos é estimada em 235.000

(Ericksson, 1966; Betteridge et al., 1989). No entanto, como em todos os mamíferos, essa

população rapidamente diminui com o envelhecimento (Ericksson, 1966). Portanto, novilhas

jovens possuem um maior número de folículos antrais em seus ovários do que vacas (Desjardins

and Hafs, 1969), o que pode estar associado com uma PIV mais eficiente. Estudos prévios

mostraram que bezerras necessitam de estimulação gonadotrófica antes da OPU- PIV para que se

alcance resultados aceitáveis (Presicce et al., 1997; Maclellan et al., 1998; Taneja et al., 2000).

Dentre os protocolos hormonais instituídos para bezerras selecionadas para coleta de oócitos, a

maioria utiliza tratamento com hormônio folículo-estimulante (FSH) antes da OPU por

laparoscopia (LOPU) e tecnologias de PIV (Armstrong et al., 1992; Fry et al., 1998).

Recentemente nosso grupo de pesquisa conduziu uma série de estudos para avaliar os

diferentes protocolos hormonais para coleta de oócitos seguida de PIV em bezerras Bos indicus

(Nelore) e Bos taurus (Holandesas; Batista et al., 2016a). Um experimento foi conduzido em uma

fazenda comercial de gado de corte próxima à cidade de Paulínia (São Paulo, Brasil). Foram

utilizadas 45 doadoras Nelore: 30 bezerras (3 a 4 meses) e 15 novilhas cíclicas (18 a 24 meses).

Em um segundo experimento conduzido no Campus da Universidade de São Paulo (USP, Campus

de Pirassununga, SP, Brasil), foram utilizadas 34 doadoras Holandesas, sendo 24 bezerras (3 a 4

meses) e 10 novilhas cíclicas (14 a 16 meses). Todas as bezerras foram aleatoriamente designadas

a receber tratamento superestimulatório com FSHp (bezerras com FSHp, n = 15) ou sem (bezerras

sem FSH, n = 15). As novilhas cíclicas foram submetidas à OPU-PIV em estágios aleatórios do

ciclo estral.

Todas as bezerras passaram por LOPU. Bezerras sem FSH também foram submetidas à

LOPU, em estágios aleatórios do ciclo estral. Bezerras superestimuladas foram tratadas antes da

LOPU com dispositivo intravaginal de P4 (dia 0, Eazi-Breed CIDR, 0.33 g; Zoetis, São Paulo, SP,

Brasil). Após 5 dias, as bezerras receberam 4 tratamentos de FSHp (140 mg; Folltropin, Agener,

SP, Brasil) administrados duas vezes ao dia em doses decrescentes (40 mg [dia 5, AM], 40 mg [dia

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68

5, PM], 30 mg [dia 6, AM]) durante um período de dois dias. A LOPU foi realizada 12 horas após

o último tratamento com FSHp (dia 7).

Em doadoras Bos indicus, o número de CCOs recuperados foi maior em bezerras com FSH

e em novilhas cíclicas, quando comparado com bezerras sem FSH (P = 0,04). Além disso, o cultivo

de CCOs foi maior em bezerras tratadas com FSH e em novilhas cíclicas, quando comparado com

bezerras sem FSH (P = 0,01). No entanto, a taxa de clivagem foi semelhante nos 3 grupos (bezerras

sem FSH, bezerras com FSH, e novilhas cíclicas; P = 0,41; Tabela 1). Apesar dos efeitos positivos

do tratamento com FSH, o número de blastocistos produzidos foi semelhantes em bezerras com e

sem FSH, e este número foi menor do que nas novilhas cíclicas (P = 0,0001; Tabela 1).

Em doadoras Bos taurus, o número de folículos visualizados (P = 0,01) e oócitos

recuperados (P = 0,0001) foi maior em bezerras com FSH do que em bezerras sem FSH e em

novilhas cíclicas. O número de CCOs cultivados foi semelhante entre bezerras sem FSH e novilhas

cíclicas, e ambos os grupos tiveram menos CCOs cultivados do que as bezerras com FSH (P =

0,0001). Apesar destes efeitos positivos do tratamento com FSH, o número de blastocistos

produzidos foi semelhante entre bezerras com e sem FSH, e este valor foi mais baixo do que nas

novilhas cíclicas (Tabela 2).

Os resultados ora apresentados demonstram que é possível produzir embriões de bezerras

utilizando LOPU/PIV. O tratamento com FSH pode ser utilizado como um tratamento

superestimulatório para melhorar a eficiência da LOPU/PIV em bezerras jovens. No entanto, mais

estudos são necessários para melhorar a produção de embriões de bezerras em comparação com

animais adultos.

Tabela 1. Número de folículos visíveis, CCOs e blastocistos (média ± EPM) depois da LOPU-

PIVI em bezerras doadoras Bos indicus (Nelore) e depois da OPU-PIV em novilhas cíclicas Bos

indicus (Nelore).

Bos indicus

Item

Bezerras sem

FSH

Bezerras

com FSH

Novilhas

cíclicas

Valor de

P

Total de folículos visualizados 19,7 ± 4z 32,3 ± 5,9y 47,1 ± 6,3x 0,003

Total de CCOs recuperados 13,5 ± 3,6b 20,9 ± 5,1ab 29,9 ± 5,3a 0,04

Taxa de recuperação (%)e 68,5a 64,7b 63,6b 0,02

Número de CCOs cultivados 4,7 ± 1,4c 11,3 ± 4,0b 18,1 ± 4,0a <0,0001

Taxa de CCOs cultivados (%)f 35,1b 54,3a 60,6a 0,01

Taxa de clivagem (%)g 47 52,2 50,3 0,41

Blastocistos produzidos 1,7 ± 0,7b 2,3 ± 0,8b 9,3 ± 2,0a <0,0001

Taxa de blastocistos (%)h 12,9b 11,3b 30,9a <0,0001 Dados seguidos por diferentes letras sobrescritas na mesma linha diferem com P ≤ 0,05 (a ≠ b ≠ c) ou P < 0,06 (x ≠ y

≠ z). eNúmero total de CCOs/número de folículos aspirados. fNúmero de CCOs cultivados/número de folículos

aspirados. gNúmero de zigotos clivados/número de CCOs. hNúmero de blastocistos/número de CCOs.

Memorias

69

Tabela 2. Número de folículos visíveis, CCOs e blastocistos (média ± EPM) depois da LOPU-

PIVI em bezerras doadoras Bos taurus (Holandesa) e depois da OPU-PIVI em novilhas cíclicas

Bos taurus (Holandesa).

Bos taurus

Bezerras sem

FSH

Bezerras com

FSH

Novilhas

cíclicas

Valor de

P

Total de folículos visualizados 22.7 ± 4.2b 54.3 ± 9.5a 24.9 ± 3.6b 0.01

Total de CCOs recuperados 11.7 ± 2.4bx 22.4 ± 5.4a 9.2 ± 1.7cy <0,0001

Taxa de recuperação (%)e 51.3a 41.3a 36.9b 0,01

CCOs cultivados 3.6 ± 1.0b 12.3 ± 3.5a 4.7 ± 1.3b <0,0001

Taxa de CCOs cultivados (%)f 30.7b 37.7a 51.1a 0,02

Taxa de clivagem (%)g 17.8 30.5 26.1 0,47

Blastocistos produzidos 0.4 ± 0.2 0.7 ± 0.4 0.5 ± 0.3 0.78

Taxa de blastocistos (%)h 2.9 2.0 4.3 0.60

Dados seguidos por diferentes letras sobrescritas na mesma linha diferem com P ≤ 0,05 (a ≠ b ≠ c) ou P < 0,06 (x ≠ y

≠ z). eNúmero total de CCOs/número de folículos aspirados. fNúmero de CCOs cultivados/número de folículos

aspirados. gNúmero de zigotos clivados/número de CCOs. hNúmero de blastocistos/número de CCOs.

Qualidade oocitária e PIV em novilhas púberes e pré-púberes

Diversos laboratórios de pesquisa têm tido sucesso na produção de embriões viáveis de

novilhas pré-púberes (Armstrong et al., 1992; Fry et al., 1998; Taneja et al., 2000). No entanto,

existe a preocupação de que oócitos de fêmeas mais jovens tenham capacidade de desenvolvimento

menor do que os de doadoras adultas (Khatir et al., 1996; Presicce et al., 1997; Majerus et al.,

1999).

Recentemente nosso grupo de pesquisa realizou um estudo na fazenda Santa Rita,

localizada próxima à cidade Descalvado, no estado de São Paulo (Guerreiro et al., 2014b), no qual

um total de 120 doadoras de quatro categorias distintas foram utilizadas, sendo estas: novilhas pré-

púberes (n = 30), novilhas púberes (n = 30), vacas em lactação (n = 30) e vacas não lactantes (n =

30). As doadoras passaram pela OPU sem sincronização prévia da onda folicular. Seis sessões de

OPU foram realizadas com cinco animais de cada categoria, ou seja, 20 doadoras por sessão.

Imediatamente antes da OPU, todos os folículos foram quantificados e todos os folículos

visíveis (≥ 2 mm) foram puncionados e, então, o total de estruturas recuperadas, a quantidade e

qualidade dos oócitos viáveis foram registrados. Todos os oócitos viáveis foram submetidos à PIV

e o seu desenvolvimento (taxa de clivagem e de blastocisto) foi avaliado. A mesma partida de

sêmen sexado do mesmo touro foi utilizada para a fertilização in vitro (FIV) dos oócitos de todas

Memorias

70

as categorias de doadoras em todas as sessões de OPU. Os embriões produzidos (n = 206) foram

transferidos para receptoras Bos taurus x Bos indicus.

Não foi observada diferença entre os grupos experimentais quanto ao número total de

folículos aspirados (P = 0,08). Apesar do número semelhante de total de oócitos recuperados (P =

0,12), as novilhas pré-púberes tiveram uma quantidade intermediária de oócitos viáveis, e as vacas

não lactantes produziram mais oócitos viáveis (P = 0,03), quando comparadas com vacas lactantes.

Entretanto, doadoras pré-púberes tiveram uma taxa de clivagem mais baixa (P< 0.0001) e taxa de

blastocisto mais baixa (P< 0.0001) quando comparadas com outras categorias (Tabela 3).

Tabela 3. Número de folículos aspirados, oócitos e embriões produzidos após a OPU-PIVI em

novilhas pré púbere e púbere, e vacas em lactação e secas da raça Holandesa. Dados apresentados

como média ± erro padrão da média.

Novilhas Vacas Valor de

P Pré-púberes Púberes Lactantes Não Lactantes

N 30 30 30 30

Total de folículos aspirados 18,3 ± 2,1 17,3 ± 1,2 14,0± 1,0 17,7 ± 1,7 0,08

Total de CCO recuperados1 14,2 ± 2,2 13,1 ± 1,1 9,8 ± 1,1 14,6 ± 1,7 0,12

CCOs cultivados 10,5 ± 1,8ab 8,3 ± 0,8ab 6,5 ± 0,9b 11,5± 1,4a 0,03

Taxa de clivagem (%)2 68,6b 98,8a 87,6a 90,1a < 0,0001

Blastocistos prodzidos 0,5 ± 0,2b 1,1 ± 0,2b 1,2 ± 0,4b 4,2 ± 0,6a < 0,0001

Taxa de blastocistos (%)3 4,8c 12,7b 18,0b 36,5a < 0,0001 1CCO – complexos cumulus oócitos. 2Número de embriões clivados/CCOs viáveis. 3Número de

blastocistos/CCOs viáveis. a,b,cLetras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (P <

0,05).

Portanto, conclui-se que doadoras Holandesas pré-púberes tem baixa competência para

produção in vitro de embriões, sendo a categoria de vacas não lactantes a mais eficiente na PIV.

Embriões produzidos de animais pré-púberes resultaram em taxa de concepção inferior em

comparação com embriões produzidos de vacas em lactação e não lactantes [pré-púberes: 0,0%

(0/15)b; púberes: 9,7% (3/28)b; vacas em lactação: 28,6% (10/25)a; vacas não lactantes: 32,7%

(36/74)a; P < 0,05; Figura 1]. No entanto, foi observada taxa de concepção semelhante para

embriões produzidos de doadoras púberes e pré-púberes.

Memorias

71

Figura 1. Taxa de concepção após a transferência de embrião. As doadoras eram novilhas pré-

púberes, púberes, vacas em lactação e não lactantes da raça Holandesa.

Um estudo subsequente foi realizado por nosso grupo com novilhas Nelore pré-púberes

(Bos indicus) do Instituto de Zootecnia em Sertãozinho, no estado de São Paulo (Batista et al.,

2016; FMVZ/USP, São Paulo, Brasil; dados não publicados). Neste experimento foi avaliada a

OPU-PIV em diferentes idades e estágios do ciclo estral. O delineamento experimental incluiu:

novilhas pré-púberes de 8 a 12 meses de idade (n = 24), novilhas pré-púberes de 18 a 22 meses de

idade (n = 20) e novilhas cíclicas de 22 a 26 meses (n = 25). Os dados estão resumidos na Tabela

4.

Tabela 4. Número de folículos visíveis, CCOs e blastocistos (média ± EPM) depois da OPU –

PIVI em novilhas pré púberes e púberes de Bos indicus (Nelore).

Novilhas

pré-púberes

Novilhas

pré-púberes Novilhas púberes Valor de Pa

(8-12 meses) (18-22 meses) (22-26 meses) Idadeb Ciclicidadec

(n = 24) (n = 20) (n = 25)

Total de folículos visualizados 19,7 ± 2,1 41,3 ± 5,28 34,0 ± 3,3 < 0,0001 0,0002

Total de CCOs recuperados 13,4 ± 1,7 30,8 ± 5,8 22,6 ± 3,2 < 0,0001 < 0,0001

Total de CCOs clivados 5,6 ± 0,8 14,8 ± 2,5 13,3 ± 1,9 < 0,0001 < 0,0001

CCOs cultivados 7,6 ± 1,0 16,8 ± 2,7 15,1 ± 2,2 < 0,0001 < 0,0001

Taxa de CCOs cultivados (%)d 57 54 60 0,13 0,5

Taxa de clivagem (%)e 73 88 84 < 0,0001 0,25

Blastocistos produzidos 1,5 ± 0,3 4,7 ± 0,9 7,2 ± 1,2 < 0,0001 < 0,0001

Memorias

72

a Efeito do grupo avaliado. b Efeito da idade no grupo pré púbere (8-12 meses vs 18-24 meses). c Efeito da ciclicidade

(cíclica vs não cíclica). d Número de oócitos viáveis/ número total de oócitos. e Número de oócitos clivados/ número

de oócitos cultivados. f Número de blastocistos/ número de oócitos cultivados.

Novilhas pré-púberes de idade entre 8 e 12 meses tiveram menor número de folículos

visualizados e de oócitos recuperados do que novilhas mais velhas, apesar do status de ciclicidade.

Não houve diferença entre os grupos experimentais sobre a taxa de CCOs cultivados ou sobre a

sua taxa de clivagem. No entanto, o número de blastocistos produzidos, bem como a taxa de

blastocisto, aumentou tanto com o avanço de idade dos animais como após os animais tornarem-

se cíclicos (Tabela 4).

O resultado da OPU/PIV em novilhas pré-púberes demonstrou uma eficiência reduzida

quando comparada com novilhas cíclicas e animais adultos. Outros estudos devem ser realizados

para tentar melhorar a eficiência da produção de animais nesta categoria.

Qualidade oocitária e PIV em doadoras gestantes

Recentemente, nosso grupo de pesquisa estudou o efeito da gestação sobre a qualidade

oocitária e PIV em novilhas Holandesas (Bayeux et al., 2016). Para tal, 179 doadoras Holandesas

(Bos taurus) de 3 categorias foram avaliadas: novilhas pré-púberes (8 a 10 meses; n = 60); novilhas

púberes (10 a 12 meses; n = 60) e novilhas prenhes (14 a 18 meses; n = 59). Todos os animais

foram submetidos à OPU em estágios aleatórios do ciclo estral. A mesma partida de sêmen do

mesmo touro foi utilizada para fertilizar os oócitos das doadoras de todas as categorias e de todas

as sessões de OPU. As novilhas púberes apresentaram maior número de oócitos recuperados assim

como CCOs cultivados em comparação com as outras categorias. No entanto, a taxa de clivagem

foi semelhante entre novilhas púberes e novilhas prenhes. Interessantemente, novilhas prenhes

apresentaram maior número de embriões produzidos por OPU e também maior taxa de blastocisto

quando comparadas com as outras categorias de novilhas (Tabela 5). Estes resultados indicam que

as novilhas prenhes apresentam maior eficiência em termos de PIV quando comparadas com

novilhas púberes e pré-púberes da raça Holandesa (Bos taurus).

Tabela 5. Número de oócitos recuperados, CCOs cultivados, blastocistos, taxa de clivagem e de

blastocisto após OPU–PIV em doadoras taurinas de diferentes categorias.

Item

Novilhas

Pré-púberes

(n = 60)

Púberes

(n=60)

Prenhes

(n=59)

Valor de

P

Número de CCOs recuperados 9,8 ± 1,3b 15,6 ± 1,4a 9,8 ± 1,6b 0,001

CCOs cultivados 4,6 ± 0,6b 9,1 ± 0,9a 5,6 ± 1,1b 0,001

Taxa de clivagem (%)d 31b 56a 78a 0,001

Bastocistos produzidos 0,31 ± 0,1c 0,9 ± 0,2b 1,8 ± 0,3a < 0,001

Taxa de blastocistos (%)f 20,2 28,1 47 0,05 < 0,0001

Memorias

73

Taxa de blastocisto (%)e 2c 4b 37a < 0,001 dNúmero de oócitos clivados/número de oócitos cultivados. eNúmero de blastocistos/Número de oócitos cultivados.

Abreviações: CCOs, complexo cumulus oócitos; PIVI, produção in vitro de embriões; OPU, ovum pick-up. Dados

com diferentes letras sobrescritas na mesma linha diferem em P < 0,001.

Qualidade oocitária e PIV de doadoras em pós-parto recente

Para avaliar o impacto do período pós-parto recente na PIV de bovinos de leite e de corte,

realizamos um estudo utilizando vacas Bos indicus (Nelore; Pierucci et al., 2015) e Bos taurus

(Holandesas; Sala, 2013). Aspirações foliculares guiadas por ultrassonografia foram realizadas a

cada 14 dias, num período de 30 a 86 dias pós-parto. As vacas foram separadas em blocos, de

acordo com a raça, quando 50% dos animais estavam ciclando, o que ocorreu no período de 30

dias pós-parto para vacas Bos taurus e 44 dias pós-parto para vacas Bos indicus. Portanto, o estudo

foi dividido em dois experimentos: experimento 1, vacas Bos taurus com CL (n = 14) e sem CL

(n = 11) no período de 30 dias pós-parto; e experimento 2, vacas Bos indicus com CL (n = 7) e

sem CL (n = 8) no período de 44 dias pós-parto.

Somente para vacas Nelore houve efeito significativo do período pós-parto no número de

folículos aspirados, oócitos recuperados e número de oócitos viáveis. Entretanto, tanto o número

de blastocistos (Figura 2) quanto a taxa de blastocistos não diferiu com o aumento de dias de pós-

parto e ciclicidade, tanto para vacas Bos indicus como para vacas Bos taurus (Figura 3).

Memorias

74

Figura 2. Número de blastocistos de acordo com os dias pós parto em vacas Holandesas – Bos

taurus (A) e Nelore – Bos indicus (B).

Memorias

75

Figura 3. Taxa de blastocistos de acordo com os dias pós parto em vacas Holandesas – Bos taurus

(A) e Nelore – Bos indicus (B).

Assim como observado em um estudo prévio, (Matoba et al., 2012), estes resultados não

geram evidência de um efeito de estresse metabólico induzido pela lactação sobre a competência

de desenvolvimento oocitário em vacas de leite e de corte no pós-parto recente, em termos de

habilidade morfológica de desenvolvimento após a FIV. Estudos prévios mostram um entrave na

fertilização durante o pós-parto recente devido à problemas metabólicos, relacionados

principalmente ao balanço energético negativo (Leroy et al., 2012). Nestes estudos, a fertilidade

foi avaliada após a inseminação artificial, com alterações endócrinas e metabólicas significativas

nos microambientes do folículo dominante. Em estudos com OPU-PIV, os folículos são aspirados

com aproximadamente 2 a 3 mm, antes da fase de crescimento do folículo dominante. Este fato

pode, em parte, explicar os diferentes resultados entre os experimentos.

Memorias

76

Qualidade oocitária e PIV durante início ou final da lactação

Uma avaliação clara dos efeitos da lactação sobre a qualidade oocitária pode ser um tanto

quanto complexo. Por exemplo, testar os efeitos isolados do estágio de lactação somente sobre a

qualidade oocitária pode ser confundido com interações de estresse calórico, já que vacas em

lactação são, em geral, mais susceptíveis à esse tipo de estresse. Além disso, vacas em lactação

podem sofrer de diferentes problemas metabólicos durante a progressão da lactação até o período

seco. Adicionalmente, o tipo de dieta e o nível de matéria seca consumida por vacas em lactação

e vacas não lactantes pode influenciar no resultado da OPU-PIV. Apesar disso, os efeitos negativos

do excesso de consumo de energia parecem comprometer a competência de desenvolvimento in

vitro de oócitos, especialmente em vacas de alto escore corporal (Adamiak, 2005). Os mecanismos

que mediam os efeitos negativos sobre a competência oocitária podem estar relacionados à

alterações endócrinas, como hiperinsulinemia, resistência periférica à insulina e aumento da

concentração sanguínea de glicose, ácidos graxos não esterificados (AGNEs) e IGF-I, que podem

interferir com o transporte de glicose nas células embrionárias e também aumentar as taxas de

apoptose.

Vacas lactantes foram selecionadas para produção de leite, levando as vacas leiteiras

modernas a serem mais propensas à desenvolverem resistência periférica à insulina para manter a

produção de leite. Diversos fatores estão envolvidos na indução de resistência insulínica em vacas

leiteiras, inclusive o balanço energético negativo excessivo no pós-parto recente. Intrigantemente,

vacas leiteiras lactantes são mais propensas à resistência insulínica e esta, aparentemente, ocorre

de forma mais evidente em animais com maior escore de condição corporal e que têm maior

consumo de dietas com alto teor de energia. Este é um problema um tanto quanto comum,

particularmente em fazendas leiteiras comerciais que utilizam uma única dieta durante toda a

lactação. Para testar se o estágio da lactação e possíveis interações com a resistência insulínica

podem influenciar a qualidade oocitária, nosso grupo de pesquisa utilizou vacas Holandesas que

estavam em início ou final da lactação no momento da OPU/PIV (Baruselli et al. 2016). Os

resultados deste estudo claramente mostram que a resistência insulínica associada com o final da

lactação (vacas em final de lactação tiveram maiores níveis de insulina circulante) pode diminuir

a qualidade oocitária e a eficiência da PIV. Por exemplo, nós observamos que vacas em estágio

final de lactação tiveram maior número de oócitos recuperador por sessão de OPU. Em contraste,

Memorias

77

o número de blastocistos bem como a taxa de blastocistos foram drasticamente menores em vacas

em estágio final de lactação (Tabela 6). Além disso, um genes pró-apoptóticos estavam mais

expressos em vacas com mais dias em lactação. Estes achados corroboram com estudos prévios,

mostrando que vacas em estágio tardio de lactação estão propensas à desenvolverem resistência

insulínica, o que claramente reduz a viabilidade oocitária durante a PIV.

Tabela 6. Resultados de ovum pick-up e produção in vitro de embriões de vacas Holandesas de alta

produção durante estágio inicial ou final de lactação.

Estágio de Lactação

Valor de P Inicial Final

Nº de animais 70 67

DIM, dias 110,5 ± 20,8 425,6 ± 21,0 N/D

Produção de leite, kg/dia 34,3 ± 1,2 23,4 ± 1,2 <0,0001

Nº de inseminações 0,7 ± 0,2 7,0 ± 0,2 <0,0001

Nº de lactações 2,4 ± 0,1 1,9 ± 0,2 0,05

ECC (escala de 1-5) 2,79 ± 0,06 3,15 ± 0,07 <0,0001

Nº de folículos 14,8 ± 2,4 22,7 ± 2,4 0,0016

Taxa de recuperação, % 46,4 ± 4,4 53,8 ± 4,5 0,1

Nº de oócitos 7,3 ± 2,0 14,3 ± 2,0 0,0004

Nº de oócitos viáveis 4,6 ± 1,6 9,7 ± 1,6 0,001

Nº de oócitos clivados (dia 3) 4,7 ± 0,6 3,9 ± 0,6 0,1

Taxa de clivagem, % 48,0 ± 0,1 41,4 ± 0,1 0,08

Nº de blastocistos (dia 7) 2,2 ± 0,4 1,4 ± 0,3 0,06

Taxa de blastocisto, % 23,0 ± 0,1 13,3 ± 0,1 0,0005

Adaptado de Baruselli et al., 2016.

Qualidade oocitária e PIV em doadoras não-lactantes

A qualidade oocitária tem sido considerada um fator importante que contribui na baixa

fertilidade relatada para vacas leiteiras de alta produção (Walsh et al., 2011). Portanto, levantamos

a hipótese de que procedimentos de OPU-PIV podem resultar em um número maior de blastocistos

por sessão de OPU em doadoras não-lactantes, em comparação com doadoras lactantes. Nossos

dados mostraram um número maior de blastocistos por sessão de OPU em vacas não-lactantes do

que em vacas lactantes (Vieira et al., 2014). Vacas não-lactantes produziram alta taxa de

blastocistos (41,9 vs. 13,4%; P = 0,001) e maior número de embriões viáveis para transferência

por OPU (3,5 ± 0.5 vs. 1,3 ± 0,3; P = 0,003) do que vacas Holandesas em lactação. Resultados

Memorias

78

semelhantes foram observados em um estudo previamente mencionado, realizado pelo nosso

grupo (Tabela 3).

Vacas de leite têm um metabolismo peculiar, que está diretamente relacionado com a

nutrição e com distúrbios do perfil endócrino. O perfil metabólico de vacas leiteiras é comumente

caracterizado por baixas concentrações de P4 e estradiol (Wiltbank et al., 2006) e altas

concentrações de AGNEs e b-hidroxibutirato (BHB; Leroy et al., 2005). Este metabolismo peculiar

têm sido associado com um microambiente folicular com qualidade abaixo da ideal, o que leva ao

comprometimento da qualidade oocitária, resultando em falhas na concepção (Sartori et al., 2002,

2004; Wiltbank et al., 2006; Leroy et al., 2008a, b; Walsh et al., 2011). Portanto, o fato de que

vacas em lactação têm maior dificuldade em manter boa eficiência reprodutiva pode ajudar a

explicar os baixos resultados observados nos programas de OPU-PIV. Deste modo, em programas

de OPU-PIV, o uso de doadoras não-lactantes deve ter preferência devido à maior produção de

embriões por sessão de OPU.

Em outro experimento (Sales et al., 2015), estudamos os efeitos de dietas com diferentes

teores de energia [100 e 170% para mantença (M) e alto teor energético (1,7M), respectivamente]

sobre os parâmetros reprodutivos, endócrinos e metabólicos em vacas não lactantes Bos indicus

(Gir; n = 14) e Bos taurus (Holandesa; n = 14) submetidas à OPU-PIV a cada 14 dias. Medimos

as concentrações plasmáticas de glicose e insulina e realizamos teste de tolerância à glicose e a

quantificação relativa dos transcritos PRDX1, HSP70.1, GLUT1, GLUT5, IGF1R, e IGF2R dos

oócitos recuperados no final do período experimental. Não foram observadas interações de raça e

do teor de energia sobre as variáveis qualitativas (oócitos viáveis, grau de qualidade e índice de

qualidade oocitária) e quantitativas (oócitos recuperados). Também não foi observado nenhum

efeito do teor de energia da dieta sobre as variáveis quantitativas e qualitativas. A produção in vitro

de embriões (taxa de clivagem e de blastocistos e o número de embriões produzidos) foi

semelhante entre as dietas, mas a dieta 1,7M reduziu a PIV de embriões em vacas Bos indicus após

60 dias de tratamento. Além disso, vacas Bos indicus recebendo a dieta 1,7M apresentaram menor

abundância dos genes HSP70.1, GLUT1, IGF1R, e IGF2R. Todas as vacas recebendo a dieta 1,7M

tiveram maiores concentrações de glicose e insulina e também apresentaram maior resistência

periférica à insulina, de acordo com o teste de tolerância a glicose. Estes resultados sugerem que

o consumo de uma dieta de alto teor energético por um longo período reduz a produção in vitro de

embriões em vacas Bos indicus não lactantes por levá-las a um estado hiperinsulinêmico e por

promover a desregulação de genes envolvidos no metabolismo celular.

Conclusões e indicações para o futuro

Concluindo, a PIV de embriões de bovinos de leite ou de corte jovens aparenta ser possível,

no entanto, muitas melhorias são necessárias para aprimorar esta técnica que vêm como um

complemento para testes de genômica. É importante ressaltar que veterinários trabalhando com

OPU-PIV precisam levar em consideração diversos aspectos fisiológicos específicos de cada raça

Memorias

79

(Bos indicus vs. Bos taurus). Além disso, é altamente recomendado que se evite trabalhar com

doadoras de oócitos submetidas à dietas de alto teor energético por um longo período e/ou sob

estresse calórico, fatores estes que podem influenciar negativamente na qualidade oocitária,

reduzindo os resultados da PIV.

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Memorias

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Protocolos de IATF que alargan el proestro y su efecto en la preñez

A. Menchaca1, R. Núñez-Olivera1, C. García-Pintos1, J. de la Mata2,3, E. Huguenine2, G. Bó4,5

1Instituto de Reproducción Animal Uruguay, Fundación IRAUy, Montevideo, Uruguay. 2Actividad Privada. 3Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de La Pampa, Santa Rosa, Argentina.

4Instituto A.P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Villa

María, Villa del Rosario, Córdoba, Argentina. 5Instituto de Reproducción Animal Córdoba, Córdoba, Argentina.

Introducción

El uso de la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) en bovinos no ha parado de crecer en los

países de la región durante los últimos 20 años, demostrando que es una tecnología que ha venido para

quedarse. Su curva de adopción se encuentra en una fase de madurez, habiendo sido primero adoptada por

los más innovadores y hoy ya es utilizada por productores más pragmáticos o conservadores. Este

crecimiento responde a varios factores, y uno de ellos es la eficacia de la tecnología. Los tratamientos para

IATF logran con éxito inducir y sincronizar la ovulación, tanto en vaquillonas como en vacas en anestro y

con cría al pie, es una tecnología de fácil aplicación en el campo, y -si bien requiere un conocimiento

profundo del profesional veterinario que la aplica- no implica un manejo complejo del rodeo, no es

necesario detectar celo, y no requiere equipamiento de alto costo para el Médico Veterinario. Considerando

el beneficio que genera, tampoco implica un gran costo para el productor. Permite una tasa de preñez

aceptable y un impacto en la curva de parición del rodeo de cría como ninguna otra tecnología, además del

impacto en el progreso genético al permitir el uso de toros de elite en la totalidad del rodeo. Podemos

resumirlo en que la IATF es una tecnología de bajo costo y alto impacto.

Los aspectos técnicos de la IATF han sido mejorados en estos años, principalmente mediante el

refinamiento de los protocolos hormonales utilizados. Hace algunos años, desde el ámbito científico se puso

especial énfasis en controlar la dinámica folicular y el momento de la ovulación, con tal éxito que hoy es

difícil mejorar aún más este aspecto. Sin embargo, evidentemente hay otros puntos a mejorar ya que aún

hay un porcentaje considerable de vacas que no se preñan en la inseminación. Con el objetivo de superar el

clásico 50% de preñez que normalmente se obtiene en una IATF en rodeos de cría, recientemente hemos

cambiado el foco para abordar otros nuevos aspectos. Hoy se plantea profundizar en el estudio de estrategias

preovulatorias para mejorar las condiciones postovulatorias. Estas estrategias procuran mejorar la función

del folículo ovulatorio estimulando su crecimiento y actividad en el período comprendido desde el retiro

del dispositivo con progesterona hasta la ovulación, principalmente mediante la inducción de un proestro

más largo. Se pretende así mejorar la actividad del cuerpo lúteo y el medio ambiente uterino luego de la

ovulación, y favorecer así el desarrollo embrionario y el reconocimiento materno de la gestación. Con esto

en mente, recientemente se han desarrollado nuevos protocolos o se han mejorado los ya existentes. Los

resultados muestran mejoras interesantes que vale la pena considerar.

Memorias

86

En esta revisión, se aborda esta idea desde sus bases fisiológicas, se resumen los principales

resultados obtenidos en el laboratorio y en el campo, y se proponen posibles mejoras para el futuro.

Por qué prolongar el proestro

Normalmente en una fase folicular espontánea al final del ciclo estral en la vaca, el intervalo entre la

luteólisis y la ovulación es de unos cuatro días aproximadamente. Sin embargo, en los protocolos

convencionales de IATF este período –comprendido desde el retiro del dispositivo con progesterona hasta

la ovulación- es bastante menor, aproximadamente de unos tres días (65-72 horas aproximadamente, Bó et

al., 2007). Esta menor duración de la fase folicular en los protocolos de IATF ocurre porque el folículo

preovulatorio ya ha alcanzado un buen desarrollo al retirar el dispositivo con progesterona al día 7 u 8, y

principalmente porque la administración de cipionato de estradiol (CPE) al retiro del dispositivo (o

benzoato de estradiol BE a las 24 h, o GnRH a las 48 más tarde), induce el pico de LH y la ovulación en un

intervalo más corto de lo que ocurriría de manera espontánea en un ciclo fisiológico. Si bien la fase folicular

comprende al proestro y al estro, para simplificar la terminología nos referiremos al proestro.

La importancia de prolongar el proestro –o de evitar acortarlo- surge de una serie de estudios en

bovinos donde se evaluó la influencia de la madurez folicular sobre la fertilidad (Bridges et al., 2008; Day,

et al., 2015). Aunque primero se había planteado la hipótesis de que en protocolos que utilizaban GnRH

como inductor de la ovulación el diámetro folicular era un fuerte indicador de fertilidad, el análisis

acumulado de varios estudios ha demostrado que –a un mismo diámetro del folículo ovulatorio- el predictor

más consistente de preñez en vacas Bos taurus es la duración del proestro (Day, 2015). Para confirmar esta

idea, en un experimento en el que las vacas fueron inducidas a ovular un folículo con un diámetro similar

entre ellas, la tasa de preñez fue mayor en las que recibieron GnRH 2,25 días después de la administración

de PGF2alfa (71%) comparado con las que recibieron GnRH 1,25 días después de la PGF2alfa (10%, P<

0,01; Bridges et al., 2010). De manera similar, Binelli y colaboradores han trabajado en un modelo

experimental en el que indujeron un proestro largo vs. un proestro corto, colocando un dispositivo con

progesterona por 7,5 u 8 días, y administrando GnRH a las 48 o 36 horas luego del retiro, respectivamente

(proestro largo vs corto). Con este modelo, han demostrado que las vacas con proestro largo tienen un

folículo más grande que induce un cuerpo lúteo de mayor tamaño, con mayor producción de progesterona

y mayor tasa de preñez (Binelli et al., 2017).

Esta fase preovulatoria puede afectar la funcionalidad uterina y el desarrollo embrionario. En bovinos

de carne y leche está demostrado que existe una alta incidencia de muerte embrionaria durante las primeras

tres semanas luego de la fertilización. Si bien en este período el embrión es responsable de su propia

sobrevivencia ya que debe inducir el reconocimiento materno de la gestación mediante una adecuada

señalización, el pasaje de los primeros estadios embrionarios hasta la etapa de conceptus depende

exclusivamente de las secreciones oviductales y uterinas (Binelli et al., 2017). Este proceso de secreción

secuencial a lo largo de los primeros días luego de la fertilización es programado por la exposición a los

estrógenos durante la fase folicular (proestro/estro), y a la acción de la progesterona durante la fase luteal

temprana. Tanto la producción de estrógenos como la de progesterona es determinada por el desarrollo

folicular preovulatorio, justamente durante la fase folicular (Binelli et al., 2017). En este período, varios

trabajos muestran que un desarrollo adecuado del folículo preovulatorio determina una mayor producción

de estrógenos, y también un mayor tamaño y actividad del cuerpo lúteo subsiguiente. A su vez, la

producción de estrógenos en este período preovulatorio programa la presencia de receptores de

progesterona a nivel endometrial, necesarios para que dicha hormona ejerza su acción sobre las secreciones

Memorias

87

(histotrofo) y el ambiente uterino y permitir así el desarrollo del embrión. Por todo esto, las condiciones

preovulatorias afectarán la actividad luteal, el ambiente uterino y el desarrollo embrionario temprano, y de

esta manera puedan determinar el éxito o el fracaso en el establecimiento de la gestación.

La administración de estradiol exógeno (CPE o BE vs. control) al momento de retirar un dispositivo

intravaginal con progesterona, induce concentraciones más altas de estradiol en sangre durante el período

preovulatorio, que también se relacionaron con menores pérdidas embrionarias en el período entre el

reconocimiento materno de la gestación y la implantación (Madsen et al., 2015). Resultados similares

hemos obtenido con la administración de CPE al retirar el dispositivo (vs. un grupo sin estradiol) con

resultados favorables en la funcionalidad uterina que indican que el estradiol no solo mejora la tasa de

ovulación o mejora la sincronía de la misma, sino que también prepara al endometrio para un mejor

desempeño (Bosolasco et al., en redacción). El problema con el uso de estradiol exógeno al retiro del

dispositivo (o BE 24 h más tarde, o GnRH 48 más tarde), es que -si bien se favorecen estos mecanismos-

también se induce la ovulación de manera prematura, acortando así el proestro y el desarrollo folicular

terminal.

Estos conceptos son relativamente nuevos y por lo tanto no habían sido considerados en el diseño de

los protocolos previos para IATF. Teniendo esto en cuenta, es que se ha propuesto prolongar el proestro en

los protocolos para IATF.

Protocolos con proestro prolongado

El protocolo convencional para IATF en rodeos de cría más utilizado en los países de Sudamérica

consiste en la administración de BE por vía im junto con la administración de progesterona mediante un

dispositivo intravaginal durante 7 u 8 días. Al retirar el dispositivo se administra una dosis de PGF2alfa,

eCG y CPE como inductor de la ovulación, y la IATF se realiza desde las 46 a 56 h luego de retirar el

dispositivo (Figura 1; Menchaca et al., 2013).

Los protocolos con progesterona y estradiol como el indicado anteriormente son los más eficaces

para sincronizar la emergencia de una onda folicular, debido a la supresión combinada de la progesterona

sobre la pulsatilidad de LH y del estradiol sobre la liberación de FSH. Así, con bajos niveles de

gonadotrofinas, los folículos antrales dependientes de las gonadotrofinas dejan de crecer y entran en atresia.

El BE inyectado por vía im será hidrolizado a 17-beta estradiol para metabolizarse algunas horas más tarde,

permitiendo un nuevo aumento en los niveles de FSH para reclutar un nuevo pool de folículos pequeños.

Así se sincroniza la emergencia de una nueva onda folicular que emerge aproximadamente a los 3-4 días

luego de administrar el BE junto con la progesterona. Este recambio folicular asegura que no se generarán

folículos persistentes o con dominancia prolongada, los que han sido asociados a baja competencia del

ovocito y baja fertilidad.

El uso de estradiol al final del protocolo tiene la función de inducir la ovulación. Con este protocolo,

la ovulación ocurre aproximadamente a las 65-72 horas luego del retiro del dispositivo. Cuando al protocolo

con progesterona y eCG aplicado en vacas en anestro se agregó una dosis de CPE, el porcentaje de vacas

que ovularon pasó de 73% (11/15) al 93% (28/30) (Bosolasco et al., en redacción). Si bien estos protocolos

con CPE al retiro del dispositivo (o con BE 24 horas más tarde, o GnRH 48 horas más tarde) son muy

Memorias

88

eficaces para inducir la ovulación, su uso podría acortar el proestro con las consecuencias negativas

descritas anteriormente.

Considerando las fortalezas y debilidades del protocolo convencional, deberíamos mantener el inicio

del tratamiento con BE y progesterona sin modificarlo (para asegurar el recambio folicular), y mejorar el

final del protocolo durante el desarrollo del folículo ovulatorio (para asegurar la ovulación manteniendo un

proestro adecuado).

El primer protocolo de IATF con proestro prolongado fue propuesto en la Universidad del Estado de

Ohio por el equipo conducido por el Dr. Michael Day (Bridges et al., 2008). Este protocolo conocido como

Co-Synch de 5 días, es un tratamiento basado en GnRH –en lugar de estradiol- al colocar el dispositivo con

progesterona. En los últimos años ha ganado espacio entre los profesionales y productores de Norteamérica,

al haberse demostrado que permite tasas de preñez más alta que las obtenidas con el protocolo convencional

Co-Synch de 7 días que se utilizaba anteriormente (Day, 2015). La base fisiológica de este tratamiento fue

reducir el tiempo de inserción del dispositivo de progesterona (de 7 a 5 días) para evitar el efecto adverso

de la ovulación de un folículo persistente sobre la fertilidad de las vacas que no ovulaban a la primera

GnRH, y a la vez prolongar el período del proestro permitiendo altos niveles endógenos de estrógenos. En

el protocolo convencional utilizado en EEUU no se utiliza estradiol ni al colocar ni luego de retirar el

dispositivo, utilizando GnRH en ambos momentos. El uso de GnRH como inductor de la ovulación se

administra a las 60 horas luego del retiro del dispositivo (al momento de realizar la IATF). En el nuevo Co-

Synch de 5 días, además de retirar dos días antes el dispositivo, también se atrasa la IATF y la GnRH a las

72 horas, alargando así el proestro. Utilizando este protocolo, el efecto favorable del proestro prolongado

estuvo asociado a mayores concentraciones de estradiol circulante antes de la ovulación y mayores

concentraciones de progesterona en la fase luteal subsiguiente (Bridges et al., 2014). En un trabajo previo

(Bridges et al., 2008) estos investigadores compararon un protocolo Co-Synch de 7 días con IATF a las 60

horas (protocolo convencional en USA) y un protocolo Co-Synch de 5 con IATF a las 72 horas (protocolo

con proestro prolongado) en vacas de carne con cría. En ese estudio, la tasa de preñez fue 10,5 puntos más

alta con el protocolo Co-Synch de 5 días (70,4%) que con el Co-Synch de 7 días (59,9%, n= 616 Angus;

P< 0,01). Resultados similares fueron reportados por otros autores, con una tasa de preñez

significativamente más alta en vacas tratadas con Co-Synch de 5 días que con Co-Synch de 7 días (Whittier

et al., 2013).

Este protocolo, si bien mejora la tasa de preñez comparado con el protocolo convencional utilizado

en EEUU, al requerir el uso de GnRH al colocar el dispositivo genera una serie de dificultades al momento

de aplicarlo (Bó et al., 2016). Se han evaluado diversas modificaciones para superar algunas de estas

limitantes en el protocolo Co-Synch de 5 días, las que han sido revisadas en profundidad en trabajos previos

(Bó et al., 2016; Menchaca et al., 2017). La mejor estrategia para resolverlo es sustituir el uso de GnRH

por BE al colocar el dispositivo. En los países en que el BE está disponible siempre es preferible evitar el

uso de GnRH. Por este motivo, desde hace algunos años estamos trabajado en un nuevo protocolo con

proestro prolongado, pero iniciando el tratamiento con BE en lugar de GnRH. Este protocolo es denominado

J-Synch, y difiere en varios aspectos con el Co-Synch de 5 días.

Memorias

89

Figura 1. Representación esquemática del protocolo convencional y del protocolo J-Synch con proestro

prolongado para IATF en vacas y vaquillonas. Ambos protocolos inician el tratamiento con benzoato de

estradiol por vía im y progesterona (P4) por vía intravaginal, y se administra gonadotrofina coriónica

equina (eCG) y prostaglandina (PG) F2alfa al retirar el dispositivo con progesterona. En el protocolo

convencional el dispositivo se retira a los 7-8 días y en el protocolo J-Synch a los 6 días. En el protocolo

convencional se utiliza cipionato de estradiol (CPE) como inductor de la ovulación (al retirar el

dispositivo) y en el protocolo J-Synch se utiliza GnRH (al momento de la IATF).

Protocolo J-Synch

El protocolo J-Synch consiste en la administración de una dosis de 2 mg de BE im aplicada al colocar

un dispositivo con progesterona durante 6 días (en lugar de 8 en el protocolo convencional), administrando

como inductor de la ovulación GnRH a las 72 h más tarde (en lugar de CPE al retirar el dispositivo). La

IATF se realiza a las 72 horas (en lugar de a las 48 horas como en el protocolo convencional) junto con la

administración de GnRH. Este protocolo se muestra en la Figura 1. Desde el 2013 se han realizado diversos

experimentos de laboratorio y de campo para desarrollar y validar este tratamiento. Parte de esta

información ha sido publicada en diferentes congresos y revistas internacionales (de la Mata y Bó, 2012;

de la Mata et al., 2015, 2018; Bó et al., 2016, 2018; Menchaca et al., 2017). Se resumen aquí estos estudios

y se presentan varios avances más recientes.

Considerando que el protocolo convencional más probado, validado y utilizado por los veterinarios

en Sudamérica es el tratamiento de 7 u 8 días con progesterona y estradiol, cualquier nueva propuesta que

Memorias

90

surja debe compararse con este protocolo. Por este motivo, en una serie de experimentos se comparó la tasa

de preñez en vaquillonas que recibieron el protocolo J-Synch vs. el protocolo convencional.

Los primeros resultados se pueden resumir en dos experimentos realizados en las estaciones de

invierno y primavera en La Pampa, Argentina (de la Mata et al., 2015). Las vaquillonas en el grupo J-Synch

recibieron IATF junto con la administración de GnRH (72 horas después del retiro del dispositivo de

progesterona), mientras que las del grupo convencional recibieron IATF a las 54 horas después del retiro

del dispositivo. El protocolo convencional es el que se describe en la Figura 1 y en este caso no se administró

eCG en ninguno de los dos grupos experimentales. El primer experimento se realizó durante el invierno

con vaquillonas con una condición corporal moderada (4 a 6 en la escala 1 a 9) al inicio del tratamiento,

que perdieron un punto en promedio durante los 30 días luego de la IATF debido a las condiciones de

sequía que se dieron en ese invierno. Los resultados fueron opuestos a los esperados, las vaquillonas con J-

Synch se preñaron menos que con el protocolo convencional (37,8%, 104/275 vs. 49,3%, 138/280,

respectivamente; P< 0,05). Considerando que estos resultados habían sido obtenidos en condiciones críticas

de alimentación -que no son las recomendables para aplicar esta tecnología- y además sin el uso de eCG,

durante la primavera siguiente se realizaron algunos trabajos adicionales en vaquillonas con mejor

condición corporal (6 a 7 puntos) y ganando peso después del inicio del tratamiento. Este experimento se

realizó en cuatro localidades que incluían 583 vaquillonas cruza Angus y Hereford. En tres de ellos se

comparó la tasa de preñez entre ambos protocolos con IATF, y en uno de ellos se asoció la IATF a la

detección de celo utilizando pintura en la base de la cola al retirar el dispositivo. La tasa de preñez sumando

todas las réplicas favorecieron al protocolo J-Synch comparado al protocolo convencional, que fue 60,6%

(157/259) y 47,9% (12/263) respectivamente (P< 0,05). Cuando se analizaron por separado las tres réplicas

sin detección de celo y por otra parte la réplica con detección de celo, la diferencia no alcanzó a ser

estadísticamente significativa en las tres replicas con IATF (55,7%, 87/156 para J-Synch vs. 49,3%, 78/158

para convencional respectivamente; P= 0,3), y sí lo fue en la réplica con IATF asociado al uso de pintura

(68,0%, 70 /103 vs. 46,6%, 49/105 respectivamente; P<0.05). Los resultados están descritos en profundidad

en el Simposio de IRAC de 2015 (de la Mata et al., 2015). Estos resultados alentaron la ejecución de nuevos

experimentos que realizamos en Uruguay en un mayor número de animales, en condiciones ambientales

normales para la época de servicio, y siempre con el uso de eCG administrada al momento de retirar el

dispositivo. Desde 2014 se han utilizado más de 25 mil vaquillonas y vacas sometidas a diseños

experimentales sólidos para alcanzar conclusiones robustas que nos permitan hacer recomendaciones

claras.

En un estudio comparamos la tasa de preñez obtenida con ambos protocolos (convencional y J-

Synch) en un total de 2.349 vaquillonas ubicadas en 5 establecimientos del norte de Uruguay. Todas las

vaquillonas fueron clasificadas por condición corporal y por actividad ovárica mediante ecografía al iniciar

el tratamiento. Los tratamientos fueron aplicados como se indica en la Figura 1, en ambos protocolos

administrando 300 UI de eCG al retirar el dispositivo. Las vaquillonas del grupo J-Synch (n= 1.125) fueron

inseminadas a las 60 horas o a las 72 horas luego de retirar el dispositivo, mientras que las del grupo

convencional (n= 1.224) se inseminaron a las 48 horas o a las 56 horas del retiro del dispositivo. Los

resultados de este experimento se muestran en la Tabla 1. El protocolo J-Synch permitió aumentar

significativamente (P< 0,01) la tasa de preñez, que fue en promedio 5,4 puntos porcentuales más alta que

con el protocolo convencional (56,1%, 631/1.125 vs. 50,7%, 620/1.224, respectivamente; P< 0,05). La

primera conclusión es que al prolongar el proestro se logra una mayor tasa de preñez que con el protocolo

convencional.

Memorias

91

Tabla 1. Tasa de preñez obtenida con el protocolo J-Synch vs. el protocolo convencional para IATF en

vaquillonas taurinas.

Protocolo

J-Synch

Protocolo convencional P

Efecto principal del protocolo

Total, n=2.349

56,1% (631/1.125) 50,7% (620/1.224) <0,01

Resultados por cada réplica

Réplica I (n=150)

87% con CL

IATF AM 53,8% (21/39) 54,1% (20/37) NS

IATF PM 52,9% (18/34) 47,5% (19/40) NS

Réplica II (n=420)

54% con CL

IATF AM 71,8% (79/110) 66,0% (68/103) NS

IATF PM 59,6% (59/99) 54,6% (59/108) NS

Réplica III (n=396)

86% con CL

IATF AM 55,4% (56/101) 52,5% (51/97) NS

IATF PM 54,1% (53/98) 45,0% (45/100) NS

Réplica IV(n=540)

59% con CL

IATF AM 55,6% (80/144) 48,5% (65/134) NS

IATF PM 53,3% (65/122) 41,4% (58/140) 0,06

Réplica V (n=843)

39% con CL

IATF AM 51,3% (99/193) 50,8% (120/236) NS

IATF PM 54,6% (101/185) 50,2% (115/229) NS

Total =2.349 IATF AM 57,1% (335/587) 53,4% (324/607) NS

IATF PM 55,0% (296/538) 48,0% (296/617) 0,05

P NS 0,06

Además de la mayor tasa de preñez promedio obtenida con el protocolo J-Synch, en cada una de las

réplicas que se muestran en la Tabla 1 la diferencia estuvo a favor de este tratamiento (entre 2,4 y 9,1 puntos

porcentuales más alta que el protocolo convencional). Es interesante que en ninguna de las réplicas el

protocolo J-Synch se comportó peor que el tratamiento convencional. Es bueno considerar que para alcanzar

diferencias significativas fue necesario comparar un gran número de animales, dado que cuando se analiza

cada réplica por separado la diferencia no alcanza valor significativo. Por este motivo no deberíamos sacar

conclusiones de trabajos con pocos animales, o con bajo poder estadístico.

Desde el punto de vista de la aplicación en el campo, para el protocolo J-Synch no hubo diferencias

entre la IATF a las 60 horas vs. 72 horas, lo que permitiría mantener una amplia ventana de inseminación

durante todo el Día 9, e inseminar 400 a 500 vacas por día al igual que con el protocolo convencional.

Memorias

92

¿Por qué J-Synch mejora la tasa de preñez?

El resultado obtenido a favor del protocolo J-Synch en las vaquillonas, llevó a plantear nuevos

experimentos tanto para comprender mejor la causa de esta mejora, así como para proponer nuevas ideas

con el objetivo de mejorar dicho tratamiento. En el siguiente estudio se comparó la dinámica folicular, la

actividad luteal y la funcionalidad uterina en vaquillonas de carne tratadas con el protocolo J-Synch vs. el

protocolo convencional de 7 días con estradiol (de la Mata et al., 2018). Las vaquillonas del grupo J-Synch

ovularon 93,7 ± 12,9 horas después del retiro del dispositivo intravaginal, mientras que las del grupo

convencional ovularon 65,0 ± 13,7 horas después del retiro del dispositivo (P< 0,05). Con este resultado

se demostró que la duración del proestro efectivamente es más prolongado con el protocolo J-Synch (28,7

horas de diferencia). Podemos pensar que el folículo ovulatorio al crecer en ausencia de progesterona por

más tiempo produzca más estradiol que en el protocolo convencional. Esta idea además es sustentada por

el hecho de que la tasa de crecimiento de este folículo desde el retiro del dispositivo hasta la ovulación fue

mayor en el protocolo J-Synch que en el protocolo convencional (1,3 ± 0,4 vs. 1,0 ± 0,4 mm/día,

respectivamente; P< 0,06). Cuando se determinaron las concentraciones de estradiol circulante no

encontramos diferencias entre ambos protocolos, lo que podría interpretarse como que el folículo ovulatorio

con el protocolo J-Synch fue capaz de producir estradiol suficiente para alcanzar niveles circulantes

similares a los inducidos por la administración exógena de CPE en el protocolo convencional. Todo esto

(mayor tasa de crecimiento asociado a niveles de estradiol en sangre similares) nos lleva a sugerir que el

folículo ovulatorio en el protocolo con proestro prolongado produciría más estrógeno y por más tiempo que

en el protocolo convencional.

Además de esto, este efecto sobre el folículo ovulatorio quizás también podría tener cierto beneficio

sobre la actividad luteal y la programación uterina luego de la ovulación como ha sido propuesto

previamente (Binelli et al., 2017). Para evaluarlo, en este experimento también se determinó la actividad

luteal y el ambiente uterino luego de la ovulación (de la Mata et al., 2018). Las concentraciones séricas de

progesterona fueron más altas (4,7 ± 0,2 vs. 3,9 ± 0,1 ng/ml; P< 0,05) y el cuerpo lúteo fue más grande

(398,7 ± 10,0 vs. 357,3 ± 10 mm3; P< 0,05) en los días 7 a 12 después de la ovulación en las vaquillonas

del grupo J-Synch comparadas con en el grupo convencional, respectivamente (Figura 2). En este mismo

estudio, realizamos biopsias endometriales a los 6 días luego de la ovulación y evaluamos la presencia y la

expresión génica de receptores de progesterona, de estradiol e IGF1. Los resultados mostraron una menor

expresión de transcriptos de receptores de progesterona (P< 0,05), lo que asociado a una mayor

concentración sérica de esta hormona estaría indicando una downregulation más avanzada que en el

protocolo convencional. Estos estudios fueron realizados mediante real time PCR e inmunohistoquímica y

reflejan un adelanto en la programación endometrial, lo que en general pueden asociarse a una mejor

funcionalidad uterina.

Estos resultados en su conjunto explicarían, al menos en parte, la mejor tasa de preñez obtenida en

los experimentos previos con el protocolo J-Synch (de la Mata et al., 2018). En suma, la información

muestra que este protocolo: a) aumenta el intervalo entre el retiro del dispositivo y la ovulación, b) permite

una mayor tasa de crecimiento del folículo ovulatorio, c) genera un cuerpo lúteo de mayor tamaño, d) induce

mayores concentraciones de progesterona en sangre, y e) favorece la programación del ambiente uterino

para recibir al embrión.

Memorias

93

Figura 2. Desarrollo folicular, tamaño del cuerpo lúteo y concentraciones séricas de progesterona en

vaquillonas que recibieron el protocolo J-Synch con proestro prolongado o el protocolo convencional (de

la Mata et al., 2018).

Mejoras al Protocolo J-Synch

Luego de estos resultados que muestran la mejor tasa de preñez obtenida con el protocolo J-Synch

(en vaquillonas y con eCG), se han realizado varios experimentos para refinar su diseño y mejorarlo. Estas

mejoras estuvieron focalizadas en aumentar la tasa de preñez, hacer más fácil la aplicación del protocolo

en el campo, disminuir el costo del tratamiento y hacerlo más versátil para aplicarlo en diferentes

condiciones.

Uso de eCG

Uno de los aspectos evaluados en este protocolo fue la necesidad o no de asociar el uso de eCG al

retirar el dispositivo (Menchaca et al., 2017). Trabajos previos con el protocolo convencional habían

mostrado el beneficio de utilizar la eCG, tanto en vacas como en vaquillonas (Menchaca et al., 2013; Núñez-

Olivera et al., 2014, 2018). Con el protocolo convencional, considerando estos resultados sería un error no

aplicarla y en nuestra práctica utilizamos la eCG de rutina como parte del protocolo (300 UI en vaquillonas

y 400 UI en vacas). Para evaluar su uso en el protocolo J-Synch, realizamos dos experimentos, uno de

campo para conocer la tasa de preñez y otro más intenso para evaluar la dinámica folicular y los perfiles

hormonales. En el trabajo de campo se utilizaron 2.598 vaquillonas Bos taurus en 6 réplicas, todas

recibieron el protocolo J-Synch y la mitad recibió o no recibió 300 UI de eCG al retirar el dispositivo. La

IATF se realizó a las 60 o 72 horas luego de retirar el dispositivo. La tasa de preñez fue mayor cuando se

administró eCG (P< 0,05), y no hubo interacción entre el tratamiento con eCG y la presencia de cuerpo

lúteo en las vaquillonas, es decir que el beneficio de la eCG ocurre tanto en vaquillonas cíclicas como en

anestro (con presencia o ausencia de cuerpo lúteo al iniciar el tratamiento). Los resultados fueron discutidos

Memorias

94

en trabajos previos en este mismo Simposio (Menchaca et al., 2017). En otro experimento, para comprender

por qué con eCG se incrementa la fertilidad, realizamos ecografías diarias para evaluar la dinámica

folicular, se tomaron muestras de sangre para evaluar las concentraciones de estradiol y progesterona, y se

realizaron biopsias de útero para estudiar el ambiente uterino. Este experimento se realizó en vaquillonas

en anestro y los resultados muestran que la eCG permitió un mayor porcentaje de vaquillonas que ovulan

luego del tratamiento, mayores concentraciones de estradiol preovulatorio, y a una menor incidencia de

cuerpos lúteos de regresión temprana luego de la ovulación (Núñez-Olivera et al., en redacción).

Considerando estos resultados en conjunto, al igual que con el protocolo convencional, el uso de eCG es

recomendable también en el protocolo J-Synch.

Momento de IATF

Otra mejora que se ha logrado con el protocolo J-Synch fue el ajuste del momento de IATF. En un

estudio se comparó la tasa de preñez obtenida con la IATF (+ GnRH) a las 48, 60 o 72 horas luego de retirar

el dispositivo con progesterona. De esta manera, a la vez se estaba comparando un proestro corto (IATF +

GnRH a las 48 h) vs. un proestro largo (IATF + GnRH a las 72 h). Los resultados fueron publicados con

mayor detalle en el International Congress on Animal Reproduction en Tours (Núñez-Olivera et al., 2016).

Para resumirlo, se utilizaron 911 vaquillonas taurinas, todas tratadas con el protocolo J-Synch con eCG al

retirar el dispositivo. Se realizaron tres réplicas para evaluar la tasa de preñez y en dos de ellas se determinó

además el diámetro del folículo ovulatorio al retirar el dispositivo y al inseminar. Los resultados se muestran

en la Figura 3.

Figura 3. Resultados al inseminar vaquillonas con diferente duración del proestro inducido con la IATF +

GnRH a las 48, 60 y 72 horas luego de retirar un dispositivo con progesterona (DIB) colocado por 6 días

(protocolo J-Synch).

Memorias

95

Estos resultados muestran la conveniencia del proestro largo de 72 horas y no adelantar la IATF a

las 48 horas. En caso de inseminar todo un rodeo sin el uso de pintura para detectar el celo, se recomienda

realizar la IATF a las 72 horas luego de retirar el dispositivo.

Uso de pintura al retirar el dispositivo

Los resultados del experimento anterior indican que habría que realizar la IATF no antes de las 72

horas. Sin embargo, también muestran que a las 48 horas ya hay un alto porcentaje de vaquillonas en celo

y que a las 72 horas algunas de ellas ya han ovulado. Por este motivo, formulamos la hipótesis que sólo en

estas vaquillonas quizás convendría adelantar la IATF a las 60 horas. Para esto deberíamos dividir la

inseminación aplicándola antes solo en aquellas vaquillonas que entran en celo más temprano. Para evaluar

esto se realizó el siguiente experimento en 1.283 vaquillonas de razas taurinas. Luego de aplicar el protocolo

J-Synch en todo el rodeo, se utilizó pintura en la base de la cola al momento de retirar el dispositivo (junto

con la PGF2alfa y la eCG). La mitad de las vaquillonas recibieron la IATF + GnRH a las 60 horas y la otra

mitad a las 72 horas luego del retiro del dispositivo. En el momento de la IATF se registró mediante la

lectura de la pintura si cada vaquillona estaba o no en celo. El resultado en la tasa de preñez fue muy claro.

En las vaquillonas que estaban en celo a las 60 horas, la tasa de preñez fue similar cuando la IATF se realizó

a las 60 o a las 72 horas. Sin embargo, aquellas vaquillonas que no estaban en celo a las 60 horas, la tasa

de preñez fue más alta cuando se inseminaron a las 72 horas que cuando se inseminaron a las 60 horas de

retirado el dispositivo. Estos resultados muestran que adelantar la IATF en las vaquillonas en celo no tiene

ventajas en términos de tasa de preñez, pero nos permite aplicar esta estrategia en programas a gran escala

en rodeos grandes donde se puede comenzar a inseminar a las 60 horas aquellas hembras en celo, y dejar

para las 72 horas a las que no han entrado en celo. En las vaquillonas que no están en celo es conveniente

no adelantar la IATF manteniéndola en las 72 horas.

¿Es necesario utilizar GnRH?

En todos estos trabajos de campo hemos visto que la mayoría de las vaquillonas están en celo al

momento de la IATF (momento en que se administra GnRH). Considerando que en este protocolo no se

administra estradiol exógeno, podemos pensar que en este celo espontáneo las concentraciones de estradiol

endógeno deberían ser suficientes para inducir el pico preovulatorio de LH. Si esto ocurre, quizás no sería

necesario agregar un inductor de la ovulación de manera exógena como la inyección de GnRH que se

administra junto con la IATF. Para evaluarlo, en el siguiente experimento se utilizaron 1.879 vaquillonas

taurinas, aquellas que estaban en celo a las 60 horas recibieron la IATF en ese momento, y en la mitad se

administró una dosis de GnRH y en la otra mitad no se administró GnRH. El porcentaje de vaquillonas que

estaba en celo en este momento (60 horas) fue el 85% del rodeo (1.594/1879). Las vaquillonas que no

estaban en celo a las 60 horas (15% del rodeo) recibieron la IATF a las 72 horas, y en este caso todas

recibieron GnRH ya que la ausencia de estro indica la necesidad de administrar un inductor de la ovulación.

La tasa de preñez fue similar entre las vaquillonas en celo que recibieron o no la inyección de GnRH (56,4%,

452/802 vs. 58,6%, 464/792, respectivamente; P= NS). Se demuestra así que en aquellas hembras en celo,

no es necesario el uso de GnRH y podemos así disminuir el costo del protocolo. Teniendo en cuenta que en

este trabajo el 85% de las vaquillonas estaba en celo, el impacto en el menor costo del tratamiento es

Memorias

96

considerable. Esta mejora la hemos incorporado en la aplicación de este protocolo en programas

comerciales.

¿Atrasamos la IATF en vaquillonas?

Considerando el resultado anterior que muestra que en aquellas vaquillonas que entran en celo

temprano se obtiene un tasa de preñez similar con la IATF a las 60 o 72 horas, y que aquellas que no están

en celo a las 60 horas no deben inseminarse antes de las 72 horas, en un siguiente experimento se evaluó

atrasar más la inseminación en estas vaquillonas que no entran en celo. Evaluamos entonces inseminar a

las 72 horas todas las vaquillonas en celo, y a las que no están en celo inseminarlas a las 72 o a las 80 horas.

Para esto se utilizaron 1.289 vaquillonas Angus de 14 meses en cuatro réplicas de las cuales el 47,4%

(611/1.289) estaba ciclando (presencia de cuerpo lúteo por ecografía al iniciar el protocolo). Todas

recibieron el mismo protocolo J-Synch que en los experimentos anteriores (Figura 1), utilizando

dispositivos intravaginales con 0,5 g de progesterona que se retiraron en la mañana del día 6 del tratamiento

junto con la administración de 300 UI de eCG y PGF2alfa. Todas las vaquillonas se pintaron en la grupa al

retirar el dispositivo y se leyó la pintura a las 72 horas del retiro. Las vaquillonas que estaban en celo se

inseminaron a las 72 horas (sin GnRH). Las vaquillonas que no estaban en celo fueron divididas en dos

grupos experimentales para recibir la IATF (con GnRH) a las 72 horas o a las 80 horas del retiro del

dispositivo (Día 9 del protocolo, en la mañana o en la tarde respectivamente). Los resultados se muestran

en la Figura 4.

Memorias

97

Figura 4. Tasa de preñez en vaquillonas que recibieron el protocolo J-Synch con IATF a las

72 horas (vaquillonas en celo) o a las 72 u 80 horas (vaquillonas sin celo) del retiro del dispositivo

con progesterona. Para a vs. b, P< 0,05.

El 84% (1.082/1.289) de las vaquillonas estaba en celo a las 72 h, y la tasa de preñez de estos

animales con la IATF a las 72 horas fue 56,7% (614/1.082). En aquellas que no estaban en celo y se

inseminaron a las 72 u 80 horas, la tasa de preñez fue menor (P< 0,05), siendo 41,7% (43/103) y 31,7

(33/104) para cada grupo, respectivamente. Los resultados muestran que la tasa de preñez en aquellas

vaquillonas que no están en celo a las 72 horas, no se mejora atrasando la IATF a las 80 horas.

¿Adelantamos la GnRH?

En el siguiente experimento se profundizó en aquellas hembras que no entran en celo, y se evaluó

separar la GnRH de la IATF, adelantando la GnRH a las 64 horas y manteniendo la IATF a las 72 horas de

retirar el dispositivo. Se utilizaron 1.825 vaquillonas Angus en seis réplicas de las cuales el 47,8%

(873/1.825) estaba ciclando (presencia de cuerpo lúteo por ecografía al colocar el dispositivo). Todos los

animales recibieron el mismo protocolo que en el experimento anterior (J-Synch) retirando el dispositivo

en la tarde de día 6 junto con la administración de eCG y PGF2alfa. Se colocó pintura en la base de la cola

y se leyó la pintura a las 64 horas más tarde, habiendo 83% en celo (1.518/1.825). Todas estas vaquillonas

en celo recibieron la IATF en ese momento (sin GnRH). Aquellas que no estaban en celo a las 64 horas se

asignaron a dos grupos experimentales para recibir GnRH a las 64 horas (n= 150) o a las 72 horas (n= 157),

y todas se inseminaron a las 72 horas. En estas vaquillonas se volvió a leer la pintura a las 72 horas en el

momento de la IATF. La tasa de preñez en las vaquillonas en celo fue 61,3% (931/1.518), mientras que en

las que no entraron en celo y recibieron GnRH a las 64 horas o 72 horas fue 57,3% (86/150) y 52,9%

(83/157). Los resultados se muestran en la Figura 5.

Memorias

98

Figura 5. Tasa de preñez en vaquillonas con J-Synch que no entraron en celo a las 64 horas y recibieron

GnRH a las 64 o a las 72 horas (con la IATF a las 72 horas). La gráfica de la izquierda muestra la tasa de

preñez mostrando estos tres grupos, y en la gráfica de la derecha se muestran las vaquillonas que entraron

en celo a las 72 horas. Para diferentes letras (a vs. b), P<0,05.

Considerando estos resultados en conjunto, el momento óptimo para la IATF en las vaquillonas en

celo puede ser a las 60-64 horas o a las 72 horas (sin GnRH). Para las vaquillonas que no entran en celo

con este protocolo, la IATF se debe realizar a las 72 horas (ni antes ni después) siempre con una dosis de

GnRH la que se puede administrar al momento de la IATF o adelantarla a las 60-64 horas.

J-Synch en vaquillonas cebú

Todos los resultados presentados previamente fueron generados en vaquillonas Bos taurus en

Uruguay y Argentina. En vaquillonas Bos indicus han sido reportados tres trabajos comparando la tasa de

preñez del protocolo J-Synch vs. el protocolo convencional, dos en Brasil y uno en Paraguay. Ambos

protocolos fueron aplicados como se describen en la Figura 1, siempre como eCG al retirar el dispositivo.

En uno de ellos no hubo diferencias significativas, y en los otros dos los resultados fueron superiores para

el protocolo J-Synch. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Tasa de preñez obtenida con el protocolo J-Synch y el protocolo convencional en vaquillonas Bos

indicus.

J-Synch Convencional Valor P Referencia

Brasil (Nelore) 53% (207/391) 54% (211/394) NS Motta et al., SBTE 2016

Brasil (Nelore) 63% (68/108) 48% (64/133) P<0.01 Pincinato et al., SBTE 2018

Paraguay (Brangus) 63% (51/81) 51% (40/79) P<0.05 Frutos et al., 2018

Memorias

99

J-Synch en vacas

La mayor parte de los experimentos con el protocolo J-Synch fueron realizados en vaquillonas y

existe poca información de su uso en vacas en anestro posparto. Para trabajar en estas condiciones, primero

realizamos una serie de estudios con IATF asociada al destete precoz utilizando el protocolo J-Synch. Las

preguntas a responder fueron: ¿a qué hora es conveniente realizar la IATF? ¿es necesario utilizar pintura?

y en caso de utilizar pintura ¿podría omitirse la administración de GnRH? Se realizó un experimento en 10

réplicas sobre un total de 1.900 vacas con 60 a 90 días posparto, donde todas las vacas fueron separadas

definitivamente de sus terneros entre uno a cinco días antes de iniciar el tratamiento para IATF. El protocolo

fue el mismo que el descrito para vaquillonas (Figura 1), utilizando un dispositivo de 0,5 g de progesterona

junto con una dosis de 2 mg de BE al Día 0 en la tarde, una dosis de PGF y eCG (400 UI en vacas) al Día

6 en la tarde al retirar el dispositivo, y la IATF al Día 9 durante todo el día (entre las 60 y 72 horas del retiro

del dispositivo). En este experimento como en los anteriores, todos los productos fueron elaborados por

Syntex, Argentina. Todas las vacas fueron pintadas en la base de la cola al retirar el dispositivo, y la pintura

fue chequeada 60 horas más tarde. La mitad de las vacas que manifestaron estro recibieron una IATF a las

60 h y la otra mitad a las 72 h, y a su vez la mitad de los animales en cada hora de IATF recibió GnRH y la

otra mitad no recibió ningún inductor de la ovulación. Las vacas que no manifestaron estro a las 60 horas,

también se dividieron en dos grupos para recibir la IATF a las 60 o a las 72 horas, pero en este caso siempre

con una dosis de GnRH junto con la inseminación. En este estudio, a las 60 horas luego de retirar el

dispositivo el 80% (1.515/1.900) de las vacas tenían la pintura borrada indicando que ya habían manifestado

estro; en estas vacas no hubo diferencia entre las que recibieron IATF a las 60 o las 72 horas (66,0%,

529/802 vs. 63,0%, 450/714, respectivamente). En estas vacas en celo tampoco hubo diferencias

significativas entre las que recibieron o no recibieron GnRH (66,0%, 499/756 vs. 63,0%, 479/760,

respectivamente). Por otra parte, en las que no presentaban celo a las 60 horas tampoco hubo diferencia en

la tasa de preñez cuando recibieron la IATF/GnRH a las 60 o a las 72 h (53,9%, 112/208 vs. 55,1%, 97/176,

respectivamente). La única diferencia encontrada en la tasa de preñez en este experimento, independiente

de la hora de IATF y de la administración o no de GnRH, fue entre las que habían manifestado estro (64,6%,

979/1.516) y las que no habían manifestado estro a las 60 horas (54,4%, 209/384). Estos resultados indican

que en vacas con destete precoz es posible aplicar el protocolo J-Synch y obtener resultados aceptables

(62,5% en este caso) y realizar la IATF entre las 60 y 72 horas con resultados similares entre ambos

momentos de inseminación. Asimismo, si se utiliza pintura al retirar el dispositivo es posible evitar el uso

de GnRH al momento de la IATF en aquellas vacas que manifestaron estro.

Si bien estos resultados fueron aceptables y durante varios años hemos utilizado este protocolo J-

Synch en vacas con destete precoz, no existían estudios que comparen ambos protocolos en vacas en anestro

con cría al pie. Para evaluar esto se hicieron dos experimentos en vacas en anestro y con cría al pie,

comparando el protocolo J-Synch y el protocolo convencional. El Experimento 1 se realizó en San Luis

(Argentina) con 973 vacas (72% en anestro) y el Experimento 2 se realizó en Rocha (Uruguay) con 1.183

vacas (87% en anestro). Las condiciones de manejo y alimentación en San Luis no son las más favorables

debido a factores ambientales y oferta forrajera, y en Uruguay si bien la oferta forrajera en general es mejor,

el porcentaje de anestro también era alto. De esta manera se pretendía comparar ambos tratamientos en

condiciones no tan favorables, tal como ocurre en muchos casos donde se aplican los programas de IATF.

Memorias

100

En el Experimento 1 en Argentina (Huguenine et al., no publicado) las vacas con el protocolo

convencional recibieron la IATF a las 48 o 56 horas de retirar el dispositivo, y con el protocolo J-Synch a

las 64 o 72 horas de retirar el dispositivo. En el protocolo convencional todas las vacas en celo a las 48

horas (detectado por el uso de pintura) recibieron la IATF en ese momento, y las que no estaban en celo

recibieron GnRH en la mañana y fueron inseminadas en la tarde a las 56 horas. En el protocolo J-Synch las

vacas despintadas (en celo) a las 64 horas recibieron la IATF en ese momento, y las que no estaban en celo

recibieron GnRH a las 64 horas y la IATF en la tarde a las 72 horas. El resultado en la tasa de preñez fue

más bajo con el protocolo J-Synch (49,1%, 244/497) que con el protocolo convencional (59,9%, 287/479,

P< 0,05). El porcentaje de vacas en celo en el protocolo J-Synch fue 50,5% (251/497) a las 64 horas y en

el protocolo convencional fue 55,1% (264/479) a las 48 horas (P= 0,15). Tanto para el protocolo J-Synch

como para el convencional, las vacas que presentaron celo se preñaron más (57,8%, 145/251 y 67,8%,

179/264, respectivamente; P< 0,05) que las que no estaban en celo (40,3%, 99/246 y 50,2%, 108/215,

respectivamente; P< 0,05).

Considerando este resultado, es probable que en vacas con cría que reciben el protocolo J-Synch (con

GnRH a las 64 horas) sea necesario prolongar aún más el proestro y atrasar la inseminación. Sobre todo

considerando que la mitad del rodeo no estaba en celo cuando se realizó la IATF a las 64 horas (50% en

celo). Por este motivo, en el Experimento 2 atrasamos la IATF en el protocolo J-Synch y la mitad de las

vacas fueron inseminadas a las 72 horas y la otra mitad a las 84 horas luego de retirar el dispositivo. En este

experimento, para ambos momentos de IATF se inseminaron vacas en celo y vacas sin celo (mediante el

chequeo de la pintura al momento de inseminar). Por su parte, el protocolo convencional recibió la IATF a

las 48 o a las 56 horas, también con vacas pintadas o despintadas en ambos momentos de IATF. Es decir

que la pintura fue registrada solo para saber cuales vacas estaban en celo en cada momento de IATF. Los

resultados se muestran en la Figura 6.

Figura 6. Tasa de preñez en vacas con cría al pie comparando el protocolo J-Synch con el protocolo

convencional para IATF. Para identificar a las vacas en celo se utilizó pintura en la base de la cola que fue

chequeada al momento de la IATF.

Memorias

101

Considerando estos resultados, el protocolo J-Synch permitió una tasa de preñez similar al protocolo

convencional solo cuando se aplicó un esquema de IATF a las 72 horas a las vacas en celo (64% de preñez)

seguido de IATF a las 80 horas a las vacas que no estaban en celo (36% de preñez). Si comparamos la tasa

de preñez obtenida con este protocolo (en promedio 57,3%, 169/295) con la tasa de preñez en el protocolo

convencional (en celo: IATF 48 h; no celo: IATF 56 h; en promedio 59,9% de preñez, 148/247), los

resultados fueron similares (P= NS). En conclusión, el esquema con J-Synch donde las vacas en celo

reciben IATF a las 72 h y las sin celo reciben la IATF a las 80 h (con GnRH), sería el más recomendable.

Sin embargo, este nuevo protocolo aún no ha superado el resultado del protocolo convencional en vacas

con cría (como sí se logró en vaquillonas).

En otro nuevo experimento realizado más recientemente, se comparó la dinámica folicular y el

momento de la ovulación con ambos protocolos aplicados en vacas con cría al pie y en anestro (Huguenine

et al., resultados preliminares). Ambos protocolos se aplicaron de la misma manera que en el experimento

anterior. Las vacas que recibieron el protocolo convencional (n= 19) ovularon en promedio a las 77,3 ± 2,9

horas del retiro del dispositivo, coincidiendo con trabajos previos para este protocolo. Las que recibieron

el protocolo J-Synch (n= 16) ovularon a las 104,8 ± 3,2 horas (P< 0,05). Esto demuestra que en vacas –tal

como había sido demostrado en vaquillonas- el protocolo J-Synch prolonga el proestro. Sin embargo, un

resultado interesante es que la ovulación ocurrió unas 11 horas más tarde que cuando este protocolo fue

evaluado en vaquillonas (93,7 ± 12,9 horas en vaquillonas; de la Mata et al., 2018). Esto confirma aún más

la necesidad de atrasar la inseminación en vacas en relación a las vaquillonas. De acuerdo con toda esta

información en conjunto, para vacas con cría en anestro mantendríamos el esquema indicado anteriormente:

vacas en celo: IATF 72 horas; vacas sin celo: IATF 80 horas.

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Memorias

104

Memorias

105

Memorias

106

Programas de IATF de alta fertilidad con semen sexado.

G.A. Bó 12, E. Huguenine3, J.J. de la Mata 4, R.L.S. de Carneiro5y A. Menchaca6

1 Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), Zona Rural, General Paz (5145), Córdoba,

Argentina. 2 Instituto A.P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de

Villa María, Villa del Rosario, Córdoba, Argentina. 3Actividad Privada, SAV, San Luis, Argentina

4 Actividad Privada y Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de La Pampa,

Argentina 5 ST Genetics Argentina, Carmen de Areco, Argentina

6 Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal Uruguay, Montevideo, Uruguay.

e-mail: gabrielbo62@gmail.com

Abstract

Durante años, los investigadores vienen buscando manipular el sexo antes de la

concepción. Si bien la utilización de semen sexado mantuvo gran interés en los últimos 20 años

para inseminar vaquillonas de leche, el uso masivo del semen sexado se vio de alguna manera

limitado debido a que la fertilidad estaba comprometida y no se podía solucionar aumentando el

número de espermatozoides por dosis inseminante. Sin embargo, se han desarrollado

recientemente nuevos procedimientos simplificados y menos traumáticos para los

espermatozoides que han permitido mejorar significativamente las tasas de preñez obtenidas con

semen sexado. Sin embargo, para la utilización masiva de esta tecnología es necesario el desarrollo

de programas de Inseminación Artificial a tiempo fijo (IATF) para semen sexado. Por lo tanto se

realizó una serie de experimentos en vaquillonas en vacas con cría al pie. En todos los casos los

animales fueron sincronizados con la ayuda de pintura en la base de la cola para detectar la

presentación de celos y optimizar los horarios de IATF. Si bien las tasas de preñez fueron en

general mayores para semen convencional que para semen sexado, las tasas de preñez con semen

sexado fueron del 45 al 50%. Por lo tanto, los resultados de los experimentos realizados

demuestran que se pueden adaptar protocolos de IATF para la utilización de semen sexado y de

esta manera posibilitar el uso masivo de esta tecnología.

Introducción

En los últimos 20 años se han realizado progresos significativos en la mejor comprensión

de los patrones del crecimiento de los folículos ováricos bovinos y como se puede sincronizar su

crecimiento y ovulación (Bó et al., 2013). En la actualidad existe una amplia gama de tratamientos

de Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) disponibles para ser utilizados tanto en rodeos

de carne como de leche (Bó et al., 2013). Básicamente los programas de IATF utilizados en la

actualidad se agrupan según el tipo de hormona utilizada. Los protocolos denominados “OvSynch”

(Pursley et al., 1995) y “Co-Synch” (Geary et al., 2001) utilizan análogos de la hormona liberadora

Memorias

107

de gonadotrofinas (GnRH) y prostaglandinas (PGF) para la sincronización de la ovulación.

También los tratamientos “Co-Synch” han sido utilizados junto a la inserción de un dispositivo

con progesterona (Lamb et al., 2001; Martínez et al., 2002) resultando en mejores tasas de preñez

en vacas y vaquillonas para carne. Por otro lado, están los protocolos que emplean benzoato de

estradiol (EB; Bó et al., 2002) y dispositivos con P4, que son los más utilizados en Argentina (Bó

et al., 2013). En los últimos años, este último tratamiento se vio simplificado debido a la aplicación

de cipionato de estradiol (ECP) como inductor de ovulación (Colazo et al., 2003), logrando

alcanzar aceptables tasas de preñez en vacas de carne (Bó et al., 2013; Uslenghi et al., 2014). Sin

embargo, se han reportado recientemente que las tasas de preñez se podrían incrementar si se

disminuye el período de crecimiento del folículo dominante ovulatorio y se prolonga la duración

del proestro (Bridges et al., 2008, 2012, Colazo y Ambrose, 2011, Bó et al., 2016).

Recientemente se ha desarrollado un nuevo tratamiento utilizando un protocolo basado en

EB y un dispositivo con progesterona (que son las hormonas más usadas en Argentina) pero donde

la remoción del dispositivo fue realizada 6 días después (en lugar de 8) y se prolongó el proestro

administrando GnRH como inductor de la ovulación a las 72 h de retirar el dispositivo en lugar de

ECP al retiro. Este protocolo fue denominado J-Synch (de la Mata y Bó, 2012). En trabajos

posteriores se encontró que las tasas de preñez a la IATF tendieron a ser mayores con el protocolo

J-Synch que con el protocolo convencional utilizado en Argentina en vaquillonas Holstein (Ré et

al., 2014; 2015) y significativamente mayores en vaquillonas de carne y receptoras de embriones

(Bó et al., 2016, Menchaca et al., 2016). Este protocolo promueve modificaciones durante el

proestro y define un perfil endocrino preovulatorio que está positivamente asociado con un CL

más competente y una mejora del medioambiente uterino (de la Mata et al., 2018). La mayor

preñez obtenida con el protocolo J-Synch en vaquillonas sugiere que podría ser una alternativa

interesante para aplicar en programas de IATF con semen sexado.

Uso de Semen Sexado en Programas de Inseminación Artificial

Durante años, los investigadores vienen buscando manipular el sexo antes de la concepción

(Garner y Seidel, 2008). Esta determinación del sexo en rodeos de carne y leche puede ser uno de

los factores determinantes para mejorar el desempeño productivo y económico de la actividad. Por

ejemplo, en los tambos el ternero macho tiene poco o ningún valor zootécnico. Sin embargo, en

los establecimientos de carne el ternero macho es el sexo de interés debido a un mayor potencial

de producción. Teniendo en cuenta esas particularidades, se han realizado muchas investigaciones

con el objetivo de predecir y/o manipular la proporción del sexo de los terneros. La separación de

los espermatozoides Y de los espermatozoides X es posible debido a las diferencias en el contenido

del ADN de esas células espermáticas (espermatozoide X posee cerca del 4% más ADN que el

espermatozoide Y), siendo realizada por citometría de flujo. Esta biotécnica asocia la emisión de

rayos láser, la coloración diferencial (usando el fluorocromo Hoechst 33342) de los

espermatozoides y las fuerzas hidrodinámicas que dirigen el espermatozoide en el momento de la

lectura durante el proceso de separación de los espermatozoides con cromosomas X e Y (Beltsville

Sperm Sexing Technology).

Memorias

108

Si bien la utilización de semen sexado mantuvo gran interés en los últimos 20 años para

inseminar vaquillonas de leche, el uso masivo del semen sexado se vio de alguna manera limitado

debido a que la fertilidad estaba comprometida y no se podía solucionar aumentando el número de

espermatozoides por dosis inseminante (DeJarnette et al., 2011). Los factores que afectan las tasas

de concepción con semen sexado a la inseminación artificial (IA) dependen del toro (fertilidad

intrínseca), procesamiento del semen, cantidad de espermatozoides, momento de la IA y del

historial reproductivo de la vaca. Estos factores se ven afectados a su vez por potenciales

“estresores” durante el proceso de separación espermática como la adición del fluorocromo

Hoechst 33342, exposición a luz ultravioleta, incubación a altas temperaturas, cambios de presión,

campos electrostáticos, estrés oxidativo, además del proceso de congelación de semen (de Graaf

et al., 2014). Sin embargo, se ha desarrollado recientemente un nuevo procedimiento simplificado

y menos traumático para los espermatozoides sexados denominado SexedULTRA, donde

inclusive se ha planteado la opción de aumentar el número de espermatozoides por pajuela de 2.1

millones como se utilizaba con el semen XY a 4 millones de espermatozoides con el SexedULTRA

(Vishwanath, 2015). Esta nueva tecnología consta de nuevos métodos para la manipulación y

procesado antes de la separación espermática, fundamentalmente cambios en la composición de

los medios utilizados en los estadios del proceso de separación, promoviendo un ambiente más

inocuo que evita cambios de pH y temperatura, respetando la integridad de los espermatozoides

(de Graaf et al., 2014). Estudios recientes reportaron que el proceso SexedULTRA resulta en una

mayor viabilidad e integridad de los espermatozoides pos descongelado (Gonzales-Marín et al.,

2017), resultando en una mayor producción de embriones in vitro en comparación con el método

más antiguo (llamado XY o Legacy; González-Marín et al., 2018). Es indudable que, para la

utilización efectiva de esta tecnología, tanto en rodeos lecheros como de carne se deberían

desarrollar protocolos de IATF para semen sexado (Kasimanickam, 2015). En un experimento

preliminar realizado por nuestro grupo (Ré et al., no publicado) se utilizaron 200 vaquillonas que

fueron tratadas con el protocolo J-Synch con un dispositivo de 0,5 g de progesterona (SynkroXY,

Proagro, Argentina) e inseminadas a las 72 h de la remoción del dispositivo. En este caso las

vaquillonas fueron pintadas en la base de la cola y las despintadas fueron IATF a las 72 h, mientras

que las pintadas fueron IA 12 h después que se despintaran en los próximos dos días. De las 100

vaquillonas con semen convencional se inseminaron todas a las 72 h y se preñó el 56%. De las IA

con semen sexado 72 vaquillonas fueron IA a las 72 h y se preñaron el 51%, 16 vaquillonas fueron

IA a las 96 h y se preñaron el 69% y otras 8 vaquillonas fueron IA a las 120 h y se preñaron el

38%, 5 quedaron sin inseminar. La preñez general no fue diferente entre los grupos (56% para el

semen convencional vs 53% para las con semen sexado; P>0,2).

Objetivo General

El objetivo general de este resumen es presentar resultados de experimentos realizados

recientemente utilizando el protocolo J-Synch en vacas y vaquillonas inseminadas con semen

sexado. El objetivo secundario fue evaluar la tasa de preñez de distintos toros utilizando semen

convencional y SexedULTRA en programas de IATF. Por último, se presentarán resultados

preliminares de un semen sexado con un 65% de sexo elegido, a diferencia del 90% que tiene el

SexedULTRA y con una mayor concentracion de espermatozoides para ser utilizado en vacas de

carne con cría al pie.

Memorias

109

Experimentos en vaquillonas para carne

Experimento 1

Se utilizaron 357 vaquillonas Angus que fueron tratadas con el protocolo J-Synch. En el

Día 0 recibieron un dispositivo intravaginal (DIB 0,5, Zoetis, Argentina) y 2 mg de EB (Gonadiol,

Zoetis) por vía i.m., 500 µg de cloprostenol (PGF, Ciclase, Zoetis) en el día de la remoción del

dispositivo (Día 6) y se pintó en la base de la cola con pintura como método visual en la detección

de celo. Las vaquillonas que manifestaron celo a las 72 h post remoción del dispositivo (pintura

alterada), fueron divididas en dos subgrupos al azar para ser IATF con semen sexado hembra

(SexedULTRA de 4 millones de espermatozoides) o con semen convencional no sexado

(Convencional). Las vaquillonas que no manifestaron celo a las 72 h (pintura sin alterar) recibieron

100 µg de acetato de gonadorelina (GnRH, Gonasyn gdr, Zoetis) en ese momento y fueron IATF

a las 84 h post remoción del dispositivo con semen sexado o con semen convencional. El semen

sexado y convencional provenía de un mismo toro y del mismo eyaculado y fue provisto por la

Empresa Sexing Technologies de Argentina. Los diagnósticos de gestación se llevaron a cabo 30

días post IATF mediante ultrasonografía (Honda HS 101 v, Japón). Los resultados se encuentran

indicados en la Tabla 1. Hubo un 57,7% (206/357) de vaquillonas en celo a las 72 h y una tasa de

preñez general del 53,8%. Las tasas de preñez fueron mayores (P<0,01) para semen convencional

que para semen sexado. A su vez las vaquillonas que mostraron celo tuvieron una mayor (P<0,01)

tasa de preñez que las que no mostraron celo.

Tabla 1. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado SexedULTRA de

4 millones de espermatozoides o convencional de acuerdo a la expresión o no de celo (lectura de

pintura) a las 72 h de la remoción del dispositivo con progesterona.

n

Celo 72 h

IATF 72 h

Sin Celo a las 72 h

IATF 84 h Total

SexedULTRA

(4 millones) 180

58/106

(54,7%) a*

24/74

(32,4%) a**

82/180

(45,5%) a

Convencional

(25 millones) 177

70/100

(70,0%) b*

40/76

(52,6%) b**

110/176

(62,5%) b ab los porcentajes entre semen sexado y convencional difieren (P<0,01)

** los porcentajes entre horarios de IATF difieren (P<0,01)

Experimento 2

En el experimento 2 se utilizaron 850 vaquillonas Angus y Angus cruza Simmental que

fueron tratadas con el protocolo J-Synch como en el Experimento 1, excepto que todas las

vaquillonas recibieron 300 IU de eCG (Novormón 5000, Zoetis) en el momento de la remoción

del dispositivo. En este experimento se detectó celo con pintura como en el experimento anterior

pero en este caso la lectura de la pintura se realizó a las 60 y 72 h de la remoción del dispositivo.

Las vaquillonas con la pintura alterada fueron divididas en dos subgrupos para ser IATF con semen

sexado (SexedULTRA de 4 millones de espermatozoides) o con semen convencional. Las

vaquillonas que no manifestaron celo a las 72 h (pintura sin alterar) recibieron GnRH en ese

momento y fueron IATF a las 84 h post remoción del dispositivo con semen sexado o con semen

Memorias

110

convencional. El semen sexado y convencional provino de 4 toros Angus y fue provisto por la

Empresa Sexing Technologies de Argentina. Los diagnósticos de gestación se llevaron a cabo 30

días post IATF mediante ultrasonografía.

En el Experimento 2 hubo un mayor (P<0,01) porcentaje de vaquillonas en celo a las 60 y

72 h (72,7%) que en el Experimento 1 y una tasa de preñez general del 54%. En este caso hubo

efectos significativos de establecimiento (P<0,01), toros (P<0,02) y tipo de semen (P<0,01) en las

tasas de preñez. También hubo un efecto significativo del horario del celo (P<0,01) pero no hubo

interacción entre tipo de semen y horario del celo (P>0,5). Los resultados están indicados en las

Tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado o convencional de

acuerdo a la expresión o no de celo (lectura de pintura) a las 60 o 72 h de la remoción del

dispositivo con progesterona.

N Celo 60 h

IATF 72 h

Celo 72 h

IATF 72 h

Sin celo a las

60 o 72 h

IATF 84 h

Total

SexedULTRA

(4 millones) 426 104/176

(59,0%)c

61/134

(45,5%)d

45/116

(38,8%)e

210/426

(49,3%)a

Convencional

(25 millones)

424 119/172

(69,2%)cd

79/136

(58,0%)e

49/116

(42,2%)e

247/424

(58,3%)b

Total 850 223/348

(64,0%)f

140/270

(51,9%)g

94/232

(40,5%)g

ab los porcentajes difieren entre semen sexado y convencional (P<0,01). cde los porcentajes difieren entre horarios de celo y entre semen sexado y convencional (P<0,05). fg los porcentajes difieren entre los horarios de celo (P<0,01).

Tabla 3. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado o convencional.

Efecto del toro sobre las tasas de preñez.

n Toro 1 Toro 2 Toro 3 Toro 4

SexedULTRA

(4 millones) 426 65/123

(52.8%)

50/97

(51.5%)

73/123

(59.3%)

22/83

(26.5%)

Convencional

(25 millones)

424 75/123

(61.0%)

56/96

(58.3%)

82/121

(67.8%)

34/84

(40.5%)

TOTAL 850 140/246

(56.9%)b

106/193

(54.9%)b

155/244

(63.5%)b

56/167

(33.5%)a

ab Los porcentajes totales de preñez difieren entre toros (P<0,02).

Tabla 4. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado o convencional.

Efecto Establecimiento sobre las tasas de preñez.

Memorias

111

n SexedULTRA

(4 millones)

Convencional

(25 millones)

Total

Establecimiento 1 244 73/123

(59,3%)

82/121

(67,8%)

155/244a

(63,5%)

Establecimiento 2 128 18/63

(28,5%)

22/65

(33,8%)

40/128

(31,2%)c

Establecimiento 3 97 26/50

(52,0%)

22/47

(46,8%)

48/97

(49,5%)b

Establecimiento 4 96 29/47

(61,7%)

34/49

(69,4%)

63/96

(65,6%)a

Establecimiento 5 181 46/91

(50,5%)

61/90

(67,7%)

107/181

(59,1%)a

Establecimiento 6 104 18/52

(34,6%)

26/52

(50.0%)

44/104

(42,3%)b abc Los porcentajes totales de preñez difieren entre establecimientos (P<0,02).

Experimento 3

El objetivo del Experimento 3 fue determinar el mejor momento del IATF con semen

sexado en vaquillonas, sobre todo en las que muestran celo a las 72 h de la remoción del

dispositivo. Se utilizaron 783 vaquillonas Angus (253 en el 2017/18 y 530 en el 2018/19) que

fueron tratadas con el protocolo J-Synch. En el Día 0 recibieron un DIB 0,5 y 2 mg de BE; PGF

300 UI de eCG en el día de la remoción del dispositivo (Día 6) y se pintaron en la base de la cola

como método visual de detección de celo, que fue observado a las 60, 72 y 84 h. Las vaquillonas

que manifestaron celo a las 60 h (pintura borrada >50%), fueron IATF a las 72 h post remoción

del dispositivo. Las que a las 72 h estaban despintadas, fueron divididas al azar para ser IATF a

las 72 h o a las 84 h. Las vaquillonas que no manifestaron estro a las 72 h (pintura sin alterar)

recibieron GnRH en ese momento y fueron IATF a las 84 h. Los diagnósticos de gestación se

llevaron a cabo 30 días post IATF mediante ultrasonografía.

Para el análisis estadístico se tuvo en cuenta las que entraron en celo a las 60 h y fueron

IATF a las 72 h, las que estaban en celo a las 72 h y fueron IATF a las 72 h u 84 h y las que no

estaban en celo a las 72 h y recibieron GnRH y fueron IATF a las 84 h. Los diagnósticos de

gestación se llevaron a cabo 30 días post IATF mediante ultrasonografía.

El porcentaje de vaquillonas en celo a las 60 y 72 h fue de 76,6%, con una tasa de preñez

general de 50% en el 2017/18 y de 53% en el 2018/2019 (P>0.4). Por lo tanto, se combinaron los

datos de las dos temporadas para realizar el análisis estadístico. En este caso no hubo efectos

significativos de establecimiento (P>0,4), de toros (P>0,7), del horario del celo (P>0,7) y del

horario de IATF (P>0,8) sobre la tasa de preñez. Los resultados están indicados en las Tablas 5, 6

y 7.

Tabla 5. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado de acuerdo a la

expresión o no de celo (lectura de pintura) a las 60, 72 o 84 h de la remoción del dispositivo con

progesterona.

Memorias

112

Celo 60 h

IATF 72 h

Celo 72 h

IATF 72 h

Celo 72 h

IATF 84 h

No Celo

IATF 84 h

Total

SexedULTRA®

(4 millones) 104/176

(49,0%)

51/94

(54,3%)

39/103

(57,3%)

130/249

(52,2%)

405/783

(51,7%)a

Tabla 6. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado. Efecto del toro

sobre las tasas de preñez.

n Toro 1 Toro 2 Toro 3

SexedULTRA®

(4 millones) 783 238/457

(52.1%)

48/110

(43.6%)

119/216

(55.1%)

Los porcentajes totales de preñez no difieren entre toros (P>0,7).

Tabla 7. Tasas de preñez en vaquillonas Angus inseminadas con semen sexado. Efecto

Establecimiento sobre las tasas de preñez.

n SexedULTRA®

(4 millones)

Establecimiento 1 293 157/293

(53,6%)

Establecimiento 2 120 51/120

(42,5%)

Establecimiento 3 93 44/93

(47,3%)

Establecimiento 4 75 37/75

(49,3%)

Establecimiento 5 96 52/96

(56,3%)

Establecimiento 6 106 64/106

(60,4%)

Los porcentajes totales de preñez no difieren entre establecimientos (P>0,4).

Los resultados de este último experimento confirman los de las temporadas anteriores, que se

pueden obtener tasas de preñez de alrededor del 50% en vaquillonas de carne inseminadas con

semen sexado. Además, de acuerdo a los resultados de este experimento y los anteriores, la

recomendación de inseminación con el protocolo J-Synch seria inseminar todos los animales en

celo (con la pintura borrada >50%) a las 72 h y los que no tienen la pintura borrada en ese momento

deben recibir GnRH a las 72 h y ser inseminadas con semen sexado o convencional a las 84 h.

Experimentos en vacas de Carne con cría al pie.

Experimento 4

Memorias

113

En este experimento se utilizaron un total de 877 vacas con cría al pie en cuatro

establecimientos ganaderos de San Luis y La Pampa. Las vacas tenían 45 a 90 días posparto, una

condición corporal de entre 3 a 3,5 y con un CL o Folículos >8 mm de diámetro y fueron tratadas

con el protocolo J-Synch con 400 IU eCG. En este experimento se detectó celo con pintura como

en el Experimento 2 y las vacas fueron divididas en dos subgrupos para ser IATF con semen

SexedULTRA o convencional de 5 toros (3 de los cuales ya habían sido utilizado en los

experimentos de vaquillonas). Los diagnósticos de gestación se llevaron a cabo 30 días post IATF

mediante ultrasonografía. En este experimento el porcentaje de vacas en celo a las 60 y 72 h fue

del 71,3% y la tasa general de preñez fue del 57%. En este caso hubo una diferencia de tipo de

semen, momento de celo (P<0,01) y el toro utilizado (P<0,05). No hubo interacciones y tampoco

hubo diferencias entre los cuatro establecimientos donde se realizó el experimento (Rango 52 a

59%). Los resultados de preñez para los distintos horarios de celo e IATF están indicados en la

Tabla 8 y para cada toro utilizado en la Tabla 9.

Tabla 8. Tasas de preñez en Angus con cría al pie inseminadas con semen sexado o convencional

de acuerdo a la expresión o no de celo (lectura de pintura) a las 60 o 72 h de la remoción del

dispositivo con progesterona.

N Celo 60h

IATF 72h

Celo 72h

IATF 72h

Celo 84h

IATF 84h

No Celo

IATF 84h

Total

SexedULTRA

(4 millones) 435 93/228

(40,8%)d

34/79

(43,0%)d

20/29

(70,6%)c

50/104

(48,1%)d

197/435

(45,3%)a

Convencional

(25 millones)

442 154/234

(65,8%)c

57/84

(67,9%)c

20/24

(83,3%)c

69/95

(72,6%)c

303/442

(68,6%)b

Total 877 247/462

(53,5%)f

91/163

(55,8%)f

40/53

(75,5%)g

119/199

(59,8%)f

ab los porcentajes difieren entre semen sexado y convencional (P<0,01). cd los porcentajes difieren entre horarios de celo y entre semen sexado y convencional (P<0,05). fg los porcentajes difieren entre los horarios de celo (P<0,01).

Tabla 9. Tasas de preñez en vacas Angus con cría al pie inseminadas con semen sexado o

convencional. Efecto del toro sobre las tasas de preñez.

n Toro 1 Toro 2 Toro 3 Toro 4 Toro 5

SexedULTRA

(4 millones) 435 26/47

(55,3%)

66/153

(43,1%)

95/197

(48,2%)

3/7

(43%)

8/31

(25,8%)

Convencional

(25 millones)

442 27/42

(64,3%)

113/153

(73,9%)

142/208

(68,3%)

5/7

(71,4%)

17/32

(53,1%)

TOTAL 877 53/89

(59,6%)a

179/306

(62,3%)a

237/405

(58,5%)a

8/14

(57,1%)a

25/63

(39,6%)b

ab Los porcentajes totales de preñez tienden a diferir entre toros (P<0,08).

Memorias

114

Experimento 5

El objetivo de este experimento fue evaluar las tasas de preñez y proporción de machos y

hembras en vacas de carne con cría al pie IATF con semen convencional (no sexado, 25 millones

de espermatozoides por dosis) y en este caso en lugar de usar semen SexedULTRA de 4 millones

y con un 90% de exactitud en el sexado, se utilizó con semen sexado con el mismo procedimiento

que el sexedULTRA pero con un distintas proporciones de espermatozoides X e Y (65% de

hembras) pero con una mayor concentración espermática por pajuela. La idea de este semen es

poder utilizarlo más masivamente en rodeos comerciales de vacas de carne y darles la opción a los

productores de alterar el porcentaje de terneros producidos de acuerdo a sus necesidades, o sea

tener más terneros machos para engordar o más terneras hembras para crecer en el número de

vacas en el programa productivo. En este caso se utilizaron 558 vacas Angus y Hereford con cría

al pie. En el Día 0 todas las vacas recibieron un dispositivo intravaginal con 0.6 g de P4 (Pluselar,

Calier, Argentina) y 2 mg de EB (Benzoato de estradiol, Calier) por vía IM. En el Día 8 las vacas

recibieron 150 µg de D+cloprostenol (Veteglan, Calier), 400 UI de eCG (Vetegon, Calier) en el

día de la remoción del dispositivo y 0,5 mg de cipionato de estradiol (Cipionato de estradiol,

Calier) y se pintó en la base de la cola con pintura como método visual en la detección de celo que

fue observado a las 48 h. Las vacas que manifestaron celo a las 48 h post remoción del dispositivo

(pintura alterada) fueron IATF en ese momento con semen convencional o con semen sexado

65/35 (denominado semen Superconvencional) en dos concentraciones: 6 y 8 millones de

espermtozoides totales por pajuela. Las que no manifestaron celo (pintura sin alterar) a las 48 h

recibieron GnRH (8 µg, Pluserelina, Calier) IM en ese momento y fueron IATF a las 48-50 h con

los tres tipos de semen ya mencionados. Los diagnósticos de gestación se llevaron a cabo entre los

64 y 74 días post IATF para diagnosticar preñez y determinar el sexo de las mismas.

Los resultados están indicados en la Tabla 10 y Figuras 1 y 2. No hubo diferencias

significativas en la tasa de preñez entre los dos toros utilizados (Figura 2) y el tipo de semen

(Convencional vs Superconvencional; Tabla 10 y Figura 2). Sin embargo las vacas que mostraron

signos de celo antes o durante la IATF (despintadas) tuvieron una mayor (P<0,01) tasa de preñez

que las vacas que no mostraron celo (Tabla 4 y Figura 1). Con respecto a la proporción de machos

y hembras en los tres grupos, el semen convencional tuvo un 51% de hembras (50/98), mientras

que este porcentaje de hembras fue del 65,5% (55/84) para las vacas inseminadas con semen

superconvencional de 8 millones de espermatozoides y del 65,3% (51/78) para las vacas

inseminadas con semen superconvencional de 6 millones de espermatozoides (Figura 3).

Tabla 10. Tasas de preñez en Vacas Angus y Hereford con cría al pie, inseminadas con semen

convencional o superconvencional de acuerdo a la expresión de celos.

Celo No Celo

Total

Convencional

(25 millones)

82/137

(59,8%)a

16/50

(32,0%)b

98/187

(52,4%)

SuperConvencional

(8 millones)

73/136

(53,7%)a

10/50

(20,0%)b

83/186

(44,6%)

Memorias

115

SuperConvencional

(6 millones)

63/125

(50,4%)a

16/60

(26,7%)b

79/185

(42,7%)

Total 218/398

(54,8%)a

42/160

(26,3%)b

ab denota diferencias en tasas de preñez entre expresión o no de celo (P<0,01)

Figura 1. Tasas de Preñez de acuerdo a la expresion o no de celos a las 48 h y al tipo de semen.

No hay diferencias entre tipo de semen (P>0.13), tanto para las en celo como para las que no

entraron en celo. abPara todos los tipos de semen las tasas de prenez difieren entre las que entraron

o no en celo (P<0,01)

Figura 2. Tasas de preñez de las vacas que entraron en celo a las 48 h, de acuerdo al toro y tipo

de semen. No hubo diferencias entre toros o entre tipo de semen (P>0.1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Vacas en celo Vacas sin celo

% d

e P

reñ

ez

25 M

8 M

6 M

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Toro 1 Toro 2 Total

% d

e P

reñ

ez

25 M

8 M

6 M

a a a

b b b

Memorias

116

Figura 3. Proporción de gestaciones diagnosticadas como hembra por ultrasonografía realizada

entre los 64 y 74 días despues de la IATF en vacas Angus y Hereford con cría al pie inseminadas

con semen convencional (no sexado) y superconvencional (sexado 65%).

Los resultados de este experimento demuestran que se pueden obtener resultados comparables

entre semen convencional y superconvencional y que las vacas en celo tienen una mayor tasa de

preñez que las que no muestran celo, donde se aprecia una baja substancial en la fertilidad en estas

vacas sin celo. La causa se esto puede estar relacionada con que las vacas que no muestran celo a

las 48 h y reciben GnRH ovulan en promedio 10 h después que las que muestran celo (68 h para

las que muestran celo y 78 h para las que no muestran celo; Cuervo et al., 2017). Por lo tanto se

puede especular que si se atrasa la IATF de todas las vacas a las 54-58 h se pueden tener más vacas

en celo que a las 48 h y mejorar, de esta manera, la tasa general de preñez. Este año se realizaran

más experimentos con semen superconvencional para probar esta hipótesis.

Discusión y conclusiones

Los resultados de los experimentos demuestran que se pueden adaptar protocolos de IATF

con la ayuda de pintura para la detección de celo para la utilización de semen sexado en vacas y

vaquillonas de carne. Cabe destacar que en ninguno de estos experimentos se realizó detección

visual del comportamiento del celo, solo se utilizó una lectura de pintura a todos los animales al

pasar por la manga. Esto se propone como parte del protocolo de IATF, aplicándose de manera

sistemática sin requerir la observación individual del comportamiento de celo. Estos datos

concuerdan con un estudio reciente (Thomas et al., 2017) en el cual vaquillonas para carne que se

IATF con semen sexado cuando fueron sincronizadas con un protocolo de CIDR-B por 14 días

más PGF 16 días después (60% para convencional y 52% para sexado, respectivamente).

Analizando los horarios de celo e IATF de estos experimentos, la recomendación de

inseminación con el protocolo J-Synch seria inseminar todos los animales en celo (con la pintura

borrada >50%) a las 72 h y los que no tienen la pintura borrada en ese momento deben recibir

GnRH a las 72 h y ser inseminadas con semen sexado o convencional a las 84 h. Por las escasas

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70%

de

He

mb

ras

25 M

8 M

6 M

Memorias

117

diferencias de tasa de preñez entre semen convencional y sexado en este grupo de animales,

parecería que sería mejor inseminar a estos animales con semen sexado a las 84 h, pero debido a

que las tasas de preñez son menores en las vaquillonas sin celo, queda la decisión en el veterinario

y su cliente de utilizar un semen convencional más barato en estos animales. Finalmente, los

resultados del último experimento demuestran que se pueden obtener resultados comparables entre

semen convencional y superconvencional y que las vacas en celo tienen una mayor tasa de preñez

que las que no muestran celo, donde se aprecia una baja substancial en la fertilidad en estas vacas

sin celo. En conclusión, los resultados de los experimentos realizados hasta ahora demuestran que

utilizando la ayuda de pintura para adecuar el horario de IATF, es posible conseguir tasas de preñez

aceptables utilizando semen sexado en vaquillonas y vacas para carne, con resultados de alrededor

del 50%, confirmando los resultados encontrados en vaquillonas de leche.

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Memorias

120

Memorias

121

Memorias

122

PERDIDAS GESTACIONALES EN RECEPTORAS DE EMBRIONES IN VITRO: FACTORES DE RIESGO Y ESTRATEGIAS PARA DISMINUIRLAS

A. García Guerra1, R. V. Sala3, L. Carrenho-Sala3, J.C.L., Motta1, E. Walleser2, L. F.

Melo1, L. Leffers1, M. Fosado2, J. F. Moreno2, M. C. Wiltbank1

1 Department of Animal Sciences, The Ohio State University, 2027 Coffey Rd, Columbus, OH, 43210, USA.

2 Department of Dairy Science, University of Wisconsin-Madison, 1675 Observatory Drive, Madison, WI, 53706, USA.

3 Sexing Technologies, Kewaskum, WI, USA. garciaguerra.1@osu.edu

Introducción

El incremento en el uso de la producción de embriones in vitro ha creado la necesidad de evaluar en forma precisa la fertilidad de dichos embriones. La fertilidad luego de la transferencia de embriones producidos in vitro es generalmente menor a la obtenida con embriones producidos in vivo (Hasler 1998; Ferraz et al. 2016). La fertilidad puede ser evaluada desde dos puntos de vista complementarios siendo el primero y más común el porcentaje de preñez obtenido, típicamente en el día 30 a 35 después del celo o inducción de la ovulación en la receptora. Sin embargo, un enfoque complementario es evaluar las perdidas gestacionales en diferentes periodos durante el primer tercio de la gestación. Las pérdidas gestacionales son expresadas normalmente como el porcentaje de receptoras previamente preñadas que pierden dicha preñez durante un periodo previamente definido. Un aspecto particular de la transferencia de embriones es que las pérdidas relacionadas a la fertilización y el desarrollo embrionario temprano (primeros 7 días) son transferidas al sistema de producción de embriones y generalmente no consideradas como parte de las perdidas gestacionales ya que ocurren fuera de la receptora. Las pérdidas durante la fertilización y el desarrollo embrionario temprano rondan el 10% y 10 a 50%, respectivamente, en protocolos de IATF (Wiltbank et al. 2016). Por consiguiente, en la transferencia de embriones las receptoras se asumen técnicamente como preñadas luego de la transferencia. Las pérdidas gestacionales observadas en diferentes periodos durante los primeros 60 días de gestación en vaquillonas lecheras receptoras de embriones producidos in vitro son presentados en la Tabla 1. Estos datos fueron obtenidos retrospectivamente a partir de una serie de estudios de nuestro grupo y reflejan la situación de un establecimiento en particular.

Memorias

123

Tabla 1. Preñez por embrión transferido (P/ET) y perdidas gestacionales durante distintos periodos de los primeros 60 días de gestación en receptoras de embriones producidos in vitro.

Preñez por embrión transferido

D21 D28 D32 D60

64,1%

(1606/2504) 46,1%

(1156/2510) 40,6%

(1340/3298) 33,6%

(1109/3296)

Perdidas gestacionales

D7 a D21 D21 a D28 D28 a D32 D32 a D60 Primeros 60

días

35,9% (898/2504)

27,9% (449/1605)

11,1% (128/1156)

17,2% (231/1340)

66.4% (2187/3296)

Como puede apreciarse en los resultados presentados arriba el porcentaje de perdidas gestacionales durante los primeros 60 días es significativo indicando que únicamente ~1/3 de los embriones transferidos resulta en una preñez de 60 días. A pesar de que estos resultados proveen un marco de referencia para investigar los factores de riesgo relacionados a las perdidas gestacionales, es importante notar que la determinación de preñez al día 21 se realiza a través de un método indirecto, la medición de progesterona circulante. Sin embargo, es altamente probable que este porcentaje este subestimado y que el porcentaje de pérdidas en el periodo siguiente (día 21 a 28) este sobre estimado. Debido a la falta de métodos precisos y de fácil aplicación para determinar la presencia de un embrión viable en el día 21, el uso de progesterona continúa siendo una herramienta útil para su estimación. La categorización de las perdidas gestacionales en periodos definidos permite obtener un panorama más preciso y a su vez abocar el desarrollo de estrategias para disminuir las pérdidas en aquellos periodos de mayor impacto.

Uno de los mayores desafíos en el manejo de perdidas gestacionales es el establecer los mecanismos por los cuales se producen estas pérdidas gestacionales en los distintos periodos. Una revisión publicada recientemente intenta explorar la relación entre las perdidas gestacionales en vacas de leche en lactancia luego de la IATF y los procesos de desarrollo del embrión y sus membranas con el objetivo de brindar un marco fisiológico a la temática de las perdidas gestacionales (Wiltbank et al. 2016). La presente revisión tiene como objetivo presentar información referida a las perdidas gestacionales en receptoras de embriones producidos in vitro y factores de riesgo asociados a las mismas. Por último, se presentan algunos estudios recientes que tuvieron como objetivo evaluar estrategias para disminuir las perdidas gestacionales.

Memorias

124

Factores que afectan la fertilidad y las pérdidas de gestación en un programa de transferencia de embriones producidos in vitro

Una multitud de factores han sido identificados que pueden influenciar la fertilidad en un programa de transferencia de embriones y pueden ser clasificados en aquellos relacionados a la receptora, al embrión, o a la interacción entre la receptora y el embrión. Tradicionalmente estos factores han sido identificados en relación a programas de transferencia de embriones producidos in vivo mediante superovulación. Sin embargo, el aumento en la producción in vitro de embriones observado en los últimos años ha creado la necesidad de identificar factores que impacten en la fertilidad de embriones producidos in vitro. Asimismo, la identificación precisa de periodos durante la gestación y los factores que impacten en pérdidas gestacionales en dichos periodos puede proveer de un marco fisiológico que permita la investigación acerca de estrategias para disminuir tales perdidas. En un estudio reciente investigamos de manera retrospectiva los factores que afectan la fertilidad en un programa de transferencia de embriones producidos in vitro en vaquillonas de leche (Carrenho-Sala et al. 2015). Los resultados preliminares son presentados aquí con la particularidad de que este es un trabajo en progreso y que los datos finales aún no han sido publicados.

Factores relacionados al embrión

La calidad del embrión transferido afecta de manera significativa los porcentajes de preñez por embrión transferido (P/ET). Embriones grado 1 (Escala recomendada por la IETS) presentaron un mayor porcentaje de P/ET al día 32 [Grado 1- 48,4% (1273/2631) vs. Grado 2- 37,6% (900/2395); P< 0,01] así como al día 60 [Grado 1- 38,9% (1023/2631) vs. Grado 2- 29,0% (694/2395); P< 0,01]. De manera similar la calidad del embrión (Grado 1) redujo el porcentaje de perdidas gestacionales entre los días 32 y 60 [Grado 1- 19,6% (250/1273) vs. Grado 2- 22,9% (206/900); P= 0,03]. Resultados similares han sido reportados para embriones producidos in vivo (Bó et al. 2011) e in vitro (Hasler 1998) por otros grupos.

El estadio del embrión determinado a través de la evaluación morfológica del mismo es un practica altamente difundida y comúnmente se realiza siguiendo las recomendaciones de la IETS (Stringfellow and Givens 2010). En el presente estudio 3 estadios fueron evaluados: 6 (blastocito); 7 (blastocito expandido); 8 (blastocito eclosionado). El porcentaje de preñez al día 32 fue significativamente mayor en embriones de estadio más avanzado [Estadio 6- 35,5%a (582/1641), Estadio 7- 46,3%b (1431/3092) and Estadio 8- 54,6%c (160/293); P<0,01]. Asimismo, el porcentaje de preñez al día 60 estuvo influenciado por el estadio embrionario [Estadio 6- 28,2%a (462/1641), Estadio 7- 36,6%b (1131/3092) and Estadio 8- 41,6%b (122/293); P<0,01]. Sin embargo, no se encontraron diferencias en las perdidas gestacionales entre el día 32 y 60 para los distintos estadios embrionarios (P=0,22). Los reportes del efecto del estadio de embriones producidos in vitro en los porcentajes de preñez muestran gran variabilidad. En un estudio reciente, se encontraron resultados similares a los reportados aquí, donde los embriones estadio 7 demostraron mayor fertilidad que embriones estadio 6 (Randi et al. 2015). Sin embargo, en ese estudio no se encontraron diferencias con el estadio 8, aunque numéricamente fueron superiores. Estos resultados se contradicen con los reportados en otros estudios (Hasler 1998; Pelizzari et al. 2015) y con los porcentajes de preñez obtenidos con

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embriones producidos in vivo. Los embriones estadio 4 (mórula) y 5 (blastocito temprano) producidos in vivo muestran mayor fertilidad que aquellos de estadio 7 (Bó et al. 2011). Es importante destacar, que por lo menos parte de esta diferencia puede ser atribuida a una diferencia en la edad del embrión entre ambos sistemas. En ambos sistemas los embriones tienen 7 días de edad, aunque la determinación del día 0 es distinta ya que en el sistema de producción de embriones in vivo el día 0 es el momento de detección de celo de la donante mientras que en el sistema in vitro el día 0 corresponde al momento de la fertilización. De esta manera, hay una diferencia de por lo menos 28 h (intervalo celo – ovulación) entre ambos embriones.

La constante búsqueda de animales de alto valor genético y la necesidad de reducir el intervalo generacional para acelerar el mejoramiento genético ha llevado a que la producción de embriones en las donantes comience a edades cada más tempranas. A pesar de que la producción in vitro de embriones permite la obtención de embriones de animales que aún no han llegado a su edad reproductiva, no hay información disponible sobre el efecto de la edad de la donante en la fertilidad de los embriones producidos. Recientemente realizamos una evaluación de este factor en más de 10.000 transferencias encontrando que la edad de la donante ejerce un efecto significativo (P<0,001) en la fertilidad y las perdidas gestacionales. Observamos que la P/ET aumenta a medida que la edad de la donante se incrementa alcanzando un máximo entre los 20 y 40 meses para luego reducirse a edades más avanzadas. Un efecto similar fue observado con las perdidas gestacionales, indicando que el periodo de menores perdidas es aproximadamente entre los 20 y 40 meses de edad. Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de investigar esta relación para así poder mejorar los sistemas de producción actuales.

Factores relacionados a la receptora

La necesidad de criterios que permitan la selección de receptoras aptas que permitan obtener altos niveles de fertilidad ha llevado a la búsqueda de factores simples de medir en las receptoras que nos permitan predecir su performance. Uno de los factores comúnmente evaluados es el tamaño del cuerpo lúteo, ya que es un tipo de información de fácil acceso debido a la necesidad inherente de evaluar el cuerpo lúteo (CL) para conocer el lado en que se debe realizar la transferencia del embrión. Sin embargo, los resultados obtenidos en varios estudios han sido contradictorios. Un estudio realizado en Colombia con más de 17.000 vaquillonas receptoras de embriones producidos in vitro encontraron que un diámetro de cuerpo lúteo > 24 mm al momento de la transferencia (día 7) estaba asociado a una mayor tasa preñez (Gonella-Diaza et al. 2013). Sin embargo, un estudio reciente sobre 4.214 transferencias en Argentina (Pelizzari et al. 2015) no encontró diferencias significativas en la fertilidad de receptoras entre tres categorías de diámetro del CL (≥14 a <16 mm; ≥16 a <18 mm, y ≥18 mm). Asimismo, en un estudio reciente realizado por nuestro grupo el efecto del tamaño del CL (18 a 19.9 mm vs ≥ 20 mm) en el día 5 del ciclo mostro una tendencia a incrementar los porcentajes de preñez al día 32 (P=0.09) sin embargo, el tamaño del cuerpo lúteo no tuvo efecto alguno en el porcentaje de pérdidas de preñez (Carrenho-Sala et al. 2015). Más recientemente evaluamos el efecto del volumen del CL en la fertilidad utilizando datos de 8.222 transferencias en vaquillonas de leche. Los resultados mostraron un efecto

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cuadrático indicando que el volumen del CL influencia la tasa de preñez por ET en donde los valores extremos resultan en tasas de P/ET menores. Los CL de aproximadamente 3800 mm3 (rango de diámetro 18.6 a 20 mm) obtuvieron un porcentaje de P/TE entre 3% y 5% mayor.

La historia reproductiva de la receptora a utilizar ha sido sujeto de algunas investigaciones y está íntimamente relacionada con la categoría (vaquillona, vaca seca o en lactancia, etc.). Algunos estudios han señalado que el uso de vaquillonas resulta en mejores índices de fertilidad que el uso de vacas, particularmente cuando se trata de animales de producción de leche (Ferraz et al. 2016). Sin embargo, la categoría de la receptora no necesariamente permite conocer su historia reproductiva. Recientemente evaluamos (Carrenho-Sala et al. 2015) el número de transferencias recibidas por una receptora y esta no mostro diferencias significativas en los porcentajes de preñez al día 32 [0- 43,3% (886/2046), 1- 44,1% (639/1450), 2- 43,4% (444/1024), 3- 42,6% (146/343) and ≥ 4- 35,6% (58/163); P=0,33] o en el porcentaje de pérdidas de preñez entre el día 32 y 60 (P=0,12). Estos resultados se contradicen con aquellos presentados por (Bó et al. 2011) y (Looney et al. 2006). Sin embargo, es de notar que en nuestros resultados receptoras con 4 o más transferencias mostraron una disminución en el porcentaje de preñez. A pesar de la reducción en los porcentajes de preñez reportada previamente, el mecanismo por el cual ocurre este fenómeno no ha sido todavía elucidado.

Uno de los factores inherentes a la transferencia de embriones es el momento en que se debe realizar la transferencia en relación al momento de ovulación de la receptora. Un estudio realizado en Brasil en 4.749 transferencias mostro que la tasa de preñez al día 32 era mayor cuando los embriones eran transferidos 6 o 7 días después del celo, mientras que transferencias realizadas antes o después de ese intervalo llevaban a una disminución de la fertilidad (Randi et al. 2015). Sin embargo, resultados preliminares de un estudio realizado por nuestro grupo no encontró diferencias significativas en los porcentajes de P/ET al día 32 de embriones transferidos 6, 7 u 8 días después de la inducción de la ovulación con GnRH en un programa de TETF (Carrenho-Sala et al. 2015). Asimismo, tampoco se encontraron diferencias en el porcentaje de P/ET al día 60 ni en el porcentaje de perdidas gestacionales entre el día 32 y 60. Sin embargo, el análisis del intervalo celo/inducción de la ovulación y la transferencia debe ser evaluado en el contexto del estadio del embrión transferido el cual será descripto en la siguiente sección.

La expresión de celo en programas de sincronización de la ovulación ha recibido recientemente considerable atención. En un trabajo reciente se encontró que la expresión de celo tuvo un efecto positivo en los porcentajes de preñez (>13%) en vacas en lactancia, tanto en IATF como en TETF (Pereira et al. 2016). De manera similar, la expresión de celo disminuyo las pérdidas de preñez entre el día 32 y 60. El efecto de la expresión de celo en el porcentaje de preñez a la TETF fue independiente del tamaño del folículo dominante para aquellos animales que demostraron celo. Similares resultados se encontraron en un estudio reciente en vaquillonas de leche que recibieron embriones producidos in vitro, con mayores porcentajes de preñez al día 32 (P=0,02) en vaquillonas que mostraron celo (44,6%; 2513/5635) que aquellas que no fueron observadas en celo (31,5%; 776/1893). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en las perdidas gestacionales (día 32 y 60) entre vaquillonas que mostraron

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celo y aquellas que no. El mecanismo por el cual aquellas receptoras que mostraron celo logran una mayor fertilidad no ha sido completamente elucidado, aunque es probable que la expresión de celo sea una manifestación de un correcto estatus hormonal que indica un endometrio mejor preparado para recibir una preñez. Una observación interesante al respecto de la expresión de celo, es que la magnitud del efecto en la fertilidad es aparentemente mayor cuando se utilizan protocolos de sincronización en base a estrógenos en comparación con protocolos que utilizan GnRH.

El estado nutricional tanto de donantes como de receptoras ha sido identificado como un factor contribuyente a la fertilidad de un programa de TE (Pelizzari et al. 2015). La menor fertilidad en animales con baja condición corporal ha sido bien establecida, sin embargo, el sobre condicionamiento de receptoras ha recibido menor atención. El estudio de Pelizzari y col., identifico que receptoras de embriones in vitro con una condición corporal ≥4.5 (escala 1-5) sufren una reducción en los porcentajes de P/ET al día 35. Resultados similares fueron obtenidos por nuestro grupo, receptoras con una condición corporal ≥3.5 tuvieron un porcentaje de P/ET al día 32 de 39,1% mientras que aquellas con condición corporal 3 obtuvieron un 45,7% de P/ET. Sin embargo, no se observaron efectos de la condición corporal en las perdidas gestacionales entre el día 32 y 60.

Interacción embrión-receptora

La interacción entre el embrión y la receptora es medida a través del grado de sincronización entre la edad-estadio del embrión y el intervalo entre el celo/inducción de la ovulación. En el trabajo realizado por nuestro grupo se evaluaron 3 estadios (6, 7 y 8) y 3 intervalos entre la inducción de la ovulación (GnRH) y la transferencia (6, 7 y 8 días). Es importante remarcar, que en el presente trabajo la edad del embrión es la misma ya que todos los embriones fueron transferidos 7 días después de la fertilización. Como resultado, el nivel de sincronización fue establecido considerando el estadio morfológico del embrión. Resultados preliminares, indican que no hubo interacción entre el estadio del embrión y el intervalo GnRH-TE en los porcentajes de preñez al día 32 (Tabla 2; P=0,77). De manera similar, no se registraron diferencias significativas para el porcentaje de preñez al día 60 (P=0,96) y las perdidas gestacionales entre el día 32 y 60 (P=0,55). Sin embargo, es interesante recalcar que las diferencias entre estadios embrionarios se mantienen, por cuanto embriones estadio 7 y 8 logran mayor fertilidad que embriones estadio 6, independientemente del intervalo entre la inducción de la ovulación y la transferencia. Los resultados obtenidos son similares a los reportados recientemente por (Randi et al., 2015). Estos resultados indican que, en cuanto a la interacción entre la receptora y el embrión, es más importante considerar el estadio del embrión ya que esta impacta de manera más significativa en la fertilidad.

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Tabla 2. Efecto de la sincronización entre estadio del embrión e intervalo GnRH-TE en el porcentaje de preñez al día 32 en receptoras de embriones in vitro (adaptado de Carrenho-Sala et al. 2015).

Intervalo GnRH- TE (n)

Estadio del Embrión

Día 6 Día 7 Día 8 N Valor P

6 35,7% (423)A

37,8% (727)A

31,8% (491)A

1641 0,21

7 45,3% (833)B

48,7% (1233)B

44,2% (1026)B

3092 0,22

8 50,9% (53)B 55,6% (153)B

55,2% (87)B 293 0,79

N 1309 2113 1604 Valor P 0,08 <0,01 <0,01

A,B Valores dentro de una columna con distintos superíndices difieren (P<0,05).

Perdidas gestacionales entre el día 30 y 60: ¿muerte embrionaria/fetal o regresión del cuerpo lúteo?

Las pérdidas gestacionales ocurridas entre los días 20 y 60 en receptoras de embriones producidas in vitro pueden alcanzar el 45%. Sin embargo, los mecanismos que median estas pérdidas no han sido elucidados creando una necesidad de entender mejor la fisiología de las perdidas gestacionales para poder diseñar estrategias que las reduzcan. Con el objetivo de mejor comprender las perdidas gestacionales realizamos un estudio que tuvo como objetivos específicos: 1) determinar si las perdidas gestacionales entre el día 30 y 60 se deben a la muerte del embrión/feto o a la regresión del cuerpo lúteo, y 2) evaluar si la suplementación de progesterona mediante dispositivos intravaginales de progesterona puede contribuir a mitigar estas pérdidas (Garcia Guerra et al. 2016). Se sincronizaron vaquillonas Holstein (n=196) con el siguiente protocolo: d-8 – colocación CIDR, d-3 - retiro del CIDR, PGF (500μg

cloprostenol), d-2 segunda PGF, d0 - GnRH (100 μg acetato de gonadorelina). En el día

7±1 después de la aplicación de GnRH se transfirió un embrión fresco producido in vitro al cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo. En el día 13 las vaquillonas fueron asignadas aleatoriamente para recibir uno de 2 tratamientos: 2 CIDR (1,38g progesterona) o Control (sin tratamiento). Las vaquillonas en el grupo CIDR recibieron 2 CIDR (uno nuevo y uno usado) en el día 13, una semana más tarde (día 20) se remplazó el CIDR usado por uno nuevo. En semanas subsiguientes y a intervalos de 7 días uno de los CIDR era retirado (el más antiguo) y reemplazado por uno nuevo. Este proceso continuo hasta el día 62 (día 0 GnRH) y tuvo como objetivo proveer suficiente progesterona para mantener una preñez en caso de que el cuerpo lúteo regresara. Todas las vaquillonas fueron evaluadas mediante ultrasonografía una vez por semana

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comenzando el día 13 y hasta el día 62, asimismo se colectaron muestras semanales de suero para determinación de progesterona y proteína especifica de la preñez B (PSPB). Se definió como perdida gestacional la inhabilidad de observar el embrión, ausencia de latido cardiaco o la regresión del cuerpo lúteo en un animal tratado con CIDR previamente diagnosticado como preñado.

El tratamiento con CIDR fue efectivo en incrementar los niveles de progesterona, por ejemplo en el día 27 los niveles de P4 fueron mayores (P=0,03) en el grupo CIDR (8,5±0,4 ng/ml) que en el grupo Control (7.3±0.4 ng/ml). El porcentaje de preñez en los distintos momentos evaluados se muestra en la Figura 1. Se encontró una tendencia a un mayor porcentaje de preñez en el grupo CIDR (P<0,10) en cada evaluación con excepción del día 27. Esta diferencia estuvo mayormente debida a una reducción en las perdidas embrionarias (Figura 2) entre el día 27 y 34 en el grupo CIDR (P<0,06).

Figura 1. Preñez por embrión transferido (P/ET) entre el día 20 y 62 en vaquillonas receptoras de embriones producidos in vitro que fueron tratadas con CIDR (n=97) durante la gestación o aquellas que permanecieron en el grupo control (n=99).

* Se encontró una tendencia hacia diferencias significativa entre tratamientos (P<0,10). † La determinación de P/ET en el día 20 se realizó mediante la evaluación de concentraciones de progesterona en suero (P4>2 ng/ml) y volumen del cuerpo lúteo (>1436 mm3). ǂ P/ET al D27 basados en concentración sérica de proteína especifica de la preñez B (PSPB>0,96 ng/ml). La determinación de la causa de la perdida gestacional se realizó únicamente en el grupo tratado con CIDR ya que este grupo proveyó el ambiente necesario para mantener una preñez aun cuando el CL hubiera regresado. Las perdidas gestacionales se clasificaron en: pérdidas debidas a muerte embrionaria/fetal (ausencia de un embrión viable en presencia de un cuerpo lúteo funcional) o perdidas debidas a regresión del cuerpo lúteo (ausencia del CL con un embrión/feto viable). De esta manera se observó que las perdidas entre el día 20 y 34 ocurrieron principalmente debido a muerte del embrión (96,2%; 25/26) y no debido a la regresión del CL (3,8%; 1/26, P<0,01). En contraposición, las perdidas ocurridas entre el día 34 y 62 se debieron a ambas causas con un 40% (2/5)

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debido a muerte embrionaria/fetal y un 60% (3/5) debido a regresión del CL (P=0,64). Estos resultados permiten concluir que las perdidas gestacionales ocurridas entre el día 20 y 34 son mayormente debidas a la muerte del embrión, mientras que las pérdidas ocurridas entre el día 34 y 62 pueden deberse tanto a la muerte embrionaria/fetal o a la regresión del CL. Asimismo, estas observaciones plantean la posibilidad de un segundo periodo de reconocimiento materno de la gestación y consecuente mantenimiento del CL. El estudio de este fenómeno y las diferencias entre embriones producidos in vivo e in vitro puede proporcionar información necesaria para entender las mayores pérdidas encontradas con la transferencia de embriones producidos in vitro, así como el desarrollo de estrategias para reducirlas. Figura 2. Perdidas de preñez entre el día 20 y 62 en vaquillonas receptoras de embriones producidos in vitro que fueron tratadas con CIDR (n=97) durante la gestación o aquellas que permanecieron en el grupo control (n=99).

* Se encontró una tendencia hacia diferencias significativa entre tratamientos (P≤0,06).

Disminución de las pérdidas de gestación (D30-60) en un programa de transferencia de embriones producidos in vitro: uso de GnRH en el periodo posovulatorio Los niveles de progesterona (P4) en el periodo posovulatorio, a través de su efecto en el endometrio, han sido asociados con un incremento en la secreción de interferón tau y el tamaño del embrión (Carter et al. 2008; Clemente et al. 2009). Estos resultados han conducido al desarrollo de estrategias con el objetivo de incrementar los niveles de progesterona durante el desarrollo embrionario temprano, previo al reconocimiento materno. Los estudios realizados con suplementación de P4 en el periodo posovulatorio muestran resultados contradictorios, con efectos positivos o neutros, o incluso en algunos casos negativos (Lonergan et al. 2015; Monteiro Jr et al. 2015). Entre las estrategias utilizadas, la inducción de la ovulación del folículo dominante de la primera onda folicular ha recibido considerable atención por su relativa simplicidad y duración. El uso de GnRH y sus análogos o hCG tiene como objetivo inducir la ovulación del folículo dominante de la primera onda folicular generando así un cuerpo lúteo accesorio y como

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resultado un incremento en los niveles de P4. El uso de esta estrategia en programas de IATF en vacas en lactancia fue revisado recientemente (Nascimento et al. 2013), indicando un incremento del 3% en los porcentajes de preñez. Sin embargo, la inducción de CL accesorios en programas de TE muestra resultados diversos, con algunos estudios indicando efectos positivos en los porcentajes de preñez (Marques et al. 2003; Wilson et al. 2005; Vasconcelos et al. 2011; Wallace et al. 2011) mientras otros no encontraron beneficio (Ideta et al. 2003; Small et al. 2004; Tribulo et al. 2004). La mayoría de los estudios citados fueron realizados con embriones producidos in vivo y el número de animales utilizados es limitado, especialmente considerando los efectos reportados en programas de IATF (Nascimento et al. 2013). En contraposición, de aquellos trabajos que encontraron efectos positivos, la mayoría presenta porcentajes de preñez muy por debajo de los esperado en el grupo control (Marques et al. 2003; Wilson et al. 2005; Vasconcelos et al. 2011). Finalmente, las perdidas gestacionales y la tasa de ovulación al tratamiento (% de animales con CL accesorio) no han sido reportadas, haciendo difícil una precisa interpretación.

Considerando la variación en los resultados obtenidos con el uso de GnRH en el periodo posovulatorio, y la falta de estudios realizados con receptoras de embriones producidos in vitro se realizó un estudio en 1562 vaquillonas Holstein en un programa de transferencia de embriones in vitro (Garcia-Guerra et al. 2015). Las receptoras fueron asignadas en el día 5.5 pos-GnRH a uno de dos grupos: control o GnRH (200 μg, acetato de gonadorelina). Embriones producidos in vitro fueron transferidos en fresco el día 7 ± 1. El diagnostico de gestación se realizó en el día 33 y 60 en todos los animales, y se colectaron muestras de un subgrupo para determinación de P4 en el día 12.

El porcentaje de ovulación a la GnRH en el día 5,5 fue 83,9% (302/360) para las vaquillonas tratadas con GNRH y de 3,3% (12/358) en el grupo Control (P<0,001). Los niveles de P4 en el día 12 fueron mayores en el grupo GNRH 7,2 ± 0,1 ng/ml que en el grupo Control 6,0 ± 0,1 ng/ml (P<0,001). No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de preñez entre tratamientos al día 33 y 60 (Tabla 3). Sin embargo, se encontraron diferencias significativas en las perdidas gestacionales entre el día 33 y 60, donde el tratamiento con GnRH disminuyo las mismas. Un análisis pormenorizado de este efecto encontró que el mismo se debía exclusivamente a una disminución de las perdidas en aquellas receptoras que recibieron embriones estadio 7. La longitud del embrión (céfalo-caudal) en el día 33 no tuvo diferencias significativas entre tratamientos o entre embriones de diferente estadio (Tabla 3). Asimismo, el volumen de la vesícula amniótica no fue diferente entre el grupo tratado con GnRH (549,1 ± 16 mm3) y el grupo Control (543,5 ± 14 mm3; P=0,86). Resultados similares fueron obtenidos en un estudio reciente realizado en Brasil en animales Girolando (N= 1807) tratados con GnRH (100 μg) al momento de la transferencia de embriones producidos in vitro (Munhoz et al. 2014). No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de preñez al día 31 y 66 entre tratamientos, sin embargo, hubo una tendencia (P=0,10) a una menor perdida gestacional en animales que recibieron GnRH (15,9%; 75/473) comparados con el grupo Control (19,9%; 95/477).

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Tabla 3. Porcentajes de preñez, perdidas gestacionales y tamaño del embrión en receptoras de embriones in vitro tratadas con GnRH en el periodo posovulatorio (adaptado de Garcia-Guerra et al. 2015).

Estadio del

Embrión

Tratamiento P/ET D33

(n) P/ET D60 (n)

Perdidas de preñez D33-

60 (n)

Longitud embrión D33

(n)

6 Control 28,6% (374) 22,7% (374)

20,6% (107)AC

10,7±0,3 (50)

GnRH 30,8% (357) 23,5% (357) 23,6% (110)AC

10,6±0,2 (61)

7 Control 45,9% (394) 33,5% (394)

27,1% (181)BC

10,8±0,2 (84)

GnRH 42,1% (437) 35,7% (437) 15,2% (184)A 10,6±0,2

(81)

Valor P

Estadio <0,01 <0,01 0,45 0,98

Tratamiento 0,90 0,35 0,16 0,46

Interacción 0,30 0,67 0,04 0,33

Las pérdidas gestacionales en receptoras de embriones producidos in vitro son en general mayores a las observadas en programas de IA o TE producidos in vivo (Farin and Farin 1995; Peterson and Lee 2003; Hasler 2012) aunque existen controversias al respecto (Pontes et al. 2009). Asimismo, estudios realizados evaluando el desarrollo embrionario indican alteraciones significativas, particularmente en el desarrollo de las membranas fetales (Alberto et al. 2013). El efecto del uso de GnRH en el porcentaje de perdidas gestacionales fue inesperado. De acuerdo, a la noción de que el aumento de progesterona en el periodo posovulatorio debe ocurrir de manera temprana (día 4-5) para influenciar el elongamiento del embrión, el uso de estrategias para inducir CL accesorio resultan en un incremento de P4 tardío (Bo et al. 2012). Sin embargo, los efectos observados respecto de las perdidas gestacionales entre el día 30 y 60 con el uso de GnRH, indicaría la posibilidad de un efecto tardío, potencialmente en el desarrollo de las membranas fetales. Transferencia de múltiples embriones: ¿es posible mejorar la fertilidad de embriones producidos in vitro de baja calidad mediante la transferencia de 2 embriones?

La fertilidad de embriones producidos in vitro se ve afectada por, entre otros factores, el estadio y la calidad del embrión como fue demostrado en el comienzo de esta revisión. Con el objetivo de evaluar la posibilidad de mejorar la fertilidad de embriones de baja calidad o de estadios que poseen menor fertilidad se evaluó la fertilidad de la transferencia de dos embriones en forma unilateral o bilateral (Carrenho-Sala et al.

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2016). Un total de 454 vaquillonas Holstein fueron sincronizadas con un protocolo Co-Synch de 5 días. En el día 7±1 (día 0 aplicación de GnRH) las vaquillonas se asignaron aleatoriamente en los siguientes grupos: transferencia de un único embrión en el cuerno ipsilateral al CL (Único; n=188); transferencia de 2 embriones ambos en el cuerno ipsilateral al CL (Unilateral; n=138); o transferencia de 2 embriones de manera bilateral (uno en cada cuerno / Bilateral; n=128). Todos los embriones utilizados fueron producidos in vitro y transferidos en fresco. Se utilizaron embriones de estadios 4 (mórula) a 8 (blastocito eclosionado) y calidad 1 o 2. Como mínimo uno de los embriones transferidos debía ser de baja calidad (grado 2) o de un estadio que resulte en menor fertilidad (estadios 4, 5 o 6). No se encontraron diferencias significativas (P>0,10) en el porcentaje de P/ET en el día 32 o 60 entre vaquillonas que recibieron un embrión único (d32 30,9% [58/188] y d60 25% [47/188]) o 2 embriones (d32 36,5% [97/266] y d60 22,2% [59/266]) independientemente de la ubicación. Sin embargo, las perdidas entre el día 32 y 60 fueron significativamente mayores (P<0,01) en receptoras que recibieron 2 embriones (39,2%; 38/97) comparado con aquellas que recibieron un único embrión (18,9%; 11/58).

La tasa de preñez en el día 32 fue similar (P=0,4) para aquellas receptoras que recibieron un embrión único 30,9% (58/188), 2 embriones de manera unilateral 36,9% (51/138), y 2 embriones de forma bilateral 35,9% (46/128). Sin embargo, se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de perdidas gestacionales entre el día 32 y 60 (P=0,04). Las perdidas gestacionales fueron mayores (P=0,01) en el grupo que recibió 2 embriones en forma bilateral 43,5% (20/46) comparado con el grupo que recibió un embrión único 18,9% (11/58), mientras que el grupo que recibió 2 embriones en forma unilateral fue intermedio 35,3% (18/51) y mostro una tendencia hacia una diferencia significativa con el grupo que recibió un embrión único (P=0,1). Cuando las perdidas gestacionales fueron evaluadas en función de la presencia confirmada de mellizos (mediante ultrasonografía) se encontró que receptoras con una preñez múltiple al día 32 sufrieron un 62,1% (18/29) de perdidas entre el día 32 y 60, mientras que aquellas que tenían una preñez única tuvieron un 24,6% (31/126) de perdidas (P<0,01). En receptoras preñadas con mellizos no se encontraron diferencias (P=0,9) en las perdidas gestacionales entre aquellas receptoras con preñeces unilaterales (62,5%; 10/16) y aquellas con preñeces bilaterales (61,5%; 8/13).

Las receptoras preñadas con un único embrión tuvieron porcentajes de perdidas gestacionales similares aun cuando hubieran recibido un único embrión (18,9%; 11/58) o recibieran 2 embriones de forma unilateral (22,9%; 8/35). Sin embargo, receptoras que recibieron 2 embriones en forma bilateral pero que se diagnosticaron preñadas con un único embrión en el día 32 mostraron una tendencia (P=0,07) a una mayor pérdida gestacional (36,4%; 12/33) que las que recibieron un único embrión. Este último hallazgo tiene como causa probable la presencia de receptoras que habiendo recibido 2 embriones en forma bilateral solo uno de ellos haya logrado establecer una preñez, pero de forma contralateral al cuerpo lúteo. Como consecuencia, la falta de señales locales al cuerpo lúteo, provenientes del embrión, haya permitido la regresión del mismo indicando nuevamente la presencia de un mecanismo de reconocimiento y mantenimiento de la gestación entre el día 32 y 60. Finalmente, la transferencia de 2 embriones de menor calidad o desarrollo no mostro una mejora en los porcentajes de preñez, pero mostro un

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marcado aumento en las perdidas gestacionales. En conclusión, la transferencia de 2 embriones no es una estrategia eficiente para aumentar la fertilidad y disminuir las perdidas gestacionales en receptoras de embriones producidos in vitro.

Conclusiones

Las mayores pérdidas gestacionales en receptoras de embriones producidos in vitro es una limitante para la aplicación masiva de este sistema reproductivo. Una serie de factores de riesgo para la fertilidad, relacionados tanto al embrión y la receptora como a la interacción entre ambos, han sido identificados y proveen una guía para la selección de receptoras y embriones que maximicen el potencial de establecer una preñez y su posterior desarrollo.

Los factores relacionados al embrión que mostraron asociaciones significativas con la fertilidad fueron el estadio y calidad del embrión, así como la edad de la donante. En relación a la receptora aquellos factores que mostraron relación con la fertilidad fueron: el tamaño del CL, la condición corporal y la expresión de celo durante el final del protocolo de sincronización. Las perdidas gestacionales entre el día 32 y 60 pueden alcanzar niveles mucho mayores a los encontrados en animales que reciben IATF siendo de esta manera un área de sumo interés. Debido al tiempo que estos animales, que sufren pérdidas entre el día 32 y 60, permanecen “improductivos” hace que el costo de estos animales sea mayor al de aquellos que no establecen inicialmente una preñez. Sin embargo, como fue demostrado hay relativamente pocos factores que están relacionados a las pérdidas de gestación entre el día 32 y 60. Estos fueron, la calidad del embrión y la edad de la donante indicando una preponderancia del rol del embrión en las perdidas entre el día 32 y 60.

Aun cuando los factores indicados previamente pueden contribuir a seleccionar aquellas receptoras o embriones que maximicen la fertilidad, esto no es siempre posible debido a la limitada oferta de ambos en muchas circunstancias. De esta manera el desarrollo, de estrategias que maximicen la fertilidad disminuyendo las perdidas gestacionales puede ser una valiosa alternativa. La suplementación de progesterona ya sea mediante la administración de GnRH o la utilización de dispositivos intravaginales de progesterona puede contribuir a disminuir estas pérdidas. De ambas estrategias la administración de GnRH en el periodo posovulatorio para generar CL accesorios es una forma simple y efectiva de suplementar progesterona, sin embargo, los resultados presentados indican que el mayor beneficio de esta estrategia es ejercido en aquellas receptoras que reciben embriones de estadios más avanzados. Este hallazgo así como el mecanismo por el cual la generación de un CL accesorio disminuye las perdidas gestacionales no ha sido completamente elucidado y es necesario llevar a cabo futuras investigaciones con este objetivo. Sin embargo, un hallazgo importante es la aparente presencia de un segundo periodo en el que el CL debe ser mantenido mediante una señal de embrión. Como consecuencia, el incremento en las perdidas gestacionales en receptoras de embriones producidos in vitro puede ser debido a fallas en este mecanismo. Estudios futuros deberán centrarse en la investigación de este mecanismo con la consecuente posibilidad de desarrollar mejores estrategias que permitan disminuir las perdidas gestacionales.

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Programas de IATF e re-IATF en ganado zebuíno

BARUSELLI, P.S.; VIEIRA, L.M.

Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo, SP, Brazil

INTRODUÇÃO

O sistema de produção de proteína de origem animal sofre constante pressão da grande

demanda do mercado mundial. Principalmente no caso da carne bovina que, com a diminuição

global de áreas disponíveis para criação e a necessidade de maior eficiência por área,

necessitam de constantes estudos para aumentar a eficiência do modelo tradicional de produção.

A produtividade de carne bovina está diretamente relacionada com a eficiência reprodutiva

do rebanho. A obtenção de elevada eficiência reprodutiva dos rebanhos tem sido associada a

boas técnicas de manejo nutricional e sanitário e com a utilização programada de biotecnologias

da reprodução. O Brasil, um dos líderes no mercado mundial de exportação de carne bovina,

encontra-se em lugar de destaque no desenvolvimento científico e na aplicação comercial de

biotecnologias da reprodução, dentre elas, a inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Com o

avanço do emprego da IATF, que atingiu 10 milhões de procedimentos em 2015, observou-se

aumento significativo do emprego da inseminação artificial (100% de aumento nos últimos 10

anos), com impacto direto no progresso do melhoramento genético dos rebanhos pela

intensificação da utilização de sêmen de reprodutores com elevado mérito genético. Verificou-

se, também, aumento da eficiência reprodutiva do rebanho pela antecipação da concepção no

período pós-parto (de 1 a 2 meses) e pelo aumento do número de fêmeas gestantes ao final da

estação de monta (de 8 a 10%), quando comparado ao sistema tradicional de produção de

bezerros por monta natural.

No entanto, a baixa eficiência reprodutiva do rebanho nacional ainda é um fator limitante

para o crescimento sustentável da pecuária. O Brasil possui em torno de 74 milhões de fêmeas

em idade reprodutiva e produz apenas 45 milhões de bezerros por ano (~ 65% de taxa de

desmame). Além disso, o país utiliza pouco a inseminação artificial (somente 11% das matrizes

são inseminadas artificialmente), técnica mundialmente utilizada para promover o melhoramento

genético dos rebanhos. As dimensões e a característica do sistema produtivo nacional exigem o

desenvolvimento de programas de inseminação artificial de fácil aplicação em larga escala,

visando diminuir as dificuldades operacionais para sua execução. Os programas reprodutivos

Memorias

140

visam principalmente a eficiente multiplicação dos animais (PRODUTIVIDADE), o rápido ganho

genético do rebanho (MÉRITO GENÉTICO) e a facilidade de execução (APLICABILIDADE).

POR QUE UTILIZAR IATF?

A eficiência reprodutiva pode ser definida como a habilidade de fazer a vaca se tornar

gestante após o parto o mais rápido e com o menor número de coberturas possível. A reprodução

ineficiente reduz a produtividade por diminuir o número de bezerros disponíveis para a produção

de carne e para a reposição das matrizes, além de aumentar os custos com tratamentos

reprodutivos e as coberturas. Uma fêmea bovina mantida em condições favoráveis tem o

potencial de produzir um bezerro por ano, mantendo um intervalo entre partos (IEP) próximo a

12 meses, considerado ideal zootecnicamente para o sistema de produção de corte. Para que

esse índice seja alcançado as vacas devem conceber até 75 dias (Bos indicus – 290 dias de

gestação) ou 85 dias (Bos taurus – 280 dias de gestação) após a parição. Como as fêmeas

zebuínas (Bos indicus) apresentam gestação mais longa que as taurinas (Bos taurus), seu

período de serviço (intervalo parto-concepção) é reduzido e, portanto, as atividades reprodutivas

devem ser estabelecidas antecipadamente (Figura 1).

Figura 1. Efeito do período de serviço (intervalo parto/concepção) no intervalo entre partos.

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141

Além disso, vacas criadas a pasto em condições tropicais, como é o caso da maior parte

do rebanho brasileiro, possuem alta incidência de anestro pós-parto, o que resulta em aumento

do intervalo parto-concepção, do IEP e, consequentemente, redução do desempenho

reprodutivo. No Brasil, a média nacional do intervalo entre partos está em 17 meses. Esses dados

reforçam que o anestro pós-parto é o principal fator que interfere no desempenho reprodutivo de

bovinos manejados em condições tropicais.

Outro aspecto que dificulta a obtenção de bons índices reprodutivos de fêmeas

inseminadas artificialmente é a baixa eficiência de detecção de estro. Em grande parte do Brasil,

o emprego dessa biotecnologia ainda depende da detecção de fêmeas em estro, dificultado o

estabelecimento do programa reprodutivo e, consideravelmente, limitando o uso da inseminação

artificial (IA). De maneira geral, programas de IA após detecção de estro apresentam resultados

satisfatórios na taxa de concepção (número de animais gestantes por IA). No entanto, baixa taxa

de prenhez (número de animais gestantes por números de animais aptos à reprodução) é

alcançada devido à baixa taxa de serviço (número de animais detectados em cio e inseminados

por números de animais aptos à reprodução), reflexo da baixa eficiência de detecção de estro.

Portanto, os principais entraves que reduzem a eficiência reprodutiva de rebanhos

inseminados artificialmente no Brasil estão associados principalmente ao anestro pós-parto e à

falha na detecção de cio. Tais fatores são agravados quando consideramos as condições

climáticas (o estresse calórico bloqueia a ciclicidade e a manifestação do cio), o sistema de

criação a pasto (condições extensivas diminuem a eficiência de detecção de cio), as

particularidades da espécie Bos indicus (estro de menor duração e predominantemente noturno

– rebanho predominante no Brasil) e as dificuldades com a mão de obra qualificada no campo

(erros de manejo para detecção de cio).

No entanto, esses obstáculos têm sido contornados com sucesso pela utilização de

protocolos de sincronização da ovulação para IATF. O emprego da IA no Brasil tem apresentado

crescimento significativo nos últimos anos (Baruselli et al., 2012). A crescente utilização da

biotécnica da reprodução está associada ao maior emprego da IATF no rebanho bovino. Os

dados mostram que a IATF atingiu 70% do total das inseminações realizadas em nosso país em

2014 (estimativa levando em consideração os dados da Asbia e a venda de produtos para

sincronização). Dessa forma, a expansão da IA tem possibilitado grande avanço no

melhoramento genético, pelo incremento do número de bezerros nascidos de touros

geneticamente superiores.

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POR QUE UTILIZAR PROGRAMAS DE RESSINCRONIZAÇÃO?

A ressincronização se refere à sincronização do estro e da ovulação de uma fêmea que foi

previamente inseminada após a observação de cio ou após a IATF. O objetivo da técnica é

eliminar a necessidade de observação de cio, diminuir o número de touros para repasse e

melhorar a eficiência reprodutiva dos rebanhos. Essas características reduzem o intervalo entre

inseminações e antecipa a concepção no período pós-parto, reduzindo o entre partos e

aumentando o número de produtos oriundos de IA que podem determinar maior valor agregado

ao produtor.

A ressincronização em fêmeas de corte no Brasil tem sido realizada em dois momentos

distintos: 1. Início da ressincronização em todas as fêmeas 22 dias após a primeira IATF, antes

do diagnóstico de gestação; e 2. Início da ressincronização no dia do diagnóstico de gestação

(28 a 32 dias após a primeira IATF; Figura 2).

A escolha do momento para início do protocolo de ressincronização é dependente do

manejo da propriedade, dos lotes da fazenda, dos custos envolvidos e da mão de obra disponível

(disponibilidade do veterinário para realização da ultrassonografia e dos funcionários da fazenda

para o manejo dos animais). A ressincronização iniciada 22 dias após a IATF prévia proporciona

antecipação em oito dias na realização da 2a IATF quando comparada a ressincronização

realizada no dia do diagnóstico de gestação (com 30 dias após a IATF prévia), Esse programa

reprodutivo pode ser indicado para evitar atraso na concepção do início da estação de monta

(evitar futuros problemas reprodutivos das matrizes) e em lotes de fêmeas vazias

ressincronizados no final da estação reprodutiva (evitando o descarte de animas não gestantes).

Essa possibilidade também pode ser de grande interesse para fazendas que precificam bezerros

por quilo de peso vivo, proporcionando o nascimento precoce dos bezerros na estação de

parição.

Por outro lado, o protocolo para ressincronização antes do diagnóstico de gestação obriga

o tratamento de 100% dos animais do lote (gestantes e não gestantes) previamente inseminados

em tempo fixo. Ainda, com esse tipo de manejo, a realização da ultrassonografia, juntamente

com a retirada de implantes, passa ser data fixa e não flexível, exigindo maior organização e

disponibilidade do médico veterinário.

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Figura 2. Desenho esquemático dos manejos para a ressincronização de fêmeas de corte para IATF: 1. Início da ressincronização, em todos os animais submetidos à primeira IATF, 22 dias após a IATF; e 2. Início da ressincronização no dia do diagnóstico de gestação (28 a 32 dias após a primeira IATF), apenas nos animais não gestantes. Protocolo IATF - protocolo de sincronização da ovulação; IATF – inseminação artificial em tempo fixo; US – diagnóstico de gestação por ultrassonografia.

Já, os programas de ressincronização que têm início no momento do diagnóstico de

gestação, apresentam maior flexibilidade. O início do protocolo pode variar do dia 28 ao 32 após

a primeira IATF, de acordo com a rotina e disponibilidade do veterinário e do pessoal na

propriedade. Além disso, o tratamento somente é realizado nas fêmeas não gestantes, o que

reduz os custos com tratamento. Como desvantagem ocorre atraso no intervalo entre

inseminações (aproximadamente 40 dias)

Diante da crescente utilização dos programas de ressincronização nas propriedades,

introduziu-se uma segunda sincronização (3 IATFs; Figura 3). O manejo reprodutivo com duas

ressincronizações (3 IATFs consecutivas), também pode ser realizado utilizando a

ressincronização antes ou após o diagnóstico de gestação. Quando se utiliza a ressincronização

antes do diagnóstico de gestação (22 dias após a prévia IATF), com três IATFs consecutivas

obtêm-se 87,4% de taxa de prenhez ao final do programa reprodutivo (Figura 4) em apenas 64

dias de estação de monta.

Memorias

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Figura 3. Manejo reprodutivo durante a estação de monta de bovino de corte: 1. Uma IATF e monta natural

(90 dias de estação de monta); 2. Duas IATFs (ressincronização 32 dias após IATF prévia – após

diagnóstico de gestação) e monta natural (90 dias de estação de monta); 3. Duas IATFs (ressincronização

22 dias após IATF prévia – antes do diagnóstico de gestação) e monta natural (90 dias de estação de

monta); 4. Três IATFs (duas ressincronizações 32 dias após IATF prévia – após diagnóstico de gestação

- 84 dias de estação de monta); 5. Três IATFs (duas ressincronizações 22 dias após IATF prévia – após

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diagnóstico de gestação - 64 dias de estação de monta). Protocolo IATF - protocolo de sincronização da

ovulação; IATF – inseminação artificial em tempo fixo; US – diagnóstico de gestação.

Figura 4. Taxa de prenhez em vacas de corte Bos indicus após programa de ressincronização com início

22 dias após IATF prévia. Adaptado de Crepaldi et al. (2014).

Outra grande vantagem do emprego dos programas de ressincronização é o

planejamento da estação de monta dos anos consecutivos. Devido ao curto intervalo entre

inseminações (32 a 42 dias), as vacas paridas nos dois primeiros meses de parição (ex.: agosto

e setembro) são capazes de receber 3 IATFs em uma estação de monta de 90 dias. Ainda, as

vacas paridas no terceiro mês (ex.: outubro) estão aptas para receberem 2 IATFs na mesma

estação de monta (ex.: novembro a janeiro). Os resultados desses estudos foram indicativos de

que aproximadamente 85% das vacas se tornam gestantes ao final da estação de monta quando

da utilização desse programa reprodutivo (Tabela 5). Além disso, esses dados, associado ao

fato de que é possível iniciar o tratamento para sincronização com 30 dias pós-parto,

demonstram que 50% das vacas paridas no terceiro mês de parição (ex.: outubro – ou seja,

animais que recebem apenas 2 IATFs) têm antecipação da parição para o segundo mês de

parição (ex.: setembro), viabilizando a utilização nesses animais de 3 IATFs na próxima estação

de monta. Também, as fêmeas paridas nos dois primeiros meses (agosto e setembro) que

concebem apenas na terceira IATF (janeiro) atrasarão a parição na estação de monta seguinte

e receberão apenas 2 IATFs. Dessa forma, após 4 a 5 anos de utilização dos manejos de

ressincronização durante a estação de monta, espera-se que a distribuição dos partos na

propriedade seja 49% no primeiro mês de parição, 34% no segundo mês de parição e 17% no

terceiro mês de parição (Tabela 1). Portanto, 83% das fêmeas receberão 3 IATFs com 87,5% de

prenhez e 17% das fêmeas receberão 2 IATFs com 75% de prenhez, resultando em 85,4% de

taxa de prenhez do rebanho ao final da estação de monta de 90 dias (Tabela 1).

Memorias

146

Tabela 1. Distribuição dos partos e eficiência reprodutiva em rebanhos bovinos que utilizam programas de

ressincronização em 90 dias de estação de monta (EM).

MÊS DE PARIÇÃO DISTRIBUIÇÃO DOS PARTOS

NÚMERO IATF NA EM TAXA DE PRENHEZ

AGO 49% 3 87,5

SET 34% 3 87,5

OUT 17% 2 75,0

TOTAL 100% 85,4

Visando reduzir ainda mais o intervalo entre inseminações, esforços tem sido empregados para

possibilitar o início do protocolo de ressincronização ainda mais precocemente (super precoce), no diestro

subsequente a IATF (13 a 14 dias após a IATF; VIEIRA, et al., 2014). Para que seja possível a utilização

deste modelo, o diagnóstico dos animais não gestantes deve ser realizado através da avaliação da

vascularização do CL, utilizando-se o ultrassom com função color-Doppler. Assim como na

ressincronização precoce, todas as fêmeas devem iniciar o tratamento de ressincronização, porém,

apenas aquelas diagnosticadas como vazias (CL com baixo fluxo sanguíneo) recebem a segunda

inseminação, resultando intervalo entre inseminações ainda mais curto (Figura 5).

Figura 5. Desenho esquemático dos 3 tipos de manejos para a ressincronização de fêmeas de corte para IATF: Ressincronização tradicional = início da ressincronização no dia do diagnóstico de gestação (28 a 32 dias após a primeira IATF), apenas nos animais não gestantes; Ressincronização precoce = início da

Memorias

147

ressincronização, em todos os animais submetidos à primeira IATF, 22 dias após a IATF; e Ressincronização super precoce = início da ressincronização, em todos os animais submetidos à primeira IATF, 14 dias após a IATF e diagnóstico de gestação pela vascularização do CL. Protocolo IATF = protocolo de sincronização da ovulação; IATF = inseminação artificial em tempo fixo; US = diagnóstico de gestação por ultrassonografia.

Nesses estudos, verificou-se que a aplicação de 2 mg BE no início do protocolo de

ressincronização (13 a 14 dias após prévia IA) induziu luteólise em parte dos animais tratados e reduziu a

taxa de concepção (VIEIRA et al., 2014), fato que não ocorre em vacas ressincronizadas precocemente

(22 dias após a IATF; SÁ FILHO et al., 2014). Esses resultados estão em conformidade com estudos

anteriores que demonstraram redução da habilidade do CL em produzir P4 em fêmeas tratadas com BE

no meio do ciclo estral (EL-ZARKOUNY & STEVENSON, 2004; MUNRO & MOORE, 1985). Isso pode

estar relacionado ao fato de o aumento de E2 estar vinculado a indução da liberação de PGF (THATCHER

et al., 1986; ARAUJO et al., 2009).

Dentro deste contexto, os programas de ressincronização super precoce passaram a ser

realizados sem o uso de estradiol no início do tratamento, utilizando-se somente 100 mg de P4 injetável

(Afisterone®, Hertape Calier) no momento da inserção de dispositivo de P4 (14 após a IATF) para induzir

a emergência de uma nova onda de crescimento folicular. Rezende et al., (2016) verificaram que a nova

onda de crescimento folicular teve início 3,0 ± 0,7 dias após o tratamento com 100 mg de P4 i.m. em vacas

Nelore. Em seguida, Penteado et al., (2016) compararam a ressincronização precoce (22 dias) com a

super precoce (14 dias) em 244 vacas Nelore lactantes. Neste estudo todas as fêmeas receberam a

primeira IATF (Dia 0) e foram distribuídas em dois programas de ressincronização: super precoce (ECC =

3,0; n = 118) e precoce (ECC = 3,0; n = 126). As vacas que receberam ressincronização super precoce

foram tratadas 14 dias após IATF (D14) com dispositivo de P4 associado a 100 mg de P4 i.m. (Afisterone®,

HertapeCalier). No D22 foi realizado o diagnóstico de gestação pelo fluxo sanguíneo do CL, utilizando-se

ultrassonografia com modo Collor Doppler (Mindray M5Vet, DPS São Paulo). As vacas que possuíam CL

com fluxo sanguíneo baixo ou ausente foram consideradas não gestantes e seguiram no protocolo para

IATF [remoção do dispositivo de P4 e administração de 0,530 mg de cloprostenol sódico (PGF), 1 mg de

CE e 300 UI de eCG i.m.; IATF 48 horas após (D24)]. As vacas gestantes passaram por remoção do

dispositivo de P4 sem tratamento adicional. As vacas que recebeu a ressincronização precoce foram

tratadas no D22 com dispositivo de P4 associado a 2 mg de BE i.m.. No D30 o dispositivo foi removido e

foi realizado o diagnóstico de gestação por ultrassonografia convencional (modo B; Mindray, M5VET,

China). As vacas não gestantes foram tratadas conforme descrito para o grupo super precoce, com IATF

no D32. Os resultados obtidos em vacas ressincronizadas super precoce e precocemente foram,

respectivamente: taxa de concepção à primeira IATF 53% vs. 48% (P=0,57), taxa de concepção à

ressincronização 51% vs. 56% (P=0,37) e taxa de prenhez acumulada após a ressincronização [75%

(89/118) em 24 dias de estação de monta e 77% (97/126) em 32 dias de estação de monta; P = 0,77].

Além de manter semelhante taxa de concepção à IATF e reduzir o intervalo entre inseminações, a

Memorias

148

ressincronização super precoce aumenta consideravelmente a taxa de serviço a cada 21 dias (de 66%

para 87,5%) em relação à ressincronização precoce, como demonstrado na figura 6

Figura 6. Taxa de serviço (TS) nos diferentes modelos de ressincronização. Ressincronização super precoce (14 dias após IATF prévia, com intervalo entre IATFs de 24 dias) com TS = 87,5%; Ressincronização precoce (22 dias após IATF prévia, com intervalo entre IATFs de 32 dias) com TS = 66%; Ressincronização após o diagnóstico de gestação, 30 dias após IATF prévia e com intervalo entre IATFs de 40 dias) com. TS = 52,5%; Modelo ideal considerando retorno ao estro a cada 21 dias com TS = 100%.

A escolha de qual modelo de ressincronização utilizar depende do sistema de produção, do manejo

de pastos e lotes na fazenda, da disponibilidade de mão de obra tanto do médico veterinário para

realização do diagnóstico de gestação, quanto dos funcionários da fazenda para o manejo dos animais.

Nas figuras 4 e 5 são apresentados os desenhos esquemáticos dos diferentes métodos de

ressincronização seguida ou não de monta natural que podem ser utilizados em programas reprodutivos

de gado de corte no Brasil.

CONCLUSÕES

Atualmente, os protocolos de sincronização da ovulação para IATF já estão definidos e

estão sendo utilizados em larga escala pelo produtor brasileiro. Essa tecnologia foi capaz de

contornar alguns dos principais desafios da pecuária brasileira (anestro pós-parto e dificuldade

TS21d=(21/35)=52,5%(ressincronizaçãotradicional)

0 21 42 63 84

IATF IATF IATF

IATF IATF IATF

RESSINCPÓSDG30dPÓSIATF40dPÓSIATF

RESSINCANTESDG22dPÓSIATF32dPÓSIATF

ModeloIDEAL(hipoté co)

IA IA IA IA IATS100%

TS21d=(21/32)=66%(ressincronizaçãoprecoce)

TAXADESERVIÇOACADA21DIAS(TS21d)=(intervalocicloestral/intervaloentreIATF)*100

32d

40d

IATF IATF IATFRESSINCANTESDG14dPÓSIATF24dPÓSIATF

TS21d=(21/24)=87,5%(ressicronizaçãosuperprecoce)

24d

32d

TS100%

TS100%

TS100%

24d

40d

TS21d=100%(todosanimaisciclandocom100%dedetecçãodeestro)

Memorias

149

de detecção do cio), viabilizando o emprego sistematizado e eficiente da inseminação artificial

programada. A aplicação da IATF melhora a eficiência reprodutiva dos rebanhos, aumentando a

quantidade e a qualidade de bezerros produzidos com consequente aumento do retorno

econômico da pecuária. Diante desses resultados, hoje os técnicos e os produtores buscam

intensificar a utilização da IATF por meio dos programas de ressincronização, com resultados

bastante promissores. Por fim, é importante reforçar que outros fatores tais como nutrição,

sanidade e a disponibilidade e a qualificação profissional estão diretamente relacionados com o

sucesso do uso dessas biotecnlogias.

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Implementación de programas de IATF a gran escala

Alejo Menchaca

Instituto de Reproducción Animal Uruguay, Fundación IRAUy, Montevideo, Uruguay.

La Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) es una tecnología que permite preñar un alto

número de animales en un mismo día sin la necesidad de detectar celo. El porcentaje de preñez al

final de la estación de monta aumenta de manera significativa, y además se genera un fuerte

impacto en la mejora genética por el uso masivo de la inseminación. La adopción de esta tecnología

ha venido creciendo en los países de Latinoamérica de manera ininterrumpida en los últimos 20

años. Esto ha generado beneficios para los veterinarios que la aplican, para las compañías de

semen, para los laboratorios farmacéuticos, y fundamentalmente para los ganaderos y la industria

de la carne y leche. Sin embargo, uno de los desafíos que genera el crecimiento en la demanda de

una tecnología, es como lo capitalizamos en una oportunidad. La principal medida del éxito que

ven nuestros clientes es la tasa de preñez al final del programa, y por lo tanto sólo es posible

alcanzar un nivel de gran escala, únicamente se si mantenemos resultados aceptables.

Al momento de implementar programas de IATF en empresas comerciales, el éxito depende

principalmente de un gran factor: la planificación. Esto permitirá diseñar el programa de manera

correcta en cuanto a los aspectos técnicos, pero también la planificación abarca otros factores que

van más allá de la técnica como lo son el manejo de los animales, la alimentación, el estado

sanitario, el personal necesario, las instalaciones y el clima, entre otros. A continuación, se

enumeran los principales puntos que deben ser considerados al planificar un programa de IATF en

bovinos. No se incluyen aquellos aspectos vinculados con los protocolos hormonales y con la

técnica de inseminación, ya que estos se han abordado en reiteradas ocasiones.

Manejo de los animales

- Las vaquillonas deben llegar a la sincronización con un desarrollo corporal adecuado y preferentemente deberían estar ciclando. Las vacas paridas deben estar con más de 45 días posparto al momento de la IATF.

- Si bien los protocolos permiten preñar vaquillonas y vacas cíclicas y en antestro, es recomendable no ingresar al programa animales en anestro profundo. Aquellas hembras sin cuerpo lúteo y con folículos menores a 8 mm es recomendable mejorarles las condiciones de alimentación e ingresarlas algunas semanas más tarde.

- Todo factor de estrés al que se enfrente el rodeo afecta la fertilidad y disminuye la tasa de preñez.

- Desde una semana previa al inicio del tratamiento y hasta 45 días luego de la IATF no deben realizarse transportes en camión, traslados innecesarios, manejo violento, descensos abruptos de la alimentación.

- Jamás deben utilizarse perros en las mangas ni mucho menos picana eléctrica.

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Alimentación

- La alimentación debe mejorarse desde el momento de iniciar el tratamiento hasta un mes luego de la IATF.

- Es necesario que las hembras tengan una condición corporal individual no menor a 2.0 (escala 1 a 5) al momento de iniciar el tratamiento.

- Las vaquillonas deben recibir una buena alimentación durante la recría para llegar al servicio en buen estado corporal y con un adecuado desarrollo reproductivo.

- Las vacas adultas deben llegar al parto en la mejor condición corporal posible, y durante el periodo posparto se debe evitar una pérdida significativa de la condición corporal. Al momento de iniciar la sincronización deberán estar en un plano de ganancia de peso o condición corporal.

Sanidad

- Todo programa de IATF debe ser conducido por un veterinario especialista en reproducción animal, quien también es responsable por el manejo sanitario que pueda afectar el resultado reproductivo.

- Todo manejo sanitario debe ser aplicado previo al inicio del programa ya que luego debe evitarse todo tipo de tratamiento.

- El régimen de vacunación previo deberá definirlo el equipo técnico que llevará adelante el programa de IATF, siempre en mutuo acuerdo con el veterinario de la empresa.

- Desde la semana previa al inicio del programa y hasta 45 días luego de la inseminación evite tratamientos como baños, uso de vacunas, inyectables, etc. Algunos de estos tratamientos generan muerte embrionaria y pérdidas de gestación.

Personal para el programa de IATF

- Buena parte de los resultados dependen del manejo de los animales implementado

generalmente por el personal del campo. Por este motivo, esta tecnología requiere un esfuerzo

colectivo de varios actores involucrados, y por lo tanto el éxito dependerá también de la

capacidad del técnico a cargo de coordinar las responsabilidades de todos quienes participan.

El manejo del personal es un punto a resolver con el suficiente tiempo antes de iniciar el

programa.

- Es necesario definir un número mínimo de operarios de campo para el día de inicio del tratamiento y para el día en que se realiza la IATF. Este número de personas se definirá en función de la cantidad de animales con los que se trabajará, el estado de las instalaciones y la experiencia de los operarios.

- En todos los casos los horarios de trabajo deben definirse de acuerdo a las indicaciones de los protocolos hormonales.

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Infraestructura

- Se requieren instalaciones en un adecuado estado de funcionamiento.

- Es necesario prever una estructura mínima que asegure la protección del sol y de la lluvia, de manera de poder realizar las actividades a tiempo fijo sin vernos condicionados por la situación climática

- Se requiere un recinto cerrado y limpio para descongelar el semen junto al sitio donde se realizará la IATF.

- Es necesario contar con agua potable en una cantidad suficiente para el día del inicio del tratamiento para mantener los dispositivos y aplicadores con la limpieza e higiene adecuada.

En suma, para implementar con éxito un programa de IATF no solo es necesario aplicar los protocolos

hormonales precisos y realizar una correcta técnica de inseminación. También se requiere controlar todos

los factores –ajenos a la propia técnica- que afectan el resultado de preñez. Todo esto debe integrarse en

una planificación bien elaborada, y esta planificación es el aspecto más relevante para lograr el éxito. La

aplicación a escala de la IATF, es decir la ejecución de varios programas de inseminación en muchas

empresas distintas y en la misma temporada de servicios, solo es posible si logramos prever todos los

riesgos y si somos capaces de mitigarlos. Así, podremos inseminar varios miles de vacas con la misma

facilidad y probabilidad de éxito que cuando inseminamos unas pocas. Al masificar el uso de esta

tecnología, incrementaremos nuestra actividad profesional y nuestro negocio, pero principalmente

generaremos un mayor impacto de esta tecnología en la productividad ganadera y la economía de la

región.

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ESTRATEGIAS PARA EL USO EFICIENTE DE RECEPTORAS DE EMBRIONES IN VITRO

A. García Guerra1, R. V. Sala3, J.C.L., Motta1, E. Walleser2, L. F. Melo1, L. Leffers1, M. Fosado2, J. F. Moreno2, M. C. Wiltbank1

1 Department of Animal Sciences, The Ohio State University, 2027 Coffey Rd,

Columbus, OH, 43210, USA. 2 Department of Dairy Science, University of Wisconsin-Madison, 1675 Observatory

Drive, Madison, WI, 53706, USA. 3 Sexing Technologies, Kewaskum, WI, USA.

garciaguerra.1@osu.edu

Introducción

La necesidad de reproducir animales de alto valor genético ha llevado al desarrollo y difusión de biotecnologías reproductivas como la producción in vitro de embriones. En el año 2015, se colectaron 111.704 donantes produciendo 612.709 embriones bovinos in vitro en todo el mundo, representando con respecto a 2014 una reducción del 13% y un incremento del ~4%, respectivamente, basado en los datos de la IETS. Una multitud de factores han sido relacionados con la eficiencia y el éxito de programas de transferencia de embriones (TE), particularmente de embriones producidos in vivo (Looney et al. 2006; Hasler 2012).

Una de las mayores limitantes a la aplicación masiva de la transferencia de embriones es la baja eficiencia de utilización de las receptoras debido a la detección de celos y las dificultades en su implementación (Bó et al. 2011). El costo asociado a mantener receptoras disponibles junto a una baja eficiencia en su utilización puede atentar contra la rentabilidad de un programa de transferencia de embriones. En consecuencia, el desarrollo de protocolos de sincronización de la ovulación para la transferencia de embriones a tiempo fijo (TETF) ha sido el foco de investigaciones a lo largo de los últimos años.

En Norteamérica, los protocolos de sincronización para TETF están basados en la utilización de GnRH. Comúnmente estos protocolos incluyen la inserción de un dispositivo de progesterona intravaginal y la aplicación de GnRH en el día 0. Siete días después el dispositivo es retirado y se aplica PGF (día 7). Finalmente, la inducción de la ovulación se realiza el día 9 mediante la aplicación de GnRH. Más recientemente, con la expansión de protocolos que prolongan el proestro el dispositivo es retirado en el día 5 y la inducción de la ovulación se realiza en el día 8 reduciendo la longitud total del protocolo. Este tipo de tratamientos de proestro prolongado ha sido adoptado como consecuencia de una mejor tasa de preñez cuando son utilizados en programas de inseminación a tiempo fijo (Bridges et al. 2008). Sin embargo, aún no se han realizado comparaciones formales entere los tratamientos con GnRH de 5 o 7 días.

En Sudamérica los protocolos comúnmente utilizados se basan principalmente en el uso de estrógenos para la sincronización de la onda folicular, junto a la inserción de un

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dispositivo de progesterona. Siete días luego de colocado el dispositivo el mismo se retira y se administra una inyección de prostaglandina F 2α (PGF) y potencialmente (dependiendo del protocolo) 400UI de ECG. La inducción de la ovulación se realiza 24 h después del retiro del dispositivo con la administración de benzoato de estradiol o más recientemente se ha propuesto la administración de cipionato de estradiol al momento del retiro del dispositivo. De esta manera, se reduce el número de encierre necesarios (Bó et al. 2011; Bo et al. 2012).

El crecimiento sostenido de la producción de embriones in vitro, particularmente en Norteamérica, ha generado la necesidad de información relacionada a factores que afectan la fertilidad en programas de transferencia de embriones producidos in vitro, así como a la evaluación de estrategias para aumentar la eficiencia y la fertilidad en los mismos. Asimismo, la utilización eficiente de receptoras y recursos requiere la evaluación de estrategias que reduzcan los costos de los programas de transferencia de embriones in vitro manteniendo al mismo tiempo altos niveles de fertilidad. La presente revisión tiene como objetivo presentar información acerca de estrategias para el uso eficiente de receptoras como resultado de estudios realizados por nuestro grupo en un programa de transferencia de embriones producidos in vitro en Wisconsin y Ohio.

Sincronización de receptoras

Detección de celos vs Sincronización de la ovulación

La utilización de prostaglandina F2α y sus análogos ha sido uno de los pilares fundamentales en el desarrollo de programas de sincronización del celo y la ovulación (Wiltbank and Pursley 2014). La extensión de programas de transferencia de embriones in vitro a gran escala ha puesto de manifiesto la necesidad de evaluar estrategias para mejorar la eficiencia de dichos sistemas. A pesar de la gran cantidad de evidencia en favor de la utilización de protocolos de sincronización de la ovulación en programas de transferencia de embriones producidos in vivo (Bó et al. 2011), los mismos no han sido evaluados con igual detalle con embriones producidos in vitro. Un trabajo reciente tuvo como objetivo evaluar la tasa de utilización y la fertilidad en receptoras sincronizadas con PGF y transferidas en base a la detección de celos versus receptoras sincronizadas con dispositivos de progesterona por 5 días con GnRH y transferidas a tiempo fijo (Sala et al. 2015). Un total de 520 vaquillonas Holstein fueron asignadas aleatoriamente a los siguientes dos grupos: sincronización con PGF + detección de celos (PGF+DC) o sincronización de la ovulación con dispositivos de progesterona + GnRH (TETF). Los animales asignados al grupo PGF+DC fueron sincronizados con dos aplicaciones de PGF con un intervalo de 14 días, seguido por detección de celo diaria por 5 días. El grupo TETF fue sincronizado con un dispositivo de progesterona intravaginal (CIDR 1,38g) por 5 días, con aplicación de PGF al retiro del dispositivo y nuevamente 24 horas más tarde. La ovulación fue inducida con GnRH 72 horas después del retiro del dispositivo. Embriones producidos in vitro fueron transferidos 7 ± 1 días después del celo/GnRH.

La utilización de un protocolo de TETF incremento la tasa de utilización de receptoras (transferidas/tratadas) sin afectar los porcentajes de preñez por embrión transferido (Tabla 1). Asimismo, el incremento de la tasa de utilización resulto en un incremento en el porcentaje de preñez por animal tratado, aumentando de esta manera la eficiencia.

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Tabla 1. Tasa de utilización y porcentajes de preñez en receptoras de embriones in vitro sincronizadas con prostaglandinas o con dispositivos de progesterona (adaptado de Sala et al. 2015).

Parámetro PGF + DC TETF Valor P

N 166 354

Tasa de utilización (transferidas/ tratadas)

65,6% (109/166) 87,3% (309/354) <0,0001

Preñez por ET D33 41,3% (45/109) 43,4% (134/309) 0,50

Preñez por ET D60 30,3% (33/109) 32,4% (100/309) 0,37

Preñez por Tratada D33 27,1% (45/166) 37,9% (134/354) 0,02

Preñez por Tratada D60 19,9% (33/166) 28,2% (100/354) 0,04

Perdida de Preñez D33-60 26,7% (12/45) 25,4% (34/134) 0,63

Reutilización de dispositivos intravaginales de progesterona en programas de TETF

La utilización de dispositivos intravaginales de progesterona ha tenido un impacto significativo en la habilidad de manipular la función ovárica y en el desarrollo de programas de sincronización tanto para inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) como para la TETF. La utilización eficiente de los mismos podría tener un impacto significativo en los programas de transferencia de embriones producidos in vitro. La reutilización de dispositivos intravaginales de progesterona como estrategia para reducir los costos de sincronización, ha sido evaluada recientemente para su uso en IATF (Sales et al. 2015). La concentración de progesterona circulante fue menor en animales tratados con dispositivos de progesterona reutilizados 1 (8 días) o 2 (16 días) veces comparado con vaquillonas que recibieron un dispositivo nuevo. El tamaño del folículo dominante al retiro del dispositivo fue mayor en vacas que recibieron el dispositivo utilizado 2 veces que en aquellas que recibieron un dispositivo nuevo, e intermedio en vacas que recibieron un dispositivo usado 1 vez. Sin embargo, la tasa de ovulación y el porcentaje de preñez en vacas Nelore fueron similar para los tres grupos.

Teniendo en cuenta los resultados mencionados, en un trabajo realizado por nuestro grupo evaluamos la reutilización de dispositivos intravaginales de progesterona (CIDR 1,38g) en un programa de transferencia de embriones producidos in vitro (Sala et al. 2015). Vaquillonas Holstein fueron sincronizadas con un CIDR por 5 días, aplicación de PGF al retiro del dispositivo y nuevamente 24 h más tarde, y GnRH 72 h después del retiro del CIDR. En el experimento 1, las vaquillonas fueron asignadas en 2 grupos: CIDR nuevo o CIDR 2do uso (usado previamente por 5 días). Los animales con un cuerpo lúteo presente al día 6 fueron transferidos 7 ± 1 días después de la aplicación de GnRH con embriones frescos producidos in vitro. No se encontraron diferencias significativas en la

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tasa de utilización, porcentajes de preñez o perdidas gestacionales entre los grupos (Tabla 2).

Tabla 2. Tamaño del cuerpo lúteo, tasa de utilización y porcentajes de preñez en receptoras de embriones in vitro sincronizadas con dispositivos de progesterona nuevos o de segundo uso (Sala et al. 2015).

Parámetro TETF CIDR Nuevo TETF CIDR 2do uso Valor P

N 178 176

Volumen CL D6 (mm3) 5189,4 ± 163 5849,6 ± 267 0,1

Tasa de utilización (transferidas/ tratadas)

88,2% (157/178) 86,4% (152/176) 0,65

Preñez por ET D33 43,9% (69/157) 42,8% (65/152) 0,87

Preñez por ET D60 33,8% (53/157) 30,9% (47/152) 0,55

Perdida de Preñez D33-60 23,2% (16/69) 27,7% (18/65) 0,39

En el experimento 2, las vaquillonas fueron asignadas en 2 grupos: CIDR nuevo o CIDR 3er uso (usado previamente 2 veces, 5 días/uso). Los animales fueron evaluados de la misma manera que en el experimento 1. El tamaño del cuerpo lúteo 5 días después de la aplicación de GnRH fue mayor en vaquillonas tratadas con CIDR de 3er uso, y hubo una tendencia a una mayor tasa de utilización (Tabla 3). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de preñez o perdidas gestacionales entre los tratamientos.

Tabla 3. Tamaño del cuerpo lúteo, tasa de utilización y porcentajes de preñez en receptoras de embriones in vitro sincronizadas con dispositivos nuevos o de tercer uso (Sala et al. 2015).

Parámetro TETF CIDR Nuevo TETF CIDR 3er

uso Valor P

N 213 209

Volumen CL D5 (mm3) 3872,9 ± 127 4378,2 ± 195 0,04

Tasa de utilización (transferidas/ tratadas)

88,3% (188/213) 93,8% (196/209) 0,05

Preñez por ET D33 41,0% (77/188) 42,3% (83/196) 0,73

Preñez por ET D60 32,4% (61/188) 33,2% (65/196) 0,82

Perdida de Preñez D33-60 20,8% (16/77) 21,7% (18/83) 0,96

Como respuesta a los excelentes resultados obtenidos con dispositivos de 3er uso realizamos el experimento 3. En el experimento 3, las vaquillonas fueron asignadas en 2

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grupos: CIDR nuevo o CIDR 4to uso (usado previamente 3 veces, 5 días/uso). Los animales fueron evaluados de la misma manera que en el experimento 1 y 2. El tamaño del cuerpo lúteo 5 días después de la aplicación de GnRH fue mayor en vaquillonas tratadas con CIDR de 4to uso. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la tasa de utilización, porcentajes de preñez por embrión transferido o perdidas gestacionales entre los días 33 y 60 (Tabla 4).

Tabla 4. Tamaño del cuerpo lúteo, tasa de utilización y porcentajes de preñez en receptoras de embriones in vitro sincronizadas con dispositivos nuevos o de 4to uso.

Parámetro TETF CIDR Nuevo TETF CIDR 4to

uso Valor P

N 338 324

Volumen CL D5 (mm3) 3470,8 ± 102 4460,1 ± 138 <0,001

Tasa de utilización (transferidas/ tratadas)

87,6% (296/338) 88,0% (285/324) 0,88

Preñez por ET D33 39,2% (116/296) 46,7% (133/285) 0,14

Preñez por ET D60 31,4% (93/296) 38,9% (111/285) 0,11

Perdida de Preñez D33-60 19,8% (23/116) 16,5% (22/133) 0,47

Los resultados obtenidos hasta el momento indican que la reutilización de dispositivos intravaginales de progesterona no afecta de manera significativa la eficiencia de utilización de receptoras ni los porcentajes de preñez luego de la transferencia de embriones producidos in vitro. Sin embargo, los niveles de progesterona logrados con el presente esquema de reutilización, así como su efecto en la dinámica folicular no han sido investigados hasta el momento. En un ensayo preliminar realizado recientemente por nuestro grupo se encontró que la reutilización de dispositivos de progesterona conlleva una disminución en los niveles de progesterona circulante (P<0,001), particularmente en los dispositivos de 3er y 4to uso. En consecuencia, el tamaño del folículo preovulatorio aumenta con el incremento en la reutilización de dispositivos. Asimismo, el intervalo entre el retiro del dispositivo de progesterona y la ovulación mostro una reducción de 8 h en los dispositivos de 4to uso comparados con los dispositivos nuevos. Sin embargo, la tasa de ovulación no mostro diferencias significativas. La estrategia de reutilización de dispositivos podría contribuir a la eficiencia de los programas de transferencia de embriones in vitro a través de la reducción del costo de sincronización.

Número y momento de aplicación de prostaglandina durante el protocolo de sincronización en programas de TETF

El protocolo que utiliza GnRH y un dispositivo de progesterona por 7 días (Co-Synch 7 días) es uno de los protocolos más utilizados en vacas y vaquillonas de carne para IATF en EEUU. Sin embargo, en los últimos 10 años el desarrollo del protocolo de 5 días (Co-

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Synch 5 días) con el consecuente incremento en las tazas de preñez con este protocolo ha llevado a su utilización de manera extensiva (Bridges et al. 2008). Como consecuencia de la necesidad de aplicar dos dosis de PGF en los protocolos de 5 días (Nascimento et al. 2014) varias modificaciones han sido propuestas recientemente con el objetivo de reducir el manejo de los animales. Una de las primeras modificaciones propuestas fue la eliminación de la segunda dosis de PGF. Los resultados obtenidos con una o dos aplicaciones de PGF al retiro del dispositivo de progesterona muestran resultados contradictorios. Algunos estudios en vaquillonas lecheras no encontraron diferencias en la regresión del CL o el porcentaje de preñez a la IATF al aplicar 1 vs 2 dosis de PGF al retiro del dispositivo (Rabaglino et al. 2010). De manera similar, resultados de otro estudio en vaquillonas de carne y leche no encontraron diferencias significativas entre 1 o 2 aplicaciones de PGF (Kasimanickam et al. 2014). Sin embargo, otros estudio en vaquillonas de carne (Peterson et al. 2011) y de leche (Say et al. 2016) encontraron una tendencia o una evidente mejora en los porcentajes de preñez a la IATF cuando dos dosis de PGF fueron administradas con un intervalo de por lo menos 6h.

La otra modificación implementada es la eliminación de la primera GnRH (al momento de la inserción del dispositivo). Esta estrategia fue basada en la baja tasa de ovulación (~30%) obtenida normalmente con la administración de GnRH y también como estrategia para eliminar la segunda aplicación de PGF ya que con esta estrategia no se generan cuerpos lúteos nuevos. Los resultados obtenidos con esta estrategia han mostrado cierta controversia. Algunos estudios demostraron tasas de preñez similares en vaquillonas lecheras (Colazo and Ambrose 2011; Kasimanickam et al. 2014) o de carne (Cruppe et al. 2014). Sin embargo, otros estudios han mostrado mejoras significativas en el porcentaje de preñez de vaquillonas de carne (Kasimanickam et al. 2014) y leche (Lima et al. 2013) cuando se administra GnRH al inicio del protocolo. El estudio de Lima y col., mostro también que la inclusión de GnRH al comienzo del protocolo sumado a la aplicación de 2 PGF con un intervalo de 24 h al retiro del dispositivo logro tasas de preñez significativamente mayores que las obtenidas con protocolos sin GnRH al inicio.

A pesar de la gran cantidad de estudios realizados para evaluar la necesidad de dos aplicaciones de PGF en los protocolos Co-Synch de 5 días para IATF, no hay información disponible sobre los efectos de estas modificaciones en el uso de estos protocolos en programas de TETF. Los protocolos de sincronización en los programas TETF contribuyen de manera significativa al costo de un programa de producción y transferencia de embriones in vitro. Los costos asociados al protocolo de sincronización están representados por el costo de las hormonas y el costo asociado con la utilización del personal para administrar dichos tratamientos. La optimización de los protocolos de sincronización con el objetivo de reducir su costo, pero manteniendo altos niveles de fertilidad presentan una oportunidad para incrementar la eficiencia y la rentabilidad. Una de las posibles estrategias para reducir el costo de los programas de sincronización es la disminución en el número de tratamientos y/o dosis de las hormonas a aplicar. Los protocolos de sincronización de receptoras basados en el CO-Synch 5 d + CIDR conllevan como fue discutido anteriormente el uso de dos aplicaciones de PGF con el consecuente incremento en el número de manejos y producto utilizados. Con el objetivo de evaluar la posibilidad de reducir el número y dosis de PGF durante un protocolo de

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sincronización para TETF basado en el CO-Synch 5d + CIDR sin GNRH al inicio se realizaron una serie de ensayos.

El primer ensayo realizado tuvo como objetivo la evaluación de la luteolisis y el desarrollo del folículo dominante después del tratamiento con dos vs una aplicación de PGF y con el uso de media vs dosis completa de PGF. Vaquillonas Holstein (N = 430) fueron sincronizadas con un protocolo CO-Synch 5 d + CIDR modificado: d-8 – inserción CIDR, d-3 – retiro del CIDR y PGF2a, d0 - GnRH (100μg acetato de gonadorelina). En el día -3, al momento del retiro del dispositivo de progesterona, lo animales fueron distribuidos aleatoriamente a un diseño 2x2 factorial como muestra la Figura 1. A fin de evaluar la luteolisis se colectaron muestras de sangre para determinación de progesterona y se realizó la evaluación mediante ultrasonografía en los días -3 y 0. El porcentaje de vaquillonas con cuerpo lúteo al momento del retiro del dispositivo y aplicación de PGF fue del 80% (344/430) y no se encontraron diferencias entre tratamientos. La concentración de progesterona, en vaquillonas con cuerpo lúteo, al momento del retiro del dispositivo (d-3) fue similar entre los tratamientos (P>0,10), sin embargo, se encontró una tendencia (P<0,10) para una mayor concentración de progesterona en el d0 en el grupo tratado con media dosis en una aplicación (Tabla 5). Asimismo, el porcentaje de vaquillonas con progesterona > 0,5 ng/ml en el d0 fue significativamente mayor (P<0,05) en el grupo tratado con una única aplicación de media dosis de PGF. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño del folículo dominante en el d-3 (P>0,10) o d0 (P>0,20). En conclusión, el uso de media dosis de PGF aplicada únicamente en el d-3 resulta en una concentración de progesterona ligeramente mayor al momento de la aplicación de GnRH, sin embargo, el tamaño del folículo dominante no fue influenciado por el tratamiento.

Figura 1. Esquema de tratamiento en vaquillonas receptoras de embriones para la evaluación del uso de una vs dos aplicaciones y media o dosis completa de PGF durante el protocolo de sincronización.

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Tabla 5. Concentración de progesterona durante el final del protocolo de sincronización en vaquillonas receptoras de embriones in vitro tratadas con una o dos aplicaciones y media o dosis completa de PGF y que presentaban un cuerpo lúteo al momento de retirar el dispositivo de progesterona.

Dosis Aplicaciones N P4 d-3 (ng/ml) P4 d0 (ng/ml)

% P4 >0.5 ng/ml d0

Completa (500μg)

2 86 6,05 ± 0,3 0,03 ± 0,01 1,2%a (1/86)

1 82 5,78 ± 0,3 0,06 ± 0,01 1,2%a (1/82)

Media (250μg) 2 88 6,60 ± 0,3 0,07 ± 0,02

1,1%a (1/88)

1 87 6,21 ± 0,4 0,39 ± 0,03 10,3%b

(9/87) a-b Indican diferencias significativas (P<0,05).

Los resultados alentadores obtenidos en el primer ensayo dieron lugar a un segundo ensayo que tuvo como objetivo la evaluación de la fertilidad y el porcentaje de perdidas gestacionales después del tratamiento con dos vs una aplicación de PGF y con el uso de media vs dosis completa de PGF durante el protocolo de sincronización para TETF. Vaquillonas Holstein (N = 3766) fueron sincronizadas con un protocolo CO-Synch 5 d + CIDR modificado: d-8 – inserción CIDR, d-3 – retiro del CIDR y PGF2a, d0 - GnRH (100μg acetato de gonadorelina). En el día -3, al momento del retiro del dispositivo de progesterona, lo animales fueron distribuidos aleatoriamente a un diseño 2x2 factorial de la siguiente manera:

Grupo 1) dos aplicaciones de PGF día -3 y -2 dosis completa (500 μg Cloprostenol/por aplicación; n=938)

Grupo 2) una aplicación de PGF día -3 dosis completa (500 μg Cloprostenol/por aplicación; n=938)

Grupo 3) dos aplicaciones de PGF día -3 y -2 media dosis (250 μg Cloprostenol/por aplicación; n=946)

Grupo 4) una aplicación de PGF día -3 media dosis (250 μg Cloprostenol/por aplicación; n=944)

Todas las vaquillonas fueron evaluadas mediante ultrasonografía 5 días después de la GnRH para evaluar presencia y ubicación del CL. Embriones frescos producidos in vitro

Memorias

170

fueron transferidos en el día 7 ± 1 después de la GnRH, y el diagnóstico de gestación se realizó mediante ultrasonografía en el día 32 y 60.

Figura 2. Porcentaje de vaquillonas que exhibieron comportamiento de celo y taza de utilización (transferidas/tratadas) luego de recibir 1 o 2 aplicaciones de media o dosis completa de PGF (adaptado de (Sala et al. 2016).

No se encontraron diferencias significativas entre tratamientos en la tasa de aprovechamiento o en el porcentaje de vaquillonas que fueron detectadas en celo (P>0,10). Asimismo, no se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de P/ET al día 32 (P>0,3), día 60 (P>0,3) ni en el porcentaje de perdidas gestacionales entre el día 32 y 60 (P>0.5, Tabla 6). La utilización de media dosis de PGF en el día -3 junto al retiro del dispositivo resulta en niveles de utilización y fertilidad similares a los obtenidos con dos aplicaciones de dosis completa en el día -3 y -2. En consecuencia, esta estrategia permite la reducción del costo del protocolo de sincronización en vaquillonas receptoras de embriones producidos in vitro y logrando al mismo tiempo niveles de fertilidad comparables a los obtenidos con tratamientos más costosos.

Memorias

171

Tabla 6. Parámetros de fertilidad y perdidas gestacionales en vaquillonas receptoras de embriones in vitro sincronizadas con 1 o 2 aplicaciones de media o dosis completa de PGF (Cloprostenol sódico) durante el protocolo de sincronización (Sala et al. 2016).

Dosis Aplicaciones P/ET d32 P/ET d60

Perdidas gestacionales

32-60

Completa (500μg) 2 43,2% (362/838) 34,7% (291/838)

19,6%

(71/362)

1 43,2% (351/812) 34,8% (283/812) 19,4%

(68/351)

Media (250μg) 2 44,5% (375/842) 36,6% (308/842)

17,9%

(67/375)

1 45,3% (381/842) 36,0% (303/842) 20,5%

(78/381)

Conclusiones

El crecimiento y difusión de la producción in vitro de embriones bovinos, trae aparejada la necesidad de tener información sobre la utilización de programas de sincronización, y estrategias que permitan aumentar la eficiencia de este tipo de programas. La utilización de programas de sincronización de la ovulación permite programar el inicio de los tratamientos en momentos predeterminados, y a la vez aumentar la eficiencia de utilización de receptoras. Es importante recordar que uno de los costos más importantes en un programa de TE es el mantenimiento de receptoras, particularmente en sistemas intensivos, donde el costo de alimentación es significativo. Como resultado, el uso de estrategias que permiten aumentar la eficiencia de utilización y al mismo tiempo lograr altos niveles de fertilidad puede aumentar la eficiencia global del programa, así como su rentabilidad. Estudios futuros deberán centrarse en estrategias que permitan la reutilización de receptoras vacías como estrategia para aumentar la eficiencia.

La posibilidad de reutilizar dispositivos de progesterona plantea una nueva estrategia para disminuir los costos de la sincronización sin afectar la fertilidad, contribuyendo también a aumentar la eficiencia global del programa de TE. Asimismo, la posibilidad de reducir el número de aplicaciones de PGF, así como la dosis utilizada manteniendo niveles altos de fertilidad plantea un método adicional para mantener un uso eficiente de receptoras a un costo menor. Finalmente, a pesar de que las estrategias presentadas obtuvieron resultados favorables es importante recordar que otros factores (condición corporal, ciclicidad, etc.) pueden afectar o condicionar el efecto de estas estrategias en programas de TETF en receptoras de embriones in vitro.

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Memorias

176

MOMENTO DE INSEMINACIÓN Y EXPRESIÓN DE CELOS EN VACAS DE LECHE

SINCRONIZADAS CON DISPOSITIVOS CON PROGESTERONA Y ESTRADIOL.

Tschopp, J.C.1 y Bó G.A 1,3.

1 Instituto de Reproducción Animal Córdoba, Córdoba, Argentina.

2 Instituto A.P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de

Villa María, Villa del Rosario, Córdoba, Argentina.

ABSTRACT

El objetivo de estos experimentos fue evaluar el efecto de la adición de GnRH al inicio y

al final de un tratamiento con estradiol (E2) y dispositivos con progesterona (P4) y la expresión de

celos sobre la tasa de preñez (TP) de vacas lecheras en lactancia inseminadas a tiempo fijo (IATF).

Para la sincronización de celos se utilizó un tratamiento de 8 días con dispositivo intravaginal con

P4 y EB en el día de la inserción y ECP como inductor de la ovulación. En el Experimento 1 se

evaluó si la adición de GnRH al inicio del protocolo mejoraba la TP y si la división del horario de

inseminación (IA), inseminando a las 48 h solo a las que presentaban celo y la adición de GnRH a

las que no mostraron celo y la IA 12 h después (60 h) mejoraba la TP en comparación con la IATF

de todas las vacas a las 48 h. Se demostró que la adición de GnRH en el Día 0 no mejoró la TP

(44% vs 40%) como sí lo hizo la división del horario de IA con adición de GnRH (53% vs 31%;

P<0,01). El objetivo del Experimento 2 y 3 fue estudiar la dinámica folicular y evaluar si la TP

varía utilizando diferentes horarios de IA (48 h vs 60 h) de acuerdo a la expresión de celos en vacas

tratadas con dispositivos con P4 y ECP como inductor de la ovulación. Se demostró que la división

del horario de IA y la adición de GnRH disminuye la dispersión del intervalo entre la IA y la

ovulación. Se encontró una interacción (P<0,05) entre el horario de IA y la expresión de celos. Las

tasas de preñez fueron mayores en las vacas en celo a las 48 h que fueron IA en ese momento

(47,8%) y las que no estaban en celo a las 48 h y que fueron IA a las 60 h (53,4%) que las que no

estaban en celo a las 48 h y que fueron IA en ese momento (19,4%) y las que estaban en celo a las

48 h y que fueron IA a las 60 h (29,7%). En el Experimento 4 se evaluó la TP en función de la

adición o no de GnRH a las vacas que no presentaban celo a las 48 h. La tasa de preñez general

fue mayor en el grupo tratado con GnRH a las vacas que no mostraron celo (50,6%; 268/530 vs

42,7%; 229/236; P<0,01). Además, cuando se consideraron solo las vacas que no presentaron celo

a las 48 h se encontró una interacción significativa (P<0,05) entre las las que mostraron celo a las

60 h (horario de la segunda IATF) y si recibieron o no GnRH. No hubo diferencia en las tasas de

preñez entre las vacas que presentaron celo a las 60 h, con GnRH (61,1%; 55/90) o sin GnRH

(53,5%; 54/101) y las que no presentaron celo a las 60 h pero que recibieron GnRH 12 h antes

(57%; 90/158; P>0,1), mientras que las vacas que no presentaron celo ni recibieron GnRH tuvieron

una menor tasa de preñez que los otros grupos (30,3%; 46/152; P< 0,001). En conclusión, la

administración de GnRH a las vacas que no dan celo a las 48 h de un protocolo de IATF con EB,

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177

dispositivo con progesterona y ECP aumentó la tasa de preñez, debido probablemente a la

ovulación de las vacas que nunca mostraron celo durante el tratamiento.

Palabras Claves: Vacas en lactancia, IATF, ECP, GnRH, horario de inseminación.

INTRODUCCIÓN

Aunque los sistemas de manejo de los rodeos lecheros comerciales difieren en distintas

partes del mundo, el objetivo reproductivo principal es preñar a las vacas lecheras lo más rápido

posible después del parto (Lucy, 2004). Una de las preguntas es si existe un antagonismo entre alta

producción y fertilidad. Varios autores sostienen que la vaca lactante en sistemas estabulados con

producciones superiores a los 10.000 Kg (Butler, 2003; Lucy, 2001; Thatcher et al., 2006) y en

sistemas pastoriles superiores a los 7.500 Kg (Diskin et al., 2006; Diskin y Morris 2008, Piccardi

et al., 2012) son vacas que poseen algún grado de subfertilidad. Sin embargo, otros autores

sugieren que esta relación no existe, sino que este fenómeno no es más que una relación temporal

que no implica una relación causa efecto (Le Blanc, 2010; Walsh et al., 2011). No obstante, el

aumento de la producción en vacas de leche que ocurrió en las últimas décadas ha sido asociado a

una menor eficiencia reproductiva de las vacas de alta producción (Washburn et al., 2002; Lopez

et al., 2004). Uno de los motivos de esta problemática reproductiva es la dificultad para la

detección de celos debido a la baja expresión de los mismos (Washburn et al., 2002; Wiltbank et

al., 2006). Se atribuye la baja expresión de celos a menores concentraciones circulantes de

estrógeno debido a un mayor metabolismo hepático de hormonas esteroideas como resultado del

mayor consumo de materia seca y mayor irrigación sanguínea a nivel hepatocelular (Sangsritavong

et al., 2002; Wiltbank et al., 2000). A su vez, los métodos tradicionales de detección de celos son

ineficientes cuando son aplicados a grandes rodeos lecheros debido a la alta relación

vacas/operarios, resultando en una disminución de la precisión y eficiencia en la detección de los

celos (Nebel et al., 1987).

Por tal motivo es que se diseñaron diferentes tratamientos hormonales para solucionar el

problema de baja tasa de servicios. Una de las alternativas más útiles para incrementar la cantidad

de vacas inseminadas en un período corto de tiempo es la utilización de protocolos que sincronizan

la ovulación y permiten la inseminación sistemática sin la necesidad de detectar celo, denominados

protocolos de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF). Además, el desarrollo de protocolos a

base de dispositivos con P4 para las vacas en anestro posparto permitió la inseminación de una

población de animales significativamente mayor (Bó et al., 2009, Bryan et al., 2013).

Los tratamientos de IATF que más se usan en Latinoamérica son en base a sales de estradiol

y dispositivos con P4 (Bó et al., 2009; 2013) y consiste en administrar 2 mg de benzoato de estradiol

(EB) por vía intramuscular (i.m.) junto con la inserción del dispositivo, en lo que nosotros

denominamos el Día 0 del tratamiento para sincronizar la emergencia de la onda folicular. En el

Día 7 u 8 se extrae el dispositivo y se aplica PGF2α i.m. para asegurar la luteólisis, junto con la

administración de 400 UI de gonadotrofina coriónica equina (eCG) y 24 h después se administra

Memorias

178

1 mg de EB i.m. para sincronizar la ovulación realizando la IATF entre las 52 y 56 h de la remoción

del dispositivo (Bó et al., 2002b; 2009).

La finalidad de aplicar estrógenos junto con la inserción del dispositivo con P4 en el inicio

del tratamiento es inhibir la FSH provocando la atresia de los folículos pequeños e inhibir la LH

que altera la actividad estrogénica del folículo dominante y producir su consecuente atresia (Bó et

al., 1994; 1995; 2000; Burke et al., 2003). La atresia folicular es seguida de un aumento de FSH

iniciando una nueva onda folicular, impidiendo de esta manera la formación de folículos

persistentes que interfieren negativamente en la fertilidad (Bó et al., 2002a; 2002b). En contraste,

en situaciones de baja P4 y en ausencia de un tratamiento que produzca la atresia folicular, el

folículo preovulatorio y el ovocito están expuestos durante un período prolongado a una alta

frecuencia de pulsos de LH, llevando a la ovulación de un ovocito sobre-estimulado o

prematuramente activado con disminución de la fertilidad pos-inseminación (Wiltbank et al.,

2006). Cuando se utiliza EB, la atresia es seguida por el comienzo de una nueva onda folicular a

los 4 días, asegurando de esta manera la presencia de un folículo nuevo y un ovocito viable en el

momento de retirar el dispositivo, 7 u 8 días después (Bó et al., 2009). Se ha sugerido que la

combinación de E2 y P4 tiene un efecto aditivo sobre la supresión de la secreción de LH, así, cuando

se administran ambos esteroides en forma conjunta se logra un mayor control sobre la secreción

de gonadotrofinas y subsecuentemente una manipulación más precisa de la dinámica folicular (Bó

et al., 1994). La segunda administración de EB es fundamental para sincronizar la ovulación en

promedio a las 66 h de retirado el dispositivo (Cutaia et al., 2001) y obtener buenos índices de

preñez a la IATF. La mayoría de los estudios que han usado estradiol como estímulo ovulatorio

emplearon EB administrado a las 24 h de retirado el dispositivo (Macmillan y Burke, 1996; Bó et

al., 2000).

Se ha demostrado que los estrógenos (E2) administrados en la fase de elevados niveles de

P4 inducen la regresión folicular y la emergencia de una nueva onda folicular sincrónica, mientras

que la administración en la fase de bajos niveles de P4 inducen liberación de LH y la ovulación

(Mapletoft et al., 2003). Los niveles de estrógenos en el proestro en vacas de alta producción son

más bajos que en animales no lactantes (Sartori et al., 2002a) y animales de baja producción (Lopez

et al., 2004), probablemente debido a la alta tasa de metabolismo hepático de los esteroides

(Sangsritavong et al., 2002). Estas menores concentraciones de estradiol pueden estar causando

disminución en la eficiencia de transporte espermático por el tracto uterino (Hawk, 1975), menor

tasa de fertilización de los ovocitos y menor calidad embrionaria (Sartori et al., 2002b).

Además del EB, otro ester de estradiol muy utilizado en la sincronización de celos y

ovulaciones en bovinos es el cipionato de estradiol (ECP). Es importante destacar que la molécula

de estradiol-17β es la única biológicamente activa, y que los esteres de estradiol solamente

producirán efectos biológicos luego de la liberación de la molécula de estradiol-17β por medio de

la enzima estearasa a nivel sanguíneo (Mapletoft et al., 2003).

El ECP es una sal de estradiol con mayor vida media que el EB, que posee una absorción

retardada desde su administración intramuscular con una actividad biológica mucho más sostenida

Memorias

179

que el estradiol-17β y se adapta a un esquema de aplicación de estradiol como inductor de la

ovulación en el momento de retirar el dispositivo con P4, evitando de esta manera tener que volver

a pasar los animales por la manga a las 24 h de retirado el dispositivo. La administración i.m. de

EB produce un pico de estradiol plasmático de gran magnitud y corta duración, mientras que el

ECP produce un pico de menor magnitud, mayor amplitud y más prolongado en el tiempo

(Vynckier et al., 1990).

Souza et al. (2009) describió que el ECP (1 mg i.m.) aplicado al retiro del dispositivo

incrementó el porcentaje de vacas en celo dentro de las 48 h, las cuales ovularon antes y fueron

menos sincronizadas comparadas con vacas sin celo prematuro, existiendo una mayor variabilidad

al momento del pico de LH en vacas tratadas con ECP en relación con las tratadas con GnRH.

Debido a esta dispersión en la ovulación las vacas que presentarían un celo prematuro tendrían una

buena fertilidad cuando se las insemina a las 48 h, mientras que cuando se las insemina a las 54 h

se estaría logrando una buena concepción en aquellas hembras que sufren un atraso en la ovulación.

Debido a la poca información detallada sobre la utilización de ECP en protocolos de IATF en

vacas Holando Argentino es que resulta de interés profundizar el estudio sobre dinámica folicular,

expresión de celos y ovulación, y su relación con la tasa de preñez cuando se lo utiliza como

inductor de ovulación

Otra manera de disminuir el número de encierres fue utilizar GnRH en el momento de

realizar la IATF como inductor de la ovulación, con resultados similares al tratamiento tradicional

en vacas de carne (Bó et al., 2000). En presencia de un folículo dominante de más de 9 mm la

administración de GnRH induce la ovulación entre las 24 a 32 h (Pursley et al., 1998). La

administración de GnRH produce un pico de liberación de LH aproximadamente 2 h después de

su administración i.m., en una magnitud que depende de los niveles de P4 en el momento de su

aplicación. La ovulación del folículo dominante está asociada con la disminución de la

concentración plasmática de estradiol y por lo tanto se ha reportado una menor expresión de celos

en los tratamientos que utilizan GnRH en lugar de estradiol como inductor de la ovulación

(Martinez et al., 2002).

Se diseñaron cuatro experimentos de inseminación a tiempo fijo con estradiol y

dispositivos con progesterona y ECP como inductor de ovulación en vacas Holando Argentino en

lactancia, para evaluar el efecto de la adición de GnRH al inicio y al final de un tratamiento y la

expresión de celos sobre la tasa de preñez.

El objetivo del experimento 1 fue evaluar si la adición de GnRH al tratamiento con EB

aplicado al momento de la inserción de un dispositivo con P4 mejora la tasa de preñez.

El objetivo del experimento 2 fue estudiar la dinámica folicular y el horario inseminación

ovulación utilizando diferentes horarios de inseminación (48 h vs 60 h) de acuerdo a la expresión

de celos.

Memorias

180

El objetivo del experimento 3 fue evaluar si la tasa de preñez varía utilizando diferentes

horarios de inseminación (48 h vs 60 h) de acuerdo a la expresión de celos.

El objetivo del experimento 4 fue evaluar si la administración de GnRH a las vacas sin

síntomas de celo a las 48 h de retirado el dispositivo y que son inseminadas a las 60 h aumenta la

tasa de preñez.

MATERIALES Y METODOS

Se utilizaron vacas lactantes Holando Argentino provenientes de un establecimiento

lechero comercial de aproximadamente 400 vacas en ordeño de la localidad de Marull, ubicado al

sudeste de la Provincia de Córdoba (República Argentina), alimentadas con dietas totales

mezcladas (TMR) y suministradas en calle de comida. Todas las categorías de animales se

encontraban encerradas en piquetes con piso de tierra con dietas a base de silo de maíz, heno de

alfalfa, expeler de soja, semilla de algodón o expeler de girasol, maíz molido y sales minerales,

balanceadas para atender o exceder los requerimientos nutricionales mínimos de cada categoría

(NRC, 2001).

Los diferentes estudios se realizaron desde septiembre 2013 hasta junio del año 2015. En

los experimentos 1, 2 y 3 las vacas recibieron su primer servicio posparto. Se utilizó semen apto

al examen de calidad seminal. Para la asignación de los tratamientos en cada experimento las vacas

fueron primero bloqueadas teniendo en cuenta las estructuras ováricas (presencia de CL o por lo

menos un folículo ≥25 mm, un folículo grande ≥10 y < 25 mm o un folículo chico < 10 mm de

diámetro), condición corporal, producción al control lechero anterior al inicio de la sincronización,

número de lactancia y días de parida; y luego distribuidas al azar en cada grupo de tratamiento.

Para la visualización de las estructuras ováricas, el diagnóstico de gestación y la reconfirmación

de la preñez se realizó ecografía transrectal con un ecógrafo Honda HS-101 V (Honda Electronics,

Japón) equipado con un transductor de 5 MHz en modo B. Para la determinación de la condición

corporal (CC) se utilizó la escala de 1 a 5, donde 1 corresponde a vacas emaciadas y 5 vacas obesas,

con divisiones de 0,25 puntos. (Edmonson et al., 1989).

Para el procesamiento estadístico de los datos de estos experimentos se utilizó el Software

Estadístico Infostat (Di Rienzo et al., 2015). Se ajustó un análisis de varianza (ANOVA) para

evaluar el efecto del tratamiento sobre las variables tamaño del folículo dominante en el momento

de la remoción del DIB y previo a la ovulación, crecimiento diario del folículo dominante y

momento de la ovulación. Luego, se analizaron los residuos del primer ajuste y se observó la

presencia de homogeneidad de varianzas entre los diferentes tratamientos para el momento de

ovulación. Para testear homogeneidad de varianzas entre tratamientos se utilizó el test de Bartlett.

Las comparaciones de media se realizaron con la diferencia media mínima (DMS) de Fisher (alfa

= 0,05) bajo el modelo extendido. Para analizar las curvas de la dinámica folicular bajo los distintos

tratamientos se ajustó un ANOVA para modelos mixtos. Para analizar el intervalo entre la IA y la

ovulación y la tasa de preñez, se realizó un gráfico de dispersión donde la variable independiente

Memorias

181

fue el intervalo entre la IA y la ovulación y la variable dependiente fue la tasa de preñez. Se analizó

mediante modelo lineal generalizado bajo distribución binaria.

Por último, se ajustaron regresiones logísticas múltiples utilizando una aproximación de

modelos mixtos para variables binarias (preñada o vacía) y con enlace logit para evaluar qué

factores y en qué medida afectaron la preñez. Cuando se encontraron diferencias significativas

entre los factores o sus interacciones se utilizó la diferencia media mínima (DMS) de Fisher

(alfa=0,05) bajo el modelo logístico extendido. La tendencia se fijó en P<0,10.

Experimento 1

Para este experimento se utilizaron 200 vacas Holando Argentino en lactancia, con 72,3 ±

29,1 días desde la parición, 2,5 ± 1,3 partos, 33,2 ± 7,1 litros de producción de leche/día, con una

condición corporal de 2,8 ± 0,4 (escala 1-5) y que recibían su primer servicio.

El protocolo de sincronización de los celos utilizado fue en el Día 0: colocación de un

dispositivo intravaginal de silicona inerte impregnados con 1g de progesterona de liberación

controlada (DIB® 1 g de P4; Zoetis) junto con la aplicación intramuscular de 2 mg de un análogo

sintético de estradiol (Benzoato de Estradiol 1mg/ml, Gonadiol®; Syntex SA). En el Día 8 se

retiraron los DIB y se aplicó 500 µg de un análogo sintético de Prostaglandina F2α (Cloprostenol

Sódico 250 μg/ml, Ciclase® DL; Syntex SA), 1 mg de análogo sintético de estradiol de acción

prolongada (Cipionato de Estradiol 0,5 mg/ml, Cipiosyn®; Syntex SA) y 400 UI de Gonadotrofina

Coriónica Equina (eCG 200 UI/ml, Novormon 5000®; Syntex SA). Los animales fueron divididos

en un diseño factorial 2x2 para recibir una dosis de análogo sintético de la Hormona Hipotalámica

Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH; Gonadorelina Acetato 50 μg/ml, Gonasyn GDR®; Syntex

SA) al momento de la colocación del DIB (Día 0; n=100) o permanecer como controles no tratados

(n=100), y para dividir el horario de inseminación inseminando a las 48 h las vacas que presentaban

celo a las 48 h y aplicar una dosis de GnRH (Día 10) a las 48 h de retirado el dispositivo y atrasar

a las 60 h la IA en animales que no manifiestan celo (n=100) o permanecer como controles no

tratados y ser inseminadas todas las vacas a las 48 h independientemente de la manifestación de

celo (n=100).

Para la determinación de presencia o ausencia de celo en los animales se contó con la ayuda

de pinturas (Celotest, Biotay SA, Argentina), considerándose como animal en celo a todo aquel

que a las 48 o 60 h de retirado el dispositivo presentaba más del 40 % de pérdida de color, tomando

como referencia el experimento realizado en vacas Braford por Stharinger et al. (2011).

Experimento 2

El experimento 2 es complementario del experimento 1 y se realizó una parte intensiva con

ultrasonografía frecuente para evaluar la dinámica folicular y el intervalo inseminación ovulación,

examinándose cada 12 h desde el momento del retiro del DIB hasta la ovulación o 120 h del retiro.

Las unidades experimentales constituyeron una muestra de 40 vacas Holando Argentino en

Memorias

182

lactancia, con 92,3 ± 12,1 días desde la parición, 2,8 ± 1,4 partos, 33,3 ± 4,4 litros de producción

de leche/día, con una condición corporal de 2,7 ± 0,3 (escala 1-5) y que recibían su primer servicio.

Para el diseño del experimento se las dividió en cuatro grupos: Grupo IATF 48: recibieron

en el Día 0, 2 mg de EB junto con la aplicación de un DIB. En el Día 8 se removieron los DIB y

se administró PGF2α, 400 UI de eCG y 1 mg de ECP. En el Día 10 se les realizó la IATF a las 48

h de retirado los dispositivos. Grupo IATF 60: ídem al grupo 1 pero se inseminaron todas a las

60 h. Grupo GnRH IATF 60: el tratamiento hormonal es similar al del grupo 2 y se las inseminó

a todas a las 60 h con la diferencia de que se les aplicó GnRH a las vacas que a las 48 h de retirado

el DIB no habían mostrado celo. Grupo GnRH IATF 48 y 60: el tratamiento hormonal es similar

al del grupo 3 con la diferencia de que las vacas que a las 48 h de retirado el dispositivo habían

estado en celo se las inseminó en ese momento y las que no mostraron celo a las 48 h se les aplicó

GnRH en ese momento y se las inseminó a las 60 h.

Experimento 3

El diseño del experimento es igual al anterior pero menos intensivo, para evaluar las tasas

de preñez a la IATF de los diferentes tratamientos. Se utilizaron 400 vacas Holando Argentino con

lactancia, con 77,0 ± 22,0 días desde la parición, 2,3 ± 1,4 partos, 33,8 ± 6,3 litros de producción

de leche/día, con una condición corporal de 2,8 ± 0,2 (escala 1-5) y que recibían su primer servicio.

Experimento 4

Se utilizaron 1066 vacas Holando Argentino en lactancia con 115,5 ± 69,2 días desde la

parición, 2,2 ± 1,2 partos, 31,6 ± 8,0 litros de producción de leche/día y una condición corporal de

2,9 ± 0,2 (escala 1-5). Para la asignación de los tratamientos se las dividió en dos grupos y se les

asignó dos tratamientos al azar. Se utilizó un tratamiento de 8 días con DIB de 1 g. En el Día 0 se

administró 2 mg de EB junto con la aplicación del dispositivo. En el Día 8 se retiraron los

dispositivos y se administró PGF2α, 400 UI de eCG, 1 mg de ECP y pintura en la base de la cola.

A las 48 h de retirado el dispositivo se inseminó a todas las vacas que presentaron celo (pérdida

de más del 40% de la pintura, n=565) y las que no manifestaron celo (n=501) recibieron una dosis

de GnRH a las 48 h (n=248) y o permanecieron como controles no tratadas (n=253) y fueron IATF

a las 60 h.

RESULTADOS

Experimento 1

Del total de animales, el 62,0% (124/200) presentó celo dentro de las 48 h de retirado el

dispositivo, mientras que el 38,0% (76/200) restante no. La aplicación de GnRH en las vacas que

no mostraron celo a las 48 h y atrasar su IATF a las 60 h mejoró el porcentaje de preñez (53% vs

Memorias

183

31%, P<0,01). Por otro lado, la colocación de GnRH a la inserción del dispositivo en el Día 0 no

mejoró significativamente las tasas de preñez (44% vs 40%, P>0.5), ni hubo una interacción entre

la aplicación de GnRH en el Día 0 y el horario de inseminación (P>0,1). Las variables condición

corporal, días de parto, número de parto, producción y número de servicios no fueron

estadísticamente significativas (P>0,05), así como tampoco la interacción entre tratamiento inicial

con GnRH y división del horario de IA y aplicación de GnRH en las vacas que no manifestaron

celo (P>0,1).

Experimento 2

Los resultados sobre expresión de celos, tasa y hora de ovulación y desarrollo folicular

según tipo de tratamiento se resumen en la Tabla 1. Se puede observar que si bien en el Grupo 4

(GnRH IATF 48 y 60) en el cual se utilizó GnRH como apoyo para inducir la ovulación del folículo

preovulatorio disminuyó la expresión de celos (P<0,05), no afectó la hora de celo (P>0,4), tasa de

ovulación (P>0,5) y hora de ovulación (P>0,9). Tampoco existió diferencia entre el diámetro del

folículo ovulatorio (P>0,2) y la tasa de crecimiento folicular (P>0,3).

Tabla 1. Expresión de celo y respuesta ovárica en vacas Holando Argentino en lactancia

inseminadas a tiempo fijo según tratamiento.

Grupo** Tasa de

celo (celo/

sincroniza

das)

Hora de

celo

Tasa de

ovulación

(ovuladas

/sincronizadas)

Hora de

ovulación *

Diámetro del

folículo

ovulatorio

(mm)*

Tasa de

crecimiento

folicular

(mm/día)*

Tasa

Preñéz

IATF 48 90,0% b 61,3 ± 4,2 90,0% (9/10) 78,7 ± 16,1 15,4 ± 2,5 1,5 ± 0,2 40,0%

IATF 60

100,0% b 56,4 ± 4,4 100,0% (10/10) 74,4 ± 18,3 16,2 ± 4,2 1,3 ± 0,3 50,0%

GnRH IATF 60

70,0% ab 51,4 ± 2,2 90,0% (9/10) 74,7 ± 13,2 13,7 ± 1,6 1,4 ± 0,2 50,0%

GnRH IATF 48 y 60

44,0% a 57,0 ± 3,0 100,0% (9/9) 76,0 ± 10,4 15,1 ± 1,9 1,4 ± 0,3 67,0%

P-Valor <0,05 0,404 0,599 0,924 0,267 0,382 0,106

ab denotan diferencias significativas (P<0.05)

*Desde el retiro del dispositivo hasta la ovulación.

** IATF 48: IATF todas a las 48 h; IATF 60: IATF todas a las 60 h; GnRH IATF 60: No despintadas GnRH a las 48 h y todas

IATF a las 60 h; GnRH IATF 48 y 60: Despintadas IATF 48 h, no despintadas GnRH a las 48 h e IATF 60 h.

Si analizamos el tamaño del FPO y momento de ovulación con respecto a la expresión de

los celos podemos ver que las vacas que presentaron celo a las 48 h ovularon antes y con un folículo

de mayor diámetro que las que no presentaron celo a las 48 h (P<0,05, Tabla 2).

Memorias

184

Tabla 2. Momento de ovulación y tamaño de FPO en vacas Holando Argentino según presencia

(despintadas) o ausencia (pintadas) de celo a las 48 h de retirado el dispositivo.

Grupo n Momento de

ovulación (h)*

Tamaño del FPO

(mm)

Celo (Despintadas) 23 61,7 ± 6,4 a 16,3 ± 4,2 a

No Celo (Pintadas) 14 84,5 ± 10,5 b 14,5 ± 1,2 b ab denotan diferencias significativas (P<0.05)

*Desde el retiro del dispositivo hasta la ovulación.

Para observar la dinámica de presentación de celos según tratamientos se unieron los

Grupos IATF 48 y IATF 60 (sin GnRH) y Grupos GnRH IATF 60 con GnRH IATF 48 y 60 (con

GnRH). La tasa de expresión celos fue mayor en las vacas que no recibieron GnRH en

comparación con las vacas que se les adicionó GnRH (P<0,05). En las vacas sin GnRH la expresión

de los celos estuvo comprendida en un rango horario que fue de las 36 h a las 84 h, con una

dispersión mayor (varianza P<0,01) que en las vacas que recibieron GnRH, que mostraron celo

entre las 48 y 60 h.

Si analizamos la dinámica de ovulación para el grupo sin GnRH (grupo IATF 48 + grupo

IATF 60) y con GnRH (grupo GnRH IATF 60 y grupo GnRH IATF 48 y 60) podemos observar

que la tasa de ovulación fue del 95,0% para ambos grupos. Esto demuestra como la administración

de GnRH induce ovulación disminuyendo la expresión de celos. Tampoco hubo diferencia

significativa en la hora media de ovulación. Sin embargo, si observamos la ventana de ovulación

se aprecia una tendencia (P<0,1) a una menor dispersión del momento de ovulación en las vacas

que se les adicionó GnRH en comparación con las que no recibieron GnRH. Ver tabla 3.

Tabla 3. Porcentaje y hora promedio de ovulación en vacas IATF con ECP como inductor de la

ovulación con o sin adición de GnRH.

Tratamiento % de

Ovulación

Media

(h)

Varianza CV Min

(h)

Máx

(h)

Mediana

(h)

Sin GnRH 95,0% a 76a 276,0c 22,30 48 96 84

Con GnRH 95,0% a 75a 124,0d 15,20 60 96 78

a Los porcentajes y media no difieren (P>0.05)

cd Las varianzas tienden a diferir (P<0,1)

En la Tabla 4 se puede ver el intervalo entre las horas de inseminación y la ovulación que

fue mayor para el grupo IATF 48 (P<0,05) que para el resto de los grupos. Se puede observar que

el coeficiente de variación y la varianza fueron menores en el Grupo GnRH IATF 48 y 60 donde

Memorias

185

se dividió el horario de inseminación según expresión del estro y se administró GnRH a las vacas

que a las 48 h de retirado el dispositivo no habían mostrado signos de estro, que en el resto de los

grupos (P<0,05).

Tabla 4. Intervalo en horas entre el momento de inseminación y la hora promedio de ovulación en

vacas Holando Argentina IATF según tratamiento.

Grupo* n Media Mediana Varianza C.V. Min Max

IATF 48 9 30,7±5,3a 36,0 227,6b 52,0% 12 48

IATF 60 10 18,0±6,1b 16,0 333,6b 129,0% -12 36

GnRH IATF

60 9 18,7±4,4b 16,0 152,9

b 89,0% 0 36

GnRH IATF

48 y 60 9 18,7±2,1b 24,0 35,6

a 34,0% 12 24

ab denotan diferencias significativas (P<0.05)

* IATF 48: IATF todas a las 48 h; IATF 60: IATF todas a las 60 h; GnRH IATF 60: No despintadas GnRH a las 48 h y todas

IATF a las 60 h; GnRH IATF 48 y 60: Despintadas IATF 48 h, no despintadas GnRH a las 48 h e IATF 60 h.

En la Figura 1 se puede observar la dispersión de la ovulación con respecto a la

inseminación según tratamientos si se toma como hora 0 al momento de la inseminación. Se puede

ver como en el grupo 4 (GnRH IATF 48 y 60) las ovulaciones se concentraron entre las 12 y 24 h

desde el momento de inseminación a diferencia del resto de los tratamientos donde la dispersión

fue mayor.

Memorias

186

Grupo1: IATF 48 h; Grupo 2: IATF 60 h; Grupo 3: No despintadas GnRH a las 48 h y todas IATF a las 60 h; Grupo 4:

Despintadas IATF 48 h, no despintadas GnRH a las 48 h e IATF 60 h

Figura 1. Dinámica de dispersión de la ovulación con respecto a la inseminación en vacas Holando

Argentino IATF según tratamientos.

En la Figura 2 se observó que el mayor porcentaje de preñez se logró cuando las vacas

ovularon entre las 12 y 24 h desde el momento de la inseminación, donde la máxima probabilidad

de preñez se dio a las 23,7h. Se evidenció que dicho intervalo es estadísticamente diferente a los

restantes. Se ajustó un modelo lineal generalizado cuadrático (regresión logística) para la variable

binaria diagnóstico en función del intervalo IA-OV, resultando una dependencia estadísticamente

significativa entre diagnóstico e intervalo IA-OV (P<0,01).

0

1

2

3

4

5

-12 0 12 24 36 48 60

N

ú

m

e

r

o

A

n

i

m

a

l

e

s

Horas

Intervalo IA - Ovulación

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Memorias

187

Figura 2. Probabilidad de preñez en función del intervalo desde la inseminación a la ovulación

(P<0,01).

Experimento 3

Al analizar la Tasa de Preñez entre grupos se observó que no existió diferencia entre grupos

Grupo IATF 48: 42,9% (42/98), Grupo IATF 60: 39,0% (39/100); Grupo GnRH + IATF 60: 40,2%

(39/97); GnRH + IATF 48 y 60: 46,0% (46/100). Del total de 400 vacas iniciadas en el

experimento, 5 vacas se han perdido debido a que fueron descartadas por venta o muerte antes del

diagnóstico de gestación.

Si bien los diferentes tratamientos no afectaron la tasa de preñez, cuando se analizaron los

datos teniendo en cuenta la expresión de celos y el horario de inseminación (Tabla 5) se observó

una interacción (P<0,01) entre estos factores. Las vacas que no presentaron celo a las 48 h y fueron

inseminadas a las 60 h y las vacas que presentaron celo a las 48 h y fueron inseminadas a las 48 h

se preñaron más que las que mostraron celo a las 48 h y fueron inseminadas a las 60 h y las que

no mostraron celo y fueron inseminadas a las 48 h (P<0,01). Esto demuestra que la división del

horario de inseminación en vacas inseminadas a tiempo fijo utilizando ECP como inductor de la

ovulación mejora el porcentaje de preñez. Se pudo observar que las vacas que mostraron celo al

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

Probabilidad de Preñez

IA/OV (horas)

Probabilidad de Preñez (modelo ajustado)

23,7

Memorias

188

momento de la inseminación después de la aplicación de GnRH tuvieron una mayor tasa de preñez

(59,5%, 29/67) que las que no lo hicieron (43,3%, 53/89 P<0,05).

Tabla 5. Tasa de preñez según presencia o ausencia de celo a las 48 h en relación a la hora de

inseminación.

Celo a 48 h Hora de Inseminación Tasa de Preñez

US 30 Días (n=395)

No 60 53,4% (70/131) a

Si 48 47,8% (56/117) a

Si 60 29,7% (33/111) b

No 48 19,4% (7/36) b

Diferentes superíndices dentro de una misma columna representan diferencias significativas (p< 0,01).

Experimento 4

La tasa de preñez general fue mayor en el grupo tratado con GnRH a las vacas que no

mostraron celo a las 48 h de retirado el dispositivo (50,6%; 268/530 vs 42,7%; 229/236; P<0,01).

Además, cuando se consideraron solo las vacas que no presentaron celo a las 48 h se encontró una

interacción significativa (P<0,05) entre las las que mostraron celo a las 60 h (horario de la segunda

IATF) y si recibieron o no GnRH. No hubo diferencia en las tasas de preñez entre las vacas que

presentaron celo a las 60 h con GnRH (61,1%; 55/90) o sin GnRH (53,5%; 54/101) y las que no

presentaron celo a las 60 h pero que recibieron GnRH 12 h antes (57%; 90/158; P>0,1), mientras

que las vacas que no presentaron celo ni recibieron GnRH tuvieron una menor tasa de preñez que

los otros grupos (30,3%; 46/152; P< 0,001).

DISCUSIÓN

Si bien la inclusión de GnRH al inicio del protocolo no mejoró el porcentaje de preñez, y

tampoco habría mejorado el inicio de la nueva onda folicular, mediante estos experimentos se

confirmó la hipótesis de que la inclusión de una dosis de GnRH al final del tratamiento de

sincronización y la modificación del horario de inseminación aumentan la tasa de preñez en vacas

tratadas con dispositivos con P4 que no hayan manifestado celo al momento de la IATF cuando se

utiliza ECP como inductor de la ovulación.

Memorias

189

En el Experimento 1, la idea de colocar GnRH en el Día 0 fue mejorar la sincronía de una

nueva onda folicular al estimular la liberación de LH y consecuentemente la ovulación de los

folículos de mayor tamaño, con la subsiguiente formación de un CL evitando de esta manera la

existencia de folículos persistentes de menor fertilidad (Pereira et al., 2015). No obstante, se

observó que este tratamiento no mostró diferencias significativas en las tasas de preñez con los

que solo utilizaron EB al inicio del tratamiento, indicando que el posible efecto ovulatorio de la

GnRH sobre los folículos >10 mm de diámetro (Wiltbank et al., 2013) no influenció la respuesta

al tratamiento. Pereira et al. (2015) realizaron un experimento para evaluar el efecto de la

administración de GnRH en el Día 0 en vacas lecheras de alta producción en Brasil y observaron

que el tratamiento con GnRH solo tuvo un aumento marginal en la tasa de preñez especialmente

durante la temporada fría del año y en vacas con ausencia de CL y baja P4 en el inicio del protocolo

(<3 ng/ml), mientras que en las con CL no se encontraron diferencias. Esto estaría indicando que

la ausencia de diferencias significativas en el Experimento 1 de esta tesis, se puede deber

principalmente a que la mayoría de las vacas (68%) tenían un CL en el momento del iniciar el

tratamiento. La razón por la diferencia en el efecto de adicionar GnRH en las vacas sin CL con las

vacas con CL puede ser debido a que la liberación de LH en respuesta a la administración de GnRH

es mayor en vacas con bajos niveles de P4 que las que tienen altos niveles de P4 (Kastelic y

Mapletoft, 1998). Por lo tanto, es lógico pensar que la GnRH va a tener un mayor efecto inductor

de la ovulación del folículo dominante en las vacas con baja P4. De hecho, en el experimento de

Pereira et al. (2015) la administración de GnRH en el Día 0 del tratamiento resultó en un mayor

porcentaje de vacas que formaron un nuevo CL y mayores niveles circulantes de P4 en el Día de

la remoción del dispositivo que en el grupo control que no recibió GnRH. Por lo tanto, el

experimento de Pereira et al. (2015) como el nuestro, muestra solo diferencias marginales en las

vacas con CL, cuestionando la justificación de adicionar GnRH en el Día 0 en forma sistemática

en vacas lecheras cuando la mayoría de ellas está ciclando al inicio del protocolo. Por lo tanto,

debido a su alta eficiencia y simplicidad, el tratamiento que más se sigue utilizando en América

Latina para iniciar una nueva onda folicular sincrónica en protocolos de IATF, es la combinación

de P4 más estradiol, ya que suprime eficientemente la secreción de FSH y LH dando inicio a una

nueva onda entre los 2 y 5 días, con un promedio de 4 días en un 90% de las vacas de carne (Bó et

al., 1994; 1995; 2002) y un 75% de las vacas de leche (Balla et al., 2005) con variaciones según el

nivel de producción. Souza et al. (2007b) demostraron que existe una correlación negativa

significativa entre la producción de leche y la emergencia de la onda folicular, las vacas con

mayores producciones de leche (> 35 kg/día) poseen una emergencia más temprana de la onda

folicular (3,5 ± 0,2 días) que las que poseen una producción menor (< 25 kg/día; 4,6 ± 0,3 días).

En este experimento los tratamientos en los que se dividió el horario de inseminación con

respecto a la expresión de celos tuvieron mayor tasa de preñez (53% vs 31%, P< 0,01) que los que

fueron IATF a las 48h, coincidiendo con los datos reportados por Souza et al., (2009) quien

sostuvo que la división del horario de inseminación mejoraría la tasa de preñez debido a que las

vacas que presentan un celo prematuro presentarían una buena fertilidad cuando se las insemina a

las 48 horas, mientras que cuando se las insemina a las 56 horas se estaría logrando una buena

concepción en aquellas vacas que sufren un atraso en la ovulación.

Memorias

190

El objetivo del Experimento 2 fue estudiar mejor la dinámica folicular en protocolos de

IATF con E2 y dispositivos con P4 utilizando ECP como inductor de la ovulación y en base a estos

hallazgos evaluar cuál era el mejor horario de inseminación y si la división del horario de

inseminación y la adición de una dosis de GnRH a las que no presentaban signos de celo mejoraba

la tasa de preñez en comparación con las que utilizaban un único horario de inseminación. Los

inductores de ovulación que más se utilizan en protocolos de IATF son hormonas que inducen un

pico de LH, tales como los ésteres de estradiol y la GnRH. Con la aplicación de ECP al retiro del

dispositivo la concentración plasmática de estradiol comienza a aumentar a las 12 horas (Vinckier

et al., 1990; Souza et al., 2009; Uslenghi, 2016) y en presencia de un folículo dominante grande

podría inducir un pico de LH anticipado, debido a la sumatoria del estradiol sintético y el estradiol

endógeno producido por el propio folículo, adelantando la ovulación de los folículos de mayor

tamaño (Colazo et al., 2003). De esta manera podrían llegar a ovular en forma temprana (antes de

las 60 h) viéndose afectada la fertilidad de las vacas que ovulan tempranamente. Por otra parte el

pico de LH que produce el ECP es de menor magnitud que el producido cuando se utiliza EB como

inductor de la ovulación (9,4 ± 2,2 vs 20,5 ± 1,9 ng/ml) pero de mayor duración (50,5 ± 3,6 vs

19,6 ± 1,2 h) que explica la mayor dispersión de celos y las ovulaciones (Sales et al., 2012;

Uslenghi et al., 2014). Las vacas tratadas con ECP como inductor de ovulación tienen una ventana

de ovulación más amplia que cuando se utiliza EB, de aproximadamente 48 h (entre 42 y 90 h pos

retiro del dispositivo) según reportó Ayres et al. (2008); por lo cual los animales que entran en celo

a las 48 h y se inseminan más tarde ven dificultada su preñez debido a que al ovular tempranamente

tienen un ovocito envejecido al momento de la inseminación, disminuyendo la tasa de fecundación

o produciendo muertes embrionarias tempranas (Dalton et al., 2001).

En el experimento 2 se pudo observar que si bien los tratamientos en los cuales se utilizó

GnRH como apoyo para inducir la ovulación del folículo pre-ovulatorio disminuyó la expresión

de celos, no afectó la hora de celo, tasa de ovulación y hora de ovulación. En las vacas sin GnRH

la expresión de los celos estuvo comprendida en un rango horario que fue de las 36 a las 84 h, con

una dispersión mayor que en las vacas que recibieron GnRH, que mostraron celo entre las 48 y 60

h. Esto demuestra como la administración de GnRH induce ovulación disminuyendo la expresión

de celos coincidiendo con lo reportado por Martinez et al. (2002) quien reportó que la ovulación

del folículo dominante al administrar GnRH está asociada con la disminución de la concentración

plasmática de estradiol y por lo tanto menor expresión de celos. Tampoco existió diferencia entre

el diámetro del FPO y la tasa de crecimiento folicular. Si analizamos el tamaño del FPO y momento

de ovulación con respecto a la expresión de los celos podemos ver que las vacas que presentaron

celo a las 48 h ovularon antes y con un folículo de mayor diámetro que las que no presentaron celo

a las 48 h, similar a lo reportado por Salfen et al. (1999). Así mismo, hubo una tendencia (P<0,1)

a una menor varianza en la hora de ovulación en las vacas que recibieron GnRH en comparación

con las que no. Cuando se analizó el horario de ovulación con respecto a la inseminación se pudo

observar una menor dispersión desde el momento de la inseminación a la ovulación en el

tratamiento donde se dividió el horario de inseminación y se utilizó GnRH en las vacas que no

presentaron celo a las 48 h con respecto al resto de los tratamientos. Con este tratamiento las

ovulaciones se concentraron entre las 12 y 24 h desde el momento de inseminación, siendo el

mejor intervalo inseminación/ovulación para lograr una adecuada tasa de fertilización según

sostienen Dransfield et al. (1998) y Rodríguez Hernández et al. (1995), a diferencia del resto de

los tratamientos donde la dispersión fue mayor. Dransfield et al. (1998) demostraron que la

Memorias

191

probabilidad de que ocurra una concepción disminuía a medida que la inseminación se aproxima

mucho al momento de la ovulación y cuando la inseminación se realizaba en animales ya ovulados.

En este experimento se pudo determinar que el intervalo inseminación/ovulación donde se logró

la mayor tasa de preñez fue entre las 12 y las 24 h, donde la máxima probabilidad de preñez se dio

a las 23,7 h. Esto demuestra que la división del horario de inseminación y la adición de GnRH en

vacas IATF utilizando ECP como inductor de la ovulación disminuye la dispersión entre la

inseminación y la ovulación resultando en un adecuado control y sincronización de las

ovulaciones. Las vacas que presentan un celo prematuro presentaran una buena fertilidad cuando

se las insemina a las 48 h, mientras que la aplicación de GnRH para evitar retrasos en las

ovulaciones y el atraso del horario de inseminación a las que no presentaron celo a las 48 h

mejoraron el porcentaje de preñez.

El experimento 3 se realizó para evaluar las tasas de preñez a la IATF de los diferentes

tratamientos, donde se observó que no hubo diferencia significativa entre tratamientos,

contrariamente a lo encontrado en el Experimento 1. En el Experimento 1, el grupo que se

inseminó de acuerdo a la expresión de celos tuvo una tasa de preñez significativamente mayor que

el grupo en el cual todas las vacas fueron IATF a las 48 h. Si bien se esperaba una mayor tasa de

preñez en este tratamiento, en este caso no hubo diferencias significativas. Es difícil poder explicar

el motivo de estos resultados diferentes. Una diferencia posible puede ser el semen utilizado en

cada uno de los experimentos. Se ha estimado que la máxima viabilidad espermática en el tracto

genital femenino es de 24 a 30 h (Hiers et al., 2003) por lo cual lograr una mejor sincronía entre la

ovulación y el arribo de los espermatozoides debería mejorar la tasa de fecundación. Sin embargo,

hay grandes variaciones entre toros en cuanto a la persistencia de espermatozoides viables en el

tracto reproductivo femenino (Dalton, 2013). Por lo tanto, es posible que el semen utilizado en

este estudio haya sido de una calidad superior o de mayor fertilidad individual que el utilizado en

el Experimento 1, compensando en parte la deficiencia en la distribución de las ovulaciones,

permaneciendo viable en el tracto genital femenino durante un mayor período de tiempo.

Desafortunadamente, estas diferencias de persistencia en el oviducto no son posibles de determinar

por los test in vitro convencionales de evaluación de la calidad seminal (Dalton, 2013). No

obstante, a pesar que las diferencias entre grupos no fueron significativas los valores favorecieron

numéricamente al grupo en el que se dividió la inseminación de acuerdo a la expresión de celos.

La conclusión más importante del Experimento 3 es que a pesar de no haber diferencias en

la tasa de preñez entre grupos, cuando se analizaron los datos teniendo en cuenta la expresión de

celos y el horario de inseminación se encontró una interacción significativa entre ellas. Se

demostró que las vacas que presentaron celo a las 48 h del retiro del dispositivo se preñaron más

cuando se las inseminó a las 48 h y las que no presentaron celo se preñaron más cuando se las

inseminó a las 60 h, afirmando que la división en el horario de inseminación en protocolos de

IATF que utilizan ECP como inductor de la ovulación sería una medida adecuada para disminuir

la a sincronía inseminación/ovulación.

Además de eso, se observó que las vacas que demostraron celo previo a la IA obtuvieron

mayor tasa de preñez que las que no lo hicieron, tanto en las que presentaron celo a las 48 h (48%

vs 30%) como las que mostraron celo luego de la aplicación de GnRH (60% vs 43%). Según Perry

Memorias

192

et al. (2014) existe una interacción entre el diámetro del folículo preovulatorio, el ambiente

hormonal óptimo (demostrado por la expresión de celos), y el establecimiento y mantenimiento de

la preñez. Las vacas que presentan celo antes de la inseminación tienen más chances de ovular y

lograr una preñez en comparación con las que no lo hacen (Perry et al., 2007). El diámetro folicular

al momento de la IATF y la ocurrencia de estro al final del protocolo de sincronización es uno de

los factores que pueden influenciar las respuestas de los protocolos de sincronización (Sa Filho et

al., 2010; 2011b) porque está relacionado con la producción de E2, el tamaño del CL de la fase

luteal subsiguiente y la producción de P4 (Thatcher et al., 2001; Souza et al., 2009). El crecimiento

folicular final y el diámetro del folículo dominante en el momento de la IATF pueden afectar

significativamente la calidad de los ovocitos, la ovulación, el ambiente uterino, y por consiguiente,

la preñez. En vacas tratadas con EB al inicio del protocolo, los folículos ovulatorios más grandes

en el día de la IATF muestran una mayor expresión de celos, mayor tasa de ovulación y dan lugar

a un mayor número de preñeces por IA (Sá Filho et al., 2010; Tschopp y Bó, 2015). En base a esto,

podríamos concluir que en vacas que presenten celo al momento de la IATF podríamos utilizar

semen de mayor valor genético debido a que tienen mayor probabilidad de preñarse.

En el experimento 4 se evaluó la tasa de preñez en función de la adición o no de GnRH a

las vacas que no presentaban celo a las 48 h y se difería su inseminación a las 60 h. En este caso

se encontró una diferencia estadística en favor del tratamiento que utilizó GnRH, demostrando que

con la adición de GnRH a las vacas que no presentaron celo a las 48 h mejora la tasa de preñez

general a la IATF (50,6% vs 42,7%). Además, el hallazgo más importante de este experimento fue

que no hubo diferencia en las tasas de preñez entre las vacas que presentaron celo a las 60 h con

GnRH (61,1%; 55/90) o sin GnRH (53,5%; 54/101) y las que no presentaron celo a las 60 h pero

que recibieron GnRH 12 h antes (57%; 90/158; P>0,1), mientras que las vacas que no presentaron

celo ni recibieron GnRH tuvieron una menor tasa de preñez que los otros grupos (30,3%; 46/152;

P< 0,001). Trabajos de Ribadu et al. (1999) informaron que el tratamiento de vacas lecheras

repetidoras con GnRH al momento de la inseminación resultó en el aumento de los índices de

preñez, pudiéndose deber simplemente a la estimulación de un pico de LH en el subconjunto de

vacas que presentan celo evidente sin el posterior pico de LH u ovulación. Del mismo modo, la

adición de GnRH a las vacas sin síntomas de celo a las 48 h parecería estar adelantando la

ovulación en las vacas que todavía no han tenido un pico de LH y por lo tanto tendrían una

ovulación muy retrasada. La administración de GnRH produce un pico de liberación de

gonadotrofinas hipofisarias dos horas después de su administración i.m., en una magnitud que

depende del estado en que se encuentra la onda folicular, desencadenando la ovulación en vacas

con un FD > a 9 mm de diámetro (Martinez et al., 1999).

Esto demuestra que la administración de GnRH mejora la tasa de preñez induciendo una

ovulación más sincrónica en las vacas que no presentan celo a las 60 h de retirado el dispositivo,

probablemente debido a que la administración de GnRH induce la ovulación de las vacas que

todavía no habían tenido un pico de LH y por lo tanto tendrían una ovulación muy retrasada y tal

vez la ovulación de vacas con folículos más pequeños (Pereira et al., 2013; Vasconcelos et al.,

2013).

A diferencia de lo ocurrido que en el Experimento 2 donde se pudo observar que las vacas

que presentaron celos se preñaron más que las que no presentaron celo, tanto a las 48 h como a las

Memorias

193

60 h, coincidiendo con Perry et al. (2007) que observó que en general, las vacas que expresan celo

antes de la inseminación tienen más chances de ovular en comparación con las que no lo hacen;

en este experimento las vacas que no presentaron celo pero que recibieron la adición de una dosis

de GnRH como inductor de la ovulación, se preñaron igual que las que expresaron celo a la hora

de la IA. Pereira et al. (2016) reportaron que la expresión de celos al momento de la IATF o TETF

se asoció con un aumento de la fertilidad mejorando la tasa de preñez (sin estro 25,5% vs con estro

38,9%) y disminución de la pérdida de preñez (sin estro 20,1% vs con estro 14,4%).

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199

Memorias

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Animales del futuro, la revolución CRISPR

Alejo Menchaca

Instituto de Reproducción Animal Uruguay, Fundación IRAUy, Montevideo, Uruguay.

Introducción

La generación de animales por edición génica es la revolución actual de la biología. Hoy es posible editar

el genoma mediante la herramienta CRISPR-Cas que permite cortar y pegar secuencias muy precisas de

ADN como nunca antes se había logrado. Así podemos mejorar prácticamente todas aquellas

características que estén determinadas por un gen, y entonces modificar completamente el fenotipo de

cualquier especie. Corderos con mayor producción de carne y lana, animales resistentes a enfermedades

virales, moscas que no producen miasis, garrapatas que casi no se reproducen, mosquitos que no

transmiten dengue, Zika ni malaria, son solo algunas de los avances que se están logrando con esta

tecnología. En pocos años, frente a una demanda mundial de alimentos cada vez mayor, la producción

animal habrá cambiado por completo. Las oportunidades y amenazas, las controversias y los consensos,

la ética y la ciencia, deberán ser revisadas para entrar entonces al nuevo futuro CRISPR.

Contexto mundial para la producción ganadera

La actividad ganadera tiene como principal objetivo abastecer a la humanidad de alimentos. La población

mundial crece sin pausa, pero el incremento demográfico que superará los 9 mil millones de habitantes

para 2050 no será el único responsable de la mayor demanda de alimento. Esto se deberá también al

mayor consumo por habitante de proteínas animales sobre carbohidratos vegetales. Los índices de

pobreza han mejorado en los últimos 200 años, y la gente tiene cada vez más acceso a alimentos de mejor

calidad. El desafío es lograr el equilibrio para alcanzar esta producción, haciéndolo de manera sustentable

en términos de beneficio económico, desarrollo social y cuidado del medio ambiente.

La creciente demanda de alimentos ya ha impactado en el crecimiento de la producción ganadera, y este

será mucho mayor en los próximos años. Tanto el sector primario como el resto de las cadenas

agroindustriales se están transformado a un ritmo sin precedentes. Esto se ha logrado básicamente

mediante el incremento de la inversión en capital financiero y la incorporación de nuevas tecnologías.

Esta expansión tiende a hacer un uso más intensivo del suelo y otros recursos naturales de manera

extrema, pudiendo afectar el equilibrio del medio ambiente a corto, mediano y largo plazo. Al mismo

tiempo, en otro escenario millones de personas en zonas rurales aún siguen criando ganado mediante

sistemas tradicionales de producción, en los que basan su subsistencia y seguridad alimentaria familiar.

Si bien este crecimiento y transformación ofrece grandes oportunidades económicas y permite mejorar

el abastecimiento de alimentos a la población con menor acceso, la rapidez de estos cambios genera

también ciertos riesgos. Por ejemplo es probable que -entre otros desequilibrios- los pequeños ganaderos

queden al margen y entren en la pobreza o en la migración con consecuencias globales, que las naciones

Memorias

201

con menor desarrollo no puedan acceder a las nuevas tecnologías profundizando su dependencia, o que

los recursos naturales y la salud sistémica del planeta sea perjudicada.

Los desafíos hacia el futuro presentan mayor dificultad que en el pasado, principalmente por el dilema

entre producir a niveles como nunca antes, pero en un contexto con recursos naturales finitos como el

suelo y el agua. Multiplicar el abastecimiento de proteínas supondría una carga considerable para unos

recursos naturales que ya están sometidos a una fuerte presión. Por ejemplo, en los últimos 50 años el

consumo de carne per cápita se incrementó aproximadamente 50% y el de productos lácteos

aproximadamente 60% (FAO, 2017). Se estima que para el 2050 el consumo de ambos alimentos se

incrementará otro 60%, y este aumento será mucho mayor en los países que hoy se encuentran en

desarrollo. En los últimos 50 años la producción también creció acompañando a la demanda, pero de

acuerdo con la FAO las estrategias clásicas están explotadas al máximo y el incremento de la producción

puede verse frenado para poder acompañar la mayor demanda de las próximas décadas.

La ganadería es responsable de la mayor parte del uso mundial de suelos y no podrá crecer mucho más.

Los pastizales y tierras de cultivo dedicadas a la producción de alimentos para el ganado representan casi

el 80% de todas las tierras agrícolas. La superficie total de tierra ocupada por pastos equivale al 26% de la

superficie terrestre libre de hielo, y sumado a esto los cultivos forrajeros para animales se siembran en un

tercio de todas las tierras cultivadas (FAO, 2016). Así, la ganadería compite por el recurso suelo con otras

actividades y no se prevé un crecimiento en el área destinada a la producción animal, por el contrario,

deberá competir con la expansión agrícola -limitada a su vez por la necesidad de evitar la deforestación

para mitigar el cambio climático-.

Sumado a este contexto caracterizado más por las limitantes que por las libertades para el crecimiento,

el consumidor con mayor poder de compra también incrementa su nivel de exigencia, y exigirá mayor

cuidado sobre el medio ambiente, mayor control en la inocuidad de los alimentos, trazabilidad desde el

origen y bienestar de los animales. Los costos de producción no solo estarán definidos por el valor de la

tierra, el personal y la alimentación o el manejo de los animales, sino más aun por la necesidad de alcanzar

que sus productos cumplan con todas estas exigencias.

Frente a este futuro, la pregunta es cómo aumentar la producción de alimentos de origen animal sin

aumentar el área destinada a la ganadería, y además contemplando las nuevas exigencias planteadas.

Conocida como “la tormenta perfecta de eventos globales” (Beddington, 2011), este es el mayor desafío

que enfrenta nuestra especie.

Cómo mejorar la producción animal

Es claro que el aumento en la producción no ocurrirá por un aumento del área destinada a la ganadería,

sino solo mediante la mejora de la productividad y de la eficiencia, primero a nivel de cada unidad

productiva pero también a nivel individual de los animales. Esto será posible con la ayuda de importantes

innovaciones tecnológicas y cambios estructurales en el sector. Los abordajes clásicos para mejorar la

productividad basados en la mejora de la alimentación, la salud, la genética, la reproducción y el manejo,

harán un aporte importante pero no suficiente. Este artículo pone énfasis en la contribución que harán

Memorias

202

las nuevas tecnologías, en particular las biotecnologías de la reproducción y la edición del genoma. Las

primeras contribuyen de manera muy valiosa tanto a la eficiencia reproductiva como a la mejora genética

clásica. La segunda es absolutamente disruptiva y permitirá transformaciones nunca antes planteadas.

Los bajos índices reproductivos en especies rumiantes muestran que globalmente tendría mucho más

impacto mejorar la eficiencia reproductiva que cualquier característica de mejora genética que hoy exista.

No obstante, también se debería maximizar el uso de los cruzamientos y la selección de razas puras, que

solo es posible mediante la implementación de las biotecnologías de la reproducción. Tecnologías como

la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), los programas de superovulación y transferencia de

embriones, y la producción de embriones in vitro, pueden contribuir tanto a la mejora de la eficiencia

reproductiva y del manejo, así como a la mejora genética de la población. El uso de semen sexado tanto

para IATF como para la producción de embriones es otra tecnología de alto impacto en la mejora de la

productividad ganadera. Todas estas tecnologías han sido desarrolladas, validadas o mejoradas en los

últimos tiempos, y todas ellas harán una importante contribución en los próximos años. Esto genera

oportunidades para diferentes actores vinculados a dichas tecnologías, tanto en el ámbito científico en

investigación y desarrollo, como para el sector proveedor de insumos, equipamiento y servicios necesarios

para aplicar dichas tecnologías.

El primer nivel de mejora en la productividad ganadera debería entonces estar dado por incrementar el

uso de estas biotecnologías para mejorar la reproducción y la genética de los animales. Por ejemplo en

los países de América Latina y el Caribe, que representa una de las regiones del mundo que produce más

carne y leche, la eficiencia reproductiva está muy lejos de su potencial. Considerando estos países en

conjunto, la tasa de procreo anual (terneros producidos cada 100 vacas) ni siquiera alcanza el 50%, lo que

implica que cada vaca produce un ternero cada dos o tres años, o dicho de otro modo se necesitan más

de dos vacas para producir un ternero por año. Si además consideramos que en estos países las vacas

tienen su primer parto no mucho antes de los cuatro años de vida (cuando podrían hacerlo antes de los

dos años), el resultado es peor aún. Si bien existen diferencias entre los distintos países de esta región,

aún en Uruguay y Argentina que poseen los mejores índices reproductivos, la productividad individual es

baja. Esto conduce a una baja eficiencia por unidad productiva, y globalmente -considerando toda la

región- a muy bajos índices de producción de carne o leche.

La IATF: un negocio creciente.

Actualmente en los países del Mercosur (Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay) se inseminan a tiempo

fijo aproximadamente unos 16 millones de vacas por año (Mapletoft et al., 2018). Este volumen tiene un

impacto en la región muy importante para la mejora de la eficiencia reproductiva, para la mejora genética

de los rodeos, y para el negocio de la cría en general. La adopción de la IATF no ha parado de crecer a

partir de su desarrollo en los años 2000, y seguramente continúe creciendo en las próximas décadas.

Cuando hace 20 años en estos países se inseminaba no mucho más del 3% de todas las vacas (la mayoría

con la tecnología anterior mediante celo detectado), actualmente se insemina aproximadamente el 10%

de las hembras (la mayoría por IATF). El hecho que en menos de 20 años la adopción de la inseminación

haya crecido más de 300%, es un buen ejemplo de la revolución tecnológica en la que hemos ingresado:

se sustituyó una tecnología clásica que tenía más de 50 años por una nueva que la supera en diversos

Memorias

203

aspectos. Y el hecho que aun quede un 90% de las vacas que no se inseminan, indica que el potencial de

crecimiento es enorme y que la expansión de la IATF será mucho mayor. La industria del semen, la

farmacéutica, las empresas de servicios, los proveedores de equipamiento y otros insumos, también

participan y se benefician de esta tecnología.

La industria de los embriones en expansión

La producción de embriones in vitro también ha tenido un impacto importante y se incrementará aún

más. Es una tecnología que si bien se aplica y se conoce casi tanto como la IATF, en una perspectiva de

largo plazo aún se encuentra en su fase inicial. La transformación de la ganadería impulsará un uso mucho

más intensivo de esta herramienta. Así comenzó a ocurrir en Brasil hace unos años y también está

ocurriendo en los otros países de la región. Hoy Brasil es el país que produce la mayor cantidad de

embriones con esta tecnología en el mundo. Cuando en 1999 en este país se transferían

aproximadamente 70 mil embriones bovinos por año, no se transferían más de 100 embriones producidos

in vitro (Viana et al., 2018). Hoy en Brasil se transfieren más de 300 mil embriones por año y casi el 90%

son producidos in vitro (datos de la IETS; Perry et al., 2017). Y aun así, esto representa menos del 0,5% de

la población de vacas en Brasil, mostrando que esta tecnología puede crecer mucho más aún. El modelo

de Brasil se está replicando en otros países vecinos, con ciertos matices pero con una tendencia al

crecimiento. Existen también aquí oportunidades que ya son una realidad y están siendo explotadas por

diversos sectores asociados a esta industria.

El sexado de semen y el cambio de paradigma

El sexado de semen también es una biotecnología de la reproducción que en las próximas décadas se

transformará en una herramienta de uso corriente. Hoy se encuentra en una fase de inserción en el

mercado, siendo aplicado por los más innovadores y sin llegar aun al público más pragmático o

convencional. La mejora de algunos aspectos técnicos que permita porcentajes de preñez similares al

semen convencional, asociado a una mejor relación costo/beneficio, permitirán que esta herramienta

genere un cambio de paradigma. Cada ganadero podrá generar sus hembras de reposición utilizando

semen XX y en el resto de las vacas producir terneros machos para el abasto (incluso con razas terminales),

o mantener sistemas solo machos o solo hembras dependiendo de cada objetivo de producción. Y esto

será lo corriente y no la excepción.

Estas tecnologías asociadas a otras herramientas también novedosas como la selección genómica, o

incluso asociadas a las pruebas genéticas clásicas, permitirán que la mejora en la productividad ocurra de

manera más rápida, eficaz y precisa. Si bien todas estas tecnologías ya existen y se están aplicando, su

expansión en los próximos años será mucho mayor. Asociado a esto, surge también la necesidad de

generar capacidades locales para aplicarlas correctamente, y también para mejorar su desempeño o

incluso desarrollar otras aún mejores. La investigación deberá estar muy presente, no existe innovación

Memorias

204

tecnológica sin ciencia previa. Las oportunidades entonces estarán presentes en varios ámbitos, no solo

para el sector productivo o industrial de alimentos, sino también para quienes desarrollan, proveen y

aplican estas tecnologías.

CRISPR: ¿y si generamos nuevos animales?

¿Cómo sería la producción ganadera con animales resistentes a enfermedades, o con características de

producción que hoy no tienen, o incluso si erradicamos otras especies o plagas que hoy perjudican a la

ganadería? Esto ya es posible: la nueva tecnología que ha revolucionado el campo de la biología es

conocida como CRISPR. Con CRISPR podríamos plantearnos erradicar ciertas enfermedades

transfronterizas que generan pérdidas cuantiosas en pandemias, o que requieren planes de vacunación

permanentes, podríamos generar animales que alcancen altos niveles de producción, o que no requieran

prácticas que afectan al bienestar animal, podríamos plantearnos erradicar otras especies como

garrapatas y moscas que hacen difícil la producción en algunas regiones. Y si lo hacemos ¿de qué modo el

sector productivo tendrá acceso a estas innovaciones? ¿y como otros sectores asociados al agro

aprovecharán las diversas oportunidades o amenazas que surjan para su negocio?

El éxito en la generación de animales editados requiere la confluencia de tres disciplinas complementarias:

la ingeniería genética, la biología molecular y las biotecnologías de la reproducción. CRISPR permite editar

el genoma y obtener de forma rápida y sencilla animales knock out (KO) para uno o varios genes (algo que

no era posible mediante la transgénesis), así como también incorporar una secuencia determinada al

genoma para generar una nueva función (knock in o KI). La edición génica no es transgénesis, no requiere

incorporar ADN exógeno. Se realiza mediante la microinyección de una construcción genética en el cigoto

recién formado, motivo por el cual la producción de embriones in vitro y la micromanipulación son

absolutamente necesarias para aplicar esta tecnología (Menchaca et al., 2016). El sistema CRISPR-Cas

funciona diseñando una secuencia de ARN idéntica (ARN guía) a la secuencia de ADN que se pretende

modificar, de esta manera una vez inyectada en el cigoto esta construcción reconoce de manera muy

precisa mediante las reglas de complementariedad a la misma secuencia en el ADN. A su vez, a este ARN

guía se le asocia una nucleasa (Cas9) que funciona a modo de tijera molecular para cortar el ADN en el

sitio preciso al que fue dirigida por el ARN guía inyectado. Una vez que ocurre el corte, el proceso de

reparación puede ser de dos maneras: a) desapareciendo o sustituyendo algún nucleótido en esta región

de corte, por lo que el gen pierde su función y la proteína codificada no estará presente en el nuevo

individuo (animal KO), o b) insertándo una secuencia preestablecida con una función conocida que

permitirá corregir problemas genéticos o agregar una nueva proteína en el individuo, y para esto hay que

incluir dicha secuencia en la construcción inyectada (animal KI). Por todo esto, el mecanismo descrito es

completamente diferente al de la transgénesis clásica, permitiendo así editar o corregir el genoma de

manera muy precisa, mucho más simple y menos costosa.

Memorias

205

Más carne y mejor lana

El primer avance en nuestro Laboratorio vinculado a la modificación del genoma ocurrió en 2012 con el

nacimiento de los primeros corderos transgénicos reportados en Latinoamérica (Crispo et al., 2015a).

Posteriormente en 2014 logramos el nacimiento los primeros corderos editados con CRISPR. En estos

corderos editamos una secuencia del gen responsable de la producción de miostatina, proteína que está

vinculada al desarrollo y diferenciación muscular. Al anular la función de este gen la miostatina no estaba

presente en los corderos nacidos. Como resultado obtuvimos individuos doble músculo, logrando así la

producción de mucha más carne en ovejas con genética Merino superfino. El desarrollo de los animales

KO luego del nacimiento fue mayor que el de los corderos control (25% más pesados a los 90 días de vida;

P< 0,05) manteniendo las mismas características de lana del Merino superfino que fue la raza que

utilizamos como fondo genético (Crispo et al., 2015b). Es interesante el hecho que esta mutación existe

de manera espontánea en algunas razas ovinas como Texel, así como también en bovinos (como Belgian

Blue o Piemontesa). Es decir que la carne de animales con esta mutación siempre se ha consumido, y

entonces no deberían existir barreras para su uso en producción animal.

Resistentes a enfermedades

La salud animal es parte fundamental de la producción ganadera por varios motivos. El impacto que tienen

algunas enfermedades infecciosas en la producción y en la economía de un país puede ser trágico. Y el

alcance del impacto dependerá del grado del evento sanitario, algunas pandemias pueden incluso afectar

la economía global como está ocurriendo actualmente con la peste porcina africana en China. Otro

aspecto relevante para la salud animal es la importancia cada vez mayor de las exigencias relativas al

bienestar animal. Los conceptos actuales recomendados por la OIE y exigidos por los principales países

consumidores indican que los animales deben vivir libres de enfermedades y sufrimiento. Y desde una

visión más holística, el concepto One Word, One Health impulsado por la OMS, la FAO y la OIE también

está enfocado en mantener los mejores estándares de salud posible en el planeta. Así subrayan la

necesidad imperiosa en la toma de conciencia colectiva del vínculo entre las enfermedades animales y la

salud pública. En un mundo que transita hacia la intensificación en la producción, la salud animal debe ser

una área prioritaria y nuevos abordajes deberían ser contemplados.

CRISPR permite generar animales resistentes a enfermedades. En nuestro laboratorio hemos trabajado

en un modelo ovino para generar animales resistentes a un virus. Pero más claro aún es el modelo

generado en cerdos contra el virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRSV). Este virus

genera una enfermedad que produce pérdidas anuales por más de 600 millones de dólares en EEUU y

más de 1.500 millones de euros en Europa, y se estima que las pérdidas son mayores aun en China y resto

de Asia. No existe tratamiento eficaz y la protección con vacunas es cuestionada, y debido además a la

alta tasa de contagio y expansión, prácticamente termina alcanzando al total de la población en las granjas

afectadas. El PRRSV inicia la infección mediante la unión del virus a un receptor celular en el huésped. Con

CRISPR fue posible generar cerdos en los que se anuló la expresión del gen que codifica el receptor celular

para este virus. El resultado fue el nacimiento de lechones que cuando se los enfrentó a un desafío con el

virus, no expresaron ningún síntoma clínico ni sufrieron infección. Todos sus hermanos no editados que

fueron sometidos al desafío padecieron la enfermedad. Se crearon así cerdos resistentes al PRRSV, y

Memorias

206

detrás de este avance estuvieron varias universidades y la mayor compañía mundial de genética porcina.

El trabajo fue publicado en Nature Biotechnology en 2016 (Whitworth et al., 2016), y en 2018

investigadores del Instituto Roslin en Escocia (Burkard et al., 2018) generaron un modelo similar para la

cepa europea de este virus que posee algunas diferencias con la cepa americana.

Este año 2019 será recordado por el inicio de la mayor crisis mundial de la carne. Fue generada en China

debido a la peste porcina africana. Se estima que esta crisis va a tener consecuencias en el abastecimiento

del mercado global -y particularmente en China- por más de 10 años. China ha sacrificado decenas de

millones de cerdos en pocos meses y se estima que terminará perdiendo una cifra cercana a los 100

millones de cerdos. EEUU, el segundo productor de carne porcina detrás de China, tiene un stock de 70

millones de cerdos, lo que muestra la incapacidad de abastecer la pérdida asiática y el desequilibrio que

se generará. Se estima que China debería incrementar un 50% su importación de carne porcina, o

sustituirlo por otras carnes. El mundo entero está replanteando su producción de carne, tanto porcina

como bovina y ovina. Y el impacto también puede afectar a la agricultura ya que gran parte del maíz y la

soja que se producían en el mundo es para abastecer el stock porcino de China. La expansión de la

pandemia hacia otros países vecinos aún está lejos de ser controlada, y según algunos especialistas es la

mayor peste que ha afectado al planeta en los últimos siglos. Este es un buen ejemplo del desafío

planteado en este artículo: ¿cómo vamos a asegurar hacia el futuro una mayor producción de carne con

este tipo de amenazas presente? Evidentemente se deberían mejorar las estrategias tradicionales que no

han logrado controlar enfermedades como esta.

La fiebre porcina africana es una enfermedad vírica altamente contagiosa que puede matar la totalidad

de los cerdos en las granjas afectadas. El virus es muy resistente y puede sobrevivir por semanas e incluso

meses en la carne de cerdo curada o salada. No existe vacuna ni tratamiento alguno, y el desarrollo de la

enfermedad puede llevar varios años haciendo difícil su identificación y control. La mejor solución es

matar a todos los animales afectados. Hace unos años, el Instituto Roslin en Edimburgo hizo importantes

avances con la edición génica vinculada con este virus. Primero se demostró que el cerdo doméstico es

sensible al virus de la peste porcina africana debido a una variante en un gen específico. Este mismo gen

posee una variante con el cerdo silvestre africano, que confiere resistencia de este jabalí a la infección de

este virus. Los investigadores del Roslin lograron editar la secuencia de este gen en los cerdos domésticos

simulando la variante silvestre, reportando así en 2016 el nacimiento de cerdos editados de esta manera

(Lillico et al., 2016). La fase final está en ejecución y consiste en someter a estos cerdos al desafío de virus

vivo, difícil de realizar en Europa debido al riesgo en bioseguridad. Este es un buen ejemplo del gran poder

de la edición génica aplicada a la salud animal. China además es el país que ha reportado más cantidad de

nacimientos de animales editados por CRISPR. Se conjuga así en un mismo país un escenario interesante:

la necesidad de resolver un problema a cualquier precio, la disponibilidad de una tecnología que puede

contribuir en esto, y el poder económico y los recursos para impulsarlo. Es probable que en los próximos

años haya grandes avances en este sentido.

Otras enfermedades virales que hasta hoy son difíciles de controlar o tienen alto impacto como la leucosis

bovina, fiebre aftosa, vaca loca, entre otras, podrían ser abordadas con esta nueva herramienta. La

difusión luego a través de compañías de genética puede ser un buen canal para llegar al ganadero. El

ejemplo de los cerdos resistentes al virus del PRRSV y el interés mostrado desde la compañía más

importante de genética porcina, es un buen reflejo de cómo se está gestando el futuro.

Memorias

207

Más bienestar animal

Las prácticas en la producción ganadera fueron incorporadas a lo largo de la historia de la domesticación.

Muchas de ellas fueron generadas en contextos completamente diferentes al actual, y fueron transmitidas

por los ganaderos de generación en generación. Los consumidores de hoy exigen un trato con valores

éticos diferentes. En las últimas décadas se ha intentado avanzar hacia un trato más compasivo y de

respeto hacia los animales, que procuran evitar el sufrimiento innecesario. El bienestar animal hoy está

muy presente en todas las cadenas agroalimentarias de origen animal, y cada vez lo estará más aún. Al

proyectarnos hacia una producción ganadera más intensiva ¿cómo podemos generar estrategias que

permitan mejorar las prácticas de bienestar animal? La edición génica también puede contribuir en este

sentido.

La edición de animales Holstein para que nazcan sin cuernos es un buen ejemplo. La presencia de cuernos

es un problema para el manejo de los bovinos, algo que los ganaderos solucionan en pocos segundos y

de manera permanente quemando el botón cornual en los terneros o cortando con una sierra la base del

cuerno contra el cráneo. Millones de terneros son sometidos a esta práctica cada año. Claro que el ternero

sufre, pero quienes promueven las prácticas de bienestar animal recomiendan que los animales no posean

cuernos durante la vida adulta para evitar lesiones y problemas mayores, y entonces se ven obligados a

aceptar el descorne en las primeras semanas de vida del ternero. Todos sabemos que algunas razas no

poseen cuernos, y la ausencia de ellos se debe a un alelo mutante que se expresa de manera dominante.

Identificada la secuencia de ADN responsable de esta característica polled en la raza Angus, un grupo de

la Universidad de Minnesota y de la empresa Recombinetics se planteó inducir esta misma mutación en

embriones Holstein (Carlson et al., 2016). Trabajaron con TALEN, una tecnología previa a CRISPR pero que

también permite la edición génica. Así lograron dos terneras Holstein sin cuernos que publicaron en

Nature Biotechnology en 2016. A este ejemplo pueden seguirlo otros que eviten prácticas asociadas a

crueldad o sufrimiento de los animales. Por ejemplo la castración en los machos es otra práctica inevitable

en la actualidad y permanentemente cuestionada, que también podría ser abordada con CRISPR para

editar animales que no expresen el comportamiento del macho evitando además la producción de semen

fértil.

Actualmente varias compañías de genética bovina, las más importantes del mundo, tienen proyectos de

I+D en edición génica. En un futuro, es probable que el semen que compren los ganaderos provendrá de

toros sobre los que se habrá aplicado edición génica. Esta será una de las formas como CRISPR llegará al

campo.

Sin moscas ni garrapatas

La tecnología CRISPR también puede aplicarse en otras especies que si bien no se utilizan para producir

alimentos, afectan directamente a la ganadería. La salud animal puede verse favorecida si -además de

generar animales resistentes a enfermedades infecciosas- también podemos intervenir en el control de

parásitos. Actualmente se están planteando nuevas ideas con el uso de CRISPR en insectos y artrópodos,

Memorias

208

técnica conocida como gene drive. Estas especies pueden generar pérdidas tanto por el efecto directo

sobre el huésped o como agentes vectores de otras enfermedades. Actualmente estamos conduciendo

un proyecto en Uruguay en conjunto con otras instituciones e investigadores del MIT y de Carolina del

Norte en la que nos proponemos controlar la mosca de la bichera o gusano barrenador del ganado, la

Chocliomyia hominivorax. Las pérdidas económicas generadas por este parásito estimadas para América

del Sur y el Caribe son tremendas. Para un productor agropecuario en cualquiera de estos países, le es

difícil imaginarse la producción de ovejas o vacas sin la mosca de la bichera. Mediante la edición génica

con CRISPR, es posible anular genes vinculados a la reproducción de la mosca, generar infertilidad o

subfertilidad, introducirlos en la población silvestre, y controlar así a esta especie (o suprimirla

completamente). La ventaja de esta estrategia además, es que si la dirigimos por ejemplo a inducir

letalidad en las hembras y que solo los machos sobrevivan, los propios individuos nacidos se encargarán

de difundir esta edición en la población silvestre. De manera muy simplista, podríamos decir que solo

bastaría con liberar unas pocas moscas editadas para extinguir una especie en todo un continente. Hasta

hoy esta mosca es parte de la realidad y nadie se plantea un escenario diferente, este parásito ha estado

presente desde mucho antes de que domesticáramos a los animales. Por eso CRISPR es disruptivo.

El ejemplo de la mosca de la bichera es válido para otros problemas no tan distintos. Existen más insectos

y otros artrópodos afectando la ganadería de los que normalmente tenemos en mente. No solo los

bovinos, ovinos y caprinos se ven afectados, también los equinos, cerdos y mascotas. La lucha contra la

garrapata es una batalla eterna que venimos perdiendo con los métodos convencionales de control, los

métodos químicos y el manejo no logran controlarlo fácilmente y mucho menos erradicarlo. Y la

leishmaniasis en perros o la anemia infecciosa equina, o incluso el virus del dengue, el zika o el parásito

de la malaria también utilizan insectos como vectores. Por ejemplo se afirma que liberación del 1% de

mosquitos editados mediante CRISPR podría erradicar la malaria en todo África en un solo año (Kahn

2019). Esto es eficacia.

El desafío ya no es técnico.

Hace cinco o seis años plantear todo esto en un evento científico no era posible, no había lugar para estas

ideas porque no existía tecnología capaz de lograrlo. Quizás tampoco se le ocurría ni siquiera a un

productor de Hollywood. De la noche a la mañana, la realidad ha superado a la ficción, hoy con CRISPR el

límite está en nuestra propia imaginación.

Entonces, cual es la limitante actual para esta tecnología. Para que CRISPR genere los beneficios

planteados, hay barreras que superan aspectos técnicos. En ocasiones es más clara la capacidad del ser

humano para desarrollar soluciones tecnológicas muy complejas, que la capacidad para ponerse de

acuerdo y utilizarlas. Con CRISPR podemos abordar infinidad de soluciones, pero la opinión pública y la

sociedad civil, las agencias regulatorias y el poder político, deben ponerse de acuerdo sobre cómo utilizar

esta tecnología. Al final de cuentas, la ciencia responde a la política. Las tecnologías son herramientas que

la gente define como usarlas, y de nada sirven los grandes avances si no se está dispuesto a incorporarlos.

Dicho esto, el futuro con CRISPR también es promisorio. Más temprano que tarde esta tecnología va a ser

aplicada como parte de la globalización que todos vivimos. El hecho que la regulación sea particular para

cada país, hace que las restricciones de unos se transforman en oportunidades para los otros. Por ejemplo

Memorias

209

el resultado de las restricciones europeas son oportunidades para EEUU y China, quien restrinja se

trasformará en un pasivo espectador y verá pasar una revolución como pocas. En el futuro, quien hoy

restringe lo veremos pagando por esta tecnología, y quien hoy promueve será quien fije las condiciones

para usarla. Aun podemos decidir de qué lado nos va a encontrar este futuro.

Conclusión.

Frente a una inminente mayor demanda de alimentos de origen animal, aún existe cierto espacio para

mejorar los índices reproductivos y la genética de la ganadería. En ambos casos, tanto para incrementar

la eficiencia reproductiva como para acelerar el progreso genético, se incrementará el uso de las

biotecnologías de la reproducción como la IATF, la producción de embriones y el sexado de semen. Por su

parte, la nueva revolución CRISPR nos permitirá generar nuevos tipos de animales, y lograremos producir

más en el mismo espacio, generando alimentos con la inocuidad necesaria, asegurando la salud y

respetando el bienestar animal, cuidando el medio ambiente y el planeta. La intensificación sustentable

es posible, pero solo haciendo uso de la ciencia, la innovación y las nuevas tecnologías.

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