memoria justificativa del proyecto ura11/03
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MEMORIA JUSTIFICATIVA DEL PROYECTO URA11/03:
CARACTERIZACIÓN DEL CICLO REPRODUCTOR DEL MUBLE (CHELON
LABROSUS) COMO ESPECIE CENTINELA PARA LA CONTAMINACIÓN EN
LA COSTA VASCA Y ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE DISRUPCIÓN
ENDOCRINA MEDIANTE HERRAMIENTAS RÁPIDAS Y SENCILLAS DE
APLICAR.
Investigadores: Maren Ortiz-Zarragoitia (IP), Miren P. Cajaraville, Maria Carmen
Barbero, Teresa Serrano, Urtzi Izagirre, Eunate Puy-Azurmendi y Cristina Bizarro
(Grupo de Investigación consolidado de Biología Celular en Toxicología Ambiental),
Departamento de Zoología y Biología Celular Animal, Facultad de Ciencia y
Tecnología, UPV/EHU.
En Leioa a 26 de Enero de 2012.
Contacto:
Dr. Maren Ortiz-Zarragoitia
Departamento de Zoología y Biología Celular
Facultad de Ciencia y Tecnología
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
Bº Sarriena, s/n, 48940 Leioa
Telf: 946013548, Fax: 946013500
e-mail: [email protected]
http://www.ehu.es/GrupoBCTA
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Caracterización del ciclo reproductor del muble (Chelon labrosus) como especie
centinela para la contaminación en la costa vasca y estudio de los efectos de
disrupción endocrina mediante herramientas rápidas y sencillas de aplicar.
RESUMEN: Entre los efectos sobre la reproducción que podemos encontrar en los
ecosistemas acuáticos, están los causados por compuestos contaminantes de origen
antropogénico. Estos compuestos, conocidos como disruptores endocrinos, alteran la
homeostasis hormonal de los organismos afectados causando finalmente problemas
sobre la capacidad de reproducción. En la costa vasca se han descrito efectos de
disrupción endocrina en organismos acuáticos como los mubles y los mejillones.
Poblaciones de mubles de Gernika, Plentzia, Arriluze y Pasaia han mostrado presencia
de organismos intersex (feminización de machos), así como respuestas en
biomarcadores moleculares y celulares asociados a la reproducción. Es por esto que el
muble siendo una especie ampliamente distribuida en la costa vasca, podría ser una
especie centinela de presencia de disruptores endocrinos en futuros programas de
biomonitoreo. El presente proyecto ha caracterizado el ciclo reproductor del muble en la
costa vasca, con el objetivo final de sentar las bases para su uso como organismo
centinela. Se ha estudiado la población de mubles de Pasaia, debido a su continua
presencia en este sitio y facilidades en las capturas. El muble muestra un periodo de
gametogénesis entre los meses de final del verano y otoño. Consigue la madurez
gametogénica al final del otoño, para proceder con la puesta y la reproducción en los
meses de invierno. Durante este periodo de desove, los mubles más maduros abandonan
las zonas de estuario para desplazarse a zonas mas abiertas. Posteriormente vuelven a
las zonas de estuario para iniciar un nuevo ciclo. Además, durante en presente trabajo
hemos desarrollado herramientas rápidas, sencillas y sensibles para el estudio de la
disrupción endocrina en mubles. En concreto hemos aislado las proteínas vitelogenina y
coriogenina, que han sido propuestas como marcadores de efectos estrogénicos en
peces. Hemos conseguido desarrollar anticuerpos para estas proteínas e incluirlos en
sistemas ELISA. Las cuantificaciones realizadas en plasma de los mubles de Pasaia han
demostrado la presencia de vitelogenina en machos, confirmando la exposición de estos
mubles a compuestos xenoestrogénicos. Además, el estudio histológico de la gónada ha
demostrado la presencia de mubles intersex (machos con gametos femeninos en los
testículos). También hemos desarrollado una novedosa técnica para el sexado de los
mubles (y en general aplicable a otras especies de peces) que sirve a su vez como
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herramienta para la detección de organismos intersex. Esta herramienta está basada en
la cuantificación de la molécula de 5S rRNA en tejido gonadal. Debido al interés
suscitado por esta técnica hemos procedido a su patente en España. Por último
mencionar que las herramientas desarrolladas en el presente estudio se han demostrado
como muy sensibles y eficaces para el estudio de la disrupción endocrina en
poblaciones de estuario y de costa y para la detección de compuestos disruptores
endocrinos en las masas de agua, con niveles suficientes para causar efectos sobre los
organismos que las habitan. Se sugiere finalmente la aplicación de un programa de
biomonitoreo utilizando mubles como especie centinela, para el estudio de la disrupción
endocrina en la costa y estuarios vascos.
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INDICE
FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA
SOLICITUD ………………...........................................................................................5
TAREAS DESARROLLADAS …………………………………………………….....7
RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS …………………………..................13
CONCLUSIONES...…………………………………………………………………..21
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO…………………………………………………………………………...22
PLAN DE FORMACION, DIFUSIÓN Y TRANSFERENCIA……………………23
ANEXO IMÁGENES…………………………………………………………………25
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FINALIDAD DEL PROYECTO Y OBJETIVOS PLANTEADOS EN LA
SOLICITUD
En un contexto en que miles de compuestos químicos son liberados al medio ambiente,
se hace evidente la necesidad de evaluar los efectos de estos aportes agudos y/o
crónicos de contaminantes a los ecosistemas y, cuando sea posible, evitar su potencial
efecto nocivo. Del mismo modo, y debido a una historia reciente de aportes químicos al
medio acuático se ha convertido en imperioso el establecer mecanismos que nos
permitan conocer el estado de nuestras masas de agua, y de implementar medidas
correctoras en los casos en que la calidad de las aguas pudieran estar deterioradas. Así,
en los últimos años ha surgido un cuerpo regulador y normativo a nivel europeo que
centra su interés sobre el análisis de la salud del medio. En lo que respecta al medio
acuático, el marco normativo europeo esta regido por la Directiva Marco del Agua
(DMA) -aprobada por la Comunidad Europea en el 2000 (2000/60/EC)-, y por la
reciente Directiva Marco Europea sobre Estrategia Marina (EM) (2008/56/CE). Esta
última directiva, en concreto, trata de garantizar que todas las aguas marinas (con toda
su diversidad ecológica) permanezcan dinámicas, limpias, sanas y productivas,
extendiendo las implicaciones de la DMA (ríos, lagos, aguas subterráneas, aguas de
transición y aguas costeras) a todas las masas de agua en Europa. Ambas directivas
pretenden obtener un buen estado de calidad de las aguas europeas, para el año 2015 en
el caso de la DMA y para el año 2020 en el caso de la EM. Para ello es necesario
implementar redes de seguimiento de la calidad del medio, y estrategias/metodologías
que permitan una correcta evaluación de su estado. En ese contexto, los biomarcadores
constituyen una herramienta muy útil para evaluar e identificar las causas de los
impactos sufridos por los organismos en los ecosistemas. Los biomarcadores son
medidas a nivel celular, bioquímico y/o molecular que indican si un organismo ha
estado expuesto a contaminantes y la respuesta del organismo al contaminante.
Es sabido que ciertos contaminantes ambientales pueden alterar el sistema reproductor y
endocrino de las especies acuáticas y producir una disminución dramática de la
población afectada poniendo en riesgo su viabilidad. Este fenómeno definido como
disrupción endocrina por la Organización Mundial de la Salud consta de cualquier
alteración en el sistema endocrino que afecta, entre otros, la reproducción y el desarrollo
de los organismos y en caso extremo producir una disminución dramática de la
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población afectada. Nuestro grupo de investigación había descrito con anterioridad la
presencia de efectos de disrupción endocrina en peces Chelon labrosus (mubles) que
habitan la Reserva de la Biosfera de Urdaibai, y los estuarios del Butrón, Oiartzun y
Nervión. Estos peces mostraban gónadas intersex (feminización del tejido gonadal con
presencia de gametos femeninos dentro del tejido testicular) y niveles elevados de
vitelogenina en plasma, además de metabolitos de compuestos disruptores endocrinos
en acumulados en la bilis. El principal objetivo del presente proyecto estaba enfocado a
caracterizar el ciclo reproductor del muble en una población de la costa vasca y evaluar
la variabilidad de distintos biomarcadores de disrupción endocrina a lo largo del ciclo
reproductor, con el fin de seleccionar las épocas de muestreo en un futuro programa de
biomonitoreo.
Los objetivos específicos que se plantearon en la solicitud fueron lo siguientes:
1- Caracterizar el ciclo gametogénico y reproductor en mubles Chelon labrosus que
habitan los estuarios y la costa vasca y cuantificar la prevalencia de organismos
intersex, indicadores de la presencia de compuestos disruptores endocrinos.
2- Cuantificar mediante sistema ELISA los niveles de vitelogenina y coriogenina en
plasma de los mubles como biomarcadores de exposición a compuestos
xenoestrogénicos.
3- Analizar los niveles de variación de genes asociados a la reproducción (vitelogenina,
receptor de estrógenos, receptor-X-retinóico y aromatasas cyp19a1 y cyp19a2) en
muestras de cerebro, hígado y gónada a lo largo del ciclo reproductor del muble, para su
caracterización y posterior aplicación en programas de biomonitoreo.
4- Transferir los resultados a la Administración y sentar las bases para el
establecimiento de un programa de seguimiento de los efectos de disrupción endocrina.
Estandarizar en la medida de lo posible los protocolos para la medición de los
biomarcadores aplicados. También, plantear posibles estrategias de actuación como
medidas correctoras o de remediación.
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TAREAS DESARROLLADAS
Recogida de muestras.
Durante el periodo de Septiembre 2010 hasta Septiembre 2011 se han recogido
muestras mensualmente en el amarradero de Pasaia, junto a las instalaciones de AZTI-
Tecnalia. Se ha contado con la colaboración del Dr. Javier Franco, perteneciente a la
citada institución, que en todo momento ha facilitado la captura y primer procesamiento
de las muestras. Cada mes se capturaron, mediante pesca con caña, entre 12 y 30
mubles (Chelon labrosus) para su procesamiento inmediato. Mencionar también, que
entre Septiembre 2011 y Diciembre 2011 se ha seguido con la captura de mubles. Estas
muestras están destinadas a confirmar los resultados obtenidos en la primera campaña,
centrándose el estudio solo en el aparato reproductor de los peces. Además, entre los
meses de Noviembre y Diciembre de 2011 se ha evaluado la posibilidad de rcoger
puntos en otros estuarios y puertos donde residen mubles. Este trabajo muy preliminar
ha incluido las zonas de Ondarroa (tenemos muestras anteriores que indican la
existencia de peces intersex), Lekeitio, Mutriku, Bakio, Plentzia (población estudiada en
el proyecto URA10/02), Armintza, Zierbana y Bermeo. Estas zonas debido a sus
actividades podrían ser puntos de interés para estudiar efectos de disrupción endocrina
en los mubles residentes.
Tras la captura de los mubles, éstos se procesaron in situ. En todo momento y a lo largo
de todo el estudio, los procedimientos seguidos se ajustaron a las normativas estatales y
europeas en vigor (Ley 32/2007 del 7 de Noviembre; Directiva 2010/63/UE) con el fin
de reducir el daño causado a los organismos capturados. Además, han contado con la
evaluación favorable del Comité de Ética para el Bienestar Animal (CEBA) de la
UPV/EHU.
Los mubles capturados fueron anestesiados sumergiéndolos en una solución saturada de
benzocaína, tras lo cual se registró su talla y peso. El tamaño del pez se midió desde su
parte frontal hasta la parte final sin incluir la aleta caudal. Inmediatamente después se
procedió a la extracción de sangre. Para ello se utilizaron jeringuillas heparinizadas,
extrayendo la sangre (unos 1,5 mL por pez) de la vena caudal. La sangre se transfirió a
microtubos eppendorf de 2 mL y se centrifugó a 1000 rpm durante 5-7 min para obtener
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el plasma. Tras recoger el plasma del sobrenadante del tubo, se transfirió a un criotubo
de 2 mL que contenía una gota de aprotinina (para la inhibición de la degradación de
proteínas) y se congeló en nitrógeno líquido. El plasma se transportó hasta el laboratorio
congelado en nitrógeno líquido, donde finalmente fue almacenado a -80ºC hasta su
análisis.
Para proceder a la disección de los peces, se sacrificaron previamente mediante
decapitación. Se extrajeron muestras de cerebro, gónada e hígado. La gónada y el
hígado se extrajeron enteros y se pesaron por separado. El cerebro se introdujo en un
vial estéril (2 mL) que contenía RNAlater (Invitrogen) para conservar el RNA presente
en el tejido, y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. En el laboratorio, estas
muestras fueron almacenadas en congeladores a -80ºC hasta su análisis. Con una
porción de las muestras de hígado y gónada, se procedió del mismo modo que con las
muestras de cerebro y se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su transporte al
laboratorio. Otra porción de la gónada y el hígado se recogió en cassetes de histología y
se sumergieron en fijador 10% de formalina tamponada con 2.5% de glutaraldehído. Se
mantuvieron a 4ºC durante 24 horas hasta su posterior procesamiento. El resto de la
gónada y del hígado se etiquetó debidamente envueltos en papel de aluminio y se
congelaron en nitrógeno líquido. Estas muestras se almacenaron a -40ºC a su llegada al
laboratorio y forman parte del Banco de Bioespecimenes Ambientales de la Bahía de
Bizkaia (BBABB) de la UPV/EHU, que servirán para futuros estudios.
Por último, se recogieron muestras de bilis de cada individuo utilizando una jeringuilla
estéril de 1 mL. La bilis se extrajo directamente del saco biliar adyacente al hígado. La
muestra de bilis se transfirió a viales de plástico inerte de 2 mL (Corning) y se congeló
rápidamente en nitrógeno líquido. También se recogieron otolitos de la parte frontal de
los peces. Tras su extracción y limpiado se almacenaron en viales de 2 mL en etanol
absoluto a 4ºC. Tanto las muestras de bilis como los otolitos de los peces se encuentran
almacenados en el BBABB de la UPV/EHU, para futuros análisis.
Además de los muestreos mencionados, se procedió a la captura de mubles con el fin de
hacer experimentos de exposición a estrógenos en el laboratorio. Estos experimentos se
realizaron para la obtención de patrones de vitelogenina y coriogenina. Estos trabajos
más específicos se describen con más detalle en la Tarea 3.
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Tarea 1: Estudio histológico de la gónada y el hígado de los mubles.
Tras 24 horas en fijador a 4ºC las muestras de gónada e hígado que se utilizaron para el
análisis histológico, se transfirieron a alcohol de 70º y se deshidrataron químicamente
en un proceso de alcoholes seriados con ayuda del procesador de tejidos automático
Leica ASP300. Posteriormente se incluyeron en resina de metacrilato (Tecnovit 7100).
Se realizaron secciones de 5 µm de grosor y se tiñeron con un protocolo convencional
de hematoxilina/eosina. Finalmente el estudio histológico se realizó en un microscopio
Olympus BX60 acoplado a un sistema de ordenador de captura de imágenes. Se prestó
especial atención a las fases gametogénicas, procesos de intersexualidad y agregados de
melanomacrófagos (células de respuesta inmune en peces).
Tarea 2: Estudio de las proteínas vitelogenina y coriogenina en el plasma de los mubles
El plasma extraído in situ a los peces se almacenó a -80ºC hasta su procesamiento, con
el fin de cuantificar los niveles de vitelogenina y coriogenina mediante ELISA (enzyme
linked immunosorbent assay) específico para muble. Este ensayo se ha realizado en
colaboración con el grupo del profesor Ángel Maquieira del Departamento de Química
de la Universidad Politécnica de Valencia (UPV). Con este fin, la alumna predoctoral
Cristina Bizarro, realizó una estancia de 1 mes en el laboratorio del grupo de Valencia.
En este periodo cuantificó las muestras de plasma para vitelogenina y comenzó el
desarrollo del sistema para la proteína coriogenina. En este momento (enero 2012), la
investigadora C. Bizarro se encuentra nuevamente en Valencia para terminar con los
análisis de coriogenina.
La purificación de la vitelogenina se realizó durante el estudio de 2010 y en este pasado
año 2011, hemos conseguido purificar la proteína coriogenina. Ambas proteínas son
parte de las proteínas de reserva de los huevos y exclusivamente sintetizadas por
hembras, bajo control hormonal por estrógenos. La exposición a estrógenos induce la
síntesis de estas proteínas en machos e individuos inmaduros, lo que las convierte en
biomarcadores sensibles de efectos xenoestrogénicos. Para proceder con el proceso de
purificación de coriogenina, se realizó un experimento en el laboratorio con mubles
adultos. Se capturaron mubles adultos (> 22 cm) en el puerto de Plentzia y se
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transportaron vivos en un acuario de 1000 L a las instalaciones acuariológicas marinas
del Servicio de Experimentación de Biología Acuática, de la Facultad de Ciencia y
Tecnología, UPV/EHU. Tras un periodo de aclimatación de 3-4 semanas, 8 mubles
machos fueron inyectados al primer y tercer día de experimentación con una dosis de 5
mg estradiol/Kg peso pez. Después de 5 y 7 días se recogieron muestras de sangre (5
mL por pez) y se obtuvo el plasma como se ha descrito en el apartado de Recogida de
muestras. El plasma se mantuvo congelado para su envío al grupo de Valencia. La
coriogenina se purificó del plasma mediante cromatografía de exclusión molecular
(columna de 2.5 X 50 cm con Sephacryl S300HR), seguida de una cromatografía de
intercambio iónico (columna de 1.5 X 25 cm con DEAESSepharosa CL6B) y se
confirmó su presencia por electroforesis SDS-PAGE. El gel se reveló con Azul Brillante
Coomassie. La coriogenina purificada se inyectó en conejos de raza Neozelandés x
California obteniéndose así los anticuerpos específicos anti-coriogenina. Parte de estos
anticuerpos fueron marcados con biotina. Al igual que para la coriogenina, también se
realizó un experimento con mubles similar para obtener vitelogenina de muble. Otro
grupo de 8 mubles fue inyectado con 10 mg estradiol/Kg peso pez semanalmente
durante 1 mes. Tras el periodo de inyección se recogió sangre de los peces y se obtuvo
el plasma, que se procesó al igual que las muestras para la purificación de coriogenina.
En este caso el objeto del experimento fue la síntesis de vitelogenina pura para usarla
como patrón en los ensayos vitelogenina-ELISA específicos.
El análisis de las muestras de plasma provenientes de los mubles capturados
mensualmente en Pasaia se realizó de la siguiente forma. Se incubó en placas de
poliestireno de 96 pocillos, el plasma de los mubles con los anticuerpos específicos para
la vitelogenina o coriogenina del muble. Tras la incubación, para la visualización de las
proteínas de interés en la muestra, se agregó un anticuerpo secundario con actividad
enzimática, que tras incubarse consigue colorear el pocillo. Finalmente se hace una
lectura de absorbancia con un lector de microplacas. En las mismas microplacas junto
con las muestras de plasma, también se midió unos pocillos en los que se ha incluido
vitelogenina o coriogenina purificada de muble a diferentes concentraciones,
consiguiéndose una recta patrón. Esta recta patrón de concentraciones conocidas de
vitelogenina o coriogneina se utilizó como referencia para cuantificar los niveles de
vitelogenina o coriogenina en cada muestra de plasma analizada.
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El sistema ELISA para vitelogenina ha sido aplicado exitosamente en las muestras del
presente proyecto, además de finalizar con la cuantificación de los niveles de
vitelogenina en plasma de los mubles analizados en el proyecto anterior URA10/02. En
el caso de la coriogenina, al ser una proteína bastante compleja, hemos tenido
problemas en la purificación, que han retrasado en desarrollo del ELISA específico. De
todas formas estos problemas han sido superados y en este momento estamos
terminando de analizar las muestras, para completar el estudio.
Tarea 3: Cuantificación de los niveles de genes asociados a la reproducción durante el
ciclo anual del muble
Con las muestras para el estudio de los niveles de expresión de genes asociados a la
reproducción (aromatasas cyp19a1 y cyp19a2, vitelogenina y receptores nucleares
hormonales er y rxr), se procedió de la siguiente manera tanto para el cerebro, la gónada
y el hígado. Las muestras fueron descongeladas, se retiró el exceso de RNAlater con un
papel secante y se introdujo cada muestra en un vial de 2 mL que contenía 1 mL de
Trizol (Invitrogen) y microbolas de teflón. Se homogenizaron las muestras en un
disruptor de tejidos (Hybaid). Posteriormente se recogió el homogenizado y se transfirió
a un microtubo eppendorf estéril de 2 mL. Se añadieron 200 µL de cloroformo y se
centrifugaron las muestras a 12000 rpm a 4ºC en una centrífuga eppendorf para la
separación de proteínas, DNA y RNA. Tras este primer centrifugado se recogió el
sobrenadante que contenía el RNA y se transfirió a una columna de extracción de RNA
(RNeasy kit, Ambión). Siguiendo el protocolo del kit comercial de extracción se
consiguió el RNA total de cada muestra. Posteriormente una alícuota de muestra
conteniendo 1 µg/µL de RNA se transfirió a un nuevo microtubo eppendorf estéril y se
procedió a la síntesis de cDNA utilizando otro kit comercial (SuperScript First Strand
Synthesis, Invitrogen). El excedente de RNA de cada muestra se almacenó a -80ºC y las
muestras de cDNA se almacenaron a -40ºC. El análisis de la expresión de los genes de
interés se realizó mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR). Para ello se
utilizaron cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos para los genes
seleccionados en mubles, desarrollados recientemente por nuestro grupo de
investigación y sintetizadas por encargo por la compañía AppliedBiosystems. El
proceso consistió en, tras descongelar el cDNA, coger una alícuota de 1 µg de cDNA y
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proceder a su análisis con los cebadores y las sondas específicas para cada gen incluidas
en el kit comercial de PCR a tiempo real de AppliedBiosystems. La lectura de los
niveles de expresión se realizó con el termociclador 7100 de AppliedBiosystems.
Tras las primeras cuantificaciones se decidió centrar esta Tarea 3 en el tejido gonadal.
Este tejido fue el que mostró mayor respuesta a nivel de cambios a lo largo del periodo
de estudio, en comparación con el hígado y el cerebro. Además, las muestras de hígado
fueron difíciles de manejar debido a su alto contenido en tejido graso durante el periodo
reproductor, lo que produjo cuantificaciones ineficaces que se descartaron del análisis
final.
Tarea 4: Transferencia de los resultados a la Administración y desarrollar un
protocolo para la clasificación de la gametogénesis en mubles de la costa vasca.
Dentro se esta tarea se ha recopilado los datos obtenidos mediante las distintas técnicas,
y se ha procedido a su integración. También ha consistido en la redacción de la
memoria final para su transferencia a la Administración. A la vista de los resultados
obtenidos, y como ya se planteó en el proyecto anterior URA10/02, se propone a la
administración competente la necesidad de poner en marcha un programa de
seguimiento de los efectos de disrupción endocrina en peces de la costa vasca. Con este
fin, nuestro grupo de investigación se ofrece a colaborar con la Administración o
agentes implicados en el desarrollo de medidas correctoras o de remediación y también
colaborará con el personal responsable de la Administración ofreciendo asesoramiento y
apoyo científico para el desarrollo de propuestas de actuación.
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RESULTADOS Y LOGROS ALCANZADOS
Estudio histológico de la gónada y el hígado de los mubles.
El estudio histológico de la gónada permitió el sexado de los organismos ya que los
mubles no muestran dimorfismo sexual aparente entre machos y hembras. El ratio
calculado a lo largo de todo el estudio (Septiembre 2010-Septiembre 2011) fue de
1:1.02, no mostrándose diferencias entre el número de machos y hembras (Figura 1).
Sin embargo, al analizar los datos mes a mes sí que se observaron ligeras diferencias.
Por ejemplo, en los meses de Septiembre (2011), Octubre, Enero, Febrero y Abril el
número de hembras fue superior al número de machos. En cambio, en los meses de
Noviembre, Marzo, Mayo y Junio los machos prevalecieron sobre las hembras. Durante
los meses de verano (Julio y Agosto) la mayoría de peces analizados mostraron gónadas
no diferenciadas, con lo que no se les pudo asignar sexo alguno. Estas ligeras
diferencias entre géneros en los meses de estudio no se consideran biológicamente
relevantes.
Lo que sí es destacable del estudio histológico de la gónada fue la detección de
individuos intersex. Los peces intersex están caracterizados por mostrar gametos
femeninos dentro del tejido reproductor masculino (se describe en detalle más adelante).
Este efecto está producido por exposición a compuestos o condiciones de disrupción
endocrina que producen la feminización de los machos. Ya en el anterior proyecto
URA10/02 habíamos detectado posibles efectos de disrupción endocrina en los mubles
de Pasaia, así como niveles de compuestos contaminantes disruptores endocrinos en la
bilis de estos mismos peces. Durante el presente estudio hemos detectado la presencia
de individuos intersex a lo largo de todo el trabajo, llegando en Noviembre a constituir
un 26% de todos los peces capturados en este mes.
Para la caracterización del desarrollo gametogénico de los mubles, se siguieron dos
estrategias complementarias. Por un lado se calcularon los índices morfométricos
gonadosomático (gonad/somatic index GSI) y hepatosomático (liver/somatic index LSI)
y por otro lado se clasificaron las gónadas en base a su estatus gametogénico tras
realizar un estudio histológico de las muestras. Los valores para GSI subieron de
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Septiembre hasta Enero y después volvieron a bajar, mostrando valores mínimos entre
los meses de Marzo y Junio (Figura 2). Esta tendencia se observó tanto para machos
como para hembras, lo que índica que en ambos géneros el desarrollo gametogénico
ocurre paralelamente llegando a su fase madura en los meses de invierno (Diciembre-
Enero). En cuanto a los valores de LSI se observaron patrones distintos para machos y
hembras (Figura 2). En el caso de las hembras los valores crecieron entre Septiembre y
Diciembre, para posteriormente bajar ligeramente y volver a mostrar un valor máximo
en Abril. A partir de este último mes los valores de LSI en hembras bajaron
drásticamente hasta conseguirse los valores mínimos en Julio. Esta tendencia de LSI
coincide perfectamente con lo descrito en GSI para hembras. Está perfectamente
descrito que en hembras de peces el peso del hígado crece durante el desarrollo
gametogénico. Es precisamente en el hígado donde se producen las proteínas
(vitelogenina y coriogenina principalmente) que se transportarán a la gónada para
almacenarlas en los ovocitos en desarrollo. Sin embargo no se observó una tendencia
similar para los machos. Los valores de LSI fueron constantes durante el periodo de
desarrollo gametogénico (Septiembre-Enero) y solo se observaron valores elevados en
los meses de Febrero-Junio, asociado a la perdida de peso en los peces debida a la
liberación de gametos y pérdida de peso en la gónada (valores bajos de GSI como se ha
indicado anteriormente). Mencionar que los mubles intersex mostraron valores de GSI
iguales a los calculados para machos y hembras cada mes, pero en cuanto a los valores
de LSI fueron similares a los calculados para hembras (Figura 2).
El estudio histológico del desarrollo gametogénico de los mubles de Pasaia, vino a
confirmar la hipótesis de partida. La gametogénesis se produjo entre los meses de
Septiembre a Noviembre y la puesta de gametos o desove ocurrió en los meses de
Diciembre, Enero y Febrero (Figura 3). En base al número de capturas por mes,
Diciembre fue el mes en el que se consiguieron menos individuos, confirmando que los
mubles una vez maduros salen de los estuarios a mar abierto para reproducirse. De
Marzo a Agosto todos los individuos analizados mostraron gónadas en post-puesta o
reposo. El ciclo gametogénico observado fue similar para machos y hembras, aunque
parece que los machos pueden alcanzar la madurez gametogénica un poco antes que las
hembras. Al final del verano (Agosto) se observó el inicio de un nuevo ciclo
gametogénico. El presente estudio ha posibilitado el desarrollo de un sistema de
clasificación para las fases gametogénicas de Chelon labrosus, que pueda ser utilizado
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en futuros trabajos con esta especie. En la Tabla 1 y Figuras 4 y 5 puede observarse la
clasificación desarrollada con las descripciones histológicas específicas para cada fase.
El estudio histopatológico de los mubles de Pasaia deparó la presencia de individuos
intersex, como ya se ha mencionado mas arriba. Durante todos los meses incluidos en el
estudio, excepto en Diciembre, la presencia de individuos intersex fue común. El rango
de individuos con gónadas intersex fue desde un 3% en Agosto hasta un 26% en
Noviembre. Los mubles con gónadas intersex mostraban ovocitos previtelogénicos
dispersos entre tejido testicular (Figura 5f). Los datos observados en este estudio
coinciden con los descritos en el proyecto URA10/02 para la población de mubles de
Pasaia. En el estudio del año 2010, los mubles fueron capturados en Junio, momento en
que la gónada se encuentra en fases tempranas del desarrollo, lo que hace la observación
de gametos más difícil. Esto redundó en una prevalencia baja de intersex (1/10) en
Pasaia. En el presente estudio, se demuestra que para estudiar alteraciones
histopatológicas en la gónada de los mubles, los meses de otoño-invierno son más
apropiados ya que la gónada está más desarrollada y es mas fácil poder observar
alteraciones en el desarrollo gametogénico.
En cuanto al estudio histológico del hígado arrojó una presencia alta de agregados de
melanomacrófagos. Los melanomacrófagos son células con capacidad fagocítica que
pueden detectarse en varios tejidos en peces. La presencia de estas células en forma de
agregados y en densidades altas, indican situaciones de estrés en los tejidos afectados,
debido a infección por parásitos, exposición a contaminantes u otros tipos de estrés no
identificados.
Estudio de las proteínas vitelogenina y coriogenina en el plasma de los mubles
Se ha desarrollado un sistema ELISA para vitelogenina de muble Chelon labrosus.
Parte de este trabajo, se realizó en el proyecto URA10/02, pero la validación de la
herramienta no se pudo realizar. En el presente proyecto hemos aplicado el estudio de
los niveles de vitelogenina en plasma de los peces de estudio, como herramienta para la
detección de efectos de xenoestrogenicidad. Los niveles mas altos cuantificados de
vitelogenina en plasma fueron en hembras de Enero (Figura 6). Los niveles de
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vitelogenina en hembras subieron de Septiembre a Enero, para después de la puesta
bajar en los meses de Marzo y Mayo. Este proceso está directamente relacionado con el
desarrollo gametogénico observado en hembras. En el caso de los machos, en todos los
meses de estudio se encontraron individuos con niveles cuantificables de vitelogenina
en plasma. Es de destacar los elevados niveles de vitelogenina cuantificados en los
machos analizados en Diciembre, que tuvieron concentraciones en plasma similares a
los de las hembras gametogénicas. Siendo la vitelogenina una proteína específica de
hembras, estos resultados confirman la presencia de compuestos xenoestrogénicos en el
puerto de Pasaia, llegando a niveles capaces de afectar negativamente a la población de
mubles local. También se cuantificaron los niveles de vitelogenina en individuos
intersex, que mostraron concentraciones similares a los obtenidos en machos.
En el caso de la coriogenina, hemos conseguido un fragmento del gen de la
coriogenina-L de Chelon labrosus, que tras su extensión será enviada a publicar a la
base de datos internacional GenBank de NCBI. Además, hemos conseguido aislar la
proteína y tras desarrollarse los anticuerpos se está procediendo a la cuantificación de
las muestras de plasma. Debido a los problemas que hemos encontrado en la
purificación de la coriogenina del plasma de los mubles, esta parte del trabajo está más
retrasada, pero se completará en breve.
Cuantificación de los niveles de genes asociados a la reproducción durante el ciclo
anual del muble
Como ya se ha adelantado en la sección anterior los estudios de expresión génica se han
centrado en la gónada. Este órgano es el que mejor ha servido para caracterizar el ciclo
reproductor del muble. El hígado también es un órgano interesante, pero el proceso de
extracción de RNA en algunos meses ha sido bastante problemático, lo que ha
redundado en resultados no muy fiables. Las muestras analizadas han correspondido a
las capturadas de los meses de Septiembre (2010), Octubre, Noviembre, Diciembre,
Enero, Marzo y Mayo. Estos meses reflejan los distintos estadíos gametogénicos del
muble y sirven como referencia para el estudio de expresión génica.
17
Los niveles de expresión de la aromatasa cyp19a1 fueron muy variables entre los
individuos estudiados (Figura 7). Aunque las diferencias entre meses no fueron
estadísticamente significativas, sí se han descrito tendencias en la expresión de cyp19a1
para los mubles hembra. Los niveles de expresión de la aromatasa gonadal en hembras
incrementaron desde los niveles cuantificados en Septiembre hasta los niveles máximos
obtenidos en Noviembre. Este incremento está asociado con el proceso de desarrollo
gametogénico descrito en el estudio histológico. Durante los meses de Diciembre y
Enero, los niveles de expresión de la aromatasa gonadal se mantuvieron elevados, para
después bajar en los meses de Marzo y Mayo. Todo este proceso está asociado con el
desarrollo gametogénico, siendo los niveles de aromatasa más bajos en las fases de
post-puesta, reposo y desarrollo gametogénico temprano, elevándose durante el proceso
de gametogénesis, y llegando al máximo con la gónada en madurez. En el caso de los
mubles machos, los niveles de expresión de cyp19a1 no cambiaron sustancialmente a lo
largo del ciclo reproductor y fueron en general inferiores a los cuantificados en
hembras. En cambio en el caso de los mubles identificados como intersex, los niveles de
expresión de aromatasa cyp19a1 mostraron tendencias similares a las cuantificadas en
hembras. En los peces intersex los niveles de expresión fueron más altos en los meses
de otoño-invierno (Septiembre-Enero) y los más bajos en los de primavera (Marzo-
Mayo).
La cuantificación de los niveles de expresión de er en gónada de los mubles, mostró
distintos patrones para machos y hembras (Figura 8). En el caso de las hembras, la
expresión de er se elevó desde Septiembre hasta Diciembre para en Enero bajar
bruscamente y mantenerse bajo hasta Mayo. Este patrón de expresión coincide con
valores altos durante el desarrollo gametogénico y madurez para bajar rápidamente en la
puesta o desove. En el caso de los machos los niveles de expresión fueron casi opuestos
a los cuantificados en hembras. Los niveles más bajos se obtuvieron durante el proceso
de gametogénesis y los más altos en la fase de post-puesta. En el caso de los peces
intersex, los niveles de er cuantificados mostraron un patrón de expresión similar al
observado para las hembras, con niveles altos durante la gametogénesis y bajos en la
puesta. Mencionar que en Mayo los niveles de er en la gónada de los peces intersex
fueron bastante altos, quizá debido a la fase gametogénica en este mes, que haría que
estos peces fuesen más parecidos a los machos normales.
18
En cuanto a los niveles de expresión de rxr en gónada, se observaron diferencias muy
claras entre machos y hembras y entre los meses de estudio (Figura 9). En las hembras
los niveles de expresión de rxr fueron elevandose a lo largo del proceso de
gametogénesis (Septiembre-Diciembre), para bajar en el periodo de puesta (Enero) y
volver a elevarse en los meses de post-puesta (Marzo-Mayo). En el caso de los machos
los niveles de expresión de rxr en gónada fueron, al igual que los descritos para er,
opuestos a los observados en hembras. Los niveles mas bajos se cuantificaron en el
periodo de gametogénesis (Septiembre-Diciembre). Los más elevados se cuantificaron
en el periodo de post-puesta. Los valores de expresión elevados cuantificados en la fase
de post-puesta, tanto para machos como para hembras, pueden estar asociados con la
función de este receptor hormonal en el mantenimiento de células gonadales
indiferenciadas, que puedan participar en el siguiente ciclo gametogénico. Para los
peces intersex, el patrón de expresión a lo largo del estudio fue similar al cuantificado
en machos, aunque en los mubles intersex la variabilidad interindividual en la expresión
de rxr fue mayor que en los machos normales.
Por último mencionar que además de los genes mencionados también se cuantificó en
gónada los niveles de expresión del gen ribosómico 5S rRNA y otros genes asociados
a su regulación. Aunque en la solicitud del presente proyecto no se hizo mención a estos
genes ni era objetivo de este proyecto, durante el trabajo con muestras de gónada se
encontraron niveles muy elevados de 5S rRNA en la gónada de los mubles hembras.
Además, la expresión de este gen en gónada siguió el mismo patrón que el descrito para
el desarrollo gametogénico, con niveles más elevados en la fase de madurez y niveles
más bajos en la fase de post-puesta. En machos los niveles siempre fueron muy bajos en
comparación con todas las hembras estudiadas (Figura 10). Para nuestra sorpresa los
mubles intersex mostraron valores intermedios entre machos y hembras. El 5S rRNA es
un gen que participa activamente en el desarrollo de los ovocitos en hembras y suele
acumularse en ovocitos para servir como primera fuente de transcriptos en los
embriones de peces. Este gen es parte de los ribosomas, cuya función en las células es la
síntesis de proteínas y puede estar regulado tanto a nivel génico (transcripcional) como
a nivel post-transcripcional. Los genes y proteínas asociadas que regulan los niveles de
expresión del 5S rRNA en gónada, también mostraron un patrón de expresión similar.
Todo esto demostró que una simple electroforesis de RNA de gónada de pez puede
servir como herramienta fácil, rápida y útil para el sexado de los individuos (Figura 10).
19
Además, en el caso de las hembras podría servir también como indicador de su
desarrollo gametogénico. Finalmente, y en lo referente a las líneas de actuación de la
convocatoria en la que se enmarca este proyecto, la cuantificación de la expresión de 5S
rRNA puede servir para detectar individuos intersex de manera rápida y sencilla. Este
procedimiento puede ser aplicado en los programas de biomonitoreo a desarrollar para
el estudio de efectos de disrupción endocrina. Nuestro grupo de investigación ha
procedido a solicitar la patente de este procedimiento, que se encuentra en este
momento en proceso.
En conclusión, los niveles de expresión de genes asociados al desarrollo gametogénico
en mubles han mostrado distintos patrones tanto en machos como en hembras. En
ambos casos la expresión de estos genes está directamente relacionada con su actividad
en el metabolismo hormonal, estando los niveles de cyp19a1 asociados a la
gametogénesis en hembras pero no en machos. En el caso de er, el patrón de expresión
en hembras es similar al descrito para cyp19a1, pero completamente opuesto en el caso
de los machos. Los niveles de rxr están más relacionados con el mantenimiento de
células germinales tempranas en ambos sexos. Finalmente, el descubrimiento de la
expresión del 5S rRNA como biomarcador de exposición a compuestos disruptores
endocrinos, abre una puerta muy interesante para futuros estudios.
Otros logros de interés del proyecto
Este proyecto ha propiciado el desarrollo de un procedimiento patentable para el sexado
de peces, que además puede ser utilizado para el estudio de los efectos de disrupción
endocrina en peces de campo. Esta procedimiento ha sido presentado como “Método
para la identificación del sexo en peces” ante la Oficina Española de Patentes y Marcas
(OEPM) con el número de solicitud P201130778 a nombre de la UPV/EHU.
También dentro del proyecto, se han fortalecido colaboraciones científicas con distintos
grupos de investigación, con los que se había iniciado trabajos en común. El grupo del
Dr. Javier Franco del centro AZTI-Tecnalia, ha facilitado la captura y procesamiento de
muestras. Además, han mostrado mucho interés por los análisis realizados y los
20
resultados obtenidos, ya que este grupo de investigación realiza los estudios de
seguimiento de la calidad de las aguas en la redes de seguimiento del Gobierno Vasco.
Mencionar por último que la colaboración con el grupo de investigación de los Dres.
Angel Maquieira y Pilar Aragón de la Universidad Politécnica de Valencia ha
posibilitado el desarrollo de los sistemas ELISA, para la cuantificación de vitelogenina
y coriogenina en plasma de los mubles.
21
CONCLUSIONES
La principal conclusión del proyecto ha sido la utilidad de una batería de
biomarcadores como herramienta para la evaluación de efectos de disrupción
endocrina en mubles de la costa vasca. Estos biomarcadores han confirmado los
efectos detectados en el proyecto URA10/02 y han demostrado que la población de
mubles de Pasaia tiene una exposición constante a compuestos disruptores endocrinos,
ya que se han detectado individuos intersex a lo largo de todo el estudio (excepto en
Diciembre) y también niveles cuantificables de vitelogenina en plasma de machos y
mubles intersex.
Se ha demostrado que la utilización de sistemas ELISA para vitelogenina (y
posiblemente también coriogenina) como herramientas sencillas y rápidas de aplicar
puede ser fundamental en los estudios de biomonitoreo para la detección de efectos de
disrupción endocrina en peces.
El descubrimiento de la expresión de 5S rRNA como marcador de peces intersex ofrece
la posibilidad de utilizar este gen en otras especies de peces, que habiten ecosistemas
potencialmente afectados por disruptores endocrinos.
El ciclo reproductor del muble en la costa vasca, en base a la población del puerto de
Pasaia, comienza a finales de verano y progresa durante el otoño. Los mubles obtienen
la madurez en los meses de invierno para proceder seguidamente con el desove. Durante
la primavera se observaron principalmente individuos en fase de post-puesta y en
verano en fase de reposo. El muble ha resultado ser una especie muy útil y sensible para
su uso en programas de seguimiento de la calidad de ambientes estuarinos en la costa
vasca y se recomienda su inclusión en un futuro programa de biomonitoreo o
seguimiento de la calidad de las aguas.
22
CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES DERIVADAS DEL
PROYECTO
Ya en el anterior proyecto URA10/02 proponíamos la necesidad del desarrollo de un
programa de bioseguimiento de alteraciones tipo disrupción endocrina en los estuarios
vascos y ampliar este estudio a otros estuarios de nuestra costa que puedan ser sensibles
a este tipo de contaminantes. Esta recomendación la hacíamos en base a la actual
legislación europea sobre la calidad de las aguas superficiales (Directiva Marco del
Agua 2000/60/CE), en la cual se recomienda la implementación de programas de
monitoreo biológico para establecer la salud de los ecosistemas acuáticos con el fin de
conseguir una calidad y gestión del medio acuático optimo.
Dentro de la propuesta de bioseguimiento se recomendaba el uso del muble Chelon
labrosus como especie centinela y su captura entre los meses de Septiembre a
Noviembre. En base a los resultados y conclusiones del presente proyecto, podemos
recomendar la extensión del periodo de estudio a todo el año, no limitándose solo a los
meses de gametogénesis. Se podría sugerir, que para la detección de individuos intersex
mediante histología, lo mas apropiado es la captura de mubles entre Septiembre y Enero
(proceso de gametogénesis). Sin embargo utilizando herramientas tipo ELISA para
vitelogenina y cuantificación de niveles de expresión de genes asociados a la
reproducción, cualquier otra época del año sería apropiada, siempre y cuando se
utilizase individuos machos o inmaduros. Este tipo de herramientas deberían incluirse
en futuros programas de seguimiento de la calidad de los ecosistemas estuarinos.
23
PLAN DE FORMACIÓN, DIFUSION Y TRANSFERENCIA
Parte de los trabajos desarrollados han sido presentados en congresos científicos
internacionales:
- O. Diaz de Cerio, I. Rojo, C. Bizarro, M. Ortiz-Zarragoitia, I. Cancio. “5S rRNA in
gonads, a powerful marker to determine gender and reproductive endocrine disruption
in fish?” 16 PRIMO Symposium, Long Beach, USA, 2011.
- O. Diaz de Cerio, I. Rojo, C. Bizarro, M. Ortiz-Zarragoitia, I. Cancio. “Specific sex and
intersex marker genes in fish: towards a tool to study fish stock dynamics and the effects
of reproductive endocrine disruption” SETAC North America Focused Topic Meeting,
Cancun, Mexico, 2011.
Parte de los resultados han sido enviados o están en preparación para su publicación en
revistas científicas internacionales:
- O. Diaz de Cerio, I. Rojo, C. Bizarro, M. Ortiz-Zarragoitia, I. Cancio “5S rRNA and
accompanying proteins in gonads, powerful markers to determine gender and
reproductive endocrine disruption in fish” Environmental Science and Technology,
enviado.
- C. Bizarro, M.P. Cajaraville, M. Ortiz-Zarragoitia “Histological and molecular
characterization of the reproductive cycle of Chelon labrosus from the Basque coast
(Bay of Biscay)” Marine Ecology Progress Series, en preparación.
En caso necesario, se prevé además la difusión de los resultados obtenidos en el
proyecto mediante su publicación revistas de carácter divulgativo.
En cuanto al carácter formativo del presente proyecto, destacar que el proyecto de
Master de la investigadora predoctoral Cristina Bizarro ha comprendido parte de los
resultados del presente proyecto. Este trabajo fue defendido en Septiembre de 2011 con
la calificación de sobresaliente y obteniendo el premio del Tribunal de Tesinas de
Master al mejor trabajo desarrollado:
24
C. Bizarro “Histological and molecular characterization of the reproductive cycle of the
thicklip grey mullet Chelon labrosus from Pasaia harbor (Basque coast)” Leioa, 2011.
Además, dentro del presente proyecto de investigación la investigadora pre-doctoral C.
Bizarro ha podido realizar una estancia en la Universidad Politécnica de Valencia para
aprender las técnicas basadas en sistemas ELISA, para la cuantificación de vitelogenina
y coriogenina en plasma de mubles. También ha posibilitado la realización de un curso
sobre el manejo de técnicas basadas en qPCR a tiempo real, para la optimización de
protocolos y su aplicación en las muestras del presente trabajo.
Finalmente mencionar que nuestro grupo de investigación estaría dispuesto a colaborar
con las administraciones/gestores implicados en el desarrollo de un plan específico de
biomonitoreo de los efectos disruptores endocrinos en poblaciones de peces de la costa
vasca. Asimismo, también mostramos nuestra disposición a transferir nuestra
experiencia y conocimiento en la formación de personal cualificado para realizar las
tareas descritas en el presente proyecto.
25
TABLA 1
Tabla 1: Descripción de las fases gametogénicas observadas en la gónada de los mubles
Chelon labrosus.
Fase gametogénica Machos Hembras
Inmadura Testículos inactivos, secciones
transversales pequeñas y muy poco
desarrollo espermatocítico. Presencia de
muchas espermatogonias y poco
espermatocitos.
Ovario inactivo con ovocitos
previtelogénicos. La pared del ovario es
muy fina.
Gametogénesis Presencia de espermatocitos primarios y
secundarios y bastantes espermatogonias.
Se pueden observar ovocitos
previtelogénicos y cortical-alveoli.
Madurez Los túbulos seminiferos contienen
espermatocitos primarios y secundarios
en desarrollo. Se observan también
espermátidas y espermatozoides
maduros.
Aparecen los ovocitos llenos de gotas de
vitelo. Un gran número de ovocitos está
hidratado.
Puesta/Atresia Los túbulos seminiferos aparecen
ensanchados y llenos de espermatozoides
maduros. En el caso de atresia los
túbulos aparecen medio vacios.
Casi un tercio de los ovocitos muestra
atresia y la pared de los ovocitos aparece
irregular o amorfa.
Inactivo/Reposo Secciones transversales muy largas con
algunos pocos espermatozoides
residuales. Se pueden observar algunas
espermatogonias en la periferia
Similar a la gónada inmadura, pero en
este caso los ovocitos son algo mayores
en tamaño, la pared del ovario es gruesa.
26
ANEXO IMÁGENES
Figura 1: Porcentaje de individuos de cada sexo capturados entre Septiembre 2010 y
Agosto 2011. También se incluye el porcentaje de individuos intersex y de individuos
indiferenciados.
27
Figura 2: Índices gonado somático (GSI) y hepatosomático (LSI) calculados en los
mubles analizados. Los valores se muestran para machos, hembras e intersex de manera
individual.
28
Figura 3: Porcentajes de individuos en cada fase gametogénica en cada mes del estudio.
En el gráfico superior se muestran los valores para los peces machos (incluidos los
mubles intersex) y en el gráfico inferior se representan los datos obtenidos para los
mubles hembras.
29
Figura 4: Micrografias obtenidas de secciones de gónada de mubles hembras teñidas
con hematoxilina/eosina. a: sección de una gónada inmadura (RS1), en la que se
observan ovocitos previtelogénicos (PO). b: sección de una gónada en desarrollo (RS2)
donde se pueden observar ovocitos previtelogénicos y otros en fase de cortica-alveoli. c:
gónada madura de hembra (RS3) en la que se observan ovocitos maduros ricos en gotas
vitelogénicas. d: sección de gónada en fase de puesta o atresia (RS4) en la que se
observan ovocitos maduros muy hidratados y algunos atrésicos. e: gónada en fase
inactiva o de reposo (RS5) donde pueden observarse unos pocos ovocitos
previtelogénicos y varios ovocitos atrésicos (AT) además de tejido intersticial (IT).
30
Figura 5: Micrografias obtenidas de secciones de gónada de mubles machos teñidas con
hematoxilina/eosina. a: sección de una gónada inmadura (RS1), con células
espermatogénicas tempranas. b: sección de una gónada en desarrollo (RS2) donde se
pueden apreciar unas pocas células espermatocíticas (color azul mas oscuro). c: gónada
madura (RS3) en la que se observan distintas fase de espermatogénesis y en el medio de
los túbulos seminíferos se puede ver la presencia de espermatozoides. d: sección de
gónada en fase de puesta o atresia (RS4) en la que se ven los túbulos seminíferos
ensanchados. e: gónada en fase inactiva o de reposo (RS5) con mucho tejido intersticial
y células espermatogénicas primordiales. f: sección de una gónada macho intersex; se
puede apreciar la presencia de ovocitos previtelogénicos (asterisco) dispersos entre el
tejido testícular con células espermatocíticas (flechas).
31
Figura 6: Niveles de vitelogenina (µg/L) cuantificados mediante ELISA en las muestras
de plasma de los mubles analizados. Se muestran los valores máximos y mínimos
cuantificados para cada mes y género por separado.
32
Figura 7: Niveles de expresión en gónada de los mubles para aromatasa ovárica
(cyp19a1) cuantificados mediante PCR a tiempo real (qPCR). Se representan los
gráficos para hembras (izquierda) y machos (derecha) por separado. En este último caso
los machos normales están representados por las barras azules y los intersex por las
barras verdes. Los valores fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de un
factor no paramétrica (Kruskall-Wallis) y la segregación de los grupos estadísticos se
realizó siguiendo el test de Tukey (nivel de significancia p < 0.05). Las matrices
triangulares de la derecha muestran los meses con diferencias significativas entre ellos
marcados con un asterisco. Las estrellas y los círculos que aparecen en los gráficos
representan valores outliers.
33
Figura 8: Niveles de expresión en gónada de los mubles para aromatasa ovárica (er)
cuantificados mediante PCR a tiempo real (qPCR). Se representan los gráficos para
hembras (izquierda) y machos (derecha) por separado. En este último caso los machos
normales están representados por las barras azules y los intersex por las barras verdes.
Los valores fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de un factor no
paramétrica (Kruskall-Wallis) y la segregación de los grupos estadísticos se realizó
siguiendo el test de Tukey (nivel de significancia p < 0.05). Las matrices triangulares de
la derecha muestran los meses con diferencias significativas entre ellos marcados con
un asterisco. Las estrellas y los círculos que aparecen en los gráficos representan valores
outliers.
34
Figura 9: Niveles de expresión en gónada de los mubles para aromatasa ovárica (rxr)
cuantificados mediante PCR a tiempo real (qPCR). Se representan los gráficos para
hembras (izquierda) y machos (derecha) por separado. En este último caso los machos
normales están representados por las barras azules y los intersex por las barras verdes.
Los valores fueron analizados estadísticamente mediante ANOVA de un factor no
paramétrica (Kruskall-Wallis) y la segregación de los grupos estadísticos se realizó
siguiendo el test de Tukey (nivel de significancia p < 0.05). Las matrices triangulares de
la derecha muestran los meses con diferencias significativas entre ellos marcados con
un asterisco. Las estrellas y los círculos que aparecen en los gráficos representan valores
outliers.
35
Figura 10: Imágenes de muestras de RNA de gónada de mubles. En la parte superior se
muestran los resultados obtenidos mediante Bioanalyzer y en la parte inferior los
obtenidos mediante una electroforesis en gel de agarosa. Las bandas mas bajas en
ambas imágenes representan el 5S rRNA, solo identificado en hembras e individuos
intersex, pero no en machos.